專利名稱：鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株和美洲毒株的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒別毒株的特異性引物，尤其涉及用于鑒別中國馬傳染性貧血病 毒弱毒疫苗株和美洲毒株的特異性引物，屬于中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株和美洲毒 株的鑒別領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢 病毒屬成員，是馬傳染性貧血病(EIA)的病原。多數(shù)自然感染馬匹呈隱性感染或在初期急 性發(fā)病后，轉(zhuǎn)為長期隱性感染。由于EIAV是包括人類艾滋病病毒的7種慢病毒中基因組最 簡單的病毒，是研究慢病毒的理想病毒之一。1970年代，中國自主研制成功的EIA弱毒疫苗解決了 EIAV免疫預(yù)防的問題，成功 的控制了該病毒在中國的流行。該疫苗株喪失了致病性，可誘導(dǎo)保護性免疫，但仍保持在宿 主體內(nèi)的復(fù)制特性。由于中國EIAV弱毒疫苗是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生對異源性毒株保護性免疫 的慢病毒，對其機理研究十分重要。為此，需要對比EIAV疫苗株和致病性異源強毒株在體 內(nèi)的生物學(xué)特性和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)能力。為此目的，需要建立能夠明確區(qū)別EIAV自然感染馬 和疫苗免疫馬的方法。目前國際動物衛(wèi)生組織OIE推薦的標準EIA檢測方法是瓊脂擴散試驗和酶聯(lián)免疫 吸附試驗，但這些血清學(xué)方法皆不能對疫苗免疫馬和強毒株自然感染馬進行鑒別。此外，這 些針對血清中抗體的檢測方法，受到機體抗體消長而影響檢測的準確性。同時，由于母源抗 體的影響，血清學(xué)的檢測方法也無法廣泛應(yīng)用。因此，有必要建立一種快速，準確，有效的方 法對感染馬匹的中國EIAV弱毒疫苗株與異源性致病毒株(如美洲的EIAVwyrailing株)進行鑒 別。2000年日本學(xué)者Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫 擴增反應(yīng)(LAMP)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反 應(yīng)。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，基因的擴增和產(chǎn) 物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15-60min擴增IO9-IOltl倍，具有不需要特殊儀器、 快速、特異性強的特點，而且結(jié)果判定簡單，既可以利用儀器檢測或肉眼觀察核酸擴增過程 中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀判定，也可以采用肉眼觀察反應(yīng)液的顏色變化來迅速判定。采用LAMP方法鑒別EIAV疫苗株EIAV10123和美洲株EIAVWy。ming，關(guān)鍵示需要針對 EIAVdlv123與EIAVwyrailing的gag所存在的序列差異片段，設(shè)計得到特異性的引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株和美洲毒株的環(huán)介 導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(LAMP)引物。本發(fā)明首先將EIAVdlv123和EIAVWy。ming進行序列比對，找出EIAVDm23與EIAVWy。ming的gag存在序列差異的片段，對各自基因組序列進行篩選，獲得各1000條LAMP引物。然后從 1000條引物中選擇3'端含該差異區(qū)序列的F3/B3引物對，選擇最為保守的gag基因作為 鑒定區(qū)域并設(shè)計引物；其中，用于鑒別EIAV疫苗株EIAVdw123的引物由引物對1和引物對2 所組成，其中，引物對1的序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，引物對2的序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 4所示；用于鑒別美洲株EIAVWy。ming的引物由引物對3和引物對4所 組成，其中，引物對3的序列為SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示，引物對4的序列為SEQ ID N0. 7 和 SEQ ID N0. 8 所示。本發(fā)明的引物對在檢測EIAV疫苗株EIAV10123和美洲株EIAVWy。ming的應(yīng)用方法，包 括將引物對1和引物對2作為檢測EIAV疫苗株EIAV10123引物，將引物對3和引物對4作 為鑒別美洲株EIAVWy。ming的引物，通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)對待檢測模板進行核酸擴增；通 過核酸擴增過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀或觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定所檢測的毒株是 否屬于EIAV疫苗株EIAVDm23或美洲株EIAVWy。