專利名稱：一種A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的口蹄疫疫苗，特別是一種由基因工程方法生產(chǎn)的A/ Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
國內(nèi)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，將成為動(dòng)物疫苗行業(yè)持續(xù)增長(zhǎng)動(dòng)力源。目前我國的肉類、 蛋類產(chǎn)量均列世界第一位，是世界畜產(chǎn)品生產(chǎn)第一大國。2004年我國全年畜牧業(yè)產(chǎn)值首次突破1萬億元大關(guān)，畜牧業(yè)產(chǎn)值占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的比重在逐步提高。由于世界范圍內(nèi)疫情不斷，口蹄疫、禽流感、瘋牛病等，給世界各國的動(dòng)物疫病防治與控制工作提出了挑戰(zhàn)。口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是畜牧業(yè)中偶蹄類動(dòng)物(豬、牛、羊及駱駝)的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。迄今為止，世界各國除北美、澳大利亞之外，都曾爆發(fā)過口蹄疫的大規(guī)模流行。這種疾病的流行曾對(duì)德國(1937-1938)、歐洲(1951-1952)、土耳其 (1964-1965)、英國(1967-1968)、奧地利(1973)、法國(1974)、韓國(2002)等國家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？谔阋叩呐R床診斷特點(diǎn)為口腔粘膜、蹄部和乳房的皮膚發(fā)生水皰和潰爛，由口蹄疫病毒引起，對(duì)于畜牧業(yè)，豬、牛及羊的飼養(yǎng)及畜產(chǎn)品的貿(mào)易危害極大?？谔阋卟《綩7OOt and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬于細(xì)小RNA病毒，對(duì)豬、牛及羊傳染途徑多，毒力強(qiáng)， 一頭病牛的排毒量可感染100萬頭牛，1克病豬蹄部水皰皮可使10萬頭豬感染發(fā)病。易于傳播，傳播迅速，流行面廣，生產(chǎn)性能下降，防治費(fèi)用高，發(fā)病率100%，成年畜死亡率一般 1-2%，但幼畜高達(dá)50%，甚至100%。往往幾個(gè)省，幾大洲甚至全球同時(shí)發(fā)生。直接接觸和間接接觸傳播均可，主要經(jīng)消化道傳播，還可經(jīng)呼吸道傳播，往往牛、羊、豬在同一時(shí)間內(nèi)發(fā)病，具有感染多種動(dòng)物的能力以及具有多種抗原形式，流行可呈跳躍式傳播，一年四季均可發(fā)生，每隔1-2年或3-5年就流行一次。近年來，豬發(fā)生有擴(kuò)大的趨勢(shì)。FMDV的初級(jí)復(fù)制是在咽部，然后感染鄰近的淋巴結(jié)并且進(jìn)入血流，進(jìn)而擴(kuò)散到各種器官和組織中。大多數(shù)情況下，動(dòng)物感染2-14天出現(xiàn)臨床癥狀。較年長(zhǎng)的動(dòng)物感染FMDV后很少出現(xiàn)死亡，但動(dòng)物的生殖能力、生長(zhǎng)和健康受到很大影響。國際獸疫局將FMDV列為A類烈性傳染病。FMDV — 旦發(fā)生，難以控制，每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補(bǔ)救措施少，被稱為畜牧業(yè)的“頭號(hào)殺手”，對(duì)于畜牧業(yè)是毀滅性打擊。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定，一旦出現(xiàn)口蹄疫疫情，當(dāng)事國將自動(dòng)喪失非口蹄疫疫區(qū)資格?？谔阋卟《揪哂酗@著的抗原多樣性，目前發(fā)現(xiàn)的FMDV有0、A、C、SATU SAT2、 SAT3(即南非1、2、3型)和Asial (亞洲1型)7個(gè)血清型。每種血清型還可以繼續(xù)分成多種亞型。我國西北地區(qū)及周邊國家及其他不同地區(qū)是A型及Asia I型口蹄疫流行區(qū)。FMDV 顆粒中含有一條正鏈極性的、由8500個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA。病毒顆粒的囊膜包括包繞單鏈RNA的四種結(jié)構(gòu)蛋白VPl (分子量34000)、VP2 (分子量30000)、VP3 (分子量沈000)、 VP4(分子量13500)。四種結(jié)構(gòu)蛋白每種60個(gè)分子構(gòu)成一個(gè)二十面體病毒粒子。二十面體的頂點(diǎn)由結(jié)構(gòu)蛋白VPl的免疫決定簇區(qū)域?yàn)?41-160區(qū)域和200-213區(qū)域。對(duì)于FMD，注射疫苗是目前預(yù)防口蹄疫的最有效手段。現(xiàn)有疫苗及其存在的問題有1、減毒疫苗及滅活疫苗傳統(tǒng)的減毒疫苗及滅活疫苗是利用大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，然后感染口蹄疫病毒，經(jīng)過培養(yǎng)、分離病毒，再用化學(xué)試劑使病毒滅活后制備而成。法國Merieux公司是最大的滅活 FMDV疫苗生產(chǎn)廠家。但制備滅活FMDV需要特殊嚴(yán)格的隔離封閉的環(huán)境進(jìn)行生產(chǎn)，以防泄露并污染周圍環(huán)境，安全性要求高，這種潛在的危險(xiǎn)限制了這種疫苗必須在偏僻的環(huán)境生產(chǎn)； 此外，疫苗的貯藏運(yùn)輸保存需要冷鏈，增加成本；滅活FMDV疫苗的效價(jià)變動(dòng)較大，疫苗還存在復(fù)強(qiáng)和殘存的痕跡活病毒引起疾病流行和大規(guī)模爆發(fā)的危險(xiǎn)；另外，疫苗的質(zhì)量還經(jīng)常會(huì)影響奶牛的乳液分泌；使用滅活的FMDV疫苗雖然不常發(fā)生過敏性休克或昏迷，但一旦發(fā)生就足以造成嚴(yán)重后果；最后，首次免疫要2周至2個(gè)月內(nèi)用二次，以后每隔6個(gè)月注射一次。