專利名稱：一種長效重組人干擾素及其重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長效重組人干擾素及其表達(dá)純化方法、重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建， 具體講，涉及一種經(jīng)過點(diǎn)突變的長效重組人干擾素，以及其表達(dá)純化方法和重組表達(dá)工程 菌的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
根據(jù)干擾素(interferons，IFNs)的定義，干擾素是一類至少在同種細(xì)胞上具有 廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在不同途徑上影響細(xì)胞的代謝、生長和分化的蛋 白質(zhì)，其活性的發(fā)揮需新合成RNA和蛋白質(zhì)，它是一類重要的細(xì)胞因子。經(jīng)過近半個(gè)世紀(jì)的 基礎(chǔ)和臨床研究，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。干擾素首先與特異性細(xì)胞受體結(jié)合，通過信號(hào)傳遞，激活細(xì)胞基因表達(dá)，從而發(fā)揮 干擾素的生物學(xué)活性1.抗病毒活性抑制病毒基因的復(fù)制。2.抗細(xì)胞增殖活性細(xì)胞膜的改變；細(xì)胞骨架的改變；刺激細(xì)胞分化；調(diào)節(jié)生長因 子的表達(dá)；抑制癌基因的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)惡化細(xì)胞的表型；激活P53基因的表達(dá)。3.免疫調(diào)節(jié)活性誘導(dǎo)其它細(xì)胞素的表達(dá)；激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞；上調(diào)HLA I和 II的表達(dá)；調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)。迄今所知，人干擾素存在多個(gè)型別干擾素_a，b，d，g，e, k，1，t，w, limitin等型 別，它們的主要特點(diǎn)和可能的臨床應(yīng)用各異。目前，研究較多并用于臨床治療的有a、b、g，其它型別干擾素是否有臨床應(yīng)用價(jià)值 尚在研究之中。干擾素-a，屬I型干擾素，約有23個(gè)變種，較詳細(xì)研究的有約13種亞型。分子量為 1946kDa，由156-166個(gè)氨基酸組成，115-151之間為保守序列?；蚣性?p22，受體基因 位于21q22. 1。世界上批準(zhǔn)用于治療病毒病和惡性腫瘤的主要干擾素_a有干擾素-alb、 a2b、a2a.，治療約40種適應(yīng)癥，包括我國將干擾素_a2b列為預(yù)防SARS的儲(chǔ)備藥物之一。干擾素在機(jī)體內(nèi)的清除速率在人和動(dòng)物都研究得比較詳細(xì)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的資料與人 體試驗(yàn)大致上相似。干擾素的活性有相對(duì)的種屬特異性，但是干擾素的藥物動(dòng)力學(xué)，不同動(dòng) 物獲得的結(jié)果卻無明顯的差別。干擾素是一種蛋白質(zhì)，口服以后一般為蛋白酶類所破壞。Schafer等(1972)證明， 新生的小白鼠口服外源性鼠干擾素之后，在血流中可以發(fā)現(xiàn)干擾素，并且可以抵抗VSV的 攻擊。新生小鼠口服兔干擾素，也可以在血流中測出兔干擾素的存在。說明血流中存在的 干擾素并非由于干擾素制劑中混有其他物質(zhì)而誘生的小白鼠干擾素，而確是口服后進(jìn)入血 流的。8日齡小白鼠也獲得同樣結(jié)果。但是，成熟小白鼠口服干擾素后，在血流中不能發(fā)現(xiàn) 干擾素。這些結(jié)果為新生兒口服干擾素防治新生兒病毒性疾病提供了基礎(chǔ)。Emisphere公 司的Eligen技術(shù)正在研究將人生長因子(與干擾素的大小相似)口服的研究。
據(jù)Merigan(1970報(bào)告，志愿者鼻腔接種干擾素后，在呼吸道可以維持17小時(shí)左 右。Harmon等(1976)證明不少正常人的鼻分泌液中含有一種人成纖維細(xì)胞干擾素的抑制 劑，但是這一抑制劑對(duì)白細(xì)胞干擾素?zé)o作用。Johnson等(1976)用10只猩猩和3名志愿者 做的試驗(yàn)表明，在鼻腔局部應(yīng)用人白細(xì)胞干擾素后(10000單位/0.01毫升滴鼻前庭)，除個(gè) 別外都能保存，但是1小時(shí)后減少了 5 50倍，說明局部應(yīng)用的干擾素可被局部的黏液流 所清除。小白鼠干擾素靜脈注射小白鼠后，血流中的干擾素濃度很快下降，1小時(shí)僅為原始 劑量的1/30，半衰期為11分鐘(Baron et al 1966)；或1小時(shí)僅為原始劑量的1/16，半衰 期為19分鐘(Finter 1966)。Gresser et al (1967)靜脈注射小白鼠128000單位干擾素， 1分鐘后血清中保存3840單位/毫升，1小時(shí)后僅80單位/毫升，半衰期為7分鐘。Ho等 (1967)給1公斤重家兔靜脈注射100000單位干擾素，在11分鐘之內(nèi)血流干擾素就下降一 半。