專利名稱：一種花生降血壓肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品，尤其涉及一種降血壓肽，同時(shí)，還涉及該降血壓肽的制備方法。 技術(shù)背景花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，年產(chǎn)已超過(guò)1500萬(wàn)噸，居世界首位。我 國(guó)生產(chǎn)的花生大部分用于榨取食用油脂，每年榨油后能得到900萬(wàn)噸的花生餅粕，這些花 生餅粕多被用作加工飼料或直接丟棄，沒(méi)有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用?；ㄉ炂芍械鞍踪|(zhì)含量達(dá) 40% 50%，且花生蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。我國(guó)對(duì)花生餅粕的利用不夠，花生蛋白研究開(kāi)發(fā)較 晚，精深加工技術(shù)相對(duì)落后，產(chǎn)品品種結(jié)構(gòu)單一，缺乏高科技含量的深加工、高檔次產(chǎn)品。目 前，花生油冷榨法和水酶法等先進(jìn)技術(shù)的出臺(tái)與推廣為提高蛋白得率和保存其生物活性打 下基礎(chǔ)，精深加工利用花生蛋白特別是花生蛋白水解多肽的研究已成為目前植物蛋白研究 領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。降血壓肽(antihypertensiv peptide,ΑΗΡ)是一類能夠降低人體血壓的小分子多 肽。它通過(guò)抑制RAS系統(tǒng)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)活 性而降低血壓。目前，降血壓肽是抗高血壓藥物研究的熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種降血壓效果明顯，無(wú)毒副作用的花生降血壓肽；目 的之二是提供該花生降血壓肽供的制備方法。本發(fā)明的目的之一可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)該花生降血壓肽含有80-96重量份的肽，0. 2-3重量份的糖，0. 5-5重量份的脂肪 和0. 5-7重量份的灰分。本發(fā)明的目的之一還可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)所述的肽中含有60-80重量份的相對(duì)分子質(zhì)量小于IOOODa的短肽。本發(fā)明的目的之二可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)該制備方法按如下步驟進(jìn)行a.原料預(yù)處理以冷榨花生餅為原料，粉碎后加水溶解，用堿調(diào)節(jié)PH至堿性，浸 提，離心取上清液；以酸沉淀上清液，離心收集沉淀；b.酶處理取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液= 1 8-10重量份配比加入堿性蛋白酶，于45 48°C、pH = 7. 9 8. 2條件下酶解30 60min，得酶解液；c.酶滅活將b步驟的酶解液用酸調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以下，使酶滅活，然后 離心取上清液，得花生降血壓肽原液；d.超濾將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)超濾膜去除大分子片段，得花生降血 壓肽液；e.脫鹽、干燥將d步驟的花生降血壓肽液依次通過(guò)H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和0H—型
3陰離子交換樹(shù)脂脫鹽，濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得產(chǎn)品。本發(fā)明的目的之二還可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)a步驟中所述的粉碎為80-100目；a步驟中所述的浸提溫度為30-80°C，浸提時(shí)間 為1-5小時(shí)；a步驟中所述的冷榨花生餅粉水=1 8-10重量份；所述的堿性是pH = 8-9，所述的酸沉淀上清液的pH = 4-5 ；c步驟中所述的pH = 4. 0-4. 5 ；d步驟中所述的超濾 膜的截留分子量為3000-5000Da ；e步驟中所述的通過(guò)離子交換樹(shù)脂的流速為10 15倍柱 體積/h ；a、c步驟中所述的酸是檸檬酸?；ㄉ笛獕弘腁CE抑制活性的檢測(cè)方法高壓液相色譜(HPLC)系統(tǒng)Waters 2690，監(jiān)測(cè)器Waters 996 ；色譜柱 Z0RBAX0DS 4. 6匪X 150匪；洗脫液30% 甲醇-70%蒸餾水(含 HAC)；流速0. 8ml/min ； 洗脫波長(zhǎng):228nm ；上樣量10μ 1。