專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分離植物或微生物總rna的試劑組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞總RNA的制備方法，具體涉及一種分離柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的試劑組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
RNA是參與細(xì)胞基因表達(dá)的主要成分，在整個(gè)遺傳信息的維持和表達(dá)過(guò)程中扮演著十分重要的角色。在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中，RNA分離已成為許多試驗(yàn)不可或缺的技術(shù)手段。分離得到的RNA質(zhì)量的高低也將直接影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。而RNA由于其自身的生物學(xué)特性，存在易降解、難保存的特點(diǎn)。提取過(guò)程中也容易被蛋白質(zhì)、DNA和其他細(xì)胞代謝物污染。因此一種能夠分離得到完整高純度RNA的方法一直是分子生物學(xué)工作者所希望實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，其對(duì)分子生物學(xué)研究亦具有重要意義。有關(guān)RNA的提取方法很多，依據(jù)RNA分離原理大致可以分為密度梯度離心，化學(xué)沉降和介質(zhì)吸附三大類(lèi)。密度梯度離心法對(duì)離心設(shè)備要求高，操作繁瑣且處理的樣品非常有限，已經(jīng)基本不再使用；化學(xué)沉降類(lèi)方法中主要包括CTAB法、SDS-酚法、異硫氰酸胍-酸酚-氯仿法。其中CTAB法和SDS-酚法在對(duì)植物、真菌等樣品的RNA提取中使用較多，其提取原理主要是利用CTAB、SDS等陰/陽(yáng)離子去污劑裂解細(xì)胞膜，釋放核酸，同時(shí)抑制RNA酶的活性。TriS-HCl、EDTA緩沖體系維持溶液pH值，穩(wěn)定核酸。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)則能有效與多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合，防止其氧化產(chǎn)物——醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)核酸的破壞。隨后經(jīng)乙醇和LiCl兩輪沉降得到RNA。由于LiCl對(duì)RNA的沉降具有一定特異性，絕大部分多糖、次生代謝物等雜質(zhì)便在沉降過(guò)程中被除去，從而得到較純的RNA。該方法在處理富含多糖多酚類(lèi)復(fù)雜樣品時(shí)仍然可以得到令人滿(mǎn)意的結(jié)果，然而對(duì)于大量樣品的處理，此類(lèi)方法仍嫌繁瑣， 操作時(shí)間也較長(zhǎng)。并且CTAB法和SDS-酚法均無(wú)法用于動(dòng)物組織總RNA的提取。異硫氰酸胍的應(yīng)用使這一狀況得到改觀，由于異硫氰酸胍具有極強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性能力，能夠在裂解細(xì)胞的同時(shí)使RNA酶迅速失活，從而克服了以上方法裂解能力不足的問(wèn)題，極大地保證了核酸的完整性。異硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法就是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種快速分離 RNA的方法，首先由Chomczynski及其同事于1987報(bào)道，并歷經(jīng)數(shù)次改進(jìn)。該方法適用大多數(shù)動(dòng)植物樣品，得到的RNA完整性好，并可在短時(shí)間內(nèi)完成操作，幾乎成為常規(guī)RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用也最為廣泛。商業(yè)化的TRIzoI試劑及其分離方法就建立在此基礎(chǔ)之上， 它比常規(guī)的異硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法更為快捷和高效，然而其價(jià)格也較為昂貴，不利于常規(guī)大量樣品的處理。介質(zhì)吸附類(lèi)方法是近年來(lái)迅速崛起的RNA分離方法，其主要原理是利用核酸在高鹽低PH溶液環(huán)境下與硅膠膜表面-OH基團(tuán)形成鹽橋從而使核酸結(jié)合于硅膠膜表面。經(jīng)一系列洗滌過(guò)程除去蛋白質(zhì)和溶液中的鹽，最后在低鹽高PH條件下將核酸從硅膠膜上洗脫，從而分離得到RNA。這種方法可在極短時(shí)間內(nèi)完成RNA的分離，并且得到的 RNA純度高、質(zhì)量好，因而得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。然而此種方法難以避免DNA的污染。由于是利用硅膠膜吸附溶液中的RNA，硅膠膜的吸附能力和吸附面積成為影響RNA得率的重要因素，不可避免的損失使得這種方法的得率并不優(yōu)于化學(xué)沉淀類(lèi)方法。而且這種損失對(duì)于分子量小的RNA來(lái)說(shuō)尤為嚴(yán)重。限制了其在一些生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，如小分子RNA干擾等。到目前為止，針對(duì)特殊樣品的RNA提取方法的研究從未終止，一種簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)而又能夠適應(yīng)廣泛樣品的RNA提取技術(shù)一直是研究者們所追求的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)方法樣品選擇性強(qiáng)、操作繁瑣、效率較低等缺點(diǎn)，提供一種分離柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的試劑組合物及其制備方法。