ming ；作為參考，所述LAMP反應(yīng)體系為引物(2. 5 μ M)各2μ1，Beataine (5Μ) 4 μ 1， MgSO4(IOOmM) L 5 μ 1，10Χ ThermoPolReactionBuffer 2· 5 μ 1，模板 DNA 2 μ 1，Bst DNA Polymerase (8U) 1 μ 1，加水補至25 μ 1。反應(yīng)條件為65°C恒溫1小時，80°C滅活10分鐘。特異性實驗結(jié)果顯示，在各自LAMP體系中，本發(fā)明所設(shè)計的引物可與模板特異性 結(jié)合，對EIAVmvi23或EIAVWy。ming無交叉反應(yīng)(圖2)。如在反應(yīng)產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR Green 1(1 100)，引物可與模板特異性結(jié)合樣品可見綠色熒光(圖3)，而陰性對照則不發(fā) 生可見綠色熒光。靈敏性實驗結(jié)果顯示，LAMP檢測與PCR檢測相比，具有更高的靈敏度。可以檢測 到6. 4 X IO2質(zhì)?？截?，比PCR法高2個數(shù)量級(圖4)。一系列實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明所設(shè)計的引物所建立的LAMP方法可以準確區(qū) 分中國EIAV弱毒疫苗株EIAV10123和EIAV美洲毒株EIAVWy。ming，該方法具有特異性強、敏感 高等優(yōu)點，可以快速鑒別中國馬傳染性貧血病毒(EIAV)弱毒疫苗株EIAVdw123和EIAV美洲 毒株EIAVWy。ming。該方法檢測過程無需特殊儀器的使用，檢測過程簡便，檢測時間短，結(jié)果判 定簡單。此外，本發(fā)明可同時對不同種類病毒進行檢測，避免檢測過程中的交叉反應(yīng)，并具 有較高檢測靈敏度(IO2拷貝數(shù))，可以滿足多種樣品的檢測要求。


圖lEIAVDm23 與 EIAVWy。ming 毒株 LAMP 引物設(shè)計方案。圖2EIAVDm23與EIAVWy。ming的LAMP反應(yīng)凝膠電泳；(反應(yīng)引物對為M.分子量 標記 DL2000 ；1. EIAVdlv123-H2O ；2. EIAVdlv123-EIAVffyominggag DNA ；3. EIAVdlv123-EIAVdlv123 gag ； 4. EIAVffyoming-H2O ；5. EIAVffyoming-EIAVDLV123gag DNA ；6. EIAVffyoming-EIAVffyoming gag DNA)。圖3EIAVdlv123 與 EIAVwyrailing 的 LAMP 反應(yīng)。加入 SYBR Green 1 (1 100)顯色。圖4EIAVdlv123為例，LAMP與PCR靈敏度實驗；PCR體系=M.分子量標記DL2000 ； 1. IO9 拷貝；2. IO8 拷貝；3. IO7 拷貝；4. IO6 拷貝；5. IO5 拷貝；6. IO4 拷貝；7. IO3 拷貝；8. IO2 拷貝；9. IO1拷貝；10.水對照；LAMP體系:M.分子量標記DL2000 ；11. IO9拷貝；12. IO8拷貝； 13. IO7拷貝；14. IO6拷貝；15. IO5拷貝；16. IO4拷貝；17. IO3拷貝；18. IO2拷貝；19. IO1 拷貝； 20.水對照。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1LAMP方法鑒別EIAV疫苗株EIAV10123和美洲株EIAVWy。ming，其引物設(shè)計是關(guān)鍵。本發(fā) 明通過http://primerexplorer. jp/e/提供的PrimerExplorer V3軟件，對根據(jù)各自基因 組序列進行篩選，獲得各1000條LAMP引物。通過核酸序列比對，找出EIAV10123與EIAVWy。ming 的gag存在序列差異的片段，然后從1000條引物中選擇3'端含該差異區(qū)序列的F3/B3引 物對，作為各自毒株的LAMP擴增引物(圖1，表1)。表 IEIAV10123 和 EIAVwyrailing 毒株 LAMP 引物
PrimerEIAVdlv123 (5'-3')EIAVwyoming (5'-3')
F3CTGGCAATTAAAGGATGTCATGACGGTACAAGGGTCTCAΒ3CTCAGACTGCTTTTTGGTAGCCCACCATGTTCTTTCAAAGFIPGCCCACCAAGTTTTTTCAAATGCTTGCCAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTTTTCCATTGTTAGAGGGCGTTTTTCTGGTAACTGTAATTGGGCGBIPGCCGTTAAGATGGGCTTACAAATTAAGCTGAGGGATGTCATTCCATTTTTTTTTCTTTCTTTCAAACTTGGCTTCCTCTCTTTCTTGTCCTGACLAMP 反應(yīng)體系為F3/B3/FIP/BIP(2. 