將本發(fā)明的花生降血壓肽溶于超純水中，離心(lX104r/min，20min)，取上清液進(jìn) 行ACE抑制活性測(cè)定。取本發(fā)明的花生降血壓肽10 μ 1和ACE (0. 25U溶于2. 5mL 0. Imo 1/ L的硼酸鹽緩沖溶液、pH = 8. 3、含0. 5mol/L氯化鈉溶液中)5 μ L于37°C恒溫水浴中保溫 6min，加入 50 μ L 6. 5mmol/L 底物(馬尿酰-組胺酰 _ 亮氨酸，Hippuryl-His-L-Leu, HHL) 溶于相同的緩沖液中。37°C下反應(yīng)30min，加入25μ 1 lmol/L鹽酸溶液中止反應(yīng)，至室溫 取10μ 1反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣，通過(guò)HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸生成量，以生成馬尿酸的量來(lái)判斷 本發(fā)明的花生降血壓肽的ACE抑制活性。計(jì)算公式為R (ο/ο) = ^ χ 100%
A式中R為本發(fā)明的花生降血壓肽對(duì)ACE的抑制率(％ )；A為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積(mAU · s)；B為本發(fā)明的花生降血壓肽組中馬尿酸的峰面積(mAU · s)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果花生蛋白的水解物具有很強(qiáng)的ACE抑制活性，是制備降血壓肽的良好原料。本發(fā) 明的花生降血壓肽具有降血壓效果明顯，無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明以冷榨花生餅為原料，通過(guò)酶水解，超濾膜分離等技術(shù)措施制備出乳白色 或淺黃色粉末狀的花生降血壓肽，與市場(chǎng)上現(xiàn)有的或文獻(xiàn)中的花生蛋白深加工產(chǎn)品比較， 具有以下優(yōu)點(diǎn)1)原料方面本發(fā)明的原料是冷榨花生粕，原料在榨油過(guò)程中最高溫度不超過(guò) 60°C，最大限度的保持了花生蛋白的活性和蛋白深加工產(chǎn)品的顏色(乳白色或淺黃色)。2)功能方面其他發(fā)明如“一種花生功能性短肽及其制備方法” “一種蛋白活性多 肽及其制備方法”是將水解度和得率作為設(shè)置工藝參數(shù)的主要檢測(cè)指標(biāo)。本發(fā)明將降血壓 功能作為主要研究方向，以ACE抑制活性為主要指標(biāo)來(lái)設(shè)置工藝參數(shù)和判斷產(chǎn)品性能。按 照上述“花生降血壓肽ACE抑制活性的檢測(cè)方法”對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品的ACE抑制活性進(jìn)行檢 測(cè)，其半數(shù)抑制率為0. 4929mg/mL。3)因產(chǎn)品具有降血壓活性，長(zhǎng)時(shí)間加熱易使產(chǎn)品變性，降血壓活性降低。本發(fā)明采 用加酸將酶處理的蛋白溶液PH調(diào)至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以下(即用酸調(diào)pH = 4. 0-4. 5)的方法
4使酶滅活。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 該制備方法按如下步驟進(jìn)行a.原料預(yù)處理以冷榨花生餅為原料，粉碎至80目，再按照冷榨花生餅粉水= 1 10重量份加水溶解，然后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH = 8，于80°C下浸提1小時(shí)，用3500r/ min的離心機(jī)離心lOmin，取上清液，再向上清液中加入3mol/L檸檬酸，控制上清液的pH = 5，酸沉淀結(jié)束后，再用3000r/min的離心機(jī)離心30min，收集沉淀；b.酶處理取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液= 1 8重量份配比加入堿性蛋白酶，于47.6°C、pH = 7.93條件下酶解601^11，堿性蛋白酶用 量為75U/g蛋白，得酶解液；c.酶滅活將b步驟的酶解液用3mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH = 4. 5至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以 下，使酶滅活，然后用3000r/min的離心機(jī)離心30min，取上清液，得花生降血壓肽原液；d.超濾將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)截留分子量為3000Da的超濾膜去除 大分子片段，得花生降血壓肽液；e.