專利名稱：一個水稻PHD-finger家族蛋白基因KT496在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及來源于水稻的 與抗逆相關(guān)的KT496基因在提高植物耐高鹽、低溫和干旱中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻、玉米和小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，三大作物的產(chǎn)量、品質(zhì)對于我國的糧食 生產(chǎn)和糧食安全都至關(guān)重要。干旱、鹽堿、高溫和凍害等非生物逆境會直接影響糧食作物的 正常生長和產(chǎn)量。利用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有耐逆性和廣泛適應(yīng)性的 農(nóng)作物新品種，可以使農(nóng)作物在逆境條件下保持穩(wěn)定高產(chǎn)。隨著轉(zhuǎn)基因研究的深入，已經(jīng)陸 續(xù)分離克隆了一些與抗逆相關(guān)的基因，包括代謝過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因，滲透調(diào)節(jié)蛋白、小 分子物質(zhì)，還有參與調(diào)控各種逆境應(yīng)答途徑的轉(zhuǎn)錄因子等。PHD-f inger是一類特征為Cys4-His_Cys3的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，長約50 80 個氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均與RING-fnger (Cys3-His-Cys4)和LIM結(jié)構(gòu)域 (Cys-His-Cys)相似，而蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)差別卻較大，其中PHD_f inger和RING以交替支持捆 綁方式結(jié)合2個鋅原子，即2個鋅原子結(jié)合位點分別由第1、第3對和第2、第4對金屬配基 組成；而LIM采用連續(xù)鋅原子結(jié)合方式，即2個鋅原子結(jié)合位點依此由第1、第2對與第3、 第4對金屬配基形成。此外，PHD-f inger的疏水中心比RING多1個保守的色氨酸殘基。Schindler等最早觀察擬南芥同源域蛋白(Homeodomain)HAT3和玉米Zmhoxl蛋 白中均有一富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，并將其命名為PHD-f inger。隨后證明PHD-f inger并 非植物特有，它也廣泛存在于酵母、線蟲與哺乳動物中，亦稱白血病關(guān)聯(lián)蛋白(Leukemia associated protein，LAP)。PHD-finger具有重要的生物學(xué)功能，主要存在于兩類蛋白 中1)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，如激活子、抑制子或協(xié)因子(cofactors)等；幻染色質(zhì)調(diào)節(jié)復(fù)合物 (chromatin modulating complexes)相關(guān)蛋白或包含乙酰轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合物蛋白，如p300 或CBP，它可能是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA或蛋白質(zhì)與RNA相互作用區(qū)。已發(fā)現(xiàn)數(shù)種 具PHD-finger的擬南芥蛋白質(zhì)，如參與抗病相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的PRHA蛋白；花粉成熟的 核信號分子MSl蛋白；發(fā)育和減數(shù)分裂過程中基因表達(dá)調(diào)控的SHL和MMDl蛋白等，并克隆 了它們的編碼基因。研究發(fā)現(xiàn)，從水稻幼胚cDNA文庫中克隆的PHD-finger家族蛋白基因HAZl具有標(biāo) 識球形+胚徑向軸分化的作用。從水稻中分離克隆PHD-finger家族蛋白基因，并研究其在 水稻生長發(fā)育和逆境信號傳導(dǎo)途徑中的作用，直接為農(nóng)作物的性狀改良提供了重要的基因 資源，具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個與耐逆性相關(guān)的水稻PHD-finger家族轉(zhuǎn)錄因子及其基 因KT496，以用于提高植物的耐逆性能。
發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的KT496基因，來源于稻屬水稻(Oryza sativa L.)， 編碼具有下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；序列表中的SEQ ID NO :1由689個氨基酸殘基組成，為蛋白KT496。本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的KT496的編碼基因既可為所述基因的cDNA序列， 也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功 能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的編碼基因可以具有序列表中SEQ IDNO 2的核苷酸序列。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增KT496任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼本發(fā)明與耐逆性相關(guān)的基因?qū)?入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐逆性獲得提高。在上述提高植物耐逆性的方法中，本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的KT496基因既可 為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90%以上同 源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方 法進行分離和/或修飾和/或設(shè)計得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列 中核苷酸同一性的微小改變可能會導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強，而且在一些應(yīng)用(例 如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶?化或縮短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的。