專(zhuān)利名稱：一種乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸(HBVcccDNA)的方法以及試劑盒的組成。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒家族，其基因組是雙鏈松弛環(huán)狀 DNA (relaxed circu21ar，rcDNA)，相對(duì)分子量為(116 210) X 109 全長(zhǎng)約為 312kb。在 HBV 的生活周期中，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的形成是關(guān)鍵一步，它是HBV的原始復(fù)制模板，對(duì)乙肝病毒的復(fù)制及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義。cccDNA的半衰期約為33 70天，只要肝細(xì)胞中還存在cccDNA，乙肝病毒的復(fù)制就不會(huì)停止，即使在藥物的強(qiáng)烈抑制下，肝細(xì)胞中的cccDNA仍然在少量復(fù)制，因此停用藥物后， ?？梢?jiàn)到患者病情的反復(fù)。只有清除細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底清除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)。乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)方法的建立始于上世紀(jì)80年代。最先采用DNA電泳及Southern雜交檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)存在一種電泳帶位置為2. Okb左右的HBV DNA分子，并在電鏡下證實(shí)為大小約3. 2kb的超螺旋DNA分子。20世紀(jì)90年代，PCR技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于 cccDNA 檢測(cè)。KockOfepatology，1996，23 :405-13)等建立了選擇性 PCR cccDNA 檢測(cè)技術(shù)。 Addison (Antiviral Res 2000 ；48 :27-37)等在此技術(shù)基礎(chǔ)上引入將競(jìng)爭(zhēng)PCR，初步實(shí)現(xiàn)了 cccDNA 的定量檢測(cè)。本世紀(jì)初，香港學(xué)者 He (Biochem Biophys Res Commun 2002 ；295 1102-1107)等建立了選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的定量檢測(cè)。當(dāng)前cccDNA檢測(cè)技術(shù)面臨的主要問(wèn)題是特異性和敏感度，爭(zhēng)論很多。查閱文獻(xiàn)和研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些引人深思的問(wèn)題。比如①國(guó)內(nèi)外不少機(jī)構(gòu)將所在實(shí)驗(yàn)室建立的技術(shù)用于藥物臨床試驗(yàn)，甚至臨床標(biāo)本的檢測(cè)。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公認(rèn)的、較穩(wěn)定并得到相關(guān)部門(mén)正式批準(zhǔn)的HBV cccDNA檢測(cè)試劑盒問(wèn)世；②采用相同或不同技術(shù)研究外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)是否存在cccDNA，所得出結(jié)論截然相反；③不少作者報(bào)告在慢性乙型肝炎的血清內(nèi)檢測(cè)到了高含量HBV cccDNA，個(gè)別報(bào)告甚至高達(dá)107拷貝/ml ！結(jié)果的可信度值得探討；④越來(lái)越多的研究報(bào)告采用cccDNA定量檢測(cè)結(jié)果比較或評(píng)價(jià)抗病毒藥物療效，但是鮮有作者關(guān)注cccDNA檢測(cè)技術(shù)問(wèn)題。建立HBV cccDNA檢測(cè)技術(shù)的難點(diǎn)在于體內(nèi)有大量與cccDNA序列同源性較高的其他形式的HBV DNA存在，包括①成熟病毒顆粒中的松弛、環(huán)狀、雙鏈DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)分子；②在5% 10%的病毒顆粒中存在的雙鏈線性DNA分子(double-strand linear DNA, dsl-DNA)；③由前基因組 RNA(pregenomic RNA, pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄形成的單鏈 DNA(single-stranded DNA, ssDNA)。選擇性熒光定量PCR的設(shè)計(jì)原理是由于rcDNA的正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口，故可以設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物，使rcDNA不會(huì)被擴(kuò)增，而cccDNA 則可被選擇性擴(kuò)增。