專利名稱：一種用于降解農藥的基因工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種用于降解農藥的基因工程菌(genetically engineered bacteria, GEB)，具有涉及一種具有紅色熒光特性和農藥降解活性及可誘導性自殺能力的基因工程菌及其構建和應用。
背景技術：
隨著化學農藥在生產中的廣泛應用，人們對農藥引起的殘留和相應的環(huán)境污染問題也越發(fā)關注。如何去除環(huán)境中的農藥殘留一直是眾多科研人員致力研究的課題。應用基因工程微生物(又稱為遺傳工程微生物，genetically engineeredmicroorganisms, GEMs)所具有的對化學農藥的降解功能以去除農藥殘留是有效而經濟的方法。盡管GEMs具有廣闊的應用前景，許多具有特定功能的GEMs在實驗條件下也表現(xiàn)出了很好的功能特性，但是真正用于生產實際的GEMs卻很少，因為GEMs與化學物質不同，它是一種能夠自我復制的實體，一旦釋放入環(huán)境中，便可以自我繁殖，持續(xù)存在，一旦發(fā)現(xiàn)它們有不利的效應，想要徹底消除它們卻極其困難?？梢?，GEMs是一把雙刃劍，將其釋放到環(huán)境中，可以發(fā)揮有益的作用，但同時又有可能影響環(huán)境中原有的生態(tài)系統(tǒng)，如干擾土著菌的分布、通過水平轉移與土著菌交換遺傳物質等，這樣會形成新的生物污染，給自然生態(tài)系統(tǒng)和人類健康帶來潛在威脅。我國的基因工程研究發(fā)展比較迅速，目前已有一定數量的GEMs的釋放，但對GEMs的生態(tài)學和釋放到環(huán)境中后的安全性研究尚未見較深入的研究報道。無論是將GEMs釋放到環(huán)境中，還是要將它們從環(huán)境中消除，都需要對GEMs的存在、分布以及遠期效應進行監(jiān)測。因此，有必要建立一個用于控制環(huán)境中的GEMs安全性的監(jiān)測體系?，F(xiàn)代分子生物學方法和技術的興起，為GEMs的環(huán)境監(jiān)控提供了有力工具。目前，已有的監(jiān)測方法，包括PCR法(Amici et al. ,1991 ；Khan etal.，1998)、單克隆抗體法(Ramos-Gonzalez et al. ,1992)、螢光素酶法(Rattray et al.，1990 ；Heller et al.， 1992 ；Ripp et al.，2000)等，在監(jiān)測時都需要有特殊的裝置或底物，實際應用受到很大限制。利用熒光蛋白標記的方法進行監(jiān)測是一簡便可行的方法，不需要任何底物或輔助因子的添加，檢測簡單，而且生物體發(fā)光能夠進行持續(xù)的實時監(jiān)測。GEMs的安全使用不僅需要具有方便的監(jiān)測系統(tǒng)，還需要具有安全控制系統(tǒng)， 即為減少GEMs的潛在危險性，研究人員設計了主動生物防御(active biological containment, ABC)體系，以便在需要的時候減少或消除GEMs的存在。雖然ABC不能保證 100%的生物防范率，但它確實有助于減少GEMs的潛在危險性。1987年，Molin等利用色氨酸啟動子控制自殺基因hok的表達成功進行細菌條件性自殺實驗(Molin et al. , 1987)； 1991年，Contreras等正式提出ABC設想(Contreras et al.，1991)，這種ABC系統(tǒng)主要是通過對自殺基因的調控性表達來控制細胞存活的，例如通過化學底物或物理條件的改變來控制自殺基因的表達從而控制GEMs的存活。采用何種方式控制細胞死亡關鍵是在于自殺基因上游的可誘導啟動子的選擇。此后，ABC系統(tǒng)的研究有了較快發(fā)展，用于ABC體系的自殺基因的種類越來越多，ABC模式也越來越完善。目前已經有多種自殺基因用于ABC系統(tǒng)， 它們通過不同的機制導致細胞死亡，如破壞細胞膜、引起細胞裂解、分解細胞遺傳物質等。雖然經過近20年的研究和不斷改造，GEMs的ABC系統(tǒng)的防御能力已經得到大大提高，但其實際應用還有待進一步的研究，因為在體外具有高效的自殺機制不代表他們在自然環(huán)境中也具有同樣的作用，細胞的生理狀態(tài)在體外實驗和現(xiàn)實環(huán)境中可能很不相同， 對誘導劑以及自殺機制的敏感性也有可能不同。如何將ABC系統(tǒng)應用于生產實際，真正有效地控制GEMs在環(huán)境中的分布并構建出安全有效的GEMs仍然有待進一步深入研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于降解農藥的基因工程菌。本發(fā)明的另一個目的是提供上述基因工程菌的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于降解農藥的基因工程菌，所述基因工程菌包含1)具有熒光特性和農藥降解活性的雙基因表達質粒；和2)誘導性自殺質粒。優(yōu)選地，所述雙基因表達質粒具有編碼紅色熒光蛋白的基因和編碼有機磷水解酶的基因。優(yōu)選地，所述雙基因表達質粒具有圖IB所示的質粒圖譜。優(yōu)選地，所述雙基因表達質粒具有如SEQ. ID. NO 1所示的堿基序列。優(yōu)選地，所述誘導性自殺質粒具有圖IC所示的質粒圖譜。優(yōu)選地，所述誘導性自殺質粒具有如SEQ. ID. NO 2所示的堿基序列。優(yōu)選地，所述基因工程菌菌株選自大腸埃希氏菌和假單胞桿菌，優(yōu)選為大腸埃希氏菌。另一方面，本發(fā)明提供了上述基因工程菌的構建方法，所述方法以下步驟1)構建具有熒光特性和農藥降解活性的雙基因表達質粒；幻構建誘導性自殺質粒；幻將步驟1) 構建的雙基因表達質粒和步驟2)構建的誘導性自殺質粒共轉染于菌株中，篩選，即得。此外，本發(fā)明還提供了由上述基因工程菌制備的細胞液體培養(yǎng)物，以及由上述基因工程菌制備的全細胞蛋白液。又一方面，本發(fā)明提供了上述基因工程菌，或上述細胞液體培養(yǎng)物，或上述全細胞蛋白液在降解農藥中的應用。此外，本發(fā)明還提供了一種降解農藥的方法，所述方法采用上述基因工程菌，或上述細胞液體培養(yǎng)物，或上述全細胞蛋白液來降解農藥。綜上所述，本發(fā)明提供一種人工構建的具有紅色熒光特性和農藥降解活性及可誘導性自殺能力的基因工程菌，該菌可用于去除農藥殘留，并具有紅色熒光能夠方便檢測，具有可誘導性自殺能力能夠進行自我清除的特點。將本發(fā)明提供的基因工程菌(genetically engineered bacteria, GEB)命名為GEB-SR0，該GEB-SRO菌由攜帶紅色熒光蛋白基因及有機磷水解酶基因的雙表達質粒pL-DsRed-pL-OPH[大腸埃希氏菌(Escherichia coli) EC-DGEP-LMT001，已于2009年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所)，其保藏號CGMCCNo.觀81，具體可參見專利申請200910091287. 