專利名稱：一種用zbtb38基因檢測黃牛體型大小的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物學領域，特別是涉及一種用鋅指和含BTB域38基因(ZBTB38)基 因預示和檢測秦川牛體尺大小的檢測方法，該方法能夠檢測出黃牛體長、體高、腰高、尻長、 腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬，尤其是體長、體高和尻長。
背景技術：
數千年來，我國的黃?；旧现蛔饕塾?，因此大多數品種達不到國際肉用牛的性 能要求，但它是我國肉牛的種源基礎。分布在黃河中下游、淮河流域以北的陜西、河南、山 西、山東等地的秦川牛、南陽牛、魯西牛、晉南牛和吉林等地的延邊牛被公認為我國五大良 種黃牛品種，是作為雜交母本生產優(yōu)質牛肉的主要品種，我國牛肉總量的80%都來自這些 品種及其與國外品種的雜交后代。中國黃牛品種肉用性能比較突出，如大理石花紋好、屠宰 率和凈肉率高等，值得在育種和生產中強化利用，其肉用改良正在生產實踐中逐步推行。體尺大小是評價黃牛品種優(yōu)劣和生產性能高低的重要指標，而且研究牛體尺大小 已經成為一個突出的問題。在長期的選育過程中，隨著中國黃牛從役用到現在的肉役兼用， 一部分體形較小的個體已經遭到淘汰，但選育較大體形黃牛個體仍是中國黃牛肉用選育的 重要目標。鋅指和含BTB域38 基因(Zinc finger and BTB domain containing 38，ZBTB38) 基因，在鼠上被稱為ZENON基因，在人上被稱為ZBTB38基因。該基因能夠促進和抑制H19/ IGF2的甲基化區(qū)域的等位基因發(fā)生甲基化(Filion等，2006，Kiefer等，2005，Sasai等， 2005)。Sasai (2005)克隆了人ZBTB38基因，并分析了它的分子特征，發(fā)現該基因由2個獨 立的區(qū)域(BTB區(qū)和附屬區(qū)域)抑制轉錄。Kiefer (2005)發(fā)現ZBTB38基因與許多通過特異 性結合甲基化DNA形式來抑制轉錄的編碼蛋白顯著相關。Filion (2006)鼠ZBTB38基因 不依賴甲基化調節(jié)兒茶酚酞合成的限速酶——酪氨酸羥化酶基因的轉錄。人類基因組中共 預測有數百個編碼含BTB結構域蛋白的基因，BTB結構域是一個進化保守的蛋白互作結構 域，位于該家族蛋白的N末端區(qū)域，屬C2H2型鋅指轉錄因子(Zollman等，1994)。BTB結構 域通過與鋒指結構域(zinc finger domain)、bZIP結構域(basic region leucine zipper domain)^ kelch MM(kelch repeats)^ MATH ^nSSMMCankyrin repeats) φ 結構域，通過協(xié)同作用行使轉錄調節(jié)、造血、染色質重塑、腫瘤發(fā)生、干細胞穩(wěn)態(tài)、細胞骨架 組織、蛋白降解以及發(fā)育等生物學功能(Aravind等，1999 ；Albagli等，1995 ；Costoya等， 2007)。人ΖΒΤΒ38基因與具有相似蛋白模塊結構的ΖΒΤΒ17、ΖΒΤΒ7、HIC-I等基因都與細胞 分化、腫瘤發(fā)生有關(Filion 等，2006 ；Maeda 等，2005 ；Patel 等，2006 ；Pinte 等，2004)。 Melnick(2000)通過研究把人ZBTB38基因的BTB結構域序列與人轉錄抑制子PLZF、HIC_1、 BCL6、ZBTB17和ZBTB7進行比對，發(fā)現作為PLZF蛋白二聚體晶體結構關鍵成分的保守殘基 在ZBTB38和HIC-1、BCL6、ZBTB17、ZBTB7中也存在，并且都包含形成α螺旋的氨基酸簇， 這些基因都屬轉錄因子，被定位于細胞核。國夕卜許多研究(Gudbjartsson等，2008 ；Lettre 等，2008 ；Mateescu 等，2005 ；Weedon等，2008)證實了 ZBTB38基因的多態(tài)位點對于影響人類體高和形態(tài)大小有明顯 的生物學作用。目前，牛ZBTB38基因突變引起的遺傳學效應國內外文獻中未見報道。 