如模板為dsl-DNA或ssDNA，由于兩條引物的方向相反，也不會(huì)被擴(kuò)增。 但是。更有甚者，有學(xué)者設(shè)計(jì)半套式PCR去檢測(cè)PBMC中的cccDNA，等于把這種非特異擴(kuò)增的概率數(shù)萬(wàn)倍放大了 ！嵌合引物法和侵入分析法區(qū)分rcDNA和cccDNA的主要依據(jù)是rcDNA 的正鏈不完整，因而嵌合引物或初始探針不能與之互補(bǔ)結(jié)合。但是，dsl-DNA分子用兩種方法均是可以被擴(kuò)增的。兩種方法的檢測(cè)低限為50拷貝/反應(yīng)，相當(dāng)于模板濃度為5X IO4拷貝/ml。由于dsl-DNA占總病毒基因組載量的5% 10%，當(dāng)病毒載量超過(guò)5X IO5 1 X IO6 拷貝/ml，就可出現(xiàn)病毒基因組“非特異”擴(kuò)增而出呈假陽(yáng)性。如何克服上述方法的缺陷，需要把握兩點(diǎn)一是要通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定每一種方法能有效區(qū)分cccDNA和其他形式的HBV DNA的“安全”范圍。如筆者實(shí)驗(yàn)室即通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)， 確定總HBV DNA在IO7拷貝/ml (含)以下時(shí)，單用選擇性熒光定量方法檢測(cè)cccDNA是可靠的，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增。二是在“噪聲”背景較高時(shí)，采取有效措施降低其他形式HBVDNA 的含量，從而消除它們對(duì)cccDNA檢測(cè)的影響。根據(jù)cccDNA本身的特殊性是可以提高檢測(cè)特異性的。比如，根據(jù)cccDNA分布特點(diǎn)。cccDNA僅位于細(xì)胞核內(nèi)，而其他幾種DNA分子均位于細(xì)胞漿內(nèi)，可采用細(xì)胞核分離技術(shù)，把細(xì)胞核分離出來(lái)進(jìn)行cccDNA檢測(cè)。另外，其他三種DNA均位于核衣殼蛋白中，且末端與P蛋白共價(jià)結(jié)合，易于與十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合，加氯化鉀后即形成沉淀，通過(guò)離心可加以分離。另外，cccDNA不能被一些酶如綠豆核酸酶(mung bean nuclease, MBN)等降解，而其他形式的DNA可降解。結(jié)合市場(chǎng)需求，本發(fā)明采用專(zhuān)用組織DNA提取試劑盒提取HBV DNA,同時(shí)采用選擇性熒光定量PCR技術(shù)對(duì)乙型肝炎病毒cccDNA進(jìn)行檢測(cè)。在核酸提取結(jié)束后，采用PSAD酶 (Plasmid-Safe ATP-dependent DNase)處理，該操作可以提高檢測(cè)cccDNA的靈敏性和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效提供檢測(cè)靈敏性、特異性的熒光探針實(shí)時(shí)檢測(cè)乙型肝炎病毒cccDNA的方法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)特征在于對(duì)HBV序列分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物，使 rcDNA不會(huì)被擴(kuò)增，而cccDNA則可被選擇性擴(kuò)增。本發(fā)明不僅可用于HBVcccDNA的檢測(cè)，也可作為臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)HBV感染的輔助診斷方法和臨床治療效果的監(jiān)測(cè)手段，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的技術(shù)特征在于，在按下述方法設(shè)計(jì)的引物和探針存在下，用PSAD酶預(yù)處理乙肝病毒DNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBVcccDNA特異性檢測(cè)1、引物和探針的制備根據(jù)HBV全序列，在HBV基因組前C編碼區(qū)，設(shè)計(jì)并合成如下序列的引物PHBV-S、PHBV-AS和探針FPHBV引物 PHBV-S 5， -TCCCCGTCTGTGCCTTC-3， (ntl549_ntl565)弓丨物 PHBV-AS 5， -CCCCAAAGCCACCCAA-3， (ntl904_ntl889)探針FPHBV
5’ -FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMMRA-3’ (ntl567_ntl58》。2、試劑盒包括以下成分一對(duì)特異性引物PHBV、一條特異性熒光探針FPHBV、Taq 酶、Plasmid-Safe ATP-dependent DNase酶、乙型肝炎病毒cccDNA陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、乙型肝炎病毒cccDNA定量標(biāo)準(zhǔn)品和PCR Buffer。3、制備反應(yīng)液反應(yīng)液每份為沈μ 1，每份反應(yīng)液中含下列組分5XPCR Buffer, 0. 2mmol/L dNTPs，2. 5mmol/LMgCl2,引物 HBV-S 禾口 HBV-AS 各 0. 