免疫預(yù)防工作量非常大。2、多肽疫苗1982年研發(fā)出人工合成的多肽苗。合成多肽疫苗能克服常規(guī)疫苗的缺點(diǎn)，很早就被認(rèn)為是動(dòng)物傳染病預(yù)防用的終極疫苗。使用大腸桿菌作為寄主細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間只需 20個(gè)小時(shí)，周期比用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)滅活疫苗短得多，基因工程疫苗對(duì)環(huán)境沒有污染，沒有泄露的危險(xiǎn)，非常安全，且生產(chǎn)出的疫苗在貯藏、運(yùn)輸和使用過程中不需要冷藏，效價(jià)穩(wěn)定。20 多年來多肽疫苗的研究多集中在VPl外殼蛋白的B細(xì)胞單一免疫決定簇，進(jìn)一步研究表明結(jié)構(gòu)蛋白VPl的免疫決定簇為141-160區(qū)域和200-213區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域的多肽片段與載體蛋白經(jīng)化學(xué)聯(lián)接后產(chǎn)生的抗體能中和病毒粒子(Nature，1982，四8 :30-33 J. Virology, 2000,74 :4902-4907 J. Virology, 2001, 75 :3164-3174 ;J. Virology, 2003, 77 :8633-8640 ； Vaccine, 2002, 20 :2603-2610 ；生物工程學(xué)報(bào)，2009，25 G) 514-519)。然而因中和抗體產(chǎn)生較少，合成多肽疫苗免疫動(dòng)物后所起的免疫保護(hù)作用并沒有人們當(dāng)初設(shè)想的那么理想，利用價(jià)值甚至被否認(rèn)。在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫的過程中，單一的中和抗原表位是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 而且，目前的FMDV疫苗，不論是滅活FMDV疫苗或者是多肽疫苗，都不能通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)分辨被免疫動(dòng)物和已感染動(dòng)物，而被免疫動(dòng)物與已感染動(dòng)物混淆會(huì)給市場(chǎng)進(jìn)出口造成極大影響。因此，制備出免疫效價(jià)提高而且可用于分辨被免疫動(dòng)物和已感染動(dòng)物的基因工程多價(jià)口蹄疫疫苗是我們不斷追求的目標(biāo)。近年來的研究證明除了 VPl的B細(xì)胞免疫決定簇之外，需要VP4的T細(xì)胞免疫簇協(xié)同作用，可獲得很好的免疫中和抗體保護(hù)效果。復(fù)旦大學(xué)等單位研制的Asial基因工程疫苗含τ-helper和VPl免疫決定簇疫苗具有保護(hù)效果，能夠產(chǎn)生中和抗體。美國UBI公司合成的多肽疫苗具有T-細(xì)胞Helper多肽與VPl的B細(xì)胞免疫決定簇多肽，大大增強(qiáng)了中和抗體的作用(10倍左右)，具有明確的免疫保護(hù)效果。具有良好的安全性無發(fā)熱癥狀、無過敏反應(yīng)發(fā)生、注射部位無吸收不良現(xiàn)象、對(duì)妊娠母豬的健康狀況和妊娠沒有影響，對(duì)產(chǎn)仔成績(jī)也沒有影響。目前需要大量、廉價(jià)生產(chǎn)多肽類疫苗。但是，化學(xué)合成超過20個(gè)氨基酸的肽鏈非常昂貴。因此，需要發(fā)展生物技術(shù)通過基因工程大量生產(chǎn)多肽。然而，實(shí)際應(yīng)用還距離很遠(yuǎn)。根據(jù)近20年對(duì)多肽的研究報(bào)告，除胰島素外，基因工程并不比化學(xué)合成具有優(yōu)勢(shì)。根本原因是基因工程的理論發(fā)展與實(shí)際應(yīng)用尚有待發(fā)展，況且，多肽在體內(nèi)迅速降解不利于相應(yīng)抗體的誘導(dǎo)產(chǎn)生。應(yīng)利用基因工程技術(shù)制備FMDV多肽疫苗。與其他基因工程多肽產(chǎn)品一樣，生產(chǎn)需解決一系列的上游設(shè)計(jì)與下游工藝問題。盡管有很多報(bào)道，離應(yīng)用尚遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種新型A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗。本發(fā)明的一種A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其基因工程菌是A/Asia I，口蹄疫病毒FMDV外殼蛋白有四種即VP1、VP2、VP3、VP4，A/Asia I 基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，(1個(gè)重復(fù)片段的核苷酸排列序列為圖1)，A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗含有211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為1-5的整數(shù)。本發(fā)明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其基因工程菌中含有串聯(lián)的基因以大腸桿菌(E.Coli)中攜帶的Lac質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。所述的疫苗還包括藥學(xué)上可接受的載體、輔料和/或免疫佐劑。另一方面，本發(fā)明還提供了能夠表達(dá)所述A/Asia I 口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的A/Asia I基因工程菌株。