Bocci等(1967)于700克家兔靜脈注射17500單位干擾素，發(fā)現(xiàn)其半衰期僅2 4分 鐘。靜脈注射后干擾素的清除速度與注射量有關(guān)，注射3X IO5單位干擾素時(shí)6小時(shí)消失， 注射3 X IO6單位，12小時(shí)消失；注射3 X IO7單位，36小時(shí)消失。干擾素制品的純度對(duì)靜脈 注射干擾素的清除無影響(Cantell et al 1976)。肌肉注射干擾素后在血流中干擾素維持的時(shí)間比靜脈注射要長。Cantell等報(bào) 道(1973)，人白細(xì)胞干擾素3X IO6單位或者家兔干擾素肌肉注射家兔后，在12小時(shí)內(nèi)血 清中可以維持相對(duì)穩(wěn)定的干擾素水平。高劑量可以使干擾素的水平上升，并延長血清中干 擾素持續(xù)時(shí)間。1次肌肉注射30X IO6單位人干擾素后48小時(shí)，血清中尚可測出一定量的 干擾素(40單位左右)。干擾素制品的純度可以影響于肌肉注射后干擾素進(jìn)入血流的速度 (Cantell etall975)。人體肌肉注射IO6單位人白細(xì)胞干擾素后，血清干擾素高峰( 100 單位/毫升)在2小時(shí)后形成，在大約6小時(shí)內(nèi)完全穩(wěn)定，24小時(shí)后仍可以測出低水平的干 擾素(Emodi all975)。皮下注射的結(jié)果與肌肉注射相似。Ho等(1974)證明，在兔腦池內(nèi)或腦室內(nèi)注射干擾素M小時(shí)后，腦脊髓液中干擾素 量可為開始時(shí)干擾素量的 5%，說明干擾素在腦脊髓液中的消失要比血流中慢得多。 DeClercq等(197 報(bào)道，人腦脊髓內(nèi)注射6 X IO5單位干擾素后12 M小時(shí)，腦脊髓液中 可保持相當(dāng)高的干擾素量(800 8000單位/毫升)，這相當(dāng)于注射時(shí)干擾素量的0. 13% 1. 3%，而血清干擾素的水平比腦脊髓液低40 80倍。近幾年來許多蛋白質(zhì)藥物，包括干擾素，經(jīng)過PEG化，或與人白蛋白連接后，延長 干擾素在血液中的濃度，每周或每月注射一次即可，深受患者的歡迎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問題在于提出一種長效重組人干擾素。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題在于提出編碼這種長效重組人干擾素的核苷酸 序列。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題在于提出表達(dá)本發(fā)明干擾素的重組表達(dá)工程菌。本發(fā)明要解決的第四個(gè)技術(shù)問題在于提出本發(fā)明的長效重組人干擾素的表達(dá)和 純化方法。為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
本發(fā)明涉及一種長效重組人干擾素，所述的長效重組人干擾素具有SEQ ID NO :1、 SEQID NO :2或SEQ ID NO 3所示的任一氨基酸序列。本發(fā)明還涉及編碼該長效重組人干擾素的核苷酸序列。其中，本發(fā)明的第一個(gè)優(yōu)選方案為所述核苷酸序列具有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選方案為，所述核苷酸序列以重組人干擾素α 2b為模板，將編 碼第50位賴氨酸和1 位精氨酸的核苷酸進(jìn)行點(diǎn)突變將編碼第50位賴氨酸的核苷酸突 變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列；將編碼1 位精氨酸的核 苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；或?qū)⒕幋a第50位 賴氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，并將編碼126位精氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a 組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第三個(gè)優(yōu)選方案為針對(duì)將編碼第50位賴氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組 氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8所示；針對(duì)編碼1 位精氨酸的核 苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ ID NO 9, SEQ ID N0:10所示。本發(fā)明還涉及一種重組表達(dá)工程菌，所述的重組表達(dá)工程菌含有SEQ ID NO :4、 SEQ IDNO :5或SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第四個(gè)優(yōu)選方案為所述重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建方法為，將目的基因片 段經(jīng)過點(diǎn)突變，得到重組表達(dá)載體PBV220/rhuIFNa2b，將重組表達(dá)載體PBV220/rhuIFNa2b 轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a，構(gòu)建得到重組表達(dá)工程菌pBV220/rhuIFNa2b/DH5a。