2ymol/L，探針 HBV-PO. 1 μ mol/L, DNA 聚合酶 1U。4、PSAD酶處理HBVDNA 在25 μ 1總反應(yīng)體系中依次加進(jìn)1 μ 1 25mM ATP, 2·5μ 110倍的Buffer，提取好的乙肝DNA模板溶液12. 5 μ 1，和0. 5 μ 1的質(zhì)粒保護(hù)DNA酶， 再用25 μ 1。將反應(yīng)體系置于37°C環(huán)境中溫育30min，再70°C滅活30min。5、熒光定量檢測(cè)PSAD酶處理的HBVcccDNA，濃度分別為108、IO7, ΙΟ6、105、 104copies/ml的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品各4 μ 1，各加入步驟(2)制得的反應(yīng)液沈μ 1，分別放入各個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)空白管和陰性對(duì)照；各反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，將含待測(cè)樣品反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果與其它反應(yīng)管擴(kuò)增結(jié)果比較，得出待測(cè)樣品中HBVcccDNA的含量。步驟5中的擴(kuò)增是于Rohe480熒光定量監(jiān)測(cè)儀中進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增時(shí)的溫度條件依次為50°C下2分鐘、94°C預(yù)變性4分鐘、94°C下15秒、60°C 45秒構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)。步驟5標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是從未用抗病毒藥物的慢性乙肝患者的血清中分離 HBV DNA，然后構(gòu)建HBV全基因質(zhì)粒pUC-536207 (GenBank登錄號(hào)AY220698，B基因型)。 取pUC-536207質(zhì)粒2. 5ug(200ng/ul，12. 5ul)，按如下體系進(jìn)行酶切反應(yīng)Lgu I內(nèi)切酶 2. 5ul(12. 5u) UOXBuffer 2ul、質(zhì)粒 12. 5ul (200ng/ul, 2. 5g)、ddH20 3ul，總體積 20ul, 瞬離均勻，在37°C水浴3小時(shí)，用Axgen凝膠回收試劑盒，回收3. 2kbDNA片段；將3. 2kb的線性HBV DNA片段在如下體系中連接1"4連接酶25ul (10000u)、10 X jMBufferlSOuL3. 2Kb 線性DNA 25ul、ddH20 1300ul，總體積1500ul，瞬離均勻，在16°C下過(guò)夜連接12 16小時(shí)，將連接產(chǎn)物取出，分為兩管，每管750ul，各管中分別加入飽和酚、氯仿各375ul，上下顛倒混勻，靜置10分鐘，12000rpm/min離心10分鐘，可見(jiàn)明顯分層，用移液器將上清液吸出，加入新的1.5ml Ep管中，各管約375ul JnANaAc 40ul，加入900ul無(wú)水乙醇，2ul糖原，-20°C過(guò)夜沉淀DNA。將產(chǎn)物取出，12000rpm/min離心10分鐘，可見(jiàn)管底有白色沉淀，棄去上清液，再加入750ul濃度為70%的乙醇溶液，12000rpm/min離心6分鐘，棄去上清，開(kāi)蓋晾干2 3分鐘，加入30ul ddH20溶解DNA。配0. 8 %的瓊脂糖凝膠，操作同前，將飽和酚-氯仿抽提的連接產(chǎn)物DNA加入上樣孔中，在電壓100V、電流50mA下電泳50分鐘，再切膠回收DNA片段，操作同前。Marker分子量標(biāo)記為2. 1Kb的DNA即為HBV cccDNA。HBVcccDNA 產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序鑒定。純化后的HBVcccDNA用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確定量，并進(jìn)行10培系列稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為108、107、106、105、104COpieS/ml的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，_20°C保存，有效期一年。上述試劑中，T4連接酶購(gòu)自美國(guó)Nra公司、Lgu I內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)MBI公司、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司、Ex TaqDNA聚合酶購(gòu)于大連Takara生物公司。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1——乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)的方法及其試劑盒1、乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR診斷試劑盒組成一對(duì)特異性弓 I 物 PHBV、一條 TaqMan 熒光探針 FPHBV、Taq 酶、Plasmid-Safe ATP-cbpendent DNase酶、乙型肝炎病毒cccDNA陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、乙型肝炎病毒cccDNA 定量標(biāo)準(zhǔn)品和PCR Buffer。