本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)KT496基因或其同源序列可通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植 物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng) 桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如PBin系列載 體(如pBin 19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)WatewayTW系列載體(如pH2GW7等)、 pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā) 載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載體或pBluescript系 列載體等。使用本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的KT496基因或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體 時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ABA、干 旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動子。所述組成性表達(dá)啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S 啟動子，玉米WDiquitin啟動子或水稻actinl啟動子等；所述組織特異性表達(dá)啟動子可 為根特異性表達(dá)啟動子、葉片特異性表達(dá)啟動子、維管特異性表達(dá)啟動子、種子特異性表 達(dá)啟動子、花特異性表達(dá)啟動子或花粉特異性表達(dá)啟動子，如2S1啟動子(GenBank號 NM_118848. 2, GI :30687489)和 NapinA (GenBank 號:M64633. 1，GI :349405)啟動子等；所述 誘導(dǎo)型啟動子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動子。上述啟動子可單 獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還 可使用增強子，包括翻譯增強子和/或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子 或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起 始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素 標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (NPTII)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩 選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或 器官可由潮霉素進行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接 以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進行篩選后還可采用Southern、PCR或點雜交等分子檢 測手段對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。其中，本發(fā)明以PCAMBIA1300為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān) 的KT496基因的植物表達(dá)載體命名為pCactF-KT496。攜帶有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的 KT496基因或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌 介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將 轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組 織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的KT496基因或其同源序列的轉(zhuǎn)基 因植株進行繼代培養(yǎng)后，可從中進一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對該轉(zhuǎn)基 因植株進行擴繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性進一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴繁包 括無性繁殖和/或種子繁殖。本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、 組織或器官既可來源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物，也 可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發(fā)明提供了一個與耐逆性相關(guān)的PHD-finger蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族基因KT496。實 驗證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可提高水稻對高鹽、干旱和低溫逆境脅迫的耐受性，且對 水稻的正常生長和經(jīng)濟性狀沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C 制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植 物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。


圖1KT496基因的逆境表達(dá)譜分析。“CK”為對照；“D1”為干旱處理至葉片微卷時； “D2”為干旱處理至葉片半卷時；“D3”為干旱處理至葉片全卷時；“Si”為鹽處理至葉片微 卷；“S2”為鹽處理至葉片半卷；“S3”為鹽處理至葉片全卷；Actin為水稻內(nèi)參基因。圖2表達(dá)載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊 界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的啟動子；T35S表示35S基因的終止子；pAct