2]和攜帶自殺基因雙拷貝的自殺質粒 PDS共轉化入E. ColiBL21AI 表達菌構成。具體地，所述制備方法如下采用氯化鈣法制備 E. coli BL21AI 表達菌感受態(tài)，轉化pL-DsRed-pL-OPH入E. coliBL21AI 表達菌感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂板上，28°C過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆搖菌將其制備成感受態(tài)， 將自殺質粒PDS轉化入此感受態(tài)中，涂布于含卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板上， 過夜培養(yǎng)，平板上生長的單克隆即為具有自殺機制及紅色熒光標記和OPH活性的基因工程菌Gra-SRO菌。通過實驗驗證了本發(fā)明提供的GEB-SRO菌株具有以下特征1)有機磷水解酶活性，可用于有機磷農藥的去除；2)紅色熒光特征，不需要任何底物或輔助因子的添加即可進行檢測，方法簡單，而且能夠進行持續(xù)的實時監(jiān)測；3)可誘導自殺能力，可根據實際情況人為控制其在環(huán)境中的消亡，增強了該菌的環(huán)境使用安全性。因此，本發(fā)明提供了一種具有紅色熒光特性和農藥降解活性及可誘導性自殺能力的基因工程菌，其為將含自殺基因雙拷貝的質粒和與自殺質粒相容的帶有紅色熒光蛋白基因與有機磷水解酶基因的功能質粒共轉于大腸桿菌，篩選得到。這種基因工程菌不僅具有農藥降解活性，可用于環(huán)境中殘留化學農藥降解，而且具有紅色熒光特性可使其在環(huán)境中易被人們發(fā)現(xiàn)，同時還具有可誘導自殺機制可以讓應用者根據實際情況人為控制其在環(huán)境中的消亡，具有廣闊的應用前景。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖IA為本發(fā)明所提供的雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH的質粒構建圖；圖IB為本發(fā)明所提供的雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH的質粒圖譜；圖IC為本發(fā)明所提供的誘導性自殺質粒pDS的質粒圖譜；圖ID為本發(fā)明所提供的誘導性自殺質粒pDS的質粒圖譜的質粒構建圖；圖2為本發(fā)明所提供的雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH轉化E. coliBL21AI 菌株克隆在熒光顯微鏡下觀察的圖片(放大倍數IOx4)，其中A為轉化菌株，B為未轉化菌株；圖3為本發(fā)明所提供的雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH轉化E. coliBL21AI 菌株克隆在日光下的直接觀察圖片，其中A為轉化菌株，B為未轉化菌株；圖4為本發(fā)明egfp基因片段的PCR擴增片段電泳圖；圖5為本發(fā)明pGEM-T-EGFP載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點為EcoR I+BamH I ；圖6為本發(fā)明pBV-EGFP載體的PCR鑒定電泳圖，其中1為egfp基因片段/ pBV-EGFP, 2 為 egfp 基因片段 /pEGFP_N3 ；圖7為本發(fā)明pL-EGFP的PCR擴增片段電泳圖；圖8為本發(fā)明pL-EGFP載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點EcoR I+BamH I，2為酶切位點EcoR I ；圖9為本發(fā)明dsred的PCR擴增片段電泳圖；圖10為本發(fā)明pGEM-T-DsRed載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點為EcoR I+BamH I ；
圖11為本發(fā)明pL-DsRed載體的PCR驗證電泳圖，其中1為dsred片段/ pDsRed-Nl,2 為 dsred 片段 /pL-DsRed ；圖12為本發(fā)明PL-DsRed載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點EcoR I+BamH I，2為酶切位點EcoR I ；圖13為本發(fā)明opd的PCR擴增電泳圖； 圖14為本發(fā)明pGEM-T-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中酶切位點為Hind IIMho I ；圖15為本發(fā)明pL-OPH載體的PCR驗證電泳圖，其中1為opd基因片段/ pGEM-T-opd, 2 為 opd 基因片段 /pL-OPH ；圖16為本發(fā)明pL-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點BamH 1，2為酶切位點 Pst I+BamH I ；圖17為本發(fā)明pL-DsRed片段的PCR擴增電泳圖；圖18為本發(fā)明Promoter-OPH-terminator片段的PCR擴增電泳圖；圖19為本發(fā)明pL-DsRed-pL-ΟΡΗ載體的PCR驗證電泳圖，其中1為dsred和 opd 基因片段 /pL-DsRed-pL-0PH, 2 為 opd 基因片段 /pGEM-T-opd，3 為 dsred 基因片段 / pDsRed-Nl ；圖20為本發(fā)明pL-DsRed-pL-OPH載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為酶切位點Nco I，2為酶切位點Me I ；圖21為本發(fā)明去除前導肽序列的krratia marcescens核酸酶基因nuc的PCR 擴增，其中1為nuc基因PCR擴增片段，M為Marker ；圖22A為本發(fā)明pET-Nuclease載體的PCR擴增電泳圖，其中1為以pAH12為模板擴增的nuc PCR片段，2為以pET-Nuclease為模板擴增的nuc PCR片段，M為Marker ；圖22B為本發(fā)明pET-Nuclease載體的酶切驗證電泳圖，其中1為ρΕΤ_2^經)(ho I單酶切線性片段，2為pET-Nuclease經Β ο I單酶切線性片段，M為Marker ；圖23為本發(fā)明pl5A和Kanamycine-Nuclease-T7片段的PCR擴增電泳圖，其中1 為 pl5A 的 PCR 擴增片段，2 為 Kanamycine-Nuclease-T7 的 PCR 擴增片段，M 為 Marker ；圖M為本發(fā)明pGEM-T-p 15A載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為pGEM_T-p 15A經 Pst I和Nde I雙酶切后片段，M為Mark ；圖25A為本發(fā)明pSS載體的PCR擴增電泳圖，其中1為以pSS為模板擴增的pl5A PCR片段，2為以pLysS為模板擴增的pl5A PCR片段，M為Marker ；圖25B為本發(fā)明pSS載體酶切鑒定電泳圖，其中1為pSS經I^st I單酶切線性片段，M 為 Marker ；圖26為本發(fā)明Nuclease_T7的PCR擴增電泳圖，其中1為Nuclease_T7的PCR擴增片段，M為Marker ；圖27為本發(fā)明pGEM-T-Nuclease-T7的酶切鑒定電泳圖，其中1為 pGEM-T-Nuclease-T7 經 BamH I 和 Pst I 雙酶切后片段，M 為 Marker ；圖觀為本發(fā)明pDS載體的酶切鑒定電泳圖，其中1為PDS經I^st I單酶切片段， M 為 Marker ；圖29A和圖29B分別為本發(fā)明GEB-SRO菌培養(yǎng)14h及放置9d過程中的菌液密度測定值。圖30A和圖30B分別為本發(fā)明GEB-SRO菌培養(yǎng)14h及放置9d過程中的菌液熒光
