專利名稱：一種檢測海水氮限制的微藻分子生物學方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海水氮限制的檢測方法，采用實時熒光定量PCR的方法對中肋骨條藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因進行定量檢測，屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾十年來，隨著人類活動的加劇，我國近海海域中營養(yǎng)鹽尤其是N、P的含量急劇增高，海水富營養(yǎng)化現(xiàn)象逐年加重。營養(yǎng)鹽濃度和結(jié)構(gòu)分別對浮游植物的生物量及種類組成有重要影響。對浮游植物的營養(yǎng)狀態(tài)進行準確的評價，將有助于預測赤潮的發(fā)生動態(tài)。在眾多營養(yǎng)鹽中，常被認為是限制性的營養(yǎng)元素有氮、磷及金屬微量元素如鐵等， 其中氮是生物細胞中不可或缺的重要元素之一。在以往評價浮游植物氮限制的研究中， 常見的方法包括營養(yǎng)鹽濃度比例、營養(yǎng)鹽添加實驗及1N標記跟蹤氮攝取率等(Dugdale and Wilkerson 1986 ；Kilham andHecky 1988 ；Collos et al. 1993)。這些傳統(tǒng)的研究手段雖然有助于了解浮游植物與氮缺乏之間的相互關(guān)系，但是仍然存在一些不足之處。自然海水中浮游植物種類組成復雜，不同藻種對營養(yǎng)鹽的需求存在很大差異，所以使用群落全體生長率或生產(chǎn)力來評估浮游植物收營養(yǎng)鹽限制的做法并不恰當。且在傳統(tǒng)的評估方法中，會先將大型浮游動物濾去以去除捕食者效應(yīng)，再將浮游植物置于容器中進行培養(yǎng)，這種做法往往會帶來一定的“培養(yǎng)瓶效應(yīng)”(Dugdale and Wilkerson 1986 ；Fogg and Calvariomartinez 1989 ；Colloset al. 1993)。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基因水平上的研究在海洋生態(tài)學中的應(yīng)用越來越廣泛。利用分子手段，對現(xiàn)場采集的樣品直接分析，避開了培養(yǎng)過程帶來的“培養(yǎng)瓶效應(yīng)”，可對浮游植物的氮限制狀態(tài)進行更準確的評價。浮游植物在受到營養(yǎng)鹽限制時所呈現(xiàn)的細胞生理反應(yīng)大致可分為以下三類 (Straus, 1994 ；La Roche et al. 1999)削減(retrenchment)或向下調(diào)節(jié)生理代謝速率、 補償作用(compensation)、獲取作用(acquisition)。 Nicolausvon Wiren (1997)指出高等植物在缺氮時會誘導增加對硝酸鹽及銨的攝取能力，也就是說細胞會發(fā)展出對氮營養(yǎng)鹽更有效的攝取系統(tǒng)(第三類生理反應(yīng))。而硝酸鹽及銨的攝取則必須經(jīng)由細胞膜上的運輸?shù)鞍走M行轉(zhuǎn)運才能進入細胞內(nèi)，因此通過測定硝酸鹽及銨鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量即可對細胞氮缺乏進行有效評估。至今已在多種浮游植物中發(fā)現(xiàn)硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基 @ (Hildebrand&Dahlin,2000 ；Michael Koltermann, 2003 ；Qinghua He,2004 ；Bongkeun Song, 2007)，都屬于NRT2家族，可以轉(zhuǎn)譯出高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，在缺氮或低硝酸鹽濃度下負責硝酸鹽的轉(zhuǎn)運。中肋骨條藻是廣溫廣鹽的典型代表，分布極廣，是我國沿岸水域常見種，多在夏末秋初形成優(yōu)勢種，并引發(fā)赤潮。因此，通過研究中肋骨條藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平，能夠?qū)λw中氮營養(yǎng)鹽的限制狀況進行準確評估。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測海水中氮限制的微藻分子生物學方法，用于精確評估水體中浮游植物的N限制狀況，預測浮游植物的生長乃至赤潮的發(fā)生動態(tài)。一種檢測海水水體中氮限制的微藻分子生物學方法，包括以下步驟a.采集生長有中肋骨條藻的待檢測海水，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；b.以所得cDNA為模板，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(NRT)為目的基因，ISSrRNA為內(nèi)參基因，進行real-time PCR，測定NRT基因的表達量；C.根據(jù)NRT基因的表達量判斷水體中氮營養(yǎng)鹽的限制情況；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量隨著硝酸鹽濃度的降低而升高，二者呈負相關(guān)關(guān)系，因此可以根據(jù)中肋骨條藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量對水體中氮限制的狀況作出準確定性評價。所述步驟b中，實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為采用STOR Green I染色法進行實時熒光定量PCR，其PCR混合液包括10 μ 1 SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10 μ Μ)各0. 4 0. 6μ 1, Rox Reference Dye 0. 4μ 1, cDNAlO IOOng,以去離子7jC校ιΕ至 20 μ 1 的最終體積；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NRT的real-time引物序列為SCNRTfp5，-GGAGGATTCG TCTCTGACAAGG-3，，SCNRTrp5' -TATGGAACAATACCGTACGATGATC-3，； 18rRNA 引物序列為 SC18SrRNAfp 5’-AGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT-3’，SC18SrRNArp5' -GTTTGATGAACTGCGATTACT AGGA-3，。所述步驟b中實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為95°C 5min ；接著進行40個循環(huán)， 每個循環(huán)包括95°C 5s,60°C 31s ；反應(yīng)完成后進行溶解曲線分析95°C 15s,60°C lmin，然后緩慢升溫至95 °C，連續(xù)記錄熒光信號的變化。所述步驟c中NRT基因表達量的計算采用2_ΔΔ"法，表達量越高表明該水體N限制作用越明顯；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量與初始的硝酸鹽濃度之間的關(guān)系為y =-1. 2147X+225. 52，R2 = 0. 9888，公式中y表示硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量，χ表示初始硝酸鹽濃度。本發(fā)明主要以中肋骨條藻為指示藻種，根據(jù)其硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的相對表達量來指示水體中氮限制的程度。本發(fā)明提供了一種估算海水中氮限制的新方法，可預測浮游植物的生長乃至赤潮的發(fā)生動態(tài)。本發(fā)明的優(yōu)點在于，應(yīng)用分子生物學技術(shù)來研究浮游植物受N限制的狀況，花費時間少，精準度高，應(yīng)用上不需經(jīng)過培養(yǎng)，直接對采樣所得的細胞進行分析，避開培養(yǎng)瓶效應(yīng)帶來的負面影響。