本發(fā)明的第五個(gè)優(yōu)選方案為本發(fā)明的工程菌的培養(yǎng)方法為挑取陽性重組表達(dá) 工程菌單菌落，接種于培養(yǎng)基，37°C活化過夜后稀釋，于30°C，220 240轉(zhuǎn)/分振搖培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長期，再于42°C，220 240轉(zhuǎn)/分振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)3 5小時(shí)。其中，培養(yǎng)基優(yōu)選LB/ Amp+培養(yǎng)基，稀釋的比例優(yōu)選為重量比1 100。本發(fā)明的第六個(gè)優(yōu)選方案為所述長效重組人干擾素表達(dá)后的純化步驟包括①收集表達(dá)后的菌體，以每克用IOml的預(yù)冷TE溶液懸浮、洗滌菌體，離心，取沉 淀，重復(fù)1 2次；②取步驟1得到的沉淀按每克加5ml預(yù)冷TE溶液，混勻后每50ml加入Img溶菌 酶，混勻，2 8°C反應(yīng)2 6小時(shí)；③將溶菌酶作用后的菌液超聲處理后，再加入4倍體積預(yù)冷的TE溶液，15000轉(zhuǎn)， 2 8°C離心20 30分鐘，收集沉淀；④將沉淀按重量比1 10懸浮于預(yù)冷4M尿素溶液中，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心20 30分鐘，收取沉淀，重復(fù)操作一次；⑤將沉淀按重量比1 15懸浮于預(yù)冷的TRIS液體中，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心20 30分鐘，收取沉淀，重復(fù)操作一次；⑥包涵體裂解按沉淀重量比1 5加入預(yù)冷8M鹽酸胍溶液，攪勻，室溫裂解1 3小時(shí)，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心1 2小時(shí)，收上清；⑦復(fù)性將上清加到2. 5M鹽酸胍溶液中稀釋，然后再加入到Wi值為9. 5的硼 酸-氫氧化鈉緩沖液中稀釋，于2 8°C過夜；⑧濃縮將稀釋后的蛋白復(fù)性液分裝入透析袋中，進(jìn)行濃縮。
其中，濃縮優(yōu)選采用PreiOOOO進(jìn)行濃縮。本發(fā)明純化得到的長效重組人干擾素的檢測方法為參照Familletti等的方法， 采用WISH-VSV系統(tǒng)檢測。將WISH細(xì)胞以10000/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)，加入 4倍系列稀釋的樣品。作用18 M小時(shí)后，換以3% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋100XTCID5tl 的VSV。待病毒對(duì)照組細(xì)胞病變完全后，以結(jié)晶紫顯色，酶標(biāo)儀測A570值。同時(shí)用重組人干 擾素-a 2b標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的長效重組人干擾素在制備治療腫瘤及病毒感染性疾病藥 物中的應(yīng)用，其中，所述的長效重組人干擾素作為所述藥物的活性成分，制備生理上可接受 的各種液體試劑或凍干試劑。根據(jù)干擾素的晶體結(jié)構(gòu)資料，改變蛋白質(zhì)表面1-2個(gè)氨基酸，破壞人血清中常見 的蛋白酶的切割位點(diǎn)，而不影響干擾素的生物學(xué)活性，從而使干擾素對(duì)人血清蛋白酶產(chǎn)生 抵抗，延長干擾素在血清中的濃度，達(dá)到長效的目的；同時(shí)也可對(duì)腸道蛋白酶產(chǎn)生抵抗，為 研制口服包括干擾素提供了基礎(chǔ)。通過實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明的長效重組人干擾素活性的穩(wěn)定 性較突變前有很大的提高，同時(shí)本發(fā)明使用的表達(dá)載體是溫控型原核表達(dá)載體，高拷貝數(shù)、 大容量、強(qiáng)啟動(dòng)子及強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子；表達(dá)效率很高。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明，并不對(duì)本 發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行限制。硼酸氫氧化鈉緩沖液的組成為每升水中加入9. 27g硼酸+3g氫氧化鈉，將PH調(diào)節(jié) 為 9.5 ；LB/Amp+培養(yǎng)基的組成為每升水中含有細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨IOg+細(xì)菌培養(yǎng)用 酵母提取物5g+氯化鈉10g，在1. 