強度測定值。圖31為熒光顯微鏡下(A和B)及日光下(C和D)觀察GEB-SRO菌和普通菌菌落的熒光檢測圖。圖32為本發(fā)明提供的GEB-SRO菌自殺機制啟動生長曲線。圖33為本發(fā)明提供的GEB-SRO菌自殺效果平板實驗結果圖。圖34為本發(fā)明提供的對硝基苯酚的標準曲線。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中所使用的技術，包括PCR、酶切等分子生物學手段，以及菌株培養(yǎng)、轉化、檢測技術等，除非特別說明，均為本領域的技術人員已知的常規(guī)技術；所使用的儀器設備、試劑、菌株等，除非是本說明書特別說明，均為本領域的研究和技術人員可以通過公共途徑獲得的。以下各實施例中所涉及的具體實驗操作方法在此說明如下1、50 μ LPCR擴增體系的配制如下總體積50 μ L，含0. 1 IOng質粒，1 XPCR緩沖液(含Mg2+)，上下游引物各 0. 8 μ mol/L, 0. 2mmol/LdNTP, 2. 5UDNA 聚合酶。2、瓊脂糖凝膠電泳，具體方法參照《分子克隆》(第三版)Sambr00kJ，Russell Dff(2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，采用TAE電泳緩沖液，溴化乙錠染色標記，溴酚藍為指示劑。3、DNA凝膠純化回收采用DNA凝膠純化回收試劑盒(購自北京鼎國生物技術有限公司)，具體操作如下1)將無石蠟油的PCR反應液或酶切反應液在的普通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的DNA條帶裝入1. 5mL離心管中，加入溶液A (膠重/溶液體積=1/3)。2) 50°C保溫10分鐘，每2分鐘顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。待溶化后置室溫加入15 μ L溶液B，充分混勻。3)將混和液轉移入離心柱，靜置2分鐘，12000r/分鐘離心30秒，倒掉收集管中的廢液。4)加入500 μ L溶液C于離心柱中，12000r/分鐘離心30秒，倒掉收集管中的廢液。5)重復步驟4) 一次。6) 12000r/分鐘離心1分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精。7)將離心純化柱套入干凈的1. 5mL離心管中，開蓋放置5 10分鐘，使乙醇充分揮發(fā)干凈。8)加入20 30 μ L溶液D (或滅菌去離子水)，靜置2分鐘后，12000r/分鐘離心 30秒。離心管中的液體即是純化的DNA片段，取4μ L電泳(0. 8%瓊脂糖，120V, 10分鐘)檢測并目測定量。-20°C保存?zhèn)溆谩?、T/A克隆方法如下PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒回收后，進行加A反應，10 μ L體系中含6 μ LPCR 回收片段，1\ 0 緩沖液，0.8讓01/1 dNTP，0. 5U iTaqDNA聚合酶，在PCR儀上72°C運行20 分鐘，然后直接取反應液與T載體進行連接。連接體系10 μ L，包括5 μ L 2 X緩沖液，1 μ LT 載體DNA(SOng)JyL加A片段，IyLT 4DNA連接酶，4°C連接過夜。取5μ L連接產物加入到100 μ L感受態(tài)細菌TOP 10中，冰浴30分鐘，42°C熱擊90秒，立即冰上放置3分鐘，加入 950 μ L液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)Ih后，5000g離心1分鐘，棄上面培養(yǎng)液，保留150 μ L 培養(yǎng)液懸浮菌體，均勻涂布在含IPTG/X- β -gal/氨芐青霉素的LB平板上，倒置平板于37°C 培養(yǎng)16 20小時后，將平板于4°C放置1 2小時，使藍色顯現(xiàn)清楚，挑取白色菌落搖菌鑒定。5、大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)及轉化方法參照《分子克隆》 (第三版)Sambrook J, Russell Dff (2001)Molecular cloning :ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,具體操作如下1)從37°C培養(yǎng)16 20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑2 3mm)，轉到含有IOOmL LB培養(yǎng)基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約3小時。為得到有效轉化，活細胞數不應超過IO8個/mL，可每隔20 30分鐘測量0D600值來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況， 待菌液0D600達到0. 35時開始收獲細菌培養(yǎng)物。2)在無菌條件下將細菌轉移到用冰預冷的50mL無菌聚丙烯管中，在冰上放置10 分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°c。3)于4°C用SorVaUGS3轉頭(或與其相當的轉頭)以4100r/分鐘離心10分鐘， 以回收細胞。4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5)每50mL初始培養(yǎng)物用30mL預冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重懸。6)于4°C以4100r/分鐘離心10分鐘，回收細胞。7)倒出上清，將管倒置1分鐘以使最后殘留的液體流盡。8)每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預冷的0. lmol/LCaCl2懸浮。