專利名稱：一種采用pcr特異檢測片形吸蟲的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒，特別涉及肝片吸蟲、大片吸蟲、 中間型吸蟲成蟲、尾蚴、蟲卵的特異PCR檢測，具體來說是一種采用PCR特異檢測片形吸蟲 的試劑盒。
背景技術(shù)：
片形吸蟲病是由片形科(Fasciolidae)片形屬(Fasciola)吸蟲(肝片吸蟲、大片 吸蟲、中間型吸蟲)寄生于家畜肝臟、膽管而引起的一種蠕蟲病。主要發(fā)生于反芻動物(黃 牛、水牛、綿羊、山羊、駱駝等)，協(xié)診癥狀主要是營養(yǎng)障礙和中毒所引起的慢性消瘦和衰竭； 病理特征是慢性膽管炎及肝炎。人也可以感染片形吸蟲。本病病原主要為肝片形吸蟲和大 片形吸蟲兩種，目前在越南還發(fā)現(xiàn)中間型吸蟲感染動物和人的報道。三種吸蟲成蟲形態(tài)基 本相似，蟲體扁平，呈柳葉狀。肝片吸蟲長20-35毫米，寬5-13毫米，色紅褐，呈扁平的葉片 狀，蟲體肩部寬而明顯；大片吸蟲長33-76毫米，寬5-12毫米，肩部不明顯，后端鈍圓。中間 吸蟲的形態(tài)很難有確定的描述，某些中間型吸蟲的形態(tài)近似肝片吸蟲，某些中間型吸蟲的 形態(tài)又近似大片吸蟲，所以，在中間型吸蟲的分類定位方面，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)較難區(qū)分中間型 吸蟲。近年來，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法已在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域廣泛 應(yīng)用。PCR以其簡便、快速、特異、敏感等優(yōu)勢已在人及動物寄生蟲病的診斷中應(yīng)用，片形吸 蟲病的診斷方法主要是通過形態(tài)學(xué)檢測成蟲和感染動物排出的蟲卵。建立片形吸蟲特異 PCR診斷方法的關(guān)鍵是尋找敏感、特異的遺傳標(biāo)記。綜上所述，現(xiàn)有檢測方法存在檢出率不高、假陽性較多、費(fèi)時費(fèi)力，容易出現(xiàn)誤診 和漏診，敏感性有限等問題，迫切需要探討一種使用方便、靈敏度高，且適合用于尾蚴和蟲 卵的快速檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用PCR特異檢測片形吸蟲的試劑盒，所述的這種采 用PCR特異檢測片形吸蟲的試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測片形吸蟲的方法檢出率不高、假 陽性較多、費(fèi)時費(fèi)力，容易出現(xiàn)誤診和漏診，敏感性有限的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，含有DNA裂解液、PCR反 應(yīng)液和肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲DNA陽性對照液，所述的DNA裂解液中由細(xì)胞裂解 液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液 的終濃度為7-10 μ Μ,所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的終濃度為0. 5Μ，所述的蛋白酶 K在所述的DNA裂解液中的終濃度為18-20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的終 濃度為3-5uM，所述的PCR反應(yīng)液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、 擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物與MgCl2配制而成，所 述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游弓丨物的序列為5 ‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3，，所述的擴(kuò)增大片吸
3蟲的下游引物為5 ‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3，，擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物 的序列為5 ‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3，，在所述的PCR反應(yīng)液中，所述的dATP、dTTP、dGTP 和dCTP的終濃度均為200μΜ，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物 和擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的終濃度均為50ρπιΟ1/μ L，所述的MgCl2的終 濃度為2mM。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有Taq DNA聚合酶。進(jìn)一步的，所述的肝片吸蟲、大片吸蟲和中間型吸蟲DNA陽性對照液的濃度均為 33.0-42ng/μ 1。進(jìn)一步的，所述的Taq DNA聚合酶的濃度為6U/ μ L。進(jìn)一步的，所述的Taq DNA聚合酶的體積為25 μ L。