034X IO5Pa高壓下蒸汽滅菌20分鐘，冷卻至55°C后加入 Amp,終濃度為50 μ g/ml ；NZY+肉湯培養(yǎng)基的組成為每升水中含有NZ胺IOg+氯化鈉5g+細(xì)菌培養(yǎng)用酵母 提取物5g，NaoH調(diào)節(jié)PH值為7. 5，在1. 034X IO5Pa高壓下蒸汽滅菌20分鐘；使用前加入 過濾滅菌后的 IM MgCl2 12. 5ml, IM MgSO4 12. 5ml，20%葡萄糖 20ml。LB-AMP+-Agar培養(yǎng)基的組成為每升水中含有細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨IOg+細(xì)菌 培養(yǎng)用酵母提取物5g+氯化鈉IOg+細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂15g，在1. 034 X IO5Pa高壓下蒸汽滅菌 20分鐘，冷卻至55°C后加入Amp，終濃度為50 μ g/ml。本發(fā)明中所用到的試劑及設(shè)備均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用到的試劑及設(shè)備。實(shí)施例1重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建設(shè)計(jì)及人工合成干擾素_a2b新基因以已有的重組人干擾素- a 2b為模板，使用QuikChange II Site-DirectedMutagenesis Kit，通過 AlignX 和 Primer5. 0 程序，分別在 50 位和 1 位設(shè) 計(jì)兩對(duì)引物，進(jìn)行點(diǎn)突變，改變其氨基酸50位賴氨酸(AAA)改為組氨酸(CAC)，第1 位精 氨酸(CGT)改為組氨酸(CAC)，構(gòu)建新的干擾素-a 2b基因。具體步驟如下配制如下PCR反應(yīng)體系
IOXbuffer :5 μ 1，干擾素-C^b質(zhì)粒1 μ 1，引物Fl :1.25 μ 1，引物卩2:1.25口1，dNTP 1 μ 1,TaqDNA 聚合酶1 μ 1，7Κ:39·5μ1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?50C、30 秒一95°C、30s，68°C、1 分鐘，68°C、4 分 30 秒，16 個(gè)循環(huán)一4°C。③向上述PCR產(chǎn)物中加入1μ 1 DPn I，混勻，37°C保溫2小時(shí)。④取50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞，加入DPn I消化后的產(chǎn)物4 μ 1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，構(gòu)建 了工程菌 pBV220/rhuIFNa2b/DH5a。轉(zhuǎn)化的步驟如下加入消化產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞冰浴30分鐘，42°C、45秒，再冰浴 2分鐘；加入0. 5ml42°C預(yù)熱的NZY+肉湯培養(yǎng)基，37°C，225 250rpm震蕩培養(yǎng)1小時(shí)；鋪 LB-AMP+-Agar培養(yǎng)基，37 °C過夜培養(yǎng)。實(shí)施例2長效重組人干擾素的純化方法因改造后的菌種長效重組人干擾素-α 2b以不溶性包涵體形式表達(dá)，需裂解溶解 后，經(jīng)過變性復(fù)性過程才能恢復(fù)到與天然構(gòu)象相似的結(jié)構(gòu)，保持其生物學(xué)活性。具體步驟如 下1.收集誘導(dǎo)后菌體，以1 10(g/ml)比例用預(yù)冷TE液懸浮，洗滌菌體，4000轉(zhuǎn)、 4°C、30分鐘離心，去上清取沉淀。2.重復(fù)步驟1.后，沉淀按1 5比例加入預(yù)冷TE，混勻后按1 50比例加入溶 菌酶，充分混勻，2 8°C，作用兩小時(shí)以上。3.溶菌酶作用后的菌液在冰浴環(huán)境中超聲，超聲強(qiáng)度70%，lmin/次，間隔 ^ lmin，鏡檢完整細(xì)胞率低于5%時(shí)結(jié)束超聲，再加入4倍體積預(yù)冷的TE，15000轉(zhuǎn)，20分 鐘，2 8 °C離心，棄上清，收集沉淀。4.將沉淀按重量比1 10懸浮于預(yù)冷4M尿素中，15000轉(zhuǎn)，20分鐘，2 8°C離 心，收取沉淀，重復(fù)操作一次。5.將沉淀按重量比1 15懸浮于預(yù)冷的TRIS液體中，15000轉(zhuǎn)，20分鐘，2 8°C
