專利名稱：用于預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及血漿miRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙肝療效。本發(fā)明還涉及檢測(cè)miRNA水平的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)感染能引起慢性肝臟疾病并顯著增加罹患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)。 雖然已廣泛使用乙肝表面抗原重組抗原疫苗預(yù)防感染，HBV感染仍然是世界各國(guó)的重要健康問(wèn)題。干擾素α與核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等是HBV感染的主要治療藥物。干擾素治療通常只能在有限的病人中獲得完全應(yīng)答，中止治療后容易復(fù)發(fā)。近年來(lái)應(yīng)用聚乙二醇化干擾素(又稱長(zhǎng)效干擾素，主要有PEG-IFNa加，PEG-IFN α 2b 兩種)顯著提高了 e抗原血清轉(zhuǎn)換(PEG-IFNa加32%，PEG-IFN a 2b 36%)和一小部分病人表面抗原血清轉(zhuǎn)換O. 9%，PEG-IFNa 2a)。然而，長(zhǎng)效干擾素容易引發(fā)如流感樣癥狀、抑郁、性格改變等副作用。核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等，是乙肝逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的有效抑制劑，能阻斷病毒基因組復(fù)制。但是，這類藥物治療不能獲得較高的血清轉(zhuǎn)換率，且有很大一部分病人在停止用藥后復(fù)發(fā)。另外，長(zhǎng)期使用容易引起耐藥突變的形成。盡管近些年在慢性乙肝的治療手段、病毒血清轉(zhuǎn)換率和病毒學(xué)應(yīng)答方面都有了顯著提高，慢性乙肝的治療效果仍不夠理想。特別是長(zhǎng)效干擾素對(duì)于發(fā)展中國(guó)家的低收入家庭非常昂貴。因此，目前急需能夠在治療前預(yù)測(cè)干擾素治療效果的方法，從而為個(gè)人化治療提供解決方案。目前已知的與治療預(yù)后相關(guān)的因素有1.治療前ALT水平，2.治療前HBV DNA, 3.性別，4.肝臟組織學(xué)狀態(tài)，5.治療過(guò)程中HBsAg低度變化動(dòng)態(tài)。然而，目前的指標(biāo)的預(yù)測(cè)能力有限，急需一種能在血液中中檢測(cè)的，有較高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是確定一種能在血液中中檢測(cè)的，有較高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的分子標(biāo)記。近年來(lái)的研究顯示小非編碼RNA(約22和核苷酸)，又稱小RNA(microRNA，miRNA)。 小RNA存在于各類組織中，能通過(guò)與靶mRNA3’未翻譯末端核苷酸配對(duì)促進(jìn)其降解或抑制翻譯。miRNA是由長(zhǎng)前體RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，并被Drosha (—種核酸酶)預(yù)處理后通過(guò) exportin-5介導(dǎo)的出核過(guò)程轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿。miRNA進(jìn)一步被DICER酶剪切，最后形成17- 個(gè)核苷酸的成熟miRNA，并與RISC復(fù)合體結(jié)合，執(zhí)行基因沉默功能。小RNA是一類在血漿中存在的短核苷酸，已有報(bào)道證明可以作為肝臟損傷和妊娠的非常敏感的分子標(biāo)記。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量研究，確定了一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿 miRNA譜，該miRNA譜包括SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA。
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并且，根據(jù)該miRNA譜提供了一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒， 該試劑盒含有針對(duì)SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針核苷酸。同時(shí)，提供了一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，該芯片含有針對(duì)SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針核苷酸。最好的，該芯片含有針對(duì)SEQ ID NO 1-10的miRNA特異性探針核苷酸。