專利名稱：添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)酸生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和 生產(chǎn)強(qiáng)度的方法。
背景技術(shù)：
丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物 中，許多厭氧微生物以丁二酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為一種優(yōu)秀的C4平臺(tái)化 合物，丁二酸可被廣泛用于藥物、精細(xì)化工產(chǎn)品以及可生物降解的聚合物前體，如可作為1， 4_ 丁二醇、四氫呋喃、脂肪酸、Y-丁內(nèi)酯等的中間物，而這些化學(xué)制品都具有很大的市場(chǎng) 潛力。利用生物法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，成本低，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過 程中可吸收大量的CO2用于菌株的代謝，能夠有效減輕溫室效應(yīng)，這也是丁二酸生產(chǎn)有別于 傳統(tǒng)有機(jī)酸生產(chǎn)的一個(gè)重要特點(diǎn)。生物法生產(chǎn)丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖類物 質(zhì)，其來源廣泛且價(jià)格低廉(玉米、廢乳清、工業(yè)生產(chǎn)廢料等)，可以減少石油、煤等不可再 生資源的消耗，大大緩解現(xiàn)今社會(huì)的能源短缺。美國能源部的報(bào)告表明，丁二酸的生物生產(chǎn) 法的應(yīng)用每年將為全世界節(jié)約大約1. 034X1016J的能源。另外，生物法制備丁二酸的過程 中，吸收并固定大量的CO2溫室氣體，能夠減少溫室氣體的排放，緩解由溫室效應(yīng)所導(dǎo)致的 全球氣候變暖的現(xiàn)狀。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1 公開了丁二酸生產(chǎn) 菌及其發(fā)酵方法，這些生產(chǎn)菌株大多是從瘤胃、狗的口腔等特征性厭氧環(huán)境中篩選出來的， 在發(fā)酵過程中存在產(chǎn)物收率較低、副產(chǎn)物較多、丁二酸濃度偏低、生產(chǎn)強(qiáng)度較低的問題，因 此開發(fā)高效的丁二酸生產(chǎn)方法是目前丞待解決的問題。在丁二酸生產(chǎn)菌發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，由于有主要產(chǎn)物丁二酸及其甲酸，乙酸，乳酸等 副產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)降低發(fā)酵罐中的PH，為了維持菌體生長的最適pH，在發(fā)酵過程中需要用氫 氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鎂等堿來中和產(chǎn)生的酸，隨著在發(fā)酵過程中堿的不斷流入，發(fā)酵罐中 金屬離子濃度的不斷升高必然導(dǎo)致滲透壓的升高，過高的滲透壓將影響菌體的生長和產(chǎn) 酸。而滲透壓保護(hù)劑比如甜菜堿、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等滲透壓保護(hù)劑能夠很好的緩解 環(huán)境中滲透壓過高的問題，因此發(fā)酵過程中添加適當(dāng)?shù)臐B透壓保護(hù)劑，從而提高了生產(chǎn)強(qiáng) 度。專利文件CN101457243公開了一種提高L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率的新工藝，發(fā)明了在發(fā)酵培 養(yǎng)基中添加甜菜堿、脯氨酸的方法，來有效提高L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率。目前國內(nèi)外還未見利 用滲透壓保護(hù)劑應(yīng)用于丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種添加滲透壓保護(hù)劑提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二 酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，以提高丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度與濃度。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二 酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，步驟如下
菌種活化菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng) 24h ；種子培養(yǎng)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10 12h后作為種 子液；發(fā)酵罐培養(yǎng)將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比 3 10%，溫度為35 40°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，整個(gè)發(fā)酵過程中pH控制 在6. 5 7. 0，攪拌速度為100 300rpm，發(fā)酵30 48h。其特征在于，在所述發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，添加有滲透壓保護(hù)劑，所述的滲透壓 保護(hù)劑的加入量為lg/L 6g/L。本發(fā)明所述的滲透壓保護(hù)劑選自甜菜堿、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸等中的一種或 多種。換言之，本發(fā)明菌種活化、種子培養(yǎng)與發(fā)酵罐培養(yǎng)等步驟，可以采用與傳統(tǒng)方法基 本相同的步驟，其主要區(qū)別是在發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中加入了滲透壓保護(hù)劑。本發(fā)明推薦接種量采用體積比7% ；攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣 量為0. 25vvm。本發(fā)明推薦所述的滲透壓保護(hù)劑的加入量為1 5g/L ；最佳值為2. 9g/ L0培養(yǎng)基加入了滲透壓保護(hù)劑之后，菌體濃度明顯比未添加的高，同時(shí)發(fā)酵周期得 到較大幅度縮短。其原理是根據(jù)微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的特性，在發(fā)酵體系中添加了適 量的滲透壓保護(hù)劑，而這些滲透壓保護(hù)劑大都是親水性的物質(zhì)，它們能夠進(jìn)入細(xì)胞，維持菌 體細(xì)胞在高底物、高產(chǎn)物和高金屬離子濃度時(shí)的滲透壓，防止菌體因滲透壓過高而失水死 亡。較高的菌體量保證了丁二酸的濃度與生產(chǎn)強(qiáng)度較大幅度的提高，從而降低了丁二酸生 產(chǎn)過程中的能耗，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為從特征厭氧環(huán)境中篩選出的丁 二酸生產(chǎn)菌株，包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716)，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)， 重組大腸桿菌Escherichia coli,產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌Anaerobiospirilum succiniciproducens(ATCC 53488)。