圖1為本發(fā)明實施例所述中肋骨條藻cDNA的SCNRT及SC18SrRNAPCR擴增圖，圖中l(wèi)、DL2000DNAMarker ；2、SCNRT ；3、SC18SrRNA。圖2為本發(fā)明實施例所述中肋骨條藻培養(yǎng)4 后硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平與初始硝酸鹽濃度之間的關(guān)系。圖3為本發(fā)明實施例所述cDNA的SCNRT PCR擴增圖，圖中1、DL2000DNA Marker ；2、中肋骨條藻；3、東海原甲藻；4、塔瑪亞歷山大藻；5、赤潮異彎藻；6、新月菱形藻；7、柔弱角毛藻；8、錐狀斯氏藻；9、偽矮海鏈藻；10、旋轉(zhuǎn)角毛藻；11、球等邊金藻；12、強壯前溝藻； 13、米氏凱倫藻。
具體實施例方式1.設(shè)計引物的有效性驗證中肋骨條藻的培養(yǎng)液的配制方法首先將天然海水經(jīng)孔徑為0. 45 μ m的混合纖維濾膜過濾，置于高壓滅菌鍋中121°C高溫高壓滅菌20min，室溫冷卻后按照f/2改良海水配方(Guillard 1993)添加除硝酸鹽以外的營養(yǎng)鹽，硝酸鹽的添加量為10% f/2，即88. 3 μ M， 培養(yǎng)液具體組分及濃度見表1。接種中肋骨條藻，并培養(yǎng)至對數(shù)生長期。表1培養(yǎng)液中具體組分及摩爾濃度
權(quán)利要求
1.一種檢測海水水體中氮限制的微藻分子生物學方法，其特征在于包括以下步驟a.采集生長有中肋骨條藻的待檢測海水，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；b.以所得cDNA為模板，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因為目的基因，ISSrRNA為內(nèi)參基因，進行 real-time PCR，測定NRT基因的表達量；C.根據(jù)NRT基因的表達量判斷水體中氮營養(yǎng)鹽的限制情況；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量隨著硝酸鹽濃度的降低而升高，二者呈負相關(guān)關(guān)系，因此可以根據(jù)中肋骨條藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量對水體中氮限制的狀況作出準確定性評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特征在于所述步驟b中，實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為采用STOR Green I染色法進行實時熒光定量PCR，其PCR混合液包括10 μ 1 SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10 μ M)各0. 4 0. 6μ 1, Rox Reference Dye 0. 4μ 1, cDNAlO IOOng,以去離子7jC校ιΕ至 20 μ 1 的最終體積；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的real-time引物序列為SCNRTfp5，-GGAGGATTCGTCTCTGACAAGG -3，，SCNRTrp5，-TATGGAACAATACCGTACGATGATC-3，； 18rRNA 引物序列為SC18SrRNAfp5，-AG GTCTGTGATGCCCTTAGATGT-3’，SC18SrRNArp5' -GTTTGATGAACTGCGATTACTAGGA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特征在于所述步驟b中實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95°C 5min ；接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95°C 5s,60°C 31s ； 反應(yīng)完成后進行溶解曲線分析95°C 15s,60°C lmin，然后緩慢升溫至95°C，連續(xù)記錄熒光信號的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微藻分子生物學方法，其特征在于所述步驟c中NRT基因表達量的計算采用2_Δ Δε 法，表達量越高表明該水體N限制作用越明顯；硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量與初始的硝酸鹽濃度之間的關(guān)系為y = -1.2147x+225. 52，公式中y表示硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量，χ表示初始硝酸鹽濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測海水氮限制的微藻分子生物學方法，主要以中肋骨條藻為指示藻種，根據(jù)其硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的相對表達量來指示水體中氮限制的程度。主要包括以下步驟a.提取中肋骨條藻RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；b.以硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因為目的基因，以18S核糖體RNA基因為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I染料染色法實時熒光定量硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量；c.通過比較不同區(qū)域硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量對水體氮限制的狀況進行評價。本發(fā)明提供了一種估算海水中氮限制的新方法，預測浮游植物的生長乃至赤潮的發(fā)生動態(tài)。
文檔編號C12Q1/68GK102399857SQ20101028014
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者俞志明, 劉云, 宋秀賢, 曹西華 申請人:中國科學院海洋研究所