本發(fā)明的核心是建立一種快速、高效而又廉價(jià)的RNA提取方法。該方法適合分離柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的方法，由于該方法向RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，故與同類(lèi)型試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對(duì)組織樣品中含量很低的核酸成分亦能夠有效分離得到。同時(shí)使核酸沉降過(guò)程在短時(shí)間內(nèi)即可完成，免除了 -20°C沉降數(shù)小時(shí)的過(guò)程，大大縮短了操作時(shí)間。該方法適用樣品廣泛，且比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價(jià)。樣品勻漿后若不立即進(jìn)行RNA提取可放于-20°C保存至少3天。申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)大量研究和對(duì)比試驗(yàn)，優(yōu)選出滿(mǎn)足本發(fā)明目的的RNA提取試劑組合物及方法。本發(fā)明的RNA純化試劑組合物包括以下組分
1)溶液A
a.按重量/體積計(jì)異硫氰酸胍50% ；
b.醋酸鈉0. lmol/L
C.氯化鈉 0. 25mol/L ；
d.氯化鎂IOmmol/L ；
e.按重量/體積計(jì)十二烷基肌氨酸鈉0. 7% ；
f.糖原 60 μ g/ml
g·按體積/體積計(jì)β -巰基乙醇0. 5%
2)溶液B 水飽和酚(ρΗ4· 0-5. 0)；
3)裂解液
a.按體積/體積計(jì)，溶液A 50% -55% ；
b.按體積/體積計(jì)，溶液B 50% -45% ；
C.按重量/體積比計(jì)甲基紅0. 2%ο ；
將溶液A和溶液B按照體積比1 1混合后，加入甲基紅固體粉末使溶液呈玫瑰
紅色為裂解液，即得到本發(fā)明所述的試劑組合物。2、申請(qǐng)人建立了一種從柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌中提取總RNA方法，其步驟包括按照前述的配方量制備RNA純化試劑組合物(配方見(jiàn)上所述)，備用。(1)樣品裂解根據(jù)樣品稱(chēng)重，按照每0. Ig樣品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于離心管中，將樣品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的離心管中劇烈震蕩，樣品勻漿后在室溫下放置5min，然后置于冰上直至所有樣品勻漿完成。不立即進(jìn)行RNA提取的樣品可將勻漿置于-20°C保存；(2)抽提
按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻漿中加入氯仿，劇烈震蕩使溶液呈乳濁狀，冰上靜置5min后于4°C下離心，離心后吸取上層水相于新離心管中并加入等體積氯仿再次抽提，離心，除去水相中殘余的酚；(3)沉降 RNA吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇，冰上至室溫25°C放置IOmin后， 離心回收RNA ；(4)洗滌溶解RNA在室溫條件下，用濃度為75%的乙醇使RNA沉淀懸浮，洗滌1_2次后，將其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的去離子水中。本發(fā)明的特點(diǎn)在于以異硫氰酸胍、苯酚為主要成分，以NaCl、MgC12等提供陽(yáng)離子，以醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)穩(wěn)定溶液PH值，經(jīng)氯仿簡(jiǎn)單抽提后，即可得到高質(zhì)量的RNA。 由于本發(fā)明的RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，故與同類(lèi)型試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對(duì)組織樣品中含量很低的核酸成分亦能夠有效分離得到。同時(shí)使核酸沉降過(guò)程在短時(shí)間內(nèi)即可完成，免除了 -20°C沉降數(shù)小時(shí)的過(guò)程，大大縮短了操作時(shí)間。該方法快捷、高效，適用樣品廣泛，且比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價(jià)?？朔藗鹘y(tǒng)方法樣品選擇性強(qiáng)、操作繁瑣、效率較低等缺點(diǎn)。且操作更為靈活，樣品勻漿后可于_20°C保存3天再進(jìn)行RNA的提取。本發(fā)明的效果是1、能夠在短時(shí)間內(nèi)從樣品中分離得到高純度的RNA。2、操作步驟簡(jiǎn)單，易于大量樣品的處理。3、適用樣品廣泛，對(duì)大部分植物、微生物及部分動(dòng)物樣品均有較好的提取效果。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO :1是來(lái)源于毛果楊(Populus trichocarpa)的Actin 9基因的 mRNA片段，序列全長(zhǎng)為17^bp。序列表SEQ IDNO 2和SEQ IDNO 3是擴(kuò)增Actin 9基因的引物對(duì)。序列表SEQ ID NO :4是來(lái)源于毛果楊(Populus trichocarpa)的Actin 1基因的 mRNA片段，序列全長(zhǎng)為1819bp。序列表SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是擴(kuò)增Actin 1基因的引物對(duì)。圖1為墨西哥株檬(Citrus aurantifolia)葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，圖中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)(TIANGEN, MD103-02)，2-5為實(shí)驗(yàn)重復(fù)。