專利名稱：一種檢測(cè)微小根毛霉的dna探針、基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)微小根毛霉的DNA探針、基因芯片 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
侵襲性真菌感染是真菌入侵人體而導(dǎo)致血液感染、各個(gè)臟器感染或全身播散的嚴(yán) 重感染。近20年來侵襲性真菌感染的發(fā)病呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，這與大量應(yīng)用廣譜抗生素、抗 癌放療、化療以及其他免疫抑制劑、類固醇藥物、器官移植、靜脈插管和各種侵襲性操作有關(guān)。
侵襲性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等條件致病真菌， 還有組織胞漿菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等地方流行性致病真菌。不同環(huán)境下，感染的真菌 種類不同。侵襲性真菌感染早期沒有特異性表現(xiàn)，所以很容易被掩蓋，病死率很高。
目前臨床常用的檢測(cè)真菌的技術(shù)主要有
(一 )鏡檢及培養(yǎng)、鑒定如六胺銀染色、PAS染色、銀氨G-S染色法、10% KOH法 以及真菌培養(yǎng)法是臨床最常用的鑒定手段，但直接鏡檢特異性差、敏感性不足，不能鑒定出 真菌種類。真菌培養(yǎng)雖能鑒定真菌種類，但培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，假陰性高，敏感性不 足，無法輔助臨床治療。
(二)免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法的基本原理是利用抗原與抗體的特異結(jié)合，來達(dá)到 相互間的特異探察。該法主要用于檢測(cè)真菌的抗原、抗體、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞成分。能根據(jù)真 菌抗原性的不同將真菌分類。但抗體的特異性限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。
免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡法及凝集反應(yīng)都是基于免疫學(xué)方法檢測(cè) 真菌的手段，但目前廣泛應(yīng)用于臨床的僅有G試驗(yàn)，G試驗(yàn)檢測(cè)的是真菌的細(xì)胞壁成分(1， 3) - β -D-葡聚糖，人體的吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液及體液中含量 增高(淺部真菌感染無類似現(xiàn)象)。適用于除隱球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早 期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有諸多假陽性可能，例 如
(1)使用纖維素膜進(jìn)行血透標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；
(2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；
(3)鏈球菌血癥；
(4)操作者處理標(biāo)本時(shí)存在污染。
另外，使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植 的念珠菌經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液等也可能造成假陽性。
(三)分子生物學(xué)技術(shù)
包括原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA中G+C mol %含量測(cè)定、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)分析、限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)等，但上述技術(shù)均耗時(shí)耗力，不具有高通 量的特點(diǎn)，不能用少量的樣本快速同時(shí)檢測(cè)多種可能存在的真菌，因此多局限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚不能真正應(yīng)用于臨床。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)微小根毛霉的DNA探針，具有SEQID No. 1所示序 列，其與微小根毛霉DNA特異性結(jié)合，檢測(cè)微小根毛霉靈敏度高。
本發(fā)明所述DNA探針可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如與以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核 酸雜交技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行生物學(xué)分析或臨床診斷。
本發(fā)明結(jié)合基因芯片技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)小樣本、高通量、特異、快速、自動(dòng)化檢測(cè)微小根 毛霉的目的。本發(fā)明提供的一種用于真菌檢測(cè)的基因芯片，通過將特異性寡核苷酸探針固 定在固相載體表面形成，所述寡核苷酸探針包含具有SEQ ID No. 1所示序列的DNA探針。探 針、引物與真菌目的基因之間的關(guān)系如表1所示。
表1.本發(fā)明所述基因芯片所使用的引物及探針
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)微小根毛霉的DNA探針，具有SEQ ID No. 1所示序列。
2.一種用于微小根毛霉檢測(cè)的基因芯片，通過將寡核苷酸探針固定在固相載體表面形 成，其特征在于，所述寡核苷酸探針包含權(quán)利要求1所述DNA探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼 龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針還包括陽性對(duì) 照探針、陰性對(duì)照探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陽性對(duì)照探針如SEQID No. 4所7J\ ο
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陰性對(duì)照探針如SEQID No. 5所7J\ ο
7.一種用于檢測(cè)微小根毛霉的試劑盒，包含權(quán)利要求1所述DNA探針。
8.一種對(duì)可能含微小根毛霉的樣品進(jìn)行檢測(cè)的方法，包含以下步驟步驟1 提取并擴(kuò)增樣品的核酸序列，所述擴(kuò)增將信標(biāo)分子標(biāo)記到擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟2 取步驟1所得擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述基因芯片上的探針 進(jìn)行雜交；步驟3 根據(jù)所述信標(biāo)分子采用相應(yīng)的檢測(cè)方法對(duì)基因芯片進(jìn)行掃描分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟1所述擴(kuò)增步驟的引物具有序列表 SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述信標(biāo)分子可以為熒光素或同位素， 所述熒光素包括Cy3、Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述同位素包括32P。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測(cè)微小根毛霉的DNA探針。本發(fā)明所述檢測(cè)微小根毛霉的DNA探針具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其檢測(cè)微小根毛霉特異性強(qiáng)，靈敏度高達(dá)0.04ng。本發(fā)明還提供包含所述DNA探針的基因芯片。采用本發(fā)明所述基因芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)可能含微小根毛霉的樣品的高通量、自動(dòng)化及快速檢測(cè)，特異性強(qiáng)，可保證檢測(cè)結(jié)果的精確性，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102031298SQ20101025829
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者李國輝 申請(qǐng)人:李國輝