5表示Actin基因的啟動子；3flag表示3倍的flag標(biāo)簽序列；OCS表示ocs基因的終止子； HindIII、KpnI、SpeI、)(bal、SalI和I3StI分別表示限制性內(nèi)切酶的酶切位點。圖IT496轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性分析及存活率統(tǒng)計。A 旱處理前苗生長狀態(tài)；B 復(fù)水前苗生長狀態(tài)；C 復(fù)水一周后苗生長狀態(tài)；D 旱處理后的存活率統(tǒng)計。圖4KT496轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性分析及存活率統(tǒng)計。A 鹽處理前苗生長狀態(tài)；B 鹽處理后苗生長狀態(tài)；C 正常培養(yǎng)一周后苗生長狀態(tài)；D 鹽處理后的存活率統(tǒng)計。圖^^496轉(zhuǎn)基因株系的耐低溫分析及存活率統(tǒng)計。A 低溫處理前苗生長狀態(tài)；B 低溫處理后苗生長狀態(tài)；C 正常培養(yǎng)一周后苗生長狀態(tài)；D 低溫處理后的存活率統(tǒng)計。圖6KT496轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)分析?！?”為質(zhì)粒對照；“2”為野生型日本晴對照； “3”為轉(zhuǎn)空載體對照；“4-8”為KT496轉(zhuǎn)基因株系；“KT496”為KT496基因的擴增產(chǎn)物； “Actin”為水稻內(nèi)參基因Actin的擴增產(chǎn)物。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿生物 技術(shù)公司合成，測序由北京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構(gòu)建過程中的核酸內(nèi)切酶購自 寶生物工程有限公司，pEASY-Tl連接試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司，T4DNA連接酶 購自Promega公司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體pHPG由本實驗 改造所得，基本骨架來自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。 1、KT496基因的表達(dá)譜分析1. 1植物材料及處理選取兩葉期的日本晴材料進行逆境處理。其中干旱處理的材料和樣品在以下階段 收集期I(Dl)葉輕微卷，相對含水量(RWC)在90%-95% ；期2(擬)葉半卷，相對含水 量(RWC)在80%-85% ；期3(D!3)葉完全卷，相對含水量在70%-75%。D1、D2和D3代表 干旱處理的三個階段。對每個處理階段，取樣三份。采樣完畢，樣品立即用液氮冷凍保存 于-80 0C ο200mM高鹽處理的材料和樣品也分以上三個時期進行收集和保存。KT496 基因的 RT-PCR 分析KT496基因的RT-PCR檢測引物引物 1 5，-gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG-3‘引物 2 5，-ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC-3，KT496基因的RT-PCR擴增片段是基因全長2067bp。Actin 基因的 RT-PCR 引物 引物 3 5，-TGTTCCTGCCATGTATGT-3，引物 4 5，-ATGTCCCTCACAATTTCC-3，ACTIN基因的RT-PCR擴增片段是252bp。以上引物分別以經(jīng)過步驟1. 1處理后的水稻幼苗cDNA為模板，陰性對照模板為正 常生長的中花11幼苗CDNA，檢測這些基因在鹽處理和干旱處理中的表達(dá)變化，PCR檢測體 系和程序為IOXbuffer2
IOmM dNTP0. 4IOM 引物 F0.4IOM 引物 R0.4Taq polymerase0. 4cDNA1ddH2015. 4PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 °C，5分鐘；變性94°C，30秒，，退火55°C，30 秒，延伸:72°C，2min，沘個循環(huán)；72 °C，10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測結(jié)果見圖1，其 中D表示干旱處理；S表示鹽處理；字母后的數(shù)字1、2和3分別指干旱處理和鹽處理的三個 程度。KT496指該基因的擴增產(chǎn)物；Actin指水稻actin基因的擴增產(chǎn)物。可見，KT496基 因在水稻幼苗中呈干旱和高鹽誘導(dǎo)性。2、0496基因的分離從基因的編碼起始位點ATG開始設(shè)計5’端引物，于終止密碼處設(shè)計3’端引物引物 5 :5，gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG 3，引物 6 :5，ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC 3，引物1中g(shù)tcgac序列為限制性內(nèi)切酶MlI的酶切位點，下劃線標(biāo)識的序列為 KT471基因的編碼序列；引物2中ctgcag序列為限制性內(nèi)切酶I^stI的酶切位點，下劃線標(biāo) 識的序列為KT496基因的編碼序列。提取幼苗期的日本晴水稻的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RT-PCR方法，用以上引 物擴增得到全長基因，基因長度為2067bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，所 編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。具體反應(yīng)為取約2 μ g 的總 RNA，加入 1 μ 1 IOXDNase buffer, 1 μ 1 的 DNase， 補DEPC處理過的水至10 μ 1體系，混勻，37 0C溫育30min后，力卩入1 μ 1的RQ DNase stop solution，65°C 溫育 IOmin 以終止反應(yīng)后，加入 2μ 1 Oligo (dT) 18primer (0. 1 μ g/ μ 1),4 μ 1 5X First-strand buffer,1 μ 1 Ribonuclease inhibitor(40U/μ 1) , 2 μ 1 4Χ dNTP (各 IOmM)，1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，小心混勻，37°C保溫 1 小時。然后90°C處理5分鐘，冰上冷卻，離心收集即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。將得到 的cDNA稀釋10倍，取1 μ 1作為PCR反應(yīng)的模板，上、下游引物(10 μ Μ)各1 μ 1，LATaq酶 (5U/y 1)0. 5 μ l，4XdNTPs (各 IOmM) 1 μ 1，2XGC buffer (Mg2+) 25 μ 1，H20 20. 5 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為預(yù)熱95°C 5min,變性94°C lmin,退火56°C 30sec,延伸72°C 2minl0sec, 34個循 環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大小與預(yù)期 結(jié)果相符的DNA片段。回收并純化上述片段，將其連接入載體pEASY-Tl (全式金公司)中， 通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) T0P10菌株，挑選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時，提取質(zhì)粒，得到含有目的片 段的重組質(zhì)粒，測序驗證正確后，用MlI和I3StI雙酶切，切下目的片段，連入同樣進行雙酶 切的pCactF植物表達(dá)載體，得到pCactF-KT496，挑取菌落PCR鑒定為陽性的菌落進行測序驗證。植物表達(dá)載體PCactF的T-DNA區(qū)圖譜如圖2所示。3、KT496轉(zhuǎn)基因水稻的獲得用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將按具體實施方式