Gudbjartsson (2008)認為人ZBTB38基因通過調節(jié)IGF II的生成來影響成年人的形態(tài) 大小，發(fā)現了 ZBTB38基因的多態(tài)位點(rs6763931)的A等位基因突變與人類身高顯著相 關(P=L 4X10-27)，并且該位點所在序列在血液和脂肪組織中高度表達。Lettre (2008) 在ZBTB38等基因上發(fā)現了幾個與人類身高和形態(tài)大小有顯著相關新多態(tài)位點，其中 rs724016位點位于內含子上，與顯著的影響人類身高(P=5.0X10-12)。同時，通過運用 全基因組掃描方法，發(fā)現了 ZBTB38基因的多態(tài)位點(rs6440003)與成年人身高顯著相關 (rs6440003，P=l. 8X10-24)。Mateescu (2005)和 Weedon (2008)分別用全基因組掃描方 法證實了 ZBTB38基因的多態(tài)位點與人類形態(tài)大小有顯著關系。綜上所述，國內外大量的研究報道都證實了 ZBTB38基因可以用來預示和檢測人 的身高和坐高等外形特征，鑒于此，申請人在ZBTB38基因作為預示和檢測中國黃牛該方法 能夠檢測出黃牛體長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬等指標的候選基因 方面進行了深入研究。以下是和本申請相關的主要參考文獻
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發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提供一種用ZBTB38基因檢測黃牛體型大小的方法，該方法采用 分子生物學技術，即采用直接測序的方法來檢測牛ZBTB38基因的序列，通過9個變異位點 基因型的分析、比較，從而預測和確定該黃牛的體型大小。為了實現上述任務，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現
一種用ZBTB38基因檢測黃牛體型大小的方法，其特征在于，該方法按如下步驟進行 步驟一，根據牛ZBTB38基因序列設計一對引物ZBTB38F和ZBTB38R，其中 ZBTB38F 5' CTG TGA GTA ACG GCA GTG AGA AC 3' ZBTB38R 5' GTC ACT GGC ATC GTC AAA CAT C 3'；
步驟二，利用該對引物對牛的基因組DNA進行PCR擴增，得到由ZBTB38F和ZBTB38R表 示的引物擴增的第一外顯子區(qū)的擴增片段，該擴增片段的長度為647bp ；
步驟三，將PCR反應產物用PCR產物純化試劑盒進行回收、純化，并對純化后產物進行 反向測序。步驟四，根據測序結果檢測出ZBTB38基因外顯子1的第2145位、2286位、2323位、 2325位、2409位、2457位、2583位、2643位和2676位共9個位點處形成的T/C、T/C、G/A、 C/T、T/C、G/C、C/T、G/A 和 G/A 共 9 個突變，分別命名為 T2145C、T2286C、G2323A、C2325T、 T2409C、G2457C、C2583T、G2643A 和 G2676A。步驟五，連鎖不平衡分析發(fā)現T2145C、T2286C、G2457C、C2583T、G2643A、G2676A 六個SNP之間緊密連鎖(r2>0. 33)，但與其他3個SNP連鎖不緊密(r2<0. 33)，可以作為一個 整體進行關聯分析，選用T2145C為代表；G2323A和C2325T之間緊密連鎖(r2>0. 33)，但與其 他7個SNP連鎖不緊密(r2<0. 33)，可以作為一個整體進行關聯分析，選用G2323A為代表； T2409C與其它8個SNP的連鎖不緊密(r2<0. 33)，需要單獨進行關聯分析。步驟六，考慮多種影響因素，對T2145C、G2323A和T2409C 3個變異位點的聯合 基因型與黃牛體尺性狀進行關聯分析，結果發(fā)現3個代表位點的聯合基因型中TTAATT和 TCGATC基因型的體尺性狀都比其他基因型高。