5μΜ)各 2μ 1，Beataine(5M)4y 1， MgSO4(IOOmM) L 5 μ 1，IOX ThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ 1,模板 DNA 2 μ 1，Bst DNA Polymerase (8U) 1 μ 1，加水補至25μ 1。反應(yīng)條件為65°C恒溫1小時，80°C滅活10分鐘。同時，為了檢驗是否存在交叉反應(yīng)，在EIAVmvi23的反應(yīng)體系中加入EIAVWy。minggag DNA模板，在EIAVwyrailing的反應(yīng)體系中加入EIAVDm23gag DNA模板。凝膠電泳未檢出條帶， SYBR Green 1(1 100)檢測未出現(xiàn)綠色熒光等陽性反應(yīng)。試驗例1特異性檢測試驗分別用EIAVmvi23與EIAVWy。ming的特異引物構(gòu)建LAMP體系，在EIAV10123的反應(yīng)體系 中加入EIAVWy。ming gag DNA模板，在EIAVWy。ming的反應(yīng)體系中加入EIAVDm23gag DNA模板，各 2 μ 1，反應(yīng)條件為65°C恒溫1小時，80°C滅活10分鐘。特異性試驗結(jié)果顯示，在各自LAMP體系中，本發(fā)明所設(shè)計的引物可與模板特異性 結(jié)合，對EIAVmvi23或EIAVWy。ming無交叉反應(yīng)(圖2)。如在反應(yīng)產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR Green 1(1 100)，引物可與模板特異性結(jié)合樣品可見綠色熒光(圖3)，而陰性對照則不發(fā) 生可見綠色熒光。試驗例2靈敏性檢測試驗以EIAV10123為例說明，將EIAVDm23gag片段連入T載體，獲得EIAVDm23T-gag質(zhì)粒， 紫外分光光度計測得核酸濃度為15 μ g/ml, 10倍倍比稀釋備用，以F3/B3為PCR引物，退火 540C，LAMP反應(yīng)條件同上，模板均為2 μ 1。
通過公式(6.02\ 1023 拷貝數(shù)/摩爾)\(濃度8/^1)/(麗8/11101) = copies/μ 1 計算拷貝數(shù)。LAMP檢測到6. 4X IO2質(zhì)粒拷貝，較之平行進行的PCR反應(yīng)靈敏度高約100倍。 2個數(shù)量級(圖4)。
權(quán)利要求
鑒別中國馬傳染性貧血病毒(Equine infectious ahemia virus)弱毒疫苗株EIAVDLV123和美洲毒株EIAVWyoming的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)引物，其特征在于用于鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株EIAVDLV123的引物由引物對1和引物對2所組成，其中，引物對1的為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，引物對2為SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；用于鑒別美洲株EIAVWyoming的引物由引物對3和引物對4所組成，其中，引物對3為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，引物對4為SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)引物在制備檢測中國馬傳染性貧血病毒弱 毒疫苗株EIAV10123和美洲毒株EIAVWy。ming試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株和美洲毒株的引物。鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株的引物由引物對1和引物對2所組成，其中，引物對1的序列為SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，引物對2序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；鑒別美洲株的引物由引物對3和引物對4所組成，引物對3的序列為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，引物對4的序列為SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。以本發(fā)明特異性引物所建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法，可以準確的鑒別中國馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗株和美洲毒株，該方法特異性強、靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK101935714SQ20101027429
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者呂曉玲, 周建華, 姜成剛, 李利, 林躍智, 王雪峰, 趙立平 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所