2獲得的與耐逆性相關(guān)的基因KT496轉(zhuǎn)化水 稻，具體方法如下利用熱激法將上述重組載體pCactF-KT496轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株(中國科學(xué)院遺 傳所贈送)，利用農(nóng)桿菌對水稻進行共轉(zhuǎn)化。將獲得的水稻轉(zhuǎn)基因植株的部分葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，在正向引物 5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3，和反向引物 5，-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3，的引導(dǎo)下，PCR 擴增 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴增獲得1009bp DNA片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，檢測結(jié)果表明 用上述方法獲得了轉(zhuǎn)化有pCactF-KT496的轉(zhuǎn)基因水稻。4、KT496轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性鑒定收獲KT496T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取5個系進行干旱脅迫。用水浸種培養(yǎng)3天 使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進行抗性篩選，同時以轉(zhuǎn)空載體的水稻中花11作對照，篩 選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性 分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插 入的KT496的Tl轉(zhuǎn)基因株系，待苗長到8cm左右時，將小苗從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每 瓶10株，三個重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期時(第3片葉完全舒展)，進行急性干旱處理。旱篩前 將苗根部洗凈，選生長狀態(tài)(粗細(xì)、株高)一致的苗(圖3A)，用吸水紙將根部水吸干，放入 干燥的新三角瓶中。每瓶詳細(xì)記錄干旱起始時間，篩選至對照莖稈部分九成干或以上。旱 篩過程大約9個小時左右(視表型而定)，然后復(fù)水，三角瓶中的營養(yǎng)液2天更換一次，以 保持營養(yǎng)液的新鮮狀態(tài)。干旱處理后的苗生長狀態(tài)如圖3B所示，復(fù)水正常培養(yǎng)一周后苗恢 復(fù)狀態(tài)如圖3C所示。最后統(tǒng)計各株系的苗存活率，如圖3D的柱形圖所示，CK的存活率為 16. 7 %，而轉(zhuǎn)KT496基因的株系的存活率均在65 %及以上，存活率遠(yuǎn)高于對照。在獲得KT496轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們再一次進行了耐旱性實驗，結(jié)果與 上述實驗結(jié)果相一致。此實驗說明KT496基因具有增強水稻耐旱性的作用。5、KT496轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性鑒定收獲ΚΤ496Τ1代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取5個系進行鹽脅迫。用水浸種培養(yǎng)3天使 其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進行抗性篩選，同時以轉(zhuǎn)空載體的水稻中花11作對照，篩選5 天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離 比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的 KT496的Tl轉(zhuǎn)基因株系，待苗長到8cm左右時，將小苗從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每瓶10 株，三個重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期(第3片葉完全舒展)，其生長狀態(tài)如圖4A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液進行鹽篩，約3天左右，對照出現(xiàn)葉尖發(fā)黃泛白，葉片下垂或半卷甚至 全卷時(圖4B)，洗去鹽溶液，正常培養(yǎng)。期間每1.5天更換一次鹽溶液。復(fù)水第二天再更 換一次營養(yǎng)液，以去除剩余的鹽分。三角瓶中的營養(yǎng)液2天更換一次，以保持營養(yǎng)液的新鮮 狀態(tài)。一周后照相(圖4C)，統(tǒng)計成活苗數(shù)，計算耐鹽苗比例，結(jié)果如圖4D(橫坐標(biāo)為不同的 轉(zhuǎn)基因株系編號，縱坐標(biāo)為耐鹽苗百分比)。實驗結(jié)果顯示，Tl代轉(zhuǎn)基因水稻植株對鹽的耐 受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)鹽處理后，KT496轉(zhuǎn)基因水稻Tl代陽性株系的植株 恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生長，轉(zhuǎn)空載體的中花11對照(CK)植株的葉片發(fā)黃、卷曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù)培養(yǎng)后很快死亡(圖4C)。在獲得KT496轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們再一次進行了耐鹽性實驗，結(jié)果與 上述實驗結(jié)果相一致。此實驗說明KT496基因具有增強水稻耐鹽性的作用。6、KT496轉(zhuǎn)基因植株耐低溫性鑒定收獲KT496 Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取5個系進行低溫脅迫。