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，即檢測(cè)SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA在使用干擾素前血漿、血清樣品中表達(dá)水平，對(duì)樣品中表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異利用統(tǒng)計(jì)方法分析預(yù)測(cè)干擾素療效。所述miRNA中至少一種的表達(dá)水平高于或者低于已知的標(biāo)準(zhǔn)水平。具體的，該方法包括步驟(1)血漿、血清樣本小RNA的抽提，(2) 核酸樣本與具有如SEQ ID No. 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針的芯片進(jìn)行雜交，(3)對(duì)雜交信號(hào)與對(duì)照樣本的雜交結(jié)果進(jìn)行比較。所述的統(tǒng)計(jì)方法是分析樣品中表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異的顯著性。所述的統(tǒng)計(jì)方法包括miRNA表達(dá)譜通過(guò)最大關(guān)聯(lián)度最小冗余度分析對(duì)每個(gè) miRNA評(píng)分；利用近鄰分類算法作為預(yù)測(cè)引擎進(jìn)行類別判斷；特征值遞增分析法和留一法交叉驗(yàn)證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。本發(fā)明中，乙肝病人治療前部分miRNA的表達(dá)譜能夠預(yù)測(cè)干擾素α治療效果，并據(jù)此公開了相關(guān)miRNA的檢測(cè)方法、預(yù)測(cè)模型建立的方法及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一個(gè)獨(dú)特的能夠區(qū)分HBV患者是否對(duì)長(zhǎng)效干擾素或普通干擾素治療應(yīng)答(初期病毒學(xué)應(yīng)答，治療12周大于21og HBVDNA降低)的miRNA表達(dá)譜。此表達(dá)譜由 hsa-miR-1268 SEQID NO. 1/10，has-miR-150* SEQID NO. 2/10, has-miR-22 SEQID N03/10, has-miR-197 SEQID N04/10, hsa_miR-26a SEQID N05/10, has-miR-188_5p SEQID N06/10, has-miR-1471 SEQID N07/10, has-miR-484 SEQID N08/10, has-miR-1181 SEQID N09/10, has-miR-194 SEQID N010/10組成。本發(fā)明提供了血清miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)方法，具體而言，該方法包括步驟，(1)抽提血漿總RNA，(2)利用微陣列結(jié)束檢測(cè)總 RNA中特定miRNA的表達(dá)譜。可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法操作。所述的統(tǒng)計(jì)方法包括下列各項(xiàng)中的一個(gè)或者幾個(gè)(DmiRNA表達(dá)譜通過(guò)最大關(guān)聯(lián)度最小冗余度分析(mRMR)對(duì)每個(gè)miRNA評(píng)分，(2)利用近鄰分類算法(NN)作為預(yù)測(cè)引擎進(jìn)行類別判斷，(3)特征值遞增分析法(IFS)和留一法交叉驗(yàn)證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。利用本發(fā)明的miRNA表達(dá)譜分析了 66例接受長(zhǎng)效干擾素治療的HBV患者樣本，其敏感度為63. 33%和特異度69. 44%。此miRNA譜由10個(gè)特異的核苷酸序列組成，其表達(dá)在無(wú)應(yīng)答和快速應(yīng)答組中有顯著差異。本發(fā)明進(jìn)一步在觀例接受普通干擾素治療的HBV患者中驗(yàn)證了此預(yù)測(cè)模型，并取得了 60. 7%的準(zhǔn)確度。本發(fā)明提供了一種miRNA表達(dá)譜，能夠以較高準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效。與其他已知與療效相關(guān)因素相比，此表達(dá)譜是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。此表達(dá)譜與HBV耐藥突變分析結(jié)合將有助于個(gè)體化治療方案的開展，最終降低治療費(fèi)用并提高完全應(yīng)答的比例。相應(yīng)的檢測(cè)方法方便、快速，成本較低。本發(fā)明同時(shí)還提供了高效、低廉的相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒和芯片。


