專利名稱：一種制備抗菌肽的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備抗菌肽的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
抗菌肽是指存在于生物體內(nèi)能抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小 分子多肽，它是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分?？咕耐ǔＳ?5-45個氨基酸殘基組成， 大部分帶正電荷。多種生物如細(xì)菌、昆蟲、植物和脊椎動物體內(nèi)都含有抗菌肽。由于抗生 素耐藥性和殘留問題的日益突出，作為一種抗生素的替代物，抗菌肽因其沒有抗生素的上 述缺點而備受關(guān)注?？股卦谛竽辽a(chǎn)中應(yīng)用已久，但其長期使用也引起了耐藥性和殘留 等嚴(yán)重問題。因此有必要尋找與抗生素效果相似，而又沒有上述問題的抗生素替代物?？?菌肽是在生物體內(nèi)廣泛存在的一種抗菌物質(zhì)，是一種低分子量的多肽，對革蘭氏陽性和陰 性菌均有較強的殺傷作用。Fowlicidin在N端有一個高度保守的cathelin前序列，屬于 cathelicidin家族，目前已發(fā)現(xiàn)FoWlicidin-l、-2、-3三種。它們對細(xì)菌的最小抑菌濃度在 0. 4-2. OyM/L之間，并有較強的結(jié)合內(nèi)毒素能力，是目前已知的活性最強的抗菌肽之一。由 于多肽合成昂貴，使用工程菌表達重組蛋白是降低成本的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種制備抗菌肽的方法及其專用菌株。本發(fā)明提供一種制備抗菌肽的方法，包括如下步驟發(fā)酵巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris)GS115/Fow CGMCC NO. 3814，得到抗菌肽。所述發(fā)酵的方法包括如下步驟1)將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCC NO. 3814 接種到如下
發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下方法配制將17. 8g Na2HP04U3. 8g NaH2P04、10g酵母提 取物、20g蛋白胨、13. 4g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基、0. 0004g生物素和5mL甲醇溶于水中，用水補 齊體積；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 0。所述發(fā)酵的方法還包括在經(jīng)過1)的培養(yǎng)之后，進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟。所述進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法為自將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/ Fow CGMCC NO. 3814接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中計起，每隔24h加入一次所述甲醇；每次加入 甲醇的體積占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.5% (體積百分比)；所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為72h。所述抗菌肽抑制的細(xì)菌為大腸桿菌K88或金黃色葡萄球菌。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow，其保藏編號為CGMCC NO. 3814。該 菌株的于2010年5月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗菌肽。
本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為Fow-3，人工合成，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中的序列2由27個氨基酸殘基組成。所述一個或數(shù)幾個氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白質(zhì)的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍。所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述序列表中的序列1由84個核苷酸組成， 其CDS區(qū)為自5，末端第1-84位核苷酸。所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達盒也是本發(fā)明保護的范 圍；擴增所述編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCCNO. 3814可以獲得抗菌肽，該抗菌肽對大腸桿菌K88或金黃色葡萄球菌具有明顯的抑 制作用，適合用于動物飼料添加劑使用。


圖1為抗菌肽抑菌結(jié)果圖2為抗菌肽電泳圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、基因序列優(yōu)化設(shè)計根據(jù)GenBank報道的釀酒酵母a -信號肽和Fowlicidin-3的氨基酸序列序列，按 照酵母偏好密碼子優(yōu)化后人工合成Fow-3基因，F(xiàn)ow-3的核苷酸序列為序列表中的序列1。 序列表中序列1自5‘末端第1-84位核苷酸序列為編碼區(qū)，該基因編碼的蛋白命名為Fow-3， 其氨基酸序列為序列表中的序列2。將Fow-3連接到pET30a(+)(北京擎科生物技術(shù)有限公 司)上，構(gòu)建載體pET30a(+)-Fow-3。用EcoR I和NotI分別雙酶切pET30a (+) _Fow_3和載 體PPIC9K分別得到小片段和載體大片段，將小片段連接到載體大片段上得到連接產(chǎn)物，將 該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO獲得的克隆提取質(zhì)粒測序鑒定，含有序列1的質(zhì)粒為正確 質(zhì)粒，命名為重組載體pPIC9k-Fow。取lOiig畢赤酵母表達載體pPIC9k-Fow，將其用限制性內(nèi)切酶Sac I在37°C下酶 切過夜，過柱純化DNA，溶于10 ii L滅菌水中。加入80 ii L畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，混 勻，置于0. 2cm電擊杯中，冰浴5min，電擊(2000V，25 y F)，迅速加入lmL lmol/L山梨醇，