脫鹽、干燥將d步驟的花生降血壓肽液按照10倍柱體積/h的流速依次通過(guò)H+ 型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫除陽(yáng)離子和0H-型陰離子交換樹(shù)脂脫除陰離子，即脫鹽，濾液經(jīng)濃縮、 冷凍干燥，得含有80重量份的肽，該肽中含有80重量份的相對(duì)分子質(zhì)量小于lOOODa的短 肽，3重量份的糖，0. 5重量份的脂肪和7重量份的灰分，三氯乙酸氮溶解指數(shù)> 90%的花 生降血壓肽產(chǎn)品。去離子交換樹(shù)脂于水中浸泡處理24h后裝柱，然后分別用7. 5%鹽酸或 10% NaOH對(duì)其進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化為H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和0H-型陰離子交換樹(shù)脂，再用水清 洗至微酸性或微堿性，重復(fù)使用。實(shí)施例2 該制備方法按如下步驟進(jìn)行a.原料預(yù)處理以冷榨花生餅為原料，粉碎至100目，再按照冷榨花生餅粉水= 1 8重量份加水溶解，然后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH = 9，于30°C下浸提5小時(shí)，用3000r/ min的離心機(jī)離心30min，取上清液，再向上清液中加入3mol/L檸檬酸，控制上清液的pH = 4，酸沉淀結(jié)束后，再用3500r/min的離心機(jī)離心lOmin，收集沉淀；b.酶處理取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液= 1 10重量份配比加入堿性蛋白酶，于44.91、口11 = 8.15條件下酶解301^11，堿性蛋白酶 用量為150U/g蛋白，得酶解液；c.酶滅活將b步驟的酶解液用3mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH = 4. 0至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以 下，使酶滅活，然后用3500r/min的離心機(jī)離心lOmin，取上清液，得花生降血壓肽原液；d.超濾將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)截留分子量為5000Da的超濾膜去除 大分子片段，得花生降血壓肽液；e.脫鹽、干燥將d步驟的花生降血壓肽液按照15倍柱體積/h的流速依次通過(guò) H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫除陽(yáng)離子和0H-型陰離子交換樹(shù)脂脫除陰離子，即脫鹽，得含有96 重量份的肽，該肽中含有60重量份的相對(duì)分子質(zhì)量小于lOOODa的短肽，0. 2重量份的糖，5重量份的脂肪和7重量份的灰分，三氯乙酸氮溶解指數(shù)> 90%的花生降血壓肽產(chǎn)品。去 離子交換樹(shù)脂于水中浸泡處理24h后裝柱，然后分別用7. 5%鹽酸或10% NaOH對(duì)其進(jìn)行處 理，轉(zhuǎn)化為H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和OH-型陰離子交換樹(shù)脂，再用水清洗至微酸性或微堿性， 重復(fù)使用。實(shí)施例3 該制備方法按如下步驟進(jìn)行a.原料預(yù)處理以冷榨花生餅為原料，粉碎至90目，再按照冷榨花生餅粉水= 1 9重量份加水溶解，然后用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH = 8. 5，于50°C下浸提3小時(shí)，用3300r/ min的離心機(jī)離心20min，取上清液，再向上清液中加入3mol/L檸檬酸，控制上清液的pH = 4. 5，酸沉淀結(jié)束后，再用3300r/min的離心機(jī)離心20min，收集沉淀b.酶處理取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液= 1 9重量份配比加入堿性蛋白酶，于46. l°C、pH = 8.05條件下酶解451^11，堿性蛋白酶用 量為110U/g蛋白，得酶解液；c.酶滅活將b步驟的酶解液用3mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH = 4. 2至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以 下，使酶滅活，然后用3300r/min的離心機(jī)離心20min，取上清液，得花生降血壓肽原液；d.超濾將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)截留分子量為4000Da的超濾膜去除 大分子片段，得花生降血壓肽液；e.脫鹽、干燥將d步驟的花生降血壓肽液按照13倍柱體積/h的流速依次通過(guò) H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫除陽(yáng)離子和OH-型陰離子交換樹(shù)脂脫除陰離子，即脫鹽，得含有85 重量份的肽，該肽中含有70重量份的相對(duì)分子質(zhì)量小于IOOODa的短肽，1. 5重量份的糖， 2. 5重量份的脂肪和3重量份的灰分，三氯乙酸氮溶解指數(shù)彡90%的花生降血壓肽產(chǎn)品。去 離子交換樹(shù)脂于水中浸泡處理24h后裝柱，然后分別用7. 5%鹽酸或10% NaOH對(duì)其進(jìn)行處 理，轉(zhuǎn)化為H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和OH-型陰離子交換樹(shù)脂，再用水清洗至微酸性或微堿性， 重復(fù)使用。
