專利名稱：利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag·c0003的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種茶樹菇的鑒定方法，具體來說是一種利 用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法。
背景技術：
茶樹菇(Agrocybe cylindracea)又稱茶新菇、楊樹菇。菇薄柄脆，美味在柄，香淳 脆嫩。茶樹菇的營養(yǎng)豐富，所含蛋白質中有18種氨基酸(8種為人體必須氨基酸)，含有豐 富的B族維生素，茶樹菇中鎂含量高，鎂是能量代謝、組織形成和骨骼發(fā)育的重要物質；同 時富含鋅、鐵等礦物質。茶樹菇中含有的茶樹菇多糖，是深受廣大市民歡迎的菇菌食品。我國食用菌資源豐富，品種比較多，但是食用菌的管理比較混亂。部分生產者有意 或無意的改名，使茶樹菇不同栽培菌種“異種同名、同種異名，，現象普遍存在。這種情況已 極大地損害了育種者和生產者的利益，不但給科學研究和學術交流帶來障礙，而且對規(guī)范 生產和產品質量標準的制定帶來很大困難。優(yōu)質菌種在茶樹菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了茶樹菇菌種在茶樹 菇產業(yè)中的重要地位。我國于1999年簽署了《國際植物新品種保護法》，2000年、頒布了《中 華人民共和國種子法》，并于2004年進行了修訂，中華人民共和國農業(yè)部第62號令頒布了 《食用菌菌種管理辦法》，這些法律、法規(guī)的實施，增強了我們對品種知識產權的保護意識， 有力地推動了我國食用菌良種選育和知識產權保護工作。然而這些法律的有效實施，需要 強有利的技術作支撐，就要求我們對現有的種質資源進行清查，進一步加快菌種鑒定技術 的研究。同時隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現，對茶樹菇栽培菌株質量的要求越來越 高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。本專 利可為茶樹菇種質資源的利用和新品種的登記工作引進更為有效的菌種鑒定體系，以及加 強對我國茶樹菇種質資源的保護工作都具有重要意義?，F有技術中茶樹菇的鑒定方法通常是采用形態(tài)學檢測、拮抗試驗和出菇試驗 方法。常規(guī)的拮抗試驗中，拮抗表現形式至少有3種，甚至更多，有時表現形式不明顯，還受 培養(yǎng)環(huán)境的影響，拮抗表現不僅在種內的不同品種之間會出現，同時在種間的菌株之間也 會表現出來，給準確判斷造成困難；出菇試驗更容易受到環(huán)境、時間等各方因素的影響，重 復性差，加大了檢測困難；形態(tài)學檢測在同一屬種內的不同品種之間可區(qū)別的特征少，有些 甚至沒有什么差異，同時還需要判斷者具有豐富的知識與經驗，方可做出準確的判斷。因此 上述的鑒定方法需要很大的人力和物力，當品種多時可能使得認定工作無法進行。常規(guī)的 拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，常規(guī)形態(tài)學檢測和出菇試驗則需要至少2個月的時 間。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法，所述的這種 利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法要解決現有技術中鑒定茶樹菇的方法復雜、需要大量的人力和物力、鑒定時間長的技術問題。本發(fā)明提供了一種利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法，包括一個培 養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個 對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR-PCR擴增的步驟，一個對SCAR-PCR擴增的產物進 行凝膠電泳的步驟，反應結束后根據凝結電泳判定結果，在所述的一個對待檢測的茶樹菇 菌種的DNA進行SCAR-PCR擴增的步驟中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 示(SEQ ID NO :1)，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示(SEQ ID NO :2)。進一步的，在所述的一個對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR-PCR擴增的步驟 中，SCAR-PCR 擴增的反應條件為94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin, 30 個循環(huán)；72 °C 5min。本發(fā)明還提供了一種鑒定茶樹菇Ag. C0003的引物，述的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO 1所示(SEQ ID NO 1 )，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示 (SEQ ID NO :2)。本發(fā)明的檢測方法以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質，不易受外界因素 等的影響，同時它的639bp的顯性標記使的判斷一目了然，減少人為判斷的偏差，大大提高 了準確性。本發(fā)明的方法得到的顯性標記可減少茶樹菇新品種認定的工作量，檢測時該方 法只需要1個陽性菌株和1個陰性菌株對照便可快速比較。本發(fā)明和已有技術相比，其技術效果是顯著的。本發(fā)明的檢測方法的靈敏度 高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，本發(fā)明的檢測方法 所需時間只需要2 — 3天，時間短、準確性高、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。


圖1是采用JG C0003專用檢測引物1 (SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2)對茶樹菇 菌株進行SCAR - PCR擴增圖譜。其中M M為泳道編號；右側的數字表示DNA片段的分子量，第3號泳道的639bp 的特異DNA條帶，為茶樹菇菌種JG C0003的標志。
具體實施例方式實驗試劑
1、CTAB抽提液(pH 8.0) 100 mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl；
2、CTAB沉淀液(ρΗ8·0) 50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA;
3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
4、TE緩沖液10mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