步驟七，考慮多種影響因素，在對3個變異位點聯合基因型于黃牛體尺性狀關聯 分析的基礎上，單獨進行3個變異位點基因型與黃牛體尺的關聯分析結果發(fā)現T2145C和 T2409C的基因型與黃牛群體體尺性狀指標無顯著相關(P>0. 05)。G2323A基因型與黃牛群 體的體長、體高和尻長顯著相關(P<0. 05)，GA型個體的體長顯著高于AA型個體(P<0. 05)， GG和GA型個體的體高極顯著高于AA型個體(P<0. 01)，GG和GA型個體的尻長顯著高于AA 型個體(P<0. 05)。本發(fā)明分析基因多態(tài)性的方法所帶來的技術效果是 1、通過檢測堿基的突變而分類的基因型。2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。3、其中用于分析基因多態(tài)性的序列片段是由ZBTB38F和ZBTB38R表示的引物擴增 的第一外顯子區(qū)。4、其中分析多態(tài)性的位點選擇已知的牛ZBTB38基因如下序列中47位的T-C堿基 突變、188位的T-C堿基突變、225位的的G-A堿基突變、227位的C-T堿基突變、311位的 T-C堿基突變、359位的G-C堿基突變、485位的C-T堿基突變、545位的G-A堿基突變、578位的G-A的堿基突變CTGTGAGTAACGGCAGTGAGAACTCCACCTCTGTGATCAGCTACAGNGGC50TCAGCCCCCTCGGTCATCGTGCACAGCAGCCAGTTTTCATCGGTGATAAT100GCACAGCAATGCCATTGCTGCCATGACCAGCCGCAACCCCAGAGGAGCTC150CTTCAGACCAGACTGTCAGTCAGACCCCAAAAGAGGANGGCAAGCCCGCC200GAGCCAGACAAAGTTGGGAGGGCCNTNAGCAGACCCAAGAGCATGAAGGA250GAAAAAGAAAGCCGGCCCGTGTAGCAGGGGAGAAGTACCAGAGGAGTCCA300AATTCACTGCNGATCCTGGAGGCTCACTGGGCAAAACTACAAATACCATT350AAAGAAACNAGTAAAATTGAAACCTACATCGCAAAGCCCGCTCTCCCTGG400AACCTCCACAAACAGCAACGTCGCACCCCTTTGTCAAATAACGGTGAAAA450TCGGAAATGAAGCCATTGTGAAGAGGCACATCCTNGGCTCTAAACTGTTC500TATAAGAGAGGGCGGAGACCCAAGTATCAAACGCCGGAGGAGACNCTGCC550CCAGGAGAGCGACCAGGAAGCCAACGGNGACAACCCTCTCGGGCTCTGCC600AGTCCGAGTGCATGGAGATGAGCGAGATGTTTGACGATGCCAGTGAC647
5、黃牛的體尺大小包括體長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬。經實驗證明，具有TTAATT和TCGATC聯合基因型個體的體型大小明顯高于其他基 因型個體的體型；GA基因型個體的體長、體高和尻長明顯低于具有AA基因型個體的。在申 請人所研究的中國黃牛群體中，具有GG基因型個體的的體長和腰角寬比AA基因型個體的 體長、體高和尻長分別低7. 17cm、10. 50cm和4. 94cm。本發(fā)明巧妙地采用反向測序的方法檢測牛ZBTB38基因外顯子1的9個變異位點 中有代表性的3個變異位點。本發(fā)明操作簡單、費用低、精確度高，可進行快速檢測。使用本發(fā)明的標記基因型 對黃牛體尺進行選擇時，將可使決定黃牛體型大小的體長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、 胸圍和坐骨端寬等8個性狀分別明顯提高。這樣以來，對于培育肉用黃牛來說無疑是一個 極大的優(yōu)勢，而且可以帶來顯著的經濟效益，將為中國養(yǎng)牛業(yè)帶來廣闊的發(fā)展前景和利潤 空間?？傊?，該研究發(fā)現的標記可以用于黃牛生長性狀的標記輔助選擇，有著重要的生產意 義，為培育肉牛新品種提供了新的方法。