9)用冷卻的無菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200 μ L轉移到無菌微量離心管中， 加入DNA(體積小于10μ L，DNA含量小于50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。10)將管放到預加溫到42°C的循環(huán)水浴中放置90秒(其間不要搖動)。11)快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1 2分鐘。12)向管中加入800 μ LLB培養(yǎng)基，然后將管轉移到37°C搖床上溫和搖動(轉速不超過225r/分鐘)，溫育45分鐘使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。13)離心濃縮細胞，然后用適量LB輕輕重懸細胞，將適當體積(每個90mm平板可達200 μ L)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含相應抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。14)將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12 16小時后可出現(xiàn)菌落。6、質粒的小量提取(SDS堿裂解法)方法參照《分子克隆》(第三版)SambrookJ，Russell DW(2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，具體操作如下1)挑轉化后的單克隆菌落于3mL含抗生素的LB培養(yǎng)基(50 μ g/L抗生素)中于 37°C劇烈振搖培養(yǎng)過夜。2)將1. 5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4°C以12000g離心30秒，
棄上清，使細菌沉淀盡可能干燥。3)將所得細菌沉淀重懸于100 μ L預冷的溶液I (溶液成分為25mmol/ LTris-HCl (pH8. 0)，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)中，劇烈振蕩，使細菌沉淀在溶液I
中完全分散。4)加200 μ L新配制的溶液II (溶液成分為:200mmol/L NaOH, 1 % SDS)，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，將離心管放置于冰上。5)力Π 150 μ L預冷的溶液111(溶液成分為3mol/L醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8)， 蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3 5分鐘。6)用微量離心機于4°C，12000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。7)加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，于-20°C放置30分鐘。用微量離心機于 4°C以12000g離心10分鐘。8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。9)用ImL 70%乙醇洗滌沉淀，按步驟8)所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥8分鐘。10)加入40 μ L含20 μ g/mL RNaseA的滅菌去離子水溶解沉淀，37°C保溫30分鐘后放入_20°C保存?zhèn)溆谩?、酶切反應單酶切反應體系總體積20 μ L，質?；駾NA片段約500ng，內切酶1 μ L，10Χ緩沖液2 μ L，用滅菌去離子水補足體積至20 μ L0 37°C保溫4小時，取5 μ L酶切產物進行電泳鑒定，繼續(xù)酶切反應直至酶切完全。雙酶切反應體系總體積20yL，質粒或DNA片段約500 μ g，兩種內切酶各 0.8yL,10X緩沖液2 μ L，用滅菌去離子水補足體積至20 μ L。37°C保溫4h，取5 μ L酶切產物進行電泳鑒定，繼續(xù)酶切反應直至酶切完全。實施例1 載體PL-EGFP的構建本實施例為載體pL-EGFP的構建，包括先進行EGFP基因片段的PCR擴增及克隆、 然后構建出載體pBV-EGFP，擴增出其中的pL-EGFP片段后，最終構建出載體pL_EGFP，具體的操作步驟詳述如下(I)EGFP基因片段的PCR擴增及T/A克隆①egfp基因片段的PCR擴增以pEGFP_N3 (Clotech公司)為模板，擴增egfp基因片段，717bp。采用pfuDNA聚合酶(Promega公司)，擴增體系50 μ L，上游引物序列為5，_G GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT (EcoR I)，下游引物序列為 5，-TTGGATCCCTTGTACAGCTC GTCCATGCCGAG (BamH I)，PCR 擴增參數設置為94°C 預變性 3 分鐘；94°C，30 秒 /68°C 80 秒(25個循環(huán))；72°C 10分鐘。擴增片段的進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示；②egfp基因片段的純化回收采用瓊脂糖凝膠電泳純化并回收egfp基因片段；③構建質粒pGEM-T-EGFP 將回收的egfp基因片段進行加A反應后，與 pGEM-TEasy載體(Promega公司)連接構建質粒pGEM_T_EGFP (加A反應及連接的具體操作見!Iomega公司的使用說明書)；④酶切鑒定采用EcoR I和BamH I雙酶切質粒pGEM_T_EGFP可以得到egfp片段，酶切鑒定電泳結果如圖5所示。(2)載體 PBV-EGFP 的構建①酶切處理質粒pBV 220 (中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所)和pGEM_T_EGFP的純化產物分別經EcoR I和BamH I雙酶切處理，凝膠電泳回收純化目的條帶；②構建質粒pBV-EGFP:連接體系25yL，包括2. 5yL 10XT4DNA連接酶緩沖液， IOOng酶切pBV 220載體后的回收片段，IOOng酶切pGEM-T-EGFP后的回收片段，1 μ LT4DNA 連接酶，16°C連接20小時。③轉化質粒pBV-EGFP 用連接產物轉化E. coli DH 5 α (購自北京天根公司)，涂布在含氨芐青霉素(50yg/mL，下同)的LB瓊脂板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于含氨芐青霉素的液體LB中(體積5mL，下同)，在37°C下200 250r/分鐘過夜培養(yǎng)。④鑒定取1. 5mL菌液進行質粒小量提取，25倍稀釋原質粒作為PCR模板，通過PCR驗證可以擴增出egfp基因片段，電泳結果如圖6所示，其中1為pBV-EGFP，2為 PEGFP-N3。