2、根據(jù)HBV全序列，在HBV基因組前C編碼區(qū)，應(yīng)用Beacon Designer2. 1軟件，設(shè)計(jì)并合成如下序列的引物PHBV-S、PHBV-AS和探針FPHBV 引物 PHBV-S 5， -TCCCCGTCTGTGCCTTC-3， (ntl549_ntl565)弓丨物 PHBV-AS 5，-CCCCAAAGCCACCCAA-3，(nt 1904-nt 1889)探針FPHBV 5， -FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMMRA-3， (ntl567-ntl582)3、制備反應(yīng)液反應(yīng)液每份為沈μ 1，每份反應(yīng)液中含下列組分5XPCR Buffer, 0. 2mmol/L dNTPs，2. 5mmol/LMgCl2,引物 HBV-S 禾口 HBV-AS 各 0. 2ymol/L，探針 HBV-PO. 1 μ mol/L, DNA 聚合酶 1U。4、PSAD酶處理HBVcccDNA 在25μ 1總反應(yīng)體系中依次加進(jìn)1μ 1 25mMATP, 2·5μ 110倍的Buffer，提取好的乙肝DNA模板溶液12. 5 μ 1，和0. 5 μ 1的質(zhì)粒保護(hù)DNA酶， 再用25 μ 1。將反應(yīng)體系置于37°C環(huán)境中溫育30min，再70°C滅活30min。5、熒光定量檢測(cè)PSAD酶處理的HBVcccDNA，濃度分別為108、IO7, ΙΟ6、105、 104copies/ml的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品各4 μ 1，各加入步驟(2)制得的反應(yīng)液沈μ 1，分別放入各個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)空白管和陰性對(duì)照；各反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，將含待測(cè)樣品反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果與其它反應(yīng)管擴(kuò)增結(jié)果比較，得出待測(cè)樣品中HBVcccDNA的含量。步驟5中的擴(kuò)增是于Rohe480熒光定量監(jiān)測(cè)儀中進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增時(shí)的溫度條件依次為50°C下2分鐘、94°C預(yù)變性4分鐘、94°C下15秒、60°C 45秒構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)。步驟5標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是從未用抗病毒藥物的慢性乙肝患者的血清中分離 HBV DNA，然后構(gòu)建HBV全基因質(zhì)粒pUC-536207 (GenBank登錄號(hào)AY220698，B基因型)。 取pUC-536207質(zhì)粒2. 5ugQ00ng/ul，12. 5ul)，按如下體系進(jìn)行酶切反應(yīng)Lgu I內(nèi)切酶 2. 5ul(12. 5u) UOXBuffer 2ul、質(zhì)粒 12. 5ul (200ng/ul, 2. 5g)、ddH20 3ul，總體積 20ul, 瞬離均勻，在37°C水浴3小時(shí)，用Axgen凝膠回收試劑盒，回收3. 2kbDNA片段；將3. 2kb的線性HBV DNA片段在如下體系中連接1"4連接酶25ul (10000u)、10 X jMBufferlSOuL3. 2Kb 線性DNA 25ul、ddH20 1300ul，總體積1500ul，瞬離均勻，在16°C下過(guò)夜連接12 16小時(shí)，將連接產(chǎn)物取出，分為兩管，每管750ul，各管中分別加入飽和酚、氯仿各375ul，上下顛倒混勻，靜置10分鐘，12000rpm/min離心10分鐘，可見(jiàn)明顯分層，用移液器將上清液吸出，加入新的1.5ml Ep管中，各管約375ul JnANaAc 40ul，加入900ul無(wú)水乙醇，2ul糖原，-20°C過(guò)夜沉淀DNA。將產(chǎn)物取出，12000rpm/min離心10分鐘，可見(jiàn)管底有白色沉淀，棄去上清液，再加入750ul濃度為70%的乙醇溶液，12000rpm/min離心6分鐘，棄去上清，開(kāi)蓋晾干2 3分鐘，加入30ul ddH20溶解DNA。配0. 8 %的瓊脂糖凝膠，操作同前，將飽和酚-氯仿抽提的連接產(chǎn)物DNA加入上樣孔中，在電壓100V、電流50mA下電泳50分鐘，再切膠回收DNA片段，操作同前。Marker分子量標(biāo)記為2. 1Kb的DNA即為HBV cccDNA。HBVcccDNA 產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序鑒定。