圖 1-9 分別是牛 ZBTB38 基因 T2145C、T2286C、G2323A、C2325T、T2409C、G2457C、 C2583T、G2643A和G2676A 9個變異位點的測序結果圖。其中，圖1是T2145C位點測序圖， 圖，2是T2286C位點測序圖，圖3是G2323A位點測序圖，圖4是C2325T位點測序圖，圖5是 T2409C位點測序圖，圖6是G2457C位點測序圖，圖7是C2583T位點測序圖，圖8是G2643A 位點測序圖，圖9是G2676A位點測序圖10是牛ZBTB38基因9個變異位點的連鎖不平衡分析圖。圖中數字為參數r2值，單 位(％ )，帶顏色的框均大于33%。以下結合具體實驗和發(fā)明人給出的具體實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。
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具體實施例方式一、實驗材料
1.實驗動物和性狀測定
本實驗選取陜西省秦川肉牛良種繁育中心的秦川牛47頭、陜西省秦寶牧業(yè)發(fā)展有限 公司的秦川牛雜交牛組合57頭、河南省南陽牛良種繁育場的南陽牛53頭、河南省郟縣紅牛 保種場的郟縣紅牛56頭、河南省夏南牛良種繁育場的夏南牛59頭、山東省魯西黃牛原種場 的魯西牛52頭、山東省王光集團魯西牛繁育場的西魯雜牛組合49頭和大連雪龍集團有限 公司的雪龍黑牛組合50頭，共計423頭個體實驗牛。實驗各牛均由頸靜脈采血10mL，W A⑶搖勻抗凝(血液A⑶=6:1)，_20°C凍存。實驗牛所測定得性狀包括
體長，從肩胛前緣(肱骨突)到同側坐骨結節(jié)后緣間的距離； 體高，又稱鬌甲高，是自鬌甲最高點到地面的垂直高度； 腰高，又稱十字部高，為兩腰角連線中點至地面的垂直高度； 尻長，又稱臀長，為腰角前緣至坐骨結節(jié)后緣間的距離； 腰角寬，兩腰角外緣間的距離； 胸深，肩胛后緣胸部上、下之間的距離； 胸圍，在肩胛骨后緣處作一垂線，用卷尺饒一周測量的距離； 坐骨端寬，也稱臀端寬或尻寬，為兩坐骨結節(jié)外緣間的寬度。2.藥品和酶
三羥甲基氨基甲烷(TriS)，TriS飽和酚和十二烷基磺酸鈉(SDS)均為北京鼎國生物技 術發(fā)展中心產品；蛋白酶!((Proteinase K)、10XPCR buffer,dNTPsUOObp marker 和 Taq DNA聚合酶為大連寶生物公司產品；瓊脂糖購自北京普博生物技術有限公司；PCR產物純化 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。3.主要儀器
Gradient Cycler PTC-200基因擴增儀、TFM-40紫外可見光成像系統(tǒng)、SZX-ZP超凈工作 臺、DYY-III型電泳儀及配套電泳槽、Eppendorf 5810R臺式高速室溫離心機(德國)、BECKMAN 冷凍離心機、AB204-E型電子天平、MiLLi-Q超純水儀和、日本松下微波爐及Eppendorf移液 器、北京六合華大基因公司的基因測序儀等。二、實驗方法
1、緩沖液與常規(guī)試劑的配制
(1)10%SDS 10 g SDS溶入90 mL水中，加熱至60°C助溶，加幾滴濃HCl調節(jié)pH至7. 2， 定容至100 mL。(2)1 mol/L Tris · HCl (pH 8. 0) 12. 114 g Tris 溶入 80 mL 水中，用濃 HCl 調 PH至8. 0，加水定容至100 mL,高壓滅菌。(3)0.5 mol/L EDTA (pH 8. 0)18. 61 g Na2EDTA ·2Η20 溶入 80 mL/K中，力口 NaOH 2 g左右調pH至8. 0，定容至100 mL,高壓滅菌。(4)2 mol/L 的 NaCl :11. 688g 溶于水，定容至 IOOmL,高壓滅菌。(5) DNA 提取液(100 mL) 1 mol/LTris · Cl (pH 8. 0) ImL,0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0)20 mL，2 mol/L 的 NaCl 5 mL，定容至 100 mL。