圖2為本氏煙(Nicotiana benthamiana)葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (1ΧΤΑΕ，1·2% )，圖中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)(TIANGEN，MD103-02)，2-3為實(shí)驗(yàn)重復(fù)。圖3為梨腐爛病菌(Valsa ambiens (Pers)Fr)菌絲總RNA非變性瓊脂糖電泳效果(ΙΧΤΑΕ,Ι. 2% )，圖中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)(TIANGEN，MD103-02)，2-5為實(shí)驗(yàn)重復(fù)。圖4為不同方法提取得到的墨西哥株檬葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，圖中 1 為分子量標(biāo)準(zhǔn)(TIANGEN, MD103-02) ,2 為=CTAB-LiCl 法得到的總RNA，3為本方法得到的總RNA，4為使用RNAisoReagent試劑(TaKaRa，D312)得到的總RNA，5為SDS-酚法得到的總RNA，6為使用Trizol試劑得到的總RNA，7為異硫氰酸胍-酸酚法得到的總RNA圖5為=RT-PCR擴(kuò)增墨西哥株檬Actin基因片段瓊脂糖電泳效果(1XTAE，2% )， 圖中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)(TIANGEN，MD109-02)，2-5為引物β-Actin(T52)擴(kuò)增產(chǎn)物，6_9為 引物β -Actin(Τ60)擴(kuò)增產(chǎn)物圖6為試劑性狀，左為Iml溶液于1. 5ml離心管中效果，右為加入氯仿分層后的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增墨西哥株檬(Citrus aurantifolia) Actin S13Jn S本實(shí)施例中墨西哥株檬葉片采集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家果樹(shù)脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心，墨西哥株檬植株為溫室盆栽植株。該品種為商業(yè)化品種和生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的品種 (材料)，公眾如果需要，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家果樹(shù)脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心可以對(duì)外發(fā)放該品種的材料。一、RNA提取使用的試劑組合物的配制1)糖原溶液(10mg/ml)用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過(guò)的去離子水將糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。 依次先后用DNA酶(購(gòu)自寶大連生物工程有限公司，即TaKaRa公司)、RNA酶(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)及蛋白酶K(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)進(jìn)行消化處理，除去藥品中的DNA、RNA及蛋白質(zhì)污染。使用等體積水飽和酚抽提一次，用等體積氯仿異戊醇(體積比為M 1)抽提兩次后，用DEPC處理過(guò)的去離子水將糖原溶液稀釋至10mg/ml，分裝于小份，-20°C保存。2)溶液 A a.按重量/體積計(jì)異硫氰酸胍50 % ；b.醋酸鈉 0. lmol/L ；c.氯化鈉 0. 25mol/L ；d.氯化鎂 IOmmol/L ；e.按重量/體積計(jì)十二烷基肌氨酸鈉0. 7% ；f.糖原 60 μ g/mlg.按體積/體積計(jì)β -巰基乙醇0. 5 %將以上固體粉末準(zhǔn)確稱(chēng)量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的終濃度達(dá)到60 μ g/ml。添加β-巰基乙醇后用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液pH至4. 6左右。最后用DEPC處理過(guò)的去離子水定容。3)溶液B 水飽和酚(ρΗ5· 0)4)裂解液 a.按體積/體積計(jì)溶液A 50 % -55 %b.按體積/體積計(jì)溶液B 50% -45%c.按重量/體積計(jì)甲基紅0. 2%o將溶液A和溶液B按照體積比1 1混合后，加入甲基紅固體粉末使溶液呈玫瑰紅色為裂解液，即得到本發(fā)明所述的試劑組合物。二、提取墨西哥株檬葉片總RNA1、準(zhǔn)確稱(chēng)取0. Ig墨西哥株檬(該品種是一個(gè)公開(kāi)使用的商業(yè)化品種)葉片樣品， 液氮研磨后迅速加入含Iml裂解液的離心管中，劇烈震蕩勻漿。2、室溫下放置5分鐘后，將離心管置冰上，直至所有樣品勻漿完畢。3、在 4°C，12000g 下離心 5 分鐘。4、將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，棄去管底殘?jiān)?、向每個(gè)離心管中加入200 μ 1氯仿，劇烈震蕩20秒使溶液呈乳狀。6、冰上放置10分鐘后于4°C，不低于12000g下離心15分鐘。7、小心吸取上層無(wú)色水相至新離心管中，加入等體積氯仿再抽提一次。8、4°C，不低于12000g下離心10分鐘。9、小心吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇。冰上放置10分鐘。10、在4°C，8000g下離心10分鐘后回收RNA沉淀。