5、0·5XTBE :44· 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA;
6、6X溴酚藍上樣緩沖液0.15%溴酚藍，40%蔗糖；
7、EB 10 mg/ml 溴化乙錠。實施例1 茶樹菇菌絲培養(yǎng)與收集
用接種耙耙碎含菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉接入250 ml三角瓶(含100 ml PDA液體)培養(yǎng)
4基中；
放置在25°C搖床上，轉速9(Tl30 r/min培養(yǎng)疒10 d ； 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干； 稱取0. 8^1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。實施例2 茶樹菇基因組DNA的提取(對菌絲體和子實體均適用)
1、取保存?zhèn)溆玫木zι包或0.8^1. 3g的子實體，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末， 轉入7ml的離心管；
2、加2.5mL 65°C預熱的抽提液，同時加入50 μ 1巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質變性
沉淀；
3、65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩1次；
4、加入2.5 ml的(氯仿異戊醇=24:1)混勻，除去蛋白質； 5,8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7ml 管；
6、加1/5體積65°C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 ml的(氯仿異戊醇=24:1)混勻；
7、10000r/min,4°C離心 lOmin，取上清；
8、加入2.5 ml 65°C預熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih至沉淀可見(可過夜);
9、12000r/min，4°C離心IOmin后，小心去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液(或無菌水)溶解沉淀IOmin ；
11、加入0.25ml飽和酚和0. 25m L (氯仿異戊醇=24:1),混勻；
12,12000 r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻；
13、放置-20°C冰箱Ih(可過夜)；
14、12000r/min，4°C離心 10 min，棄上清；
15、(可選做)加0.5 1 mL 70%乙醇洗滌，12000 r/min，4°C離心8min，棄上清；重
復一次
16、自然風干沉淀，用30μ1TE溶液(或無菌去離子水)溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩嵤├? SCAR-PCR擴增
SCAR-PCR 擴增體系SCAR-PCR 擴增體系為 IOXPCR buffer 2. 5 μ 1，25mmol/L MgCL2 1 μ 1, 2. 5 m mol/L dNTP 2 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ 1,10 μ mol/ L檢測引物各1 μ 1，Ing IOng/ μ 1模板DNA (茶樹菇AG. C0003提取的DNA)和實施例2 提取的待檢測菌種DNA 1 μ 1，ddH20 16.2 μ 1 ；
SCAR-PCR 反應條件為 94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin，30 個循 環(huán)；72°C 5min。實施例4 PCR擴增產物檢測
法一取PCR擴增產物8 μ 1力卩上1. 5 μ 1 6 X溴酚藍上樣緩沖液，混勻，在1. 0%瓊 脂糖凝膠(含GoldviewTMDNA染料)進行電泳，5V/cm恒壓電泳50 min，通過紫外凝膠成像系 統(tǒng)觀察并照像。法二 取PCR擴增產物8 μ L，與1. 5 μ L 6 X溴酚藍上樣緩沖液混勻，點樣于1%的 瓊醋糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm恒壓電泳0. 5 lh，電泳結束后，用EB染色， 然后在凝膠成像儀上照相。結果只有茶樹菇AG. C0003菌株能擴增出分子量為639bp特有的DNA條帶(如
5圖1中箭頭標注所示)。如果擴增出的DNA條帶的大小為639bp，則表示該菌株為茶樹菇 AG. C0003,反之則為其它菌株。
權利要求
一種利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag.c0003的方法，其特征在于包括一個培養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR PCR擴增的步驟，一個對SCAR PCR擴增的產物進行凝膠電泳的步驟，反應結束后根據凝結電泳判定結果，在所述的一個對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR PCR擴增的步驟中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.如權利要求1所述的一種利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag.C0003的方法，其特征在 于在所述的一個對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR-PCR擴增的步驟中，SCAR-PCR擴 增的反應條件為94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C 5min。
3.一種鑒定茶樹菇Ag.c0003的引物，其特征在于所述的上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，提供了一種利用分子標記技術鑒定茶樹菇Ag·c0003的方法，包括一個培養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進行SCAR-PCR擴增的步驟，一個對SCAR-PCR擴增的產物進行凝膠電泳的步驟，反應結束后根據凝結電泳判定結果，本發(fā)明的檢測方法的靈敏度高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)檢測方法相比，本發(fā)明的檢測方法所需時間只需要2－3天，時間短、準確性高、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101962687SQ20101054398
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權日2010年11月15日
發(fā)明者楊開耀, 鄧優(yōu)錦 申請人:上海百茸食用菌有限公司