本發(fā)明還提供了一種采用特異PCR方法檢測片型吸蟲的方法，包括如下步驟(1)對未知吸蟲的成蟲、尾蚴、蟲卵進(jìn)行DNA的提?。?2)以上述提取的DNA作為模板，利用PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，所述的PCR反應(yīng) 液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物、 擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物與MgCl2配制而成，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的 下游引物的序列為5 ‘ -CCAATGACAAAGTGACAGCG-3 ’，所述的擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物 為5 ‘ -CCAATGACAAAGTAACAGCA-3 ’，擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的序列為 5 '-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3'；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察。進(jìn)一步的，PCR擴(kuò)增條件為:92-95°C 預(yù)變性 4-6min ;92-95°C 變性 25-35sec、 50-60°C退火 25-35sec、70-74°C延伸 25_35sec，30-40 個循環(huán)；70_74°C后延伸 4_6min。進(jìn)一步的，在所述的PCR反應(yīng)液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的終濃度均 為200 μ M，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物和擴(kuò)增肝片吸蟲和 大片吸蟲的共用上游引物的終濃度均為50pmol/yL，所述的MgCl2的終濃度為2mM。本發(fā)明同時提供了所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟(I)DNA的提取蟲體材料置于1. 5mL的離心管中，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次，移 去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA，56°C過夜消化15_18h ；消化好 的蟲體懸液按 Promega 試劑盒Wizard SV Genomic DNA purification system 使用說明 提取蟲體DNA，直接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。尾蚴DNA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復(fù)洗5次，用兩個載玻片將其壓 碎，去掉外面的螺殼，螺肉內(nèi)尾蚴的提取方法參照蟲體的提取方法。蟲卵DNA的提取方法參照MUller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0. 1克陽 性糞便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氫氧化鉀的溶 液Iml室溫下作用lOmin，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前面的步 驟清洗兩次。離心去上清后加入1. 2ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離心5min。 此時蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200 μ 1上清到另一個1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留100 μ 1左右液體， 用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心管內(nèi)加滿雙蒸 水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1. 2ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5次。最后離心去上清，保留30 μ 1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個、3個、5個蟲卵到含有 30 μ 1雙蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3μ 1上清PCR擴(kuò)增。(2) PCR擴(kuò)增按照擴(kuò)增樣品數(shù)η (η =樣品數(shù)+2)取PCR反應(yīng)液、TaqDNA酶混合于 一離心管中，混勻，分裝；將陽、陰性對照液分別加入一個分裝管中，取各樣品的DNA加入對 應(yīng)反應(yīng)管中；各反應(yīng)管標(biāo)記后離心混勻，置于PCR儀上反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物觀察取擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣于1. 0%瓊脂糖凝膠上，電泳后置于紫外 透射儀下觀察結(jié)果并拍照分析。步驟⑵所述TaqDNA酶按每個PCR反應(yīng)含1. 25U加入。步驟(2)所述PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30seC、55°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 個循環(huán)；72°C后延伸 5min。本發(fā)明試劑盒PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化過程為Mg2+濃度梯度在1. 