以上菌種均為本領(lǐng)域早已公開使用，公開銷售的菌種， 公眾能夠通過公開途徑獲得這些菌種。本發(fā)明所述的菌種活化步驟中，菌株活化的斜面培養(yǎng)基為pH6. 0 8. 0的能提供 碳源、氮源及無機(jī)鹽的固體斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)將菌體在斜面培養(yǎng)基中平板劃線后，在厭氧 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含N2、CO2和H2的混合氣體，溫度為30 40°C，活化培養(yǎng)24 48h， 用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存。本發(fā)明所述的種子培養(yǎng)步驟中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6. 0 8. 0的能夠提供碳 源、氮源及無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)在IOOmL的血清瓶中加入20 SOmL的種子培養(yǎng) 基，通入CO2氣體lmin，在115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，在溫度 為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 300rpm的條件下培養(yǎng)10 16h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。本發(fā)明所述的發(fā)酵步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6. 0 8. 0的能夠提供碳源、氮 源及無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，并加入滲透壓保護(hù)劑，3L發(fā)酵罐中裝1. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量 為體積比3 10%，溫度為35 40°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，整個(gè)發(fā)酵過程
4中pH控制在6. 5 7. 0，攪拌速度為100 300rpm，發(fā)酵30 48h。本發(fā)明所述的滲透壓保護(hù)劑包括甜菜堿、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸等中的一種或多 種。本發(fā)明通過在丁二酸發(fā)酵體系中添加了適量的滲透壓保護(hù)劑，保護(hù)菌體細(xì)胞在高 底物、高產(chǎn)物和高金屬離子濃度時(shí)的滲透壓，維持菌體活力，實(shí)現(xiàn)丁二酸的濃度與生產(chǎn)強(qiáng)度 較大幅度的提高，降低丁二酸生產(chǎn)過程中的能耗，提高了生產(chǎn)效率，具有工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。說明書附1為未添加脯氨酸的發(fā)酵進(jìn)程曲線；圖2為添加了脯氨酸之后的發(fā)酵進(jìn)程曲線。
具體實(shí)施例方式以下所述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做了詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制實(shí)施例1菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716) 該菌已申請(qǐng)專利并獲得授權(quán)，專利授權(quán)公告號(hào)為Cm00537744C。斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，瓊月旨 20，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，富馬酸二鈉1，KH2P0 3， MgCl2 · 6Η200· 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。菌種活化將凍存于_70°C冰箱的菌種融化后在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后， 在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，200r/min，37°C培養(yǎng)10 12h 后作為種子液。3L發(fā)酵罐培養(yǎng)3L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)裝液量為1.5L，將活化好的種子液和滅好的葡 萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為7%，(ν/ν)，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為 0.25vvm。結(jié)果見表1、圖Α、圖B通過添加了 2. 9g/L的脯氨酸之后菌體濃度明顯比未添加 的高，同時(shí)發(fā)酵周期縮短了 30%。表1未添加脯氨酸與添加脯氨酸結(jié)果對(duì)比
丁二酸甲酸乙酸發(fā)酵周期(g/L)(g/L)(g/L)(h)未添加脯氨酸42.087.659.1233添加了 2.9 g/L脯氨酸41.017.359.2123實(shí)施例2本實(shí)施例采用與實(shí)施例1完全相同的菌種、發(fā)酵條件和實(shí)驗(yàn)方法。在3L發(fā)酵罐中添加了 2. 9g/L的脯氨酸。結(jié)果見表2。經(jīng)過48h發(fā)酵，添加2. 9g/ L的脯氨酸，丁二酸的產(chǎn)量比未添加脯氨酸的增加了 21. 7%。
表2未添加脯氨酸與添加脯氨酸結(jié)果對(duì)比
發(fā)酵周期殘?zhí)嵌《峒姿嵋宜幄?g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加脯氨酸481646.238.911.2添加了 2.9g/L脯氨酸48256.749.813.2實(shí)施例3本實(shí)施例采用與實(shí)施例1完全相同的菌種、發(fā)酵條件和實(shí)驗(yàn)方法在3L發(fā)酵罐中添加了 5. 35g/L的脯氨酸。結(jié)果見表3。添加5. 35g/L的甜菜堿比 未添加甜菜堿的發(fā)酵周期縮短了 18%。表3未添加甜菜堿與添加甜菜堿結(jié)果對(duì)比丁二酸甲酸乙酸發(fā)酵時(shí)間(g/L)(g/L)(g/L)(h)
未添加甜菜堿 添加了 5.35g/L甜菜堿42.08 41.037.65 7.419.12 9.3133 26實(shí)施例4本實(shí)施例采用與實(shí)施例1完全相同的菌種、發(fā)酵條件和實(shí)驗(yàn)方法在3L發(fā)酵罐中添加了 5. 35g/L的甜菜堿。結(jié)果見表4，通過添加5. 35g/L的甜菜 堿比未添加甜菜堿的丁二酸的濃度提高了 11.9%。表4未添加脯氨酸與添加脯氨酸結(jié)果對(duì)比
發(fā)酵時(shí)間殘?zhí)嵌《峒姿嵋宜?h)(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加甜菜堿485.546.258.6510.12添加了 5.35 g/L甜菜堿480.2551.758.4810.32實(shí)施例5菌種產(chǎn)琥拍酸厭氧螺菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens (ATCC 53488)。斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，瓊月旨 20，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白胨5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，蛋白胨10，MnCl2O. 05，F(xiàn)eCl2 0. 05，K2HPO4 2. 0，CaCl2 0. 05，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。菌種活化將凍存于-70°C冰箱的菌種融化后在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，