11、倒掉上清，加入Iml 75%乙醇使沉淀懸浮，洗滌沉淀。12、在8000g室溫離心5分鐘回收沉淀。13、重復(fù)步驟 11-13。14、完全除去上清，室溫靜置15-20分鐘使RNA沉淀干燥。15、將沉淀溶于DEPC處理過(guò)的去離子水中，于_80°C下保存本實(shí)施例經(jīng)4次重復(fù)得到的總RNA得率平均為3090 μ g/g組織，4次重復(fù)分離得到的總RNA其A26(1/28(1值均在2. 06-2. 10之間，其A26(1/23(1比值均在2. 09-2. 19之間，電泳條帶正常(見(jiàn)圖1)。三、cDNA合成使用DNase I試劑(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)對(duì)提取得到的總RNA進(jìn)行消化，具體步驟參照該公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用Oligo dT引物進(jìn)行cDNA的合成，具體步驟如下1、取2μ g消化后的總RNA，加入1μ 1 Oligo (dT) 12_18 (100 μ Μ)(上述材料或試劑均購(gòu)自！^ermentas公司產(chǎn)品)引物后，加入DEPC水至總體積10 μ 1。2、70°C水浴IOmin后迅速在冰上急冷5min。3、瞬時(shí)離心后在離心管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液5μ 1 5XM-MLV Reaction BufferU μ 1 M-MLV (200U/ μ 1)(購(gòu)自 Promega 公司產(chǎn)品)、6μ 1 dNTP(10mM.)(購(gòu)自 Roche 公司產(chǎn)品)、0. 5μ 1 RRI RNase inhibibtor (40U/μ 1)(寶生物工程大連公司產(chǎn)品)、2. 5 μ 1 DEPC-H2O。4、42°C水浴1小時(shí)后70°C處理IOmin使反轉(zhuǎn)錄酶失活。5、5倍稀釋后分裝成小分保存于-20°C四、PCR擴(kuò)增Actin基因片段RT-PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因Actin片段，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的Actin 9基因序列 (基因登錄號(hào)XM_002331844)設(shè)計(jì)如下的一對(duì)引物，其DNA序列如下β -Actin (Τ52)-F :5，-TCTATTCCAGCCATCTCTC-3，(序列表編號(hào) SEQ ID NO 2)，β -Actin (Τ52)-R :5，-GACCCTCCAATCCAAAC-3，(序列表編號(hào) SEQ ID NO 3)。
序列全長(zhǎng)為1726bp，其物種為毛果楊(Populus trichocarpa)，楊屬植物，其mRNA 片段如下所示(序列表編號(hào)SEQ ID NO 1)CTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCGCACCAGCAACCGCAATACAAACAAGCAATTTAGGCCAGGCCACGTCT ATAGCTAGATTTGGCTTGGTTCGTTCTCTGATTATTCTCTCTTATACTTTTTTTGCACAGAACTTGTAGAAAATGGCCGATTCTGAGGATA TTCAGCCCCTTGTCTGCGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCTGGGGATGATGCTCCCAGGGCAGTGTTTCCAAGTATTGT GGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCTTATGTTGGTGACGAAGCACAATCTAAGAGAGGTATCTTG ACCTTGAAATACCCTATTGAGCATGGTATTGTTAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACACTTTCTACAATGAGCTTCGTG TTGCTCCTGAGGAGCACCCAGTCCTCCTTACAGAGGCTCCTCTTAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACTCAAATCATGTTTGAGAC CTTCAATGTGCCTGCAATGTATGTTGCTATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGCTGGATTCTGGT GATGGTGTGTCTCACACTGTGCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTTCCACATGCCATCCTTCGTTTGGATCTTGCTGGTCGTGATCTCACTG ATGCTTTGATGAAGATCCTCACCGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTGC ATATGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGTAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTATGAGCTACCTGATGGTCAGGTC ATCACCATTGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCATCGGAATGGAAGCTGCTGGTATCCACGAGACTA CTTACAATTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATATCAGAAAGGATCTATATGGTAATATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATGTTCCCTGG TATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAAATCACTGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTTGCACCACCAGAGAGAAAATACAGT