5mM至3. OmM之間、退火溫度在50°C至60°C之間進(jìn)行調(diào)整，以取 得用ITS-2PCR擴(kuò)增的最佳Mg2+濃度和最佳退火溫度。經(jīng)試驗(yàn)確定，最佳退火溫度為60°C ； MgCl2的濃度為2. 5mM ；循環(huán)數(shù)選擇為35個循環(huán)。本發(fā)明尤其適用于中間宿主螺中尾蚴和感染動物排出的蟲卵的檢測。本發(fā)明通過對來自于全球不同流行區(qū)(中國、尼日爾、法國、美國、西班牙)片形吸 蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲卵進(jìn)行快速檢測。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，利用三種片形吸蟲擴(kuò)增了核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-2基因(The second internal transcribed spacers (ITS-2) ofnuclear ribosomal DNA)白勺差異設(shè)計了 兩對特異引物，發(fā)現(xiàn)了該段基因能特異的區(qū)分肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲和其他常見 感染人的寄生蟲。本申請人根據(jù)片形吸蟲ITS-2基因的特性并結(jié)合PCR技術(shù)的檢測特點(diǎn)， 設(shè)計一種片形吸蟲特異PCR檢測的方法。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明通過對來自于不同流行區(qū)的片形吸蟲分離株進(jìn)行遺傳變異分析，通過 測序發(fā)現(xiàn)大片吸蟲的ITS-2序列全長為361bp，肝片吸蟲的ITS-2序列全長為362bp，兩個 蟲種的變異位點(diǎn)共有6個，但都很分散。設(shè)計引物時選擇了 ITS-2序列第270bp-290bp之 間的序列作為下游引物，涵蓋兩個變異位點(diǎn)，并將271bp處的堿基A錯配成G。本申請人根 據(jù)上述兩個變異位點(diǎn)設(shè)計一種特異反應(yīng)體系，建立了用于鑒別肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型 吸蟲的快速、特異、敏感的檢測方法。(2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種鑒別云肝片吸蟲、大片吸蟲、中 間型吸蟲的特異性檢測試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客 觀，不僅可用于人和動物片形吸蟲病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查，還可用于研究片形吸蟲分子鑒定 標(biāo)記的開發(fā)與分析等科研用途，為片形吸蟲病診斷和防治技術(shù)等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。


圖1為肝片吸蟲特異性電泳圖譜；其中，M，DL2000marker ； 1-8代表肝片吸蟲，大片吸蟲，中間型吸蟲，日本血吸蟲，同盤吸蟲，胰闊盤吸蟲，牛弓首蛔蟲，水牛DNA ;9為陰性 對照。圖2為為大片吸蟲特異性電泳圖；M，DL2000marker ； 1-8代表肝片吸蟲，大片吸 蟲，中間型吸蟲，日本血吸蟲，同盤吸蟲，胰闊盤吸蟲，牛弓首蛔蟲，水牛DNA ；9為陰性對照。圖3為肝片吸蟲特異PCR敏感性電泳圖譜；1代表DNA濃度為44. 16ng(肝片吸 蟲)；2-7代表DNA稀釋倍數(shù)如下:25，50，100，200，400，800倍；8為陰性對照。圖4為大片吸蟲特異PCR敏感性圖譜；1代表DNA濃度為140. 96ng (大片吸蟲)；
2-7代表DNA稀釋倍數(shù)如下:25，50，100，200，400，800倍；8為陰性對照。圖5為采用特異引物對肝片吸蟲進(jìn)行特異PCR檢測的電泳圖譜；1為大片吸蟲成 蟲陽性對照，2為貴州水牛的大片吸蟲，3為廣西水牛的大片吸蟲，4為來自貴州山羊的肝片 吸蟲，5為來自黑龍江奶牛的中間型吸蟲，6-7為來自四川山羊的肝片吸蟲，8為來自甘肅山 羊的肝片吸蟲，9為來自南京山羊的肝片吸蟲，10為來自法國山羊的肝片吸蟲，11為來自尼 日爾黃牛的肝片吸蟲，12為來自尼日爾綿羊的大片吸蟲，13為陰性對照。圖6為采用特異引物對大片吸蟲特異PCR檢測的電泳圖譜；1為大片吸蟲成蟲陽 性對照，2為貴州水牛的大片吸蟲，3為廣西水牛的大片吸蟲，4為來自貴州山羊的肝片吸 蟲，5為來自黑龍江奶牛的中間型吸蟲，6-7為來自四川山羊的肝片吸蟲，8為來自甘肅山羊 的肝片吸蟲，9為來自南京山羊的肝片吸蟲，10為來自法國山羊的肝片吸蟲，11為來自尼日 爾黃牛的肝片吸蟲，12為來自尼日爾綿羊的大片吸蟲，13為陰性對照。圖7為采用特異引物對來自自然感染大片吸蟲的水牛糞便中的蟲卵進(jìn)行特異PCR 檢測的電泳圖譜；1代表大片吸蟲成蟲樣本(FgGXBl) ；2代表肝片吸蟲成蟲樣本(FhCMA)；