6培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，200r/min，37°C培養(yǎng)10 12h后作為種子液。3L發(fā)酵罐培養(yǎng)3L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)裝液量為1. 5L，將活化好的種子液和滅好的葡 萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為7%，(ν/ν)，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為 0. 25vvm0發(fā)酵結(jié)果見表5，通過添加了 2. 9g/L脯氨酸之后，在相同初糖濃度下，葡萄糖完全 耗完，發(fā)酵周期縮短了 23%。表5未添加脯氨酸與添加脯氨酸結(jié)果對(duì)比
「00581 發(fā)酵時(shí)間 il 丁二酸 _(h)(g/L)(g/L)
權(quán)利要求
一種添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特征在于，步驟如下菌種活化菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h；種子培養(yǎng)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10~12 h后作為種子液；發(fā)酵罐培養(yǎng)將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比3~10 %，其特征在于，在所述發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，添加有滲透壓保護(hù)劑，所述的滲透壓保護(hù)劑的加入量為1 g/L~6 g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其 特征在于，所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物選自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJl 13、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 Jciiflo^ciBiAs succinogenes 130Z、重組大腸 木干菌 Escherichia cc^i，或產(chǎn)Jl^i白酸厭氧 累菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特 征在于，所述的滲透壓保護(hù)劑選自甜菜堿、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特 征在于，所述的菌種活化步驟中，菌株活化的斜面培養(yǎng)基為PH6. (Γ8. O的能提供碳源、氮源 及無機(jī)鹽的固體斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)將菌體在斜面培養(yǎng)基中平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含N2、CO2和H2的混合氣體，溫度為3(T40 rpC,活化培養(yǎng)24、8 h，用于種子培 養(yǎng)基接種和菌株保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特 征在于，所述的種子培養(yǎng)步驟中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PH6. (Γ8. O的能夠提供碳源、氮源及 無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)在IOOmL的血清瓶中加入2(T80 mL的種子培養(yǎng)基，通入CO2氣 體1 min，在115 121 rpC滅菌15 30 min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，在溫度為30 40 ？ C， 搖床轉(zhuǎn)速為ΚΚΓ300 rpm的條件下培養(yǎng)l(Tl6 h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其 特征在于，所述的發(fā)酵步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PH6. (Γ8. O的能夠提供碳源、氮源及無 機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，并加入滲透壓保護(hù)劑，3 L發(fā)酵罐中裝1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為體 積比7%，溫度為35、0 ？ C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，整個(gè)發(fā)酵過程中pH控制在 6. 5 7.0，攪拌速度為100 300 rpm，發(fā)酵30 48 h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特 征在于，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件是攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，CO2通氣量為0. 25 vvm0
8.根據(jù)權(quán)利要求廣7之一所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方 法，其特征在于，所述的滲透壓保護(hù)劑的加入量為廣5 g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特 征在于，所述的滲透壓保護(hù)劑的加入量為2. 9 g/L。
全文摘要
添加滲透壓保護(hù)劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，步驟是，菌種活化菌種在斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線后，在37℃厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24h；種子培養(yǎng)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)后作為種子液；發(fā)酵罐培養(yǎng)將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為體積比3~10%，特征是，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加有滲透壓保護(hù)劑，滲透壓保護(hù)劑的加入量為1g/L~6g/L。本發(fā)明通過添加滲透壓保護(hù)劑，保護(hù)菌體細(xì)胞在高底物、高產(chǎn)物和高金屬離子濃度時(shí)的滲透壓，維持菌體活力，實(shí)現(xiàn)丁二酸的濃度與生產(chǎn)強(qiáng)度較大幅度的提高，降低丁二酸生產(chǎn)過程中的能耗，提高了生產(chǎn)效率，具有工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101955978SQ20101026807
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 張敏, 方曉江, 李建, 歐陽平凱, 鄭曉宇, 韋萍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)