圖1.優(yōu)化能夠預(yù)測(cè)干擾素療效的miRNA譜流程圖。圖2.十個(gè)miRNA表達(dá)譜在快速應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答組的熱圖顯示。綠色小于平均值-標(biāo)準(zhǔn)差，黑色在平均值-標(biāo)準(zhǔn)差與平均值+標(biāo)準(zhǔn)差之間，紅色大于平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。十個(gè)miRNA依次為hsa-miR-1268 SEQID NO. 1/10，has-miR-150* SEQID NO. 2/10, has-miR-22 SEQID N03/10, has-miR-197 SEQID N04/10, hsa_miR-26a SEQID N05/10, has-miR-188-5p SEQID N06/10, has-miR-1471 SEQID N07/10, has-miR-484 SEQID N08/10, has-miR-1181 SEQID N09/10, has-miR-194 SEQID N010/10。圖3.干擾素療效預(yù)測(cè)的IFS(遞增特征值)曲線圖。X軸，特征值的數(shù)量，Y軸， 去一交互檢驗(yàn)準(zhǔn)確度。在選取10個(gè)特征值時(shí)到達(dá)準(zhǔn)確度達(dá)到最高。圖4.肝臟-血漿miRNA表達(dá)譜的相關(guān)性分析。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)一.實(shí)驗(yàn)材料
本發(fā)明從94例接受長(zhǎng)效干擾素和普通干擾素的慢性乙肝患者中獲得血漿和血清樣本。本研究通過(guò)了倫理委員會(huì)的審核，所有病人都簽署了知情同意書。訓(xùn)練集包括66例接受EG-IFN α 2a (180yg/周)或PEG-1FN α 2b (100 μ g/周)的HBV患者，測(cè)試集中包括沘例接受普通干擾素(IFN_a2b或IFN-a lb，3_5MU/qod)的HBV患者。入組病人的基本臨床數(shù)據(jù)表1所示，其中81.9%為e抗原陽(yáng)性，平均病毒載量為7. 05 Iog10拷貝/毫升。入組排除標(biāo)準(zhǔn)入組的HBV患者在開始治療前6個(gè)月未接受核苷類似物或干擾素治療，病毒載量在5 X IO4拷貝/ml以上，肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶不正常(>1.0 ULN).排除標(biāo)準(zhǔn)包括HIV 或HCV共感染。所有病人都檢測(cè)了 HBV表面抗原，e抗原(雅培AXSYM HBsAg (正常值 0-2S/N) and HBe 2.0 MEIA Kit (正常值0-1. OS/CO),病毒載量通過(guò)定量PCR檢測(cè) (匹基生物)?？焖賾?yīng)答定義為在治療開始后12周HBVDNA有大于21og的降低，小于21og 的降低定義為無(wú)應(yīng)答。二.實(shí)驗(yàn)方法 RNA抽提和miRNA芯片
使用mirVana· PARIS· (Ambion, Austin, TX)試劑盒，從400 μ 1血漿樣本中抽取總 RNA。RNA濃度通過(guò)NanoDrop 1000光譜儀定量(NanoDrop Technologies, ffaltham, ΜΑ)。 從福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本(FFPE)中抽提RNA使用Qiagen RNAeasy FFPE試劑盒。簡(jiǎn)要操作步驟如下用手術(shù)刀將FFPE標(biāo)本從載玻片上刮下，并用二甲苯脫蠟，離心去除二甲苯后，加入100%乙醇去除殘留二甲苯。經(jīng)全速離心和空氣干燥后，F(xiàn)FPE標(biāo)本通過(guò)的蛋白酶K分別在55°C消化15分鐘，80°C消化15分鐘。經(jīng)過(guò)gDNA離心柱去除基因組DNA后， 樣本再經(jīng)過(guò)RNeasy柱，洗滌兩遍后用無(wú)核酸酶水洗脫。miRNA芯片檢測(cè)
本發(fā)明使用人miRNA芯片(Agilent ^Technologies, Santa Clara, CA)比較了 94份血漿標(biāo)本和13份FFPE標(biāo)本.此芯片包含Sanger數(shù)據(jù)庫(kù)V12. 0 851種人類miRNA。將樣本
5總RNA通過(guò)Cy3標(biāo)記，并與芯片雜交，經(jīng)洗滌后芯片通過(guò)G2505C ((Agilent Technologies, Santa Clara, CA)掃描儀進(jìn)行掃描。標(biāo)記和雜交過(guò)程都按照agilent miRNA芯片系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。芯片圖像信息通過(guò)掃描軟件Rev. 5.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)化為強(qiáng)度信息。通過(guò)背景去除，芯片信號(hào)導(dǎo)出到GeneSpring GXlO 軟件(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化再進(jìn)行進(jìn)一步分析。定量RT-PCR