電泳結果證明所得質粒為目的質粒pBV-EGFP。(3)載體 pL-EGFP 的構建①pL-EGFP片段的PCR擴增以pBV-EGFP為模板，采用PCR擴增pL_EGFP片段， 3624bp。采用pfuDNA聚合酶，擴增體系50 μ L，上游引物序列為5' -TTCGAGCTCCGTGCGTGTT GACTATTTTACCT (Sac I)，下游引物序列為 5，-GCTCTAGATCGGCAAGGTGTTCTGGTC(Xba I) ,PCR 擴增參數設置為94°C預變性3分鐘；94°C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分鐘10秒(25個循環(huán))；72°C，10分鐘。擴增片段的電泳結果如圖7所示；②pL-EGFP片段的純化回收利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR擴增的 pL-EGFP 片段；③pL-EGFP片段的磷酸化，連接及轉化1)磷酸化利用T4多核苷酸激酶(購自大連寶生物工程公司)磷酸化PCR產物 pL-EGFP片段末端，按如下體系配置反應管PCR產物片段約25pmol/L，5yL 10XT4多核苷酸激酶緩沖液，1 μ L 10mmol/LATP, 1 μ LT4多核苷酸激酶，用滅菌去離子水補充體積至 50 μ L0 37°C，反應30分鐘。然后65°C，20分鐘滅活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次；2)連接進行自身環(huán)化連接，體系如下磷酸化的PCR產物lOOng，1 μ L10XT4DNA 連接酶緩沖液，0. 5 μ LT4DNA連接酶(購自大連寶生物工程公司)，1. 5 μ L30% PEG8000，用水補足體積至10 μ L。16°C，反應20小時；3)轉化及鑒定取SyL連接產物轉化E. coli DH5 α，涂布在含氨芐青霉素的LB 瓊脂板過夜培養(yǎng)。挑取單克隆入含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于過夜培養(yǎng)。次日，取菌液ImL離心沉淀菌體，菌體顏色呈現(xiàn)明顯綠色的即為所要克隆的菌體，提取質粒，并用EcoR I和BamH I進行酶切鑒定，所得條帶大小與預期一致，電泳結果如圖8所示，其中1為酶切位點EcoR I+BamH I，2為酶切位點EcoR I，說明pL_EGFP質粒構建成功。實施例2 雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH的構建本實施例為雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH的構建，包括先分別構建并擴增出質粒pL-DsRed和質粒pL-OPH后，連接構建出雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH，其質粒構建圖如圖IA所示，相應的質粒圖譜如圖IB所示，具體的操作步驟詳述如下(1)質粒 pL-DsRed 的構建①DsRed基因片段的PCR擴增及T/A克隆以pDsRed-Nl (購自Clontech公司) 為模板，擴增DsRed基因片段，其堿基序列如SEQ. ID. N03所示，690bp。采用pfuDNA聚合酶， 擴增體系50 μ L，PCR擴增參數設置為94°C預變性3分鐘-MV，30秒/57°C，30秒/72°C， 90秒(25個循環(huán))；72°C，10分鐘。擴增片段的電泳結果，如圖9所示；上游引物序列為5’ -GGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGA (EcoR I)，下游引物序列為 5’-CGGGATCCCTCATTACTACAGGAA CAGGTGGTGGC(BamH I)；②DsRed基因片段的純化回收電泳純化回收PCR電泳擴增的DsRed基因片段；③質粒pGEM-T-DsRed的構建進行加A反應后與pGEM_TCasy載體連接構建質粒 pGEM-T-DsRed；④酶切鑒定利用EcoR I和BamH I雙酶切構建的質粒pGEM-T-DsRed，酶切鑒定電泳結果如圖10所示。⑤質粒PL-DsRed的構建1)酶切處理采用EcoR I和BamH I雙酶切處理pGEM-T-DsRed和pL_EGFP ；2)純化回收凝膠電泳純化回收目的條帶；3)構建pL-DsRed載體進行連接；4)驗證利用PCR擴增DsRed基因進行驗證，電泳結果如圖11所示，其中1為 pDsRed-Nl，2為pL-DsRed ；同時利用EcoR I和BamH I進行雙酶切鑒定，可見雙酶切可切出 DsRed基因片段(690bp)，EcoR I單酶切所得線性化條帶也與預期一致(36Mbp)，電泳結果如圖12所示，其中1為酶切位點EcoR I+BamH I，2為酶切位點EcoR I。( 質粒pL-OPH的構建①OPH基因片段的PCR擴增及T/A克隆以質粒pGEM-T-opd (中科院動物研究所) 為模板擴增OPH的基因opd，其堿基序列如SEQ. ID. NO 4所示，1098bp。采用pfuDNA聚合酶， 擴增體系50 μ L，PCR擴增參數設置為94°C預變性3分鐘；94°C，30秒/57°C，35秒/72°C， 2分鐘(25個循環(huán))；72°C，10分鐘。擴增片段的電泳結果如圖13所示；②opd基因片段的純化回收電泳純化回收PCR電泳擴增的opd基因片段；③質粒pGEM-T-OPH的構建進行加A反應后與pGEM-TCasy載體連接構建質粒 pGEM-T-OPH ；④酶切鑒定利用BamH I和I^st I雙酶切構建的質粒pGEM-Τ-ΟΡΗ，酶切鑒定電泳結果如圖14所示。⑤質粒pL-OPH的構建1)酶切處理采用BamH I和I3St I雙酶切處理pGEM-T-OPH和載體pBV 220 ；2)純化回收凝膠電泳純化回收目的條帶opd ；3)構建pBV-OPH載體進行連接；
4)構建pL-OPH載體用EcoR I和I3St I雙酶切處理pBV-OPH切出opd基因，與用EcoR I和I^st I雙酶切的載體pL-EGFP進行連接構建pL_0PH載體；5)驗證利用PCR擴增opd基因進行驗證，電泳結果如圖15所示，其中1為 pGEM-T-opd，2為pL-OPH ；同時利用EcoR I和I^st I進行雙酶切鑒定，電泳結果如圖16所示，其中1為酶切位點BamH I，2為酶切位點Pst I+BamH I。(3)雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-ΟΡΗ的構建①pL-DsRed 片段和 Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 擴增DpL-DsRed片段的PCR擴增以pL-DsRed為模板采用PCR擴增pL-DsRed片段， 3615bPo采用pfuDNA聚合酶，擴增體系50 μ L，PCR擴增參數設置為94°C預變性3分鐘； 940C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分鐘10秒(25個循環(huán))；72°C，10分鐘。