蛋白酶K:20 mg蛋白酶K溶入1 mL滅菌超純水中，按200 μ L分裝 儲存于_20°C。(7)3 mol/L乙酸鈉40. 81 g三水乙酸鈉(NaAc ·3Η20)溶于70 mL水中用冰乙酸 調PH至5. 2，加水定容至100 mL,高壓滅菌。(8) 50 X TAE (貯存液)242 g Tris 堿，57. 1 mL 冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH=8.0)，加雙蒸水定容至1 L0工作液為1XTAE。(9)抗凝劑ACD 檸檬酸0. 48g、檸檬酸鈉1. 32g、葡萄糖1. 47g，定容IOOmL水中， 高壓滅菌。每6mL的血液中加入ImL的A⑶液。(IO)PBS 在 800mL 蒸溜水中溶解 8g NaCl、0. 2gKCl、1. 44 g Na2HP04 和 0. 24gKH2P04,用HCl調節(jié)pH值到7. 4，加水定容到IOOOmL,高壓滅菌20min，室溫保存。2、引物的設計與合成
引物由北京六合華大基因公司合成 ZBTB38F 5' CTG TGA GTA ACG GCA GTG AGA AC 3' ZBTB38R 5' GTC ACT GGC ATC GTC AAA CAT C 3' 3、?；蚪MDNA的小量提取
(1)冷凍血樣室溫解凍，吸取1 mL血液于2 mL滅菌離心管中，加入等體積的磷酸緩沖 液(PBS)混勻，溫和搖動10min，4°C，12000r/min離心10 min，棄上清液，重復上述步驟至上
清液透明、沉淀呈透明色。(2)離心管中加入DNA抽提緩沖液lmL，輕輕吹打使血細胞沉淀脫離離心管壁。(3)加蛋白酶K至終濃度為60 μ g/mL,混勻，55°C水浴中消化過夜(12 16 h)至絮 狀沉淀不見，溶液澄清。(4)反應液冷卻至室溫，加入等體積Tris飽和酚，溫和搖動10 min,使其充分混 勻，4°C，12000 r/min離心lOmin，將上層水相轉入另一滅菌離心管，重復上述步驟1次。(5)加入等體積Tris飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1 )，溫和搖動lOmin，使其 充分混勻，4°C，12000 r/min離心lOmin，將上層水相轉入另一滅菌離心管。(6)加入等體積氯仿，溫和搖動10 min，使其充分混勻，4°C，12000 r/min離心10 min，將上層水相轉入另一滅菌離心管。(7)加入2倍體積預冷無水乙醇(-20°C )，在-20°C放置30 min后，輕輕顛倒試管 使DNA呈絮狀沉淀。4°C，12000 r/min離心8min，棄去乙醇。(8)加入預冷的70%乙醇lmL，溫和搖動lOmin, 4°C, 12000r/min離心5min漂洗 DNA沉淀，4°C，12000 r/min離心10 min，棄上清液，重復該步驟2次。室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)加入200 μ L TE溶解DNA，4°C保存直至DNA完全溶解。4、PCR 反應
(1)以牛DNA為模板進行PCR擴增，15 μ L反應體系中包含以下溶液或試劑10XPCR buffer1. 5 μ LdNTP Mixture (各 2. 5mM)0. 8 yL引物 1 (20 μ Μ)0. 5 μ L引物 2 (20 μ Μ)0. 5 μ L10Taq DNA 聚合酶(5Uy L) 基因組 DNA (100 ngy L) 加滅菌蒸餾水至
0. 15 μ L l.OyL 15 μ L
(2)將上述溶液混合并按以下條件進行PCR反應。95°C，預變性 5 min ;94°C，變性 30sec，60°C，復性 30sec，72°C延伸 30 sec，32 個 循環(huán)；72°C延伸IOmin。(3)反應結束后，取PCR反應液(5 μ L)進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物。5、PCR產物測序
將PCR產物用北京天根生化科技有點公司提供的PCR產物純化試劑盒進行純化，然后 將純化產物送往北京六合華大基因公司進行反向測序。6、統(tǒng)計模型建立