3-11代表感染了大片吸蟲的水牛糞便中的蟲卵樣本；12-17代表單個大片吸蟲蟲卵；18代 表未感染大片吸蟲的水牛的糞便。圖8為采用特異引物對自然感染大片吸蟲尾蚴的中間宿主螺進(jìn)行特異PCR檢測的 電泳圖譜；1代表大片吸蟲成蟲樣本(FgGXBl) ；2代表肝片吸蟲成蟲樣本(FhCMA) ；3_18代 表單個螺樣本(感染大片吸蟲尾蚴)；19代表未感染大片吸蟲尾蚴的中間宿主螺樣本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，含有DNA裂解液、PCR反應(yīng)液 和肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲DNA陽性對照液，所述的DNA裂解液中由細(xì)胞裂解液、 EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液的終 濃度為7-lOuM，所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的終濃度為0. 5M，所述的蛋白酶K在所 述的DNA裂解液中的終濃度為18-20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的終濃度 為3-5uM，所述的PCR反應(yīng)液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增 大片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物與MgCl2配制而成，所述的 擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物的序列為5 ‘-CCAATGACAAAGTGACAGCG-3，，所述的擴(kuò)增大片吸蟲的 下游引物為5 ‘-CCAATGACAAAGTAACAGCA-3，，擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的序 列為 5 ‘-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3，，在所述的 PCR 反應(yīng)液中，所述的 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP的終濃度均為200 μ M，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物和擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的終濃度均為50pmol/yL，所述的MgCl2的終濃 度為2mM。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有Taq DNA聚合酶。進(jìn)一步的，所述的肝片吸蟲、大片吸蟲和中間型吸蟲DNA陽性對照液的濃度均為 33. 0-42. Ong/μ 1。進(jìn)一步的，所述的Taq DNA聚合酶的濃度為6U/ μ L。進(jìn)一步的，所述的Taq DNA聚合酶的體積為25 μ L。實(shí)施例2 —個優(yōu)選的試劑盒試劑盒內(nèi)含DNA裂解液，其中含細(xì)胞裂解液(7 μ Μ)、ρΗ 8. 0的(終濃度0. 5Μ) EDTA、蛋白酶Κ(終濃度20mM)和RNase A溶液(終濃度5 μ M)的混合溶液共IOOml ；PCR反 應(yīng)液100個反應(yīng)(25 μ L/反應(yīng))是終濃度為200 μ M的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，終濃度為 50pmol/yL的擴(kuò)增肝片吸蟲的引物、終濃度為50pmol/y L的擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物、終 濃度為50ρπιΟ1/μ L的擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物、終濃度為2mM的MgCl2的 混合溶液，25yL Taq DNA聚合酶(6U/μ L)；肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲DNA陽性對照 液。 實(shí)施例2試劑盒特異性試驗(yàn)用經(jīng)過DNA有效性驗(yàn)證的肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲對照樣品DNA各1 μ L 為模板，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)空白對照和試劑盒陰、陽性對照。表IPCR擴(kuò)增體系
組份
PCR反應(yīng)液 模板DNA
Taq DNA 聚合酶(8U/pL)
總體積
PCR擴(kuò)增條件 94°C 變性 5min
94°C變性
30sec
體積
23.75μ
Ιμ 0. 25μ
25μ
60°C復(fù)性
72°C 延伸 30sec 72°C 延伸 5min
PCR產(chǎn)物在1. 0% TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系
3Osec 35個循環(huán)
統(tǒng)攝像。 結(jié)果試劑盒分別能夠從肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲(兩種引物均可擴(kuò)出)樣
7本DNA中擴(kuò)出300bp的條帶(圖1和圖2)。實(shí)施例3試劑盒的敏感性試驗(yàn)首先將片形吸蟲成蟲提取DNA后進(jìn)行稀釋，旋渦振蕩混勻，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白測定儀的操作規(guī)程，檢測其總DNA含量。肝片吸蟲為44. 16ng，大 片吸蟲為140. 96ng。按25，50，100，200，400，800倍稀釋DNA, PCR擴(kuò)增條件同上，同時設(shè)空 白對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定其敏感性。試驗(yàn)結(jié)果表明該P(yáng)CR檢 測方法敏感性高，最低能檢測到0. Ilng的肝片吸蟲，0. 35ng的大片吸蟲(圖3和圖4)。