離心，收取沉淀，重復(fù)操作一次。6.包涵體裂解按沉淀重量比1 5加入預(yù)冷的裂解液即8M鹽酸胍，攪勻，室溫 裂解2小時(shí)，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心1小時(shí)，收上清，稀釋40倍測蛋白濃度。7.復(fù)性將上清加到2. 5M鹽酸胍中稀釋，稀釋后蛋白濃度為％ig/ml，然后再加入 到復(fù)性液中稀釋，稀釋后蛋白濃度為0. lmg/ml，于2 8°C過夜。8.濃縮將稀釋后的蛋白復(fù)性液分裝入透析袋中，以PEG10000進(jìn)行濃縮，得到濃 縮液分裝，-70°C保存，測活備用。實(shí)施例3 抗病毒活性穩(wěn)定性比較通過血清作用檢測本發(fā)明干擾素的抗病毒活性的穩(wěn)定性。血清中的血清蛋白酶會(huì) 降低干擾素的抗病毒活性，在樣品上細(xì)胞測活前將未突變、突變干擾素樣品分別與新鮮人血清以體積比1 4混合，37°C水浴15分鐘，再進(jìn)行抗病毒活性測定，檢測其活性是否降低 及其程度，進(jìn)而說明突變后的干擾素穩(wěn)定性是否有所提高。1.將純化后的未突變干擾素樣品、突變干擾素樣品分別與新鮮人血清以體積比 1 4混合，37°C水浴15分鐘。其中MO為干擾素原始樣品；Ml為50位賴氨酸變?yōu)榻M氨酸的長效重組人干擾素；M2為1 位精氨酸變?yōu)榻M氨酸的長效重組人干擾素；M3為50、1 位氨基酸均變?yōu)榻M氨酸的長效重組人干擾素。MO'為MO純化后經(jīng)血清作用的長效重組人干擾素；Ml'為Ml純化后經(jīng)血清作用的長效重組人干擾素；M2'為M2純化后經(jīng)血清作用的長效重組人干擾素；M3'為M3純化后經(jīng)血清作用的長效重組人干擾素.2.經(jīng)上述步驟處理后的樣品，按照WISH/VSV的干擾素抗病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)操作流 程，測定待測樣品的抗病毒活性。3.比較樣品M0、M1、M2、M3經(jīng)人血清處理15分鐘后，抗病毒活性減少的程度如下MO = 5. 15 X IO6M0，=3. 09 X IO6血清作用前后活性減少了 40%Ml = 1. 80 X IO6Ml，= 1.49X IO6血清作用前后活性減少了 17.2%M2 = 1. 59 X IO5M2，= 1.41 X IO5血清作用前后活性減少了 11.32%M3 = 66119M3，= 62798血清作用前后活性減少了 5. 02%從結(jié)果可以看出突變后干擾素活性的穩(wěn)定性有顯著的增加；同時(shí)突變兩個(gè)位點(diǎn)，穩(wěn)定性最強(qiáng)，對(duì)人血清蛋白酶的抵抗性強(qiáng)。電子序列表<110>北京金迪克生物技術(shù)研究所，北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司<120> —種長效重組人干擾素及其重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法<160>10<170>patent version 2. 1<210>1<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>1MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQHAETIPVLHEMIQQIFNLF STKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE<210>2<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><400>2 MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLF STKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQHITLYLKEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
<210>1<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><400>3MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQHAETIPVLHEMIQQIFNLF STKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQHITLYLKEKKYSPCAWEVV RAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE<210>4<211>501<212>DNA<213>人工序列<220><400>ATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTCTCTGGGTTCTCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCTCAGA TGCGTCGTATCTCTCTGTTCTCTTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAGTTCGGTAACCAG TTCCAGCACGCTGAAACCATCCCGGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCTACCAAAGACTC TTCTGCTGCTTGGGACGAAACCCTGCTGGACAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTT GCGTTATCCAGGGTGTTGGTGTTACCGAAACCCCGCTGATGAAAGAAGACTCTATCCTGGCTGTTCGTAAATACTTC CAGCGTATCACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCG TTCTTTCTCTCTGTCTACCAACCTGCAGGAATCTCTGCGTTCTAAAGAATAA<210>5<211>501<212>DNA<213>人工序列<220>