使用mirVANA miRNA抽提試劑盒從100-200 μ 1血漿標(biāo)本中獲取小RNA，具體步驟按產(chǎn)品說(shuō)明書所述。洗脫的RNA通過(guò)Labconco冷凍干燥系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，使用megaplex RT引物庫(kù)和與擴(kuò)增引物庫(kù)(ABI)將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和與擴(kuò)增。獲得的cDNA使用I^aqman miRNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)單個(gè)miRNA進(jìn)行定量。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)94例接受干擾素治療的HBV病人進(jìn)行了 miRNA表達(dá)譜檢測(cè)。本發(fā)明區(qū)分不同初始病毒學(xué)應(yīng)答的策略如圖1所示。一共66例信息充分的病例入組為訓(xùn)練組，通過(guò)將miRNA表達(dá)譜經(jīng)訓(xùn)練后模型在28例的測(cè)試病例中進(jìn)行驗(yàn)證。兩組病人的基本臨床水平相似(表1)，兩組的初始應(yīng)答率分別為45. 5%和35.7% (ρ值0.4948， Fisher， s exact test)。表1.病人的臨床基本數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的HiiRNA譜，其特征在于，該miRNA譜包括 SEQ ID NO 1-10 中一個(gè)或多個(gè) miRNA。
2.一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有針對(duì) SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針核苷酸。
3.一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，其特征在于，該芯片含有針對(duì)SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的芯片，其特征在于，該芯片含有針對(duì)SEQID NO 1_10的miRNA 特異性探針核苷酸。
5.一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，其特征在于，在使用干擾素前，檢測(cè)血漿、血清樣品中SEQ ID NO 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA的表達(dá)水平，對(duì)樣品中上述miRNA 表達(dá)水平與其標(biāo)準(zhǔn)水平的差異利用統(tǒng)計(jì)方法分析，預(yù)測(cè)干擾素療效。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述miRNA中至少一種的表達(dá)水平高于或者低于已知的標(biāo)準(zhǔn)水平。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法包括步驟(1)血漿、血清樣本小 RNA的抽提，(2) 核酸樣本與具有如SEQ ID No. 1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA特異性探針的芯片進(jìn)行雜交，(3)對(duì)雜交信號(hào)與對(duì)照樣本的雜交結(jié)果進(jìn)行比較。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用統(tǒng)計(jì)方法分析樣品中表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異的顯著性。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的統(tǒng)計(jì)方法包括miRNA表達(dá)譜通過(guò)最大關(guān)聯(lián)度最小冗余度分析對(duì)每個(gè)miRNA評(píng)分；利用近鄰分類算法作為預(yù)測(cè)引擎進(jìn)行類別判斷；特征值遞增分析法和留一法交叉驗(yàn)證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜，該miRNA譜包括SEQIDNO1-10中一個(gè)或多個(gè)miRNA。同時(shí)提供了相應(yīng)的、高效、低廉的試劑盒和檢測(cè)芯片以及檢測(cè)方法。本發(fā)明檢測(cè)血漿、血清中miRNA水平，適合應(yīng)用于臨床判斷干擾素治療的有效性。與其他已知與療效相關(guān)因素相比，此表達(dá)譜是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。此表達(dá)譜與HBV耐藥突變分析結(jié)合將有助于個(gè)體化治療方案的開展，最終降低治療費(fèi)用并提高完全應(yīng)答的比例。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102399852SQ20101027556
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者吳景迪, 張占卿, 張小楠, 張欣欣, 張繼明, 王介非, 袁正宏, 鄔敏, 陳曉蓉, 陳良, 黃濤 申請(qǐng)人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心