實(shí)施例4試劑盒對來自不同地區(qū)片形吸蟲樣本的檢測用經(jīng)過DNA有效性驗(yàn)證的肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲(來自中國、尼日爾、法 國、美國、西班牙)樣品DNA各1 μ L為模板，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè) 空白對照和試劑盒陰、陽性對照。PCR產(chǎn)物在1. 0% TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系 統(tǒng)攝像。結(jié)果試劑盒分別能夠從肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲(兩種引物均可擴(kuò)出)樣 本DNA中擴(kuò)出300bp的條帶(圖5和圖6)。單獨(dú)圖5出來?xiàng)l帶，即表示該片形吸蟲為肝片 吸蟲；單獨(dú)圖6出來?xiàng)l帶，則表示它是大片吸蟲；而兩圖一起出來，則表示它為中間型吸蟲。實(shí)施例5試劑盒的保存期試驗(yàn)將在4°C和-20°C保存1個月、3個月、6個月、9個月的試劑盒對已知樣品進(jìn)行檢 測，擴(kuò)增條件同前述。結(jié)果表明試劑盒可在4°C (Bst酶除外，須-20°C保存)和-20°C保存 長期保存，在試驗(yàn)周期的9個月內(nèi)，在合適保存條件下陽性樣品均能擴(kuò)增出目的亮帶，而陰 性對照無目的亮帶出現(xiàn)。實(shí)施例6試劑盒對自然感染大片吸蟲水牛糞便中蟲卵以及自然感染大片吸蟲尾 蚴的中間宿主螺樣品在診斷中的應(yīng)用1.DNA 樣品大片吸蟲的蟲卵15個樣品、尾蚴樣品16個樣品，70%酒精保存?zhèn)溆谩?. DNA 的提取尾蚴DNA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復(fù)洗5次，用兩個載玻片將其壓 碎，去掉外面的螺殼，螺肉內(nèi)尾蚴的提取方法參照成蟲的提取方法。蟲卵DNA的提取方法參照MUller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0. 1克陽 性糞便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氫氧化鉀的溶 液Iml室溫下作用lOmin，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前面的步 驟清洗兩次。離心去上清后加入1. 2ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離心5min。 此時蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200 μ 1上清到另一個1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留100 μ 1左右液體， 用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心管內(nèi)加滿雙蒸 水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1. 2ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5次。最后離心去上 清，保留30 μ 1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個、3個、5個蟲卵到含有 30 μ 1雙蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。
加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3μ 1上清PCR擴(kuò)增。3. PCR 擴(kuò)增首先應(yīng)用試劑盒對上述抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時做空白對照、陰性對 照和陽性對照。4.瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物在1. 0% TBE瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。5.結(jié)果與分析對事先經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定的肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲 卵樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，以上樣本均能快速被檢測出(圖7和圖8)，證明了所建立的特異PCR 方法能有效快速的檢測肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲感染，還可用于片形吸蟲病的流行 病學(xué)調(diào)查研究。
權(quán)利要求