<400> ATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTCTCTGGGTTCTCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCTCAGATGCGT CGTATCTCTCTGTTCTCTTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAGTTCGGTAACCAGTTCCA GAAAGCTGAAACCATCCCGGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCTACCAAAGACTCTTCTG CTGCTTGGGACGAAACCCTGCTGGACAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTT ATCCAGGGTGTTGGTGTTACCGAAACCCCGCTGATGAAAGAAGACTCTATCCTGGCTGTTCGTAAATACTTCCAGCA CATCACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCTT TCTCTCTGTCTACCAACCTGCAGGAATCTCTGCGTTCTAAAGAATAA<210>6<211>501<212>DNA<213>人工序列<220><400>ATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTCTCTGGGTTCTCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCTCAGATGCGT CGTATCTCTCTGTTCTCTTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAGTTCGGTAACCAGTTCCA GCACGCTGAAACCATCCCGGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCTACCAAAGACTCTTCTG CTGCTTGGGACGAAACCCTGCTGGACAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTT ATCCAGGGTGTTGGTGTTACCGAAACCCCGCTGATGAAAGAAGACTCTATCCTGGCTGTTCGTAAATACTTCCAGCA CATCACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCTT TCTCTCTGTCTACCAACCTGCAGGAATCTCTGCGTTCTAAAGAATAA<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>
GGTAACCAGTTCCAGCACGCTGAAACCATCCCG
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CGGGATGGTTTCAGCGTGCTGGAACTGGTTACC
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<213>人工序列
<220><400>CGTAAATACTTCCAGCACATCACCCTGTACC<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><400>GGTACAGGGTGATGTGCTGGAAGTATTTACG
權(quán)利要求
1.一種長效重組人干擾素，其特征在于，所述的長效重組人干擾素具有SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的任一氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的長效重組人干擾素的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有SEQID NO 4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列以長效重組人干 擾素-α 2 b為模板，針對(duì)編碼第50位賴氨酸和1 位精氨酸的核苷酸設(shè)計(jì)引物，將編碼第50位賴氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID N0:4所示的 核苷酸序列；將編碼1 位精氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID N0:5所示的 核苷酸序列；或?qū)⒕幋a第50位賴氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，并將編碼1 位精氨酸的 核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸，構(gòu)建SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的針對(duì)將編碼第50位賴氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸的引物序列如 SEQID NO 7, SEQ ID NO 8 所示；所述的針對(duì)編碼126位精氨酸的核苷酸突變?yōu)榫幋a組氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ IDNO 9, SEQ ID NO 10 所示。