用水浸種培養(yǎng)3天 使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進行抗性篩選，同時以轉(zhuǎn)空載體的水稻中花11作對照，篩 選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性 分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插 入的KT496的Tl轉(zhuǎn)基因株系，待苗長到8cm左右時，將小苗從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每 瓶10株，三個重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期(第3片葉完全舒展)，其生長狀態(tài)如圖5A。開始4。C 冷篩，當(dāng)對照新葉、老葉全卷后1至2天(圖5B)，重新正常培養(yǎng)，期間三角瓶中的營養(yǎng)液2 天更換一次，以保持營養(yǎng)液的新鮮狀態(tài)。低溫篩選結(jié)果如圖5C所示，轉(zhuǎn)空載體對照株系大 部分都已發(fā)黃、萎蔫、死亡，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出很強的低溫耐受力和恢復(fù)能力，恢復(fù)一周 后的存活率統(tǒng)計如圖5D，轉(zhuǎn)基因株系的存貨率均比對照要低。在獲得KT496轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們再一次進行了耐低溫性實驗，結(jié)果 與上述實驗結(jié)果相一致。此實驗說明KT496基因具有增強水稻耐受低溫的能力。7、KT496轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析KT496基因的RT-PCR檢測引物引物 7 5 ‘ GATAAAGTCGAGGGGGGGCC 3 ‘引物 8 5 ‘ CACTTGCGAAATGCTTA 3 ‘KT496基因的RT-PCR擴增片段是381bp。以上引物分別以水稻KT496轉(zhuǎn)基因各株系的幼苗cDNA為模板，陰性對照模板為正 常生長的日本晴幼苗cDNA，檢測KT496基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況，PCR檢測體系和程 序為IOXbuffer2IOmM dNTP0. 4IOM 引物 F0.4IOM 引物 R0.4Taq polymerase 0. 4cDNA1ddH2015. 4PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C，5分鐘；變性94°C，30秒，，退火55°C，30 秒，延伸:72°C，2min，沘個循環(huán)；72 °C，10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測結(jié)果見圖6，其 中，KT496指該基因的擴增產(chǎn)物；Actin指水稻actin基因的擴增產(chǎn)物?？梢?，KT496基因在 轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中均有不同程度的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種增強植物抗逆性的方法，其特征是將植物抗逆相關(guān)蛋白的編碼基因插入表達(dá)載 體，獲得含有植物抗逆相關(guān)蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植 物，從表達(dá)所述植物抗逆相關(guān)蛋白的植株或所述植物抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)量增加的植株中篩 選得到抗逆性增強的植株；其中，所述植物抗逆相關(guān)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示ο
2.權(quán)利要求1所述的增強植物抗逆性的方法，其特征在于所述植物抗性相關(guān)蛋白的 編碼基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；2)與SEQID NO :2序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述抗逆相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胫参锝M織、 細(xì)胞或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植 物。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)載體的特征是用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體 的出發(fā)載體是一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微 彈轟擊的載體，或者是可在原核生物中復(fù)制的載體。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述表達(dá)載體的特征是用所述抗逆相關(guān)蛋白編碼基 因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，用一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子來驅(qū)動其表 達(dá)。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述出發(fā)載體為pCAMBIA系列載體，優(yōu)選為 PCAMBIA1300。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述增強植物的抗逆性是指增強植物耐受低溫、干旱 和高鹽的能力。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗逆相關(guān)蛋白可用于增強轉(zhuǎn)基因水稻的耐逆性。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述增強轉(zhuǎn)基因水稻的耐逆性是指增強了水稻對低 溫、干旱和高鹽的耐受性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個來源于水稻的與耐逆性相關(guān)的PHD-finger家族轉(zhuǎn)錄因子基因KT496。實驗證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對低溫、高鹽和干旱脅迫的耐受性。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/29GK102127551SQ20101056604
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者劉春霞, 劉雨, 周君莉, 李早霞, 李曉娟, 王喜萍 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司