電泳結果如圖17 所示。2)Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 擴增以 pL_0PH 為模板采用 PCR 擴增 Promoter-OPH-terminator 片段，2002bpo 采用 pfuDNA 聚合酶，擴增體系 50 μ L, PCR 擴增參數設置為94°C預變性3分鐘；94°C，40秒/53°C，35秒/72°C，4分鐘30秒(25個循環(huán))； 72°C, 10分鐘。電泳結果如圖18所示。②雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-ΟΡΗ的構建1)純化回收利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化pL-DsRed和 Promoter-OPH-terminatorPCR 擴增片段；2)磷酸化利用T4多核苷酸激酶磷酸化ftOmoter-OPH-terminator片段末端。 按如下體系配置反應管PCR產物片段約25pmol/L，5 μ LlO X Τ4多核苷酸激酶緩沖液，1 μ L 10mmol/LATP, 1 μ L T4多核苷酸激酶，用滅菌去離子水補充體積至50 μ L。37°C，反應30分鐘。然后65°C，20分鐘滅活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次。3)連接進行連接的體系如下=PL-DsRed片段純化產物lOOng，磷酸化 Promoter-OPH-terminator 片段 lOOng, 1 μ L 10ΧT4DNA連接酶緩沖液，0. 5 μ L T4DNA連接酶，1.5yL 30% PEG8000，用水補足體積至 10μ L。16°C，反應 20h。4)轉化及鑒定取8 μ L連接產物轉化Ε. coli DH 5 α ,涂布在含氨芐青霉素的 LB瓊脂板過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于3mL含氨芐青霉素的液體LB中28 V 200 250r/分鐘過夜培養(yǎng)。取1. 5mL菌液進行質粒小量提取，25倍稀釋原質粒作為PCR模板，同時擴增DsRed基因片段和opd基因片段，進行PCR驗證，電泳結果如圖19所示，其中1為 pL-DsRed-pL-ΟΡΗ, 2 為 pGEM-T-opd，3 為 pDsRed-Nl ；分別利用 Sac I 和 Nco I 進行單酶切驗證，電泳結果如圖20所示，其中1為酶切位點Nco I，2為酶切位點Mc I。實施例3 誘導性自殺質粒pDS的構建本實施例為導性自殺質粒pDS的構建，可參見文獻Li Q, Wu YJ. Af Iuorescent genetically engineered micro-organism that degradesorganophosphates and commits suicide when required. Applied Microbiologyand Biotechnology.2009, 82(4) :749-756,在此詳述如下。(1)自殺基因雙拷貝質粒pDS的構建①引物的設計與合成設計引物以pAH12為模板擴增去除前導肽序列的krratia marcescens核酸酶基
12因nuc插入pET-28b載體中T7啟動子下游構成pET_Nuclease，再設計引物以pET_Nuclease 為模板擴增含卡那霉素抗性基因，krratia核酸酶基因和T7啟動子的片段，將該片段與以pLysS為模板擴增的含pl5A復制子序列的片段連接形成含單拷貝自殺基因的自殺質粒 PSS，再設計引物擴增含T7啟動子和自殺基因的片段插入pSS形成自殺基因的第二拷貝，構成含自殺基因雙拷貝的自殺質粒PDS。②載體pET-Nuclease的構建1)自殺基因片段的PCR擴增以質粒pAH12 (德國奧爾登堡大學贈送)為模板擴增去除前導肽序列的krratia marcescens核酸酶基因nuc (741bp)，采用pfu DNA聚合酶，擴增體系50 μ L，上游引物序列 5，-CATGCCATGGCAGCCGACACGCTCGAATCCAT (Nco I)，下游引物序列5，-CCGCTCGAGTCAGTTTTT GCAGCCCATCAACT (Xho I)。PCR 擴增參數設置為94°C 預變性 3min ;94°C，40s/68°C，90s Q5 個循環(huán))；72°C，10min。擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖21所示，可見，nuc基因 PCR擴增片段大小與預期一致。2)載體 pET-Nuclease 的構建載體pET_28b (Novagen公司)和核酸酶基因nuc的PCR純化產物分別經Nco I 和B10 I雙酶切處理，利用DNA凝膠回收試劑盒(購自北京鼎國生物技術有限公司)回收純化目的條帶，進行連接反應，連接產物轉化E. C0liDH5a，涂布于LB瓊脂板(含卡那霉素 50yg/mL，下同，特別指明者除外)，37°C過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于液體LB中(體積5mL， 含卡那霉素，下同，特別指明者除外)，在37°C 200 250r/min過夜培養(yǎng)。取1. 5mL菌液進行質粒小量提取，25倍稀釋原質粒作為PCR模板，擴增nuc片段，進行PCR鑒定，擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖22A所示，可見以pET-Nuclease為模板可以擴增出nuc片段。同時利用內切酶》ιο I對所提質粒進行單酶切鑒定，酶切鑒定電泳結果如圖22B所示， 可見，用Bio I對其進行單酶切得到與預期一致的線性片段(5980bp)，PCR及酶切驗證說明載體pET-Nuclease構建成功。③自殺基因單拷貝質粒pSS的構建l)Kan-Nuclease-T7片段和pl5A片段的PCR擴增及T/A克隆以質粒pET-Nuclease為模板擴增含卡那霉素抗性基因，krratia核酸酶基因和 T7啟動子的片段Kan-Nuclease-T7，采用pfu DNA聚合酶，擴增體系50 μ L，上游引物序列 5，-AACTGCAGAACTACGGCTACACTAGAAGGACAG (Pst I)，下游引物序列5，-GGAATTCCATATGGTA GTAGGTTGAGGCCGTTGAG (Nde I)。PCR 擴增參數設置為94°C 預變性 3min ;94°C，40s/57°C， 35s/72°C，5min 30s (25個循環(huán))；72°C，IOmin0擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖23 所示，可見擴增片段大小與預期一致0934bp)。