根據群體特點，構建線性模型如下
Yijkl: μ + Gi+ S, Bpi + Ma7 + ε ijkl’
Y一性狀觀察值，μ 一群體平均值,Gi—基因型固定效應，Sy—性別固定效應，— 種場群固定效應，Ma7 一測量年齡效應，ε iJkl 一隨機誤差。使用統(tǒng)計軟件SAS中的GLM程序，使用最小二乘方法檢驗基因型與性狀間的相關程度。以下是發(fā)明人給出的實施例。實施實例牛ZBTB38基因多態(tài)性與秦川牛群體體尺性狀的相關
利用本發(fā)明的引物(ZBTB38F和ZBTB38R)對黃牛群體423個個體的基因組DNA進行PCR 擴增，得到由ZBTB38F和ZBTB38R表示的引物擴增的第一外顯子區(qū)的擴增片段，該擴增片段 的長度為647bp ；將PCR反應產物用PCR產物純化試劑盒進行回收、純化后反向測序，然后 進行多態(tài)性分析。在黃群體中共檢測到9個多態(tài)位點，將其命名為T2145C、T2286C、G2323A、 C2325T、T2409C、G2457C、C2583T、G2643A 和 G2676A (見圖 1-9)。分析多態(tài)性的位點選擇已知的牛ZBTB38基因如下序列中47位的T-C堿基突變、 188位的T-C堿基突變、225位的的G-A堿基突變、227位的C-T堿基突變、311位的T-C堿基 突變、359位的G-C堿基突變、485位的C-T堿基突變、545位的G-A堿基突變、578位的G-A 的堿基突變
CTGTGAGTAA CGGCAGTGAG AACTCCACCT CTGTGATCAG CTACAGNGGC 50 TCAGCCCCCT CGGTCATCGT GCACAGCAGC CAGTTTTCAT CGGTGATAAT 100 GCACAGCAAT GCCATTGCTG CCATGACCAG CCGCAACCCC AGAGGAGCTC 150 CTTCAGACCA GACTGTCAGT CAGACCCCAA AAGAGGANGG CAAGCCCGCC 200 GAGCCAGACA AAGTTGGGAG GGCCNTNAGC AGACCCAAGA GCATGAAGGA 250 GAAAAAGAAA GCCGGCCCGT GTAGCAGGGG AGAAGTACCA GAGGAGTCCA 300 AATTCACTGC NGATCCTGGA GGCTCACTGG GCAAAACTAC AAATACCATT 350 AAAGAAACNA GTAAAATTGA AACCTACATC GCAAAGCCCG CTCTCCCTGG 400 AACCTCCACA AACAGCAACG TCGCACCCCT TTGTCAAATA ACGGTGAAAA 450 TCGGAAATGA AGCCATTGTG AAGAGGCACA TCCTNGGCTC TAAACTGTTC 500 TATAAGAGAG GGCGGAGACC CAAGTATCAA ACGCCGGAGG AGACNCTGCC 550
11CCAGGAGAGC GACCAGGAAG CCAACGGNGA CAACCCTCTC GGGCTCTGCC 600 AGTCCGAGTG CATGGAGATG AGCGAGATGT TTGACGATGC CAGTGAC 647 通過連鎖不平衡分析結果(見圖10)發(fā)現9個變異位點中T2145C、T2286C、G2457C、 C2583T、G2643A、G2676A六個SNP之間緊密連鎖(r2>0. 33)，但與其他3個SNP連鎖不緊密 (r2<0. 33)，可以作為一個整體進行關聯分析，選用T2145C為代表；G2323A和C2325T之間緊 密連鎖(r2>0. 33)，但與其他7個SNP連鎖不緊密(r2<0. 33)，可以作為一個整體進行關聯分 析，選用G2323A為代表；T2409C與其它8個SNP的連鎖不緊密(r2<0. 33)，需要單獨進行關 聯分析?？紤]測定年齡、性別、品種、場地等多種影響因素，牛ZBTB38基因T2145C、G2323A 和T2409C 3個變異位點聯合基因型與黃牛群體尺性狀的關聯分析結果見表1。僅在423 頭黃牛群體中發(fā)現27種聯合基因型的TTAATT、TCGATC, TTGGTT, TTGATT, TCGGTT, TCGGTC, TCGATT, CCGGTT, CCGGTC和CCGGCC共10種基因型，其他17種基因型沒有在試驗牛群體中 表現出來。在這10種基因型的黃牛個體中，以TTAATT和TCGATC基因型的體尺性狀指標為 最尚。表1 ZBTB38基因不同聯合基因型對黃牛群體體尺性狀的影響