6.一種重組表達(dá)工程菌，其特征在于，所述的重組表達(dá)工程菌中含有權(quán)利要求3所述 的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)工程菌，其特征在于，所述重組表達(dá)工程菌的構(gòu) 建方法為，將目的基因片段經(jīng)過點(diǎn)突變，得到重組表達(dá)載體pBV220/rhUIFNa2b，將重組表 達(dá)載體PBV220/rhuIFNa2b轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Dffia，構(gòu)建得到重組表達(dá)工程菌pBV220/ rhuIFNa2b/DH5a。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)工程菌，其特征在于，所述重組表達(dá)工程菌的培 養(yǎng)方法為挑取陽性重組表達(dá)工程菌單菌落，接種于培養(yǎng)基中，37°C活化過夜后稀釋，于 300C，220 240轉(zhuǎn)/分振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，再于42°C，220 240轉(zhuǎn)/分振搖誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 5小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效重組人干擾素，其特征在于，所述長效重組人干擾素表 達(dá)后的純化步驟包括①收集表達(dá)后的菌體，以每克用IOml的預(yù)冷TE溶液懸浮、洗滌菌體，離心，取沉淀，重 復(fù)1 2次；②取步驟1得到的沉淀按每克加5ml預(yù)冷TE溶液，混勻后每50ml加入Img溶菌酶，混 勻，2 8°C反應(yīng)2 6小時(shí)；③將溶菌酶作用后的菌液超聲處理后，再加入4倍體積預(yù)冷的TE溶液，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心20 30分鐘，收集沉淀；④將沉淀按重量比1 10懸浮于預(yù)冷4M尿素溶液中，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心20 30 分鐘，收取沉淀，重復(fù)操作一次；⑤將沉淀按重量比1 15懸浮于預(yù)冷的TRIS液體中，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心20 30分鐘，收取沉淀，重復(fù)操作一次；⑥包涵體裂解按沉淀重量比1 5加入預(yù)冷8M鹽酸胍溶液，攪勻，室溫裂解1 3小 時(shí)，15000轉(zhuǎn)，2 8°C離心1 2小時(shí)，收上清；⑦復(fù)性將上清加到2.5M鹽酸胍溶液中稀釋，然后再加入到Wi值為9. 5的硼酸-氫氧 化鈉緩沖液中稀釋，于2 8°C過夜；⑧濃縮將稀釋后的蛋白復(fù)性液分裝入透析袋中，進(jìn)行濃縮。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效重組人干擾素在制備治療腫瘤及病毒感染性疾病藥物 中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的長效重組人干擾素應(yīng)用，其特征在于，所述的長效重組人 干擾素作為所述藥物的活性成分，制備生理上可接受的各種液體試劑或凍干試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長效重組人干擾素及其表達(dá)純化方法、重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建，具體講，涉及一種經(jīng)過點(diǎn)突變的長效重組人干擾素，以及其表達(dá)純化方法和重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建。所述的長效重組人干擾素具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示的任一氨基酸序列，編碼長效重組人干擾素的核苷酸具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ IDNO6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的長效重組人干擾素具有穩(wěn)定性強(qiáng)，對(duì)人血清蛋白酶的抵抗性強(qiáng)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102146133SQ20101030126
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者侯云德, 高寒春 申請人:北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司, 北京金迪克生物技術(shù)研究所