以pLysS為模板擴增含pl5A復制子序列的片段pl5A，采用ExTaq DNA聚合酶，擴增體系 50 μ L，上游引物序列5’ -AACTGCAGAACCAATGGCATTGCGGATCCCCTTAGCTCCTGAAAATCT CGATA (Pst I-BamHI)下游引物序列5，_GGAATTCCATATGATAGTGACTGGCGATGCTGT (NdeI)。PCR 擴增參數設置為94°C 預變性 3min ；94°C，40s/55 °C，35s/72°C，2min (25 個循環(huán))；72°C, IOmin0擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖23所示，可見擴增片段大小與預期一致 (1529bp)電泳純化回收片段pl5A直接與pGEM-T Easy載體(Promega公司)連接構建質粒pGEM-T-p 15A。利用酶切鑒定陽性克隆，酶切鑒定電泳結果如圖M所示，可見，pl5A復制子序列的PCR產物與T載體連接后經I3StI和Nde I雙酶切后可以切出一段約1500bp的片段以及一段約3000bp左右的片段，前者為pl5A復制子片段，后者為切出的T載體，都與預期一致，說明pGEM-T-pl5A成功構建。2)自殺基因單拷貝質粒pSS的構建片段Kan-Nuclease_T7 的 PCR 純化產物和質粒 pGEM_T_pl5A 分別經 I3St I 和 Nde I雙酶切處理，凝膠電泳回收目的條帶進行連接反應，連接產物轉化E. coli DH5，涂布在LB 瓊脂板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于液體LB中37°C 200 250r/min過夜培養(yǎng)。取 1. 5mL菌液進行質粒小量提取，25倍稀釋原質粒作為PCR模板，擴增pl5A片段進行PCR驗證，上游引物序列5，-AACTGCAGAACCAATGGCATTGCGGATCCCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG ATA (Pst I-BamH I)下游引物序列5，_GGAATTCCATATGATAGTGACTGGCGATGCTGT(Nde I)。擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖25A所示，可見以pSS為模板可以擴增出pl5A片段(1529bp)。 同時利用I3St I對所提取質粒進行酶切鑒定，酶切鑒定電泳結果如圖25B所示，可見單酶切線性化后得到的片段與預期一致G439bp)。PCR及酶切驗證結果說明pSS成功構建。④自殺基因雙拷貝質粒pDS的構建1)片段 Nuclease_T7 的 PCR 擴增及 T/A 克隆以pET-Nuclease為模板擴增含T7啟動子和自殺基因的Nuclease-T7片段，采用 ExTaq DNA 聚合酶，擴增體系 50 μ L,上游引物序列5，-CGGGATCCCGCTGCGCGTAACCACCACA ( BamH I)，下游引物序列5，-AACTGCAGGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACC (Pst I)。PCR 擴增參數設置為:94°C預變性:3min ;941，408/611，358/721，21^11(25個循環(huán))；72°C IOmin0 擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖26所示，可見得到與預期一致的特異性擴增片段(1330bp)。電泳純化回收Nuclease-T7片段后與pGEM-T fesy載體連接構建質粒 pGEM-T-Nuclease-T7。利用BamH I和I^st I雙酶切鑒定。酶切鑒定電泳結果如圖27所示， 可見，在約3000bp處可見有T載體片段，在IOOObp與2000bp之間有目的條帶Nuclease_T7 片段。2)自殺基因雙拷貝質粒pDS的構建質粒pSS和pGEM-T-Nuclease_T7純化產物分別經Pst I和BamH I雙酶切處理，凝膠電泳回收目的條帶，進行連接反應，連接產物轉化E. coliDH5，涂布在LB瓊脂板上，37°C 過夜培養(yǎng)。挑單克隆菌落于液體LB中37°C 200 250r/min過夜培養(yǎng)。取1. 5mL菌液進行質粒小量提取，利用Pst I對所提取質粒進行酶切鑒定。酶切鑒定電泳結果如圖觀所示， 可見單酶切線性化后得到的片段與預期一致(5732bp)。實施例4 GEB-SRO菌的構建本實施例將雙基因表達質粒pL-DsRed-pL-OPH和誘導性自殺質粒pDS共轉染至菌體內，構建出了具有自殺機制及紅色熒光標記和OPH活性的基因工程菌GEB-SRO菌。具體過程如下采用氯化鈣法制備E. coli BL21AI 表達菌感受態(tài)，將構建的pL-DsRed-pL-OPH轉化入E. coli BL21AI 表達菌感受態(tài)，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂板上，28°C過夜培養(yǎng)。次日，挑單克隆搖菌，將其制備成感受態(tài)，將誘導性自殺質粒pDS轉化入此感受態(tài)中，涂布于含卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板上二8°C過夜培養(yǎng)，平板上生長的單克隆即為具有自殺機制及紅色熒光標記和OPH活性的基因工程菌GEB-SRO菌。實施例5 =GEB-SRO菌的紅色熒光特性的檢測挑取在卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板生長的GEB-SRO菌的單克隆置入含卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的液體LB中，于30°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，各菌液分別以2% 比例接種于新的含相應抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，30°C振搖培養(yǎng)，每隔池取樣一次，直至 14h，然后將菌液靜置于30°C，連續(xù)9d，每天取樣一次，測定所有樣品的0D_值和熒光強度值(激發(fā)波長558nm，發(fā)射波長583nm，狹縫寬度5nm)。分別以OD6tltl和熒光強度值為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標繪制曲線。實驗結果表明，將GEB-SRO菌接種在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14小時后，其菌密度0D600 由最初的0. 0933增加為1. 7795(見圖^A)，在這14h內，樣品的熒光強度值有微小差別 (40 150，具體見圖30A)。而菌液連續(xù)放置9天，每天測定的菌液密度和熒光值表明，在菌液放置過程中，菌液密度變化較小(見圖^B)，菌液的熒光強度卻發(fā)生了很大變化，在第9 天時GEB-SRO菌菌樣的熒光強度已達到1000以上，對照菌E. coliBL21AITM的熒光強度幾乎無變化(見圖30B)。