在對這3個代表性變異位點聯合基因型關聯分析的基礎上，單獨進行關聯分析結果發(fā) 現T2145C和T2409C的基因型與黃牛群體體尺性狀指標無顯著相關(P>0. 05)。而G2323A 的基因型與黃牛群體的體長、體高和尻長顯著相關(P<0. 05)(見表2)，GA型個體的體長顯 著高于AA型個體(P<0. 05)，GG和GA型個體的體高極顯著高于AA型個體(P<0. 01)，GG和 GA型個體的尻長顯著高于AA型個體(P<0. 05)。具有GG基因型個體的的體長和腰角寬比 AA基因型個體的體長、體高和尻長分別低7. 17cm、10. 50cm和4. 94 cm (見表2)。
表2 ZBTB38基因G2323A位點不同基因型對黃牛群體體長、體高和尻長性狀的影 響
均值比較時同一列無相同字母者差異顯著(abP<0. 05) a = (GG — AA) /2 ；d = GA — (GG + AA) /2 ；D 顯性度，D = d/a。
權利要求
一種用ZBTB38基因檢測黃牛體型大小的方法，其特征在于，包括下列步驟步驟一，根據牛ZBTB38基因序列設計一對引物ZBTB38F和ZBTB38R；引物ZBTB38F5’ CTG TGA GTA ACG GCA GTG AGA AC 3’引物ZBTB38R5’ GTC ACT GGC ATC GTC AAA CAT C 3’；步驟二，利用該對引物ZBTB38F和ZBTB38R對牛的基因組DNA進行PCR擴增，得到由ZBTB38F和ZBTB38R表示的引物擴增的第一外顯子區(qū)的擴增片段，該擴增片段的長度為647bp；步驟三，將PCR反應產物用PCR產物純化試劑盒進行回收、純化，并對純化后產物進行反向測序；步驟四，根據測序結果檢測出ZBTB38基因外顯子1的第2145位、第2286位、第2323位、第2325位、第2409位、第2457位、第2583位、第2643位和第2676位共9個位點處形成的T/C、T/C、G/A、C/T、T/C、G/C、C/T、G/A和G/A共9個突變，分別命名為T2145C、T2286C、G2323A、C2325T、T2409C、G2457C、C2583T、G2643A和G2676A；步驟五，連鎖不平衡分析發(fā)現T2145C、T2286C、G2457C、C2583T、G2643A、G2676A六個SNP之間緊密連鎖，即r2>0.33，可選用T2145C為代表；G2323A和C2325T之間緊密連鎖，即r2>0.33，可選用G2323A為代表；T2409C與其它8個SNP的連鎖不緊密，即r2<0.33，需要單獨進行關聯分析；步驟六，考慮多種影響因素，T2145C、G2323A和T2409C三個變異位點聯合基因型與黃牛體尺性狀的關聯分析結果發(fā)現三個代表位點的聯合基因型中TTAATT和TCGATC基因型的體尺性狀指標高于其他基因型；步驟七，單獨進行關聯分析結果發(fā)現T2145C和T2409C位點的基因型與黃牛群體體尺性狀指標無顯著相關；G2323A基因型與黃牛群體的體長、體高和尻長顯著相關；GA型個體的體長顯著高于AA型個體，GG和GA型個體的體高極顯著高于AA型個體，GG和GA型個體的尻長顯著高于AA型個體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ZBTB38基因外顯子的序列片段是由 ZBTB38F和ZBTB38R表示的弓|物擴增的第一外顯子區(qū)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因多態(tài)性部位的位點為已知的牛 ZBTB38基因如下序列中第47位的T-C堿基突變、188位的T-C堿基突變、225位的的G-A 