GTCTGGATTGGAGGGTCAATCCTTGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGTACGACGAGTCTGGCCCATCCA TCGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCCGAACAGTGCGGTGATGGTGAGTTCTTTCTTTCTATTTAGTTGGCTTTTTTCGTGTCAAGGTGT CATGAACTCAAAGTCCTAGTTGATATGGAGAATTTGTTGAGGTGGGGGTCATTGAAGGAGGGAACATTCTGATATTCAATGTATCGAATAG GCTTGTGATTCGATGTTGTTATTGCTGCTTTTTAAGATGCGCAACTGTAATGGTCCTCCCTCTCGATGTGGTGGTCAGACACTTTGGTAGT CAAGCTCTTTGCTTTCTTCCACATCATCTGTGGTTCAACCTTGCGTCTTTTTAGTAGGATGCTTGTAGACGGAGAGTGGTTGTGATGATGC
rp rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rp rp rp rp rpCCATCTCAACATTTGAAGGTGTTTTTTTCCTTGGGAACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTGTGTTAGTGTCAATTTG根據(jù)登錄號(hào)XM_002^8674報(bào)道的Actin 1基因序列作為RT-PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因 Actin片段，設(shè)計(jì)了如下另一對(duì)引物對(duì)，其DNA序列如下β -Actin (Τ60)-F :5，-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3，(序列表編號(hào) SEQ ID NO 5)，β -Actin (Τ60)-R :5，-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3，(序列表編號(hào) SEQ ID NO 6)。序列全長(zhǎng)為1819bp，其物種為毛果楊(Populus trichocarpa)，楊屬植物，其mRNA 片段如下所示(序列表編號(hào)SEQ ID NO 4)AACCCTTACACTCCTCCATTTTCGTCTCACCCTCTCTCTCGAGCGCAACCACCAGCTAGCAAGTCAGGC AGGCCACATCTTTCGCTAGACTTGGCTTGGTCTGTTTCGCTCTCTGTCTCTAGATATCTCCTCTGTCTCCGACTTCAAAAGAATTTGTAGA AAATGGCCGATGCCGAGGATATTCAACCCCTTGTCTGTGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCAGGTGATGATGCACCCAG GGCAGTGTTTCCCAGTATTGTGGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCCTATGTTGGTGATGAAGCA CAATCTAAAAGAGGTATCTTGACCTTGAAATACCCCATTGAGCACGGTATTGTAAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACA CTTTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCTCCTGAAGAGCACCCAGTCCTCCTGACTGAGGCTCCCCTCAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGAT GACTCAAATTATGTTTGAGACCTTCAATGTTCCTGCAATGTATGTTGCCATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACT GGTATTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGTGAGTCACACTGTGCCAATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCACACGCCATCCTTCGTTTGGATC TTGCTGGTCGTGACCTCACCGATGCTTTGATGAAGATTCTGACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCG TGATATGAAGGAGAAACTTGCGTATGTTGCCCTCGACTACGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTAC GAGCTTCCTGATGGTCAGGTCATCACCATCGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCTTCTCTCATTGGAATGGAAG CTGCTGGCATCCACGAGACTACATACAACTCAATCATGAAGTGTGATGTGGATATTAGAAAGGATCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGG TGGTTCCACTATGTTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCA CCACCAGAGAGAAAGTACAGTGTCTGGATTGGAGGATCTATCCTTGCTTCCCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGT ATGATGAGTCTGGCCCATCCATTGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCTACAAGTGCTTTGATGGTGAGTTCTTTTTCCTATTTAGTTGGC TTTTTTCGTGTCAAGGTGTCATGAACTCAAAGTCCTGGTTGATATGGAGAATTTATTGAGGTGGGGGTCACTGAAGGAGAAGGGAACATTC TGATCTTCTATGTATCGAATAG