4置于28°C靜止培養(yǎng)2hr，涂于MDS平板(1.34% YNB，4X 10-5%生物素，2%葡萄糖，1M山梨 醇和1. 5%瓊脂)，長出的菌落即為His+表型，命名為GS115/FOW，該菌株的于2010年5月 5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC NO. 3814。實施例2、重組表達抗菌肽工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)1、種子培養(yǎng)將實施例1獲得巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCCNO. 3814接種在30mL種子培養(yǎng)基中28°C搖瓶培養(yǎng)至0D600 = 4. 0-6. 0 ；在50mL離心 管中5000r/min離心4min收集菌體。所述種子培養(yǎng)基為酵母提取物，2%菌體蛋白胨，100mM磷酸鉀緩沖液、pH6. 0， 1. 34% YNB，4X1(T5%生物素禾口 甘油。2、發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)獲得的菌體重懸于30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C誘導(dǎo)發(fā)酵。 從將菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中開始，每隔24h加入一次甲醇(每次加入甲醇的體積占初始發(fā)酵 培養(yǎng)基體積的0. 5% )；從將菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中開始，至發(fā)酵結(jié)束，共72h，72h誘導(dǎo)后取樣 lmL, 12000r/min離心lmin，取上清液，將上清液記作重組抗菌肽溶液。1L 所述發(fā)酵培養(yǎng)基(BMGY 培養(yǎng)基)由 17. 8g Na2HP04、13. 8g NaH2P04、lOg 酵母提 取物、20g蛋白胨、13. 4g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(YNB)、0. 0004g生物素、5ml甲醇，用水補齊體 積；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 0。酵母提取物購自0X0ID，產(chǎn)品目錄號為LP0021 ；蛋白胨購自0X0ID，產(chǎn)品目錄號為 LP0037 ；酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(YNB)為日本進口分裝，無編號；生物素購自北京必克瑞生物 科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為CSA1049 ；甘油購自北京化學(xué)試劑公司，分析純。采用Tricine-SDS-PAGE方法，由上述獲得的重組抗菌肽與上樣緩沖液按4 1比 例混合，37°C放置15min，每孔上樣20iiL。使用4%的濃縮膠，10 %夾層膠和16%的分離 膠。先用30V恒壓，待樣品進入夾層膠后100V至電泳結(jié)束。采用考馬斯亮藍(lán)G250染色，脫 色過夜直至背景無色，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出上清液的Tricine-SDS-PAGE圖 譜，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)前；2為誘導(dǎo)72h，可以檢測到抗菌肽的表達產(chǎn)物(大小 3. 4kDa)。檢測重組抗菌肽溶液中蛋白濃度，換算，得到每毫升發(fā)酵液中含有0.2ug重組抗 菌肽。將發(fā)酵72小時后發(fā)酵容器中所有物質(zhì)記作發(fā)酵液。實施例3、重組抗菌肽的抗菌活性研究采用平板擴散方法，大腸桿菌K88或金黃色葡萄球菌(均購自CGMCC)作為指示 菌。在平板內(nèi)倒入瓊脂含量為1.5%的LB培養(yǎng)基作為下層，待其凝固后放上牛津杯。將 20 P L指示菌加入將要凝固的LB (瓊脂含量為0. 8% )培養(yǎng)基中倒入平板，指示菌終濃度約 為106CFU/mL。拔出牛津杯，每孔加入50 y L由實施例2獲得的重組抗菌肽溶液，37°C培養(yǎng) 12h，觀察抑菌圈大小，結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出，上清液的抑菌活性，其中a.為 誘導(dǎo)72h后；b為誘導(dǎo)前；1為大腸桿菌K88 ；2為金黃色葡萄球菌，說明表達產(chǎn)物對兩種致病 菌均有明顯抑制作用。統(tǒng)計抑菌圈的大小，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均數(shù)，結(jié)果為對大腸桿 菌k88的抑菌圈大小平均值達到11mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小平均值達到15mm。
權(quán)利要求
一種制備抗菌肽的方法，包括如下步驟發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115/Fow CGMCC NO.3814，得到抗菌肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的方法包括如下步驟1)將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCC NO. 3814接種到如下發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下方法配制將17. 8g Na2HP04U3. 8g NaH2P04U0g酵母提取 物、20g蛋白胨、13. 4g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基、0. 0004g生物素和5mL甲醇溶于水中，用水補齊 體積；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的方法還包括在經(jīng)過1)的 培養(yǎng)之后，進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述進行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法 為自將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCC NO. 3814接種到所述發(fā)酵 培養(yǎng)基中計起，每隔24h加入一次所述甲醇；每次加入甲醇的體積占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積 0.5% (體積百分比)；所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述抗菌肽抑制的細(xì)菌為大腸 桿菌K88或金黃色葡萄球菌。
6.巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115/Fow，其保藏編號為 CGMCC NO. 3814。
7.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-3)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
10.含有權(quán)利要求8或9所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備抗菌肽的方法及其專用菌株。本發(fā)明提供的一種制備抗菌肽的方法，包括如下步驟1)種子培養(yǎng)將巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCC No.3814接種到種子培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600＝4.0-6.0，離心收集菌體；2)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟1)獲得的菌體重懸于發(fā)酵培養(yǎng)基，再向發(fā)酵體系加甲醇，得到抗菌肽，將發(fā)酵罐中所有物質(zhì)記作發(fā)酵體系；本發(fā)明的實驗證明誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115/Fow CGMCC No.3814獲得抗菌肽對大腸桿菌K88或金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。
文檔編號C12N1/19GK101892277SQ20101020022
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者曹云鶴, 李德發(fā), 林剛, 王春林, 王曉秋, 董冰, 陳軼群 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)