堿基突變、227位的C-T堿基突變、311位的T-C堿基突變、359位的G-C堿基突變、485位的 C-T堿基突變、545位的G-A堿基突變、578位的G-A的堿基突變CTGTGAGTAACGGCAGTGAGAACTCCACCTCTGTGATCAGCTACAGNGGC50TCAGCCCCCTCGGTCATCGTGCACAGCAGCCAGTTTTCATCGGTGATAAT100GCACAGCAATGCCATTGCTGCCATGACCAGCCGCAACCCCAGAGGAGCTC150CTTCAGACCAGACTGTCAGTCAGACCCCAAAAGAGGANGGCAAGCCCGCC200GAGCCAGACAAAGTTGGGAGGGCCNTNAGCAGACCCAAGAGCATGAAGGA250GAAAAAGAAAGCCGGCCCGTGTAGCAGGGGAGAAGTACCAGAGGAGTCCA300AATTCACTGCNGATCCTGGAGGCTCACTGGGCAAAACTACAAATACCATT350AAAGAAACNAGTAAAATTGAAACCTACATCGCAAAGCCCGCTCTCCCTGG400AACCTCCACAAACAGCAACGTCGCACCCCTTTGTCAAATAACGGTGAAAA450TCGGAAATGA AGCCATTGTG AAGAGGCACA TCCTNGGCTC TAAACTGTTC 500 TATAAGAGAG GGCGGAGACC CAAGTATCAA ACGCCGGAGG AGACNCTGCC 550 CCAGGAGAGC GACCAGGAAG CCAACGGNGA CAACCCTCTC GGGCTCTGCC 600 AGTCCGAGTG CATGGAGATG AGCGAGATGT TTGACGATGC CAGTGAC 647。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的9個變異位點的分析可以由T2145C、 G2323A和T2409C 3個變異位點代表。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的T2145C、G2323A和T2409C3個變異 位點的聯合基因型中TTAATT和TCGATC基因型的體尺性狀指標均高于其他基因型。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的T2145C、G2323A和T2409C3個變異 位點單獨進行關聯分析時，僅有G2323A位點的基因型與黃牛群體的體長、體高和尻長顯著 相關。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用ZBTB38基因檢測黃牛體型大小的方法，該方法根據牛ZBTB38基因序列設計一對引物；利用該引物對牛的基因組DNA進行PCR擴增；并對PCR產物進行反向測序，檢測出ZBTB38基因外顯子1的第2145位、2286位、2323位、2325位、2409位、2457位、2583位、2643位和2676位共9個位點處形成的T/C、T/C、G/A、C/T、T/C、G/C、C/T、G/A和G/A共9個突變，分別命名為T2145C、T2286C、G2323A、C2325T、T2409C、G2457C、C2583T、G2643A和G2676A變異位點。根據實驗結果表明，9個變異位點的分析可以由T2145C、G2323A和T2409C三個變異位點代表，且T2145C、G2323A和T2409C3個變異位點的聯合基因型中TTAATT和TCGATC基因型的體尺性狀指標均高于其他基因型；G2323A位點的基因型與黃牛群體的體長、體高和尻長顯著相關(P<0.05)。該方法操作簡單、費用低、精確度高，可進行快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101906479SQ201010274180
公開日2010年12月8日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權日2010年9月7日
發(fā)明者劉永峰, 昝林森 申請人:西北農林科技大學