權(quán)利要求
一種花生降血壓肽，其特征在于該花生降血壓肽含有80 96重量份的肽，0.2 3重量份的糖，0.5 5重量份的脂肪和0.5 7重量份的灰分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生降血壓肽，其特征在于所述的肽中含有60-80重量 份的相對(duì)分子質(zhì)量小于lOOODa的短肽。
3.權(quán)利要求1所述的一種花生降血壓肽的制備方法，其特征在于該制備方法按如下步 驟進(jìn)行a.原料預(yù)處理以冷榨花生餅為原料，粉碎后加水溶解，用堿調(diào)節(jié)PH至堿性，浸提，離 心取上清液；以酸沉淀上清液，離心收集沉淀；b.酶處理取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液= 1 8-10重量份配比加入堿性蛋白酶，于45 48°C、pH= 7. 9 8. 2條件下酶解30 60min，得酶解液；c.酶滅活將b步驟的酶解液用酸調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以下，使酶滅活，然后離心 取上清液，得花生降血壓肽原液；d.超濾將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)超濾膜去除大分子片段，得花生降血壓肽液；e.脫鹽、干燥將d步驟的花生降血壓肽液依次通過(guò)H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和0H—型陰 離子交換樹(shù)脂脫鹽，濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于a步驟中所述的粉碎 為 80-100 目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于a步驟中所述的浸提 溫度為30-80°C，浸提時(shí)間為1-5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于a步驟中所述的冷榨 花生餅粉水=1 8-10重量份；所述的堿性是pH = 8-9，所述的酸沉淀上清液的pH = 4-5。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于c步驟中所述的pH= 4. 0-4. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于d步驟中所述的超濾 膜的截留分子量為3000-5000Da。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于e步驟中所述的通過(guò) 離子交換樹(shù)脂的流速為10 15倍柱體積/h。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的花生降血壓肽的制備方法，其特征在于a、c步驟中所述的 酸是檸檬酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種花生降血壓肽及其制備方法，該制備方法按如下步驟進(jìn)行a.以冷榨花生餅為原料，粉碎后加水溶解，用堿調(diào)節(jié)pH至堿性，浸提，離心取上清液；以酸沉淀上清液，離心收集沉淀；b.取a步驟的沉淀加水溶解，然后按照堿性蛋白酶沉淀物水溶液＝1∶8-10重量份配比加入堿性蛋白酶，酶解，得酶解液；c.將b步驟的酶解液用酸調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)以下，使酶滅活，然后離心取上清液，得花生降血壓肽原液；d.將c步驟的花生降血壓肽原液通過(guò)超濾膜去除大分子片段，得花生降血壓肽液；e.將d步驟的花生降血壓肽液依次通過(guò)H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和OH-型陰離子交換樹(shù)脂脫鹽，濾液經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12P21/06GK101979653SQ201010510989
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者何東平, 劉麗娜, 徐同成, 杜方嶺, 王文亮, 祝清俊, 程安瑋 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所