GCCTGTGATTCAATGTTGATATCGCTGCCATTTGTGAAGCTTAAACTGTAATGGTCCTCCCTCCGGATG TGGTGGGCAGACAGACACTTTGGTAATCAAGTTCTTTGCTTCCCTCACATCATCACCAATGGTTCAACCTTGTGTCTTTTTTAGTAGGATG CTTGTAGTCGGAGAGTGATTGTGATGATGCTTTTCTATTTTTATTTTTTTTCCATCTCGACATTTGAAGGGTTTATTTTTTTTTCCTGGGA ACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTATGTTAGTGTCAATTTGCTTTCATAAACCCTATGGAAATCATATTTAATACTTTTG TTTGAACTTTGAATTGATCTTPCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種分離柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA純化試劑組合物，其特征在于， 包括以下組分1)溶液Aa.按重量/體積計(jì)異硫氰酸胍50%；b.醋酸鈉0. lmol/L ；c.氯化鈉0. 25mol/L ；d.氯化鎂IOmmol/L ；e.按重量/體積計(jì)十二烷基肌氨酸鈉0.7% ；f.糖原60 μ g/ml ；g.按體積/體積計(jì)β-巰基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水飽和酚；3)裂解液a.按體積/體積計(jì)，溶液A50% -55% ；b.按體積/體積計(jì)，溶液B50% -45% ；c.按重量/體積比甲基紅0.2%o ；將溶液A和溶液B按體積比1 1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液。
2.一種分離柑橘類(lèi)植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA的方法，其特征在于包含以下步驟(1)、制備RNA純化試劑組合物1)溶液Aa.按重量/體積計(jì)異硫氰酸胍50%；b.醋酸鈉0. lmol/L ；c.氯化鈉0. 25mol/L ；d.氯化鎂IOmmol/L ；e.按重量/體積計(jì)十二烷基肌氨酸鈉0.7% ；f.糖原60 μ g/mlg.按體積/體積計(jì)β-巰基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水飽和酚；3)裂解液a.按體積/體積計(jì)，溶液A50% -55% ；b.按體積/體積計(jì)，溶液B50% -45% ；c.按重量/體積比甲基紅0.2%o ；將溶液A和溶液B按體積比1 1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液；(2)樣品裂解根據(jù)樣品稱(chēng)重，按照每0. Ig樣品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于離心管中，將樣品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的離心管中劇烈震蕩，樣品勻漿后在室溫下放置5min， 然后置于冰上直至所有樣品勻漿完成，不立即進(jìn)行RNA提取的樣品可將勻漿置于-20°C保存；⑶抽提按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻漿中加入氯仿，劇烈震蕩使溶液呈乳濁狀，冰上靜置5min后于4°C下離心，離心后吸取上層水相于新離心管中并加入等體積氯仿再次抽提，離心，除去水相中殘余的酚；(4)沉降RNA吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇，冰上至室溫25°C放置IOmin后，離心回收RNA ；(5)洗滌溶解RNA在室溫條件下，用濃度為75%的乙醇使RNA沉淀懸浮，洗滌1-2次后，將其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯處理的去離子水中。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)方法領(lǐng)域，涉及一種分離植物或微生物總RNA的試劑組合物及制備方法。以異硫氰酸胍、苯酚為主要成分，以NaCl、MgCl2等提供陽(yáng)離子，以醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)穩(wěn)定溶液pH，經(jīng)氯仿簡(jiǎn)單抽提后，即可得高質(zhì)量的RNA。由于本發(fā)明的RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，與同類(lèi)試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對(duì)組織樣品中含量很低的核酸成分亦能有效分離。使核酸沉降過(guò)程短時(shí)間內(nèi)即可完成，免除了-20℃沉降數(shù)小時(shí)的過(guò)程，大大縮短了操作時(shí)間。該方法快捷、高效，適用樣品廣泛，比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價(jià)。克服了傳統(tǒng)方法樣品選擇性強(qiáng)、操作繁瑣、效率較低等缺點(diǎn)。且操作更為靈活，樣品勻漿后可于-20℃保存3天再進(jìn)行RNA的提取。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102443580SQ201010509840
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者丁芳, 徐文興, 楊帆, 洪霓, 王利平, 王國(guó)平 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)