一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，其特征在于含有DNA裂解液、PCR反應(yīng)液和肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲DNA陽性對照液，所述的DNA裂解液中由細(xì)胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液配制而成，在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液的終濃度為7 10uM，所述的EDTA在所述的DNA裂解液中的終濃度為0.5M，所述的蛋白酶K在所述的DNA裂解液中的終濃度為18 20mM，所述的RNase A在所述的DNA裂解液中的終濃度為3 5uM，所述的PCR反應(yīng)液中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物與MgCl2配制而成，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物的序列為5‘ CCAATGACAAAGTGACAGCG 3’，所述的擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物為5‘ CCAATGACAAAGTAACAGCA 3’，擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的序列為5‘ ATATTGCGGCCATGGGTTAG 3’，在所述的PCR反應(yīng)液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的終濃度均為200μM，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物和擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的終濃度均為50pmol/μL，所述的MgCl2的終濃度為2mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，其特征在于所 述的試劑盒中還含有Taq DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，其特征在于 所述的肝片吸蟲、大片吸蟲和中間型吸蟲DNA陽性對照液的濃度均為33. 0-42. Ong/μ L·
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，其特征在于所 述的Taq DNA聚合酶的濃度為6U/ μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種采用特異PCR檢測片形吸蟲的試劑盒，其特征在于所 述的Taq DNA聚合酶的體積為25 μ L。
6.一種采用特異PCR方法檢測片型吸蟲的方法，其特征在于包括如下步驟(1)對未知吸蟲的成蟲、尾蚴、蟲卵進(jìn)行DNA的提??；(2)以上述提取的DNA作為模板，利用PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，所述的PCR反應(yīng)液 中由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、擴(kuò)增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物、 擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物與MgCl2配制而成，所述的擴(kuò)增肝片吸蟲的 下游引物的序列為5 ‘ -CCAATGACAAAGTGACAGCG-3 ’，所述的擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物 為5 ‘ -CCAATGACAAAGTAACAGCA-3 ’，擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游引物的序列為 5 '-ATATTGCGGCCATGGGTTAG-3'；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種采用特異PCR方法檢測片型吸蟲、的方法，其特征在于 PCR 擴(kuò)增條件為92-95°C預(yù)變性 4-6min ；92-95°C變性 25-35sec、50-60°C退火 25_35sec、 70-74°C延伸 25-35sec，30-40 個循環(huán)；70_74°C后延伸 4_6min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種采用特異PCR方法檢測片型吸蟲、的方法，其特征在于 在所述的PCR反應(yīng)液中，所述的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的終濃度均為200 μ Μ，所述的擴(kuò) 增肝片吸蟲的下游引物、擴(kuò)增大片吸蟲的下游引物和擴(kuò)增肝片吸蟲和大片吸蟲的共用上游 引物的終濃度均為50pmol/ μ L，所述的MgCl2的終濃度為2mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種片形吸蟲特異PCR檢測試劑盒，它含有DNA裂解液、PCR反應(yīng)液和肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲DNA陽性對照液。本發(fā)明還提供了一種采用特異PCR方法檢測片型吸蟲的方法。本發(fā)明可快速、特異、靈敏地檢測螺內(nèi)片形吸蟲尾蚴、感染動物糞便內(nèi)片形吸蟲蟲卵的診斷和檢測。本發(fā)明建立了用于檢測肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲成蟲、尾蚴、蟲卵的快速、特異、敏感的PCR方法，可準(zhǔn)確地鑒定肝片吸蟲、大片吸蟲、中間型吸蟲成蟲、尾蚴、蟲卵。本發(fā)明的試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀，可用于片形吸蟲的快速鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK101962679SQ20101029713
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者朱興全, 李鑫, 艾琳, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所