純化后的HBVcccDNA用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確定量，并進(jìn)行10培系列稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為108、107、106、105、104COpieS/ml的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，_20°C保存，有效期一年。實(shí)施例2——臨床檢測(cè)用上述方法對(duì)150例陽(yáng)性乙型肝炎臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中檢出HBVcccDNA患者 141例，占總數(shù)的94%，并且能夠?qū)BVcccDNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般方法。本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確，快速簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。該發(fā)明設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物，使rcDNA不會(huì)被擴(kuò)增，而cccDNA則可被選擇性擴(kuò)增。另外通過(guò)PSAD酶對(duì)提取的樣本 DNA進(jìn)行處理，可有效降低非cccDNA擴(kuò)增，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏性和特異性。本發(fā)明不僅可用于HBVcccDNA的檢測(cè)，也可作為臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)HBV感染的輔助診斷方法和臨床治療效果的監(jiān)測(cè)手段，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)的方法及其試劑盒，其特征是試劑盒包括以下成分一對(duì)特異性引物PHBV、一條特異性熒光探針FPHBV、Taq酶、 Plasmid-Safe ATP-dependent DNase酶、乙型肝炎病毒cccDNA陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、乙型肝炎病毒cccDNA定量標(biāo)準(zhǔn)品和PCR Buffer。
2.按照權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)的方法，其特征是 根據(jù)HBV全序列，在HBV基因組前C編碼區(qū)，設(shè)計(jì)并合成如下序列的引物PHBV-S、PHBV-AS 和探針FPHBV 引物 PHBV-S 5’ -TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’ (nt 1549-nt 1565)，引物 PHBV-AS 5’ -CCCCAAAGCCACCCAA-3’ (nt 1904-nt 1889)，探針FPHBV 5’ -FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMARA-3‘ (ntl567_ntl58》。
3.按照權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)的方法，其特征是 樣本 HBV DNA 提取后，用 Plasmid-Safe ATP-dependent DNase (PSAD)酶進(jìn)行酶切處理。
4.按照權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)的方法，其特征是 標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是①質(zhì)粒構(gòu)建將HBV全序列DNA片段構(gòu)建到質(zhì)粒pUC-536207中，膠回收純化3. 2Kb DNA片段；②連接將3. 2Kb的線性HBV DNA片段進(jìn)行連接，構(gòu)成3. 2Kb的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA即HBVcccDNA，并測(cè)序鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒cccDNA熒光定量PCR檢測(cè)方法及其試劑盒組成，首先，檢索到人體乙型肝炎病毒基因組全序列，針對(duì)其保守序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物和一條TaqMvan熒光染料標(biāo)記的探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增目的基因。本發(fā)明采用Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(PSBD)酶進(jìn)行酶切處理樣本DNA，提高檢測(cè)的特異性和靈敏性。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102329888SQ201010533880
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者吳大治, 夏懿, 張繼明, 楊志軍, 江培學(xué), 趙旭, 陳偉華 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院