另外，取培養(yǎng)14h的GEB-SRO菌樣品進行平板實驗。用無抗生素的LB培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)14h的GEB-SRO菌樣品至OD6tltl為0. 2，然后對該稀釋液作200倍稀釋，取150 μ L最終稀釋液涂布于含卡那霉素與氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板，30°C培養(yǎng)，同時每天在熒光顯微鏡下和日光下觀察平板克隆。當GEB-SRO菌在平板上培養(yǎng)約2d左右，具體如圖31所示，在熒光顯微鏡下就可以觀察到強的紅色熒光(見A，而B為普通菌落對照)，培養(yǎng)大約5d左右， 在日光下用肉眼就可以看到菌落呈現(xiàn)紅色(見C)，明顯區(qū)別于普通菌菌落(見D)。實施例6 =GEB-SRO菌的可誘導自殺能力的檢測挑取在卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板生長的GEB-SRO菌的單克隆入含卡那霉素和氨芐青霉素雙抗的液體LB中，于30°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，各菌液分別以2% 比例接種于新的含相應抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，30°C振搖培養(yǎng)，待菌液OD6tltl達到0. 5 0. 8時，將GEB-SRO菌菌液各分成兩份，其一加入阿拉伯糖誘導劑(終濃度為0. 01 % )，所有菌液均繼續(xù)在30°C培養(yǎng)并每隔池取樣一次，直至14h，測定所有樣品的OD6tltl值，結果如圖 32所示，表明加入誘導劑啟動自殺機制后，GEB-SRO菌的生長明顯減慢，約4h后，其生長停滯。另外，取培養(yǎng)14h的樣品進行平板實驗。用無抗生素的LB培養(yǎng)基稀釋誘導與非誘導菌樣至OD6tltl為0. 2，然后對該稀釋液作200倍稀釋，取150 μ L最終稀釋液涂布于含卡那霉素或氨芐青霉素或者含卡那霉素與氨芐青霉素雙抗的LB瓊脂板，300C過夜培養(yǎng)，次日對平板上的克隆計數，結果見圖33，其中A為未經誘導(即未啟動自殺機制)的GEB-SRO菌涂布于含卡那霉素與氨芐青霉素的平板，可見菌落密布，約20000個克隆以上；B為經誘導 (啟動自殺機制)的GEB-SRO菌涂布于含卡那霉素的平板，C為經誘導(啟動自殺機制) 的GEB-SRO菌涂布于含卡那霉素與氨芐青霉素的平板，D為經誘導(啟動自殺機制)的 GEB-SRO菌涂布于含氨芐青霉素的平板，可見在含有卡那霉素以及雙抗的平板上沒有克隆生長，而在僅含氨芐青霉素的平板上有155士38個克隆。實施例7 =GEB-SRO菌的全細胞蛋白液的有機磷水解酶活性測定1)蛋白質濃度的測定
蛋白質濃度采用Bradford(1976)的方法測定。2)對硝基苯酚標準曲線的制作用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7. 8)將對硝基苯酚稀釋成6個濃度梯度(0、 30、60、90、120、150mmol/L)，分別測定400nm的吸光度值，然后以OD4tltl值為縱坐標，對硝基苯酚濃度為橫坐標，繪制標準曲線(見圖34)。3)轉化菌的OPH活性測定①取30°C培養(yǎng)14h和放置第4d、第8d的菌樣制備全細胞蛋白。②反應體系總體積lmL，50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7. 8)中含10 μ g全細胞蛋白，3 μ L 50mmol/L的有機磷農藥底物對硫磷，混勻。③30°C反應1. 5h后用分光光度計測定OD4tltl值，結果見表1。表1GEB-SR0的全細胞蛋白裂解液的有機磷水解酶活性
權利要求
1.一種用于降解農藥的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含1)具有熒光特性和農藥降解活性的雙基因表達質粒；和2、誘導性自殺質粒。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述雙基因表達質粒具有編碼紅色熒光蛋白的基因和編碼有機磷水解酶的基因。
3.根據權利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述雙基因表達質粒具有圖 IB所示的質粒圖譜；優(yōu)選地，所述雙基因表達質粒具有如SEQ. ID. NO 1所示的堿基序列。
4.根據權利要求1至4中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述誘導性自殺質粒具有圖IC所示的質粒圖譜；優(yōu)選地，所述誘導性自殺質粒具有如SEQ. ID. NO 2所示的堿基序列。
5.根據權利要求1至5中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌菌株選自大腸埃希氏菌和假單胞桿菌，優(yōu)選為大腸埃希氏菌。
6.權利要求1至5中任一項所述基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法以下步驟1)構建具有熒光特性和農藥降解活性的雙基因表達質粒；2)構建誘導性自殺質粒；3)將步驟1)構建的雙基因表達質粒和步驟2)構建的誘導性自殺質粒共轉染于菌株中，篩選，即得。
7.由權利要求1至5中任一項所述基因工程菌制備的細胞液體培養(yǎng)物。
8.由權利要求1至5中任一項所述基因工程菌制備的全細胞蛋白液。
9.權利要求1至5中任一項所述基因工程菌，或權利要求7所述的細胞液體培養(yǎng)物，或權利要求8所述的全細胞蛋白液在降解農藥中的應用。
10.一種降解農藥的方法，其特征在于，所述方法采用權利要求1至6中任一項所述基因工程菌，或權利要求7所述的細胞液體培養(yǎng)物，或權利要求8所述的全細胞蛋白液來降解農藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于降解農藥的基因工程菌及其應用。本發(fā)明提供的用于降解農藥的基因工程菌包含1)具有熒光特性和農藥降解活性的雙基因表達質粒；和2)誘導性自殺質粒。本發(fā)明提供的基因工程菌不僅具有農藥降解活性，可用于環(huán)境中殘留化學農藥降解，而且具有紅色熒光特性可使其在環(huán)境中易被人們發(fā)現(xiàn)，同時還具有可誘導自殺機制可以讓應用者根據實際情況人為控制其在環(huán)境中的消亡，具有較高的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102465109SQ20101055426
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者伍一軍, 李琴, 李薇 申請人:中國科學院動物研究所