該A/Asia I基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒分別含有2114個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為1-5的整數(shù)。本發(fā)明提供所述A/Asia I 口蹄疫疫苗在防治口蹄疫疾病中的用途以及在區(qū)分感染動(dòng)物和被免疫動(dòng)物中的用途。本發(fā)明還提供了一種偶蹄類家畜A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗制備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的制備，其特征在于(1)為合成A/Asia I基因工程菌，用化學(xué)合成的方法合成編碼VP4的T-細(xì)胞 helper的15個(gè)氨基酸片段的基因連接A型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的 DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫原性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)A/ Asia I重復(fù)片段，串聯(lián)8次；(2)為合成A/Asia I基因工程菌，將A/Asia I的8個(gè)重復(fù)片段插入Lac質(zhì)粒載體；(3)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，得到A/Asia I菌株；(4)將A/Asia I菌株置于營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間為12-M小時(shí)，發(fā)酵液中加入氨芐西林使其最后濃度為50 μ g/ml，及IPTG，濃度為0. 5mM, 發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體，經(jīng)細(xì)胞粉碎，包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，與佐劑勻漿形成A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗。本發(fā)明對(duì)多肽的基因工程研究包括建立了上游高效表達(dá)的設(shè)計(jì)和密集型高新技術(shù)的下游工藝，建立了高收率、低成本的簡(jiǎn)化工藝。A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗是系列多肽藥物之一，可以廉價(jià)大量生產(chǎn)。以大腸桿菌為工程菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間只需 12個(gè)小時(shí)，基因工程疫苗對(duì)環(huán)境沒有污染，沒有泄露的危險(xiǎn)。生產(chǎn)出來的疫苗在貯藏、運(yùn)輸和使用過程中無需冷鏈。我們根據(jù)我國的一些地區(qū)發(fā)生的疫情及鄰近接壤的國家報(bào)道的口蹄疫病毒血清型，選擇A型、Asia I型兩種血清型，能夠有效地防治A型及Asia I型兩種血清型口蹄疫，對(duì)于我國適用。我們的基因工程口蹄疫病毒疫苗除免疫效價(jià)高外還可分辨被免疫動(dòng)物及已感染動(dòng)物。使用本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)1)安全性好，本發(fā)明是基因工程產(chǎn)品，不是滅活疫苗，不存在因痕量活病毒泄露而引起疾病爆發(fā)的危險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，以較高劑量的疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，在較長(zhǎng)的觀測(cè)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康存活。2)本發(fā)明的疫苗適用于基因工程的方法大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本。3)利用本發(fā)明的疫苗可以區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。在自然界中，感染A型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生A型口蹄疫抗體；感染0型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生0型口蹄疫抗體；感染Asia I型口蹄疫的動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生Asia I型口蹄疫抗體。本發(fā)明的疫苗同時(shí)具有A型及Asia I型兩種口蹄疫病毒VPl免疫決定簇，免疫注射后，動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗 A型、抗Asia I型兩種口蹄疫的抗體，可以藉此區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物，避免給動(dòng)物進(jìn)出口造成混亂。4)本發(fā)明的疫苗含有A型及Asia I型兩種口蹄疫病毒VPl免疫決定簇，又含有 VP4的T-Helper多肽，大大增強(qiáng)了中和抗體的作用，8個(gè)重復(fù)片段表達(dá)，多肽的分子量大，在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，其產(chǎn)生中和抗體的時(shí)間也大大延長(zhǎng)。5)本發(fā)明的疫苗適用于我國A型及Asia I型兩種口蹄疫病毒流行區(qū)。


圖1是A/Asia I基因工程菌的表達(dá)載體中的結(jié)構(gòu)SEQ ID ；圖2是質(zhì)粒F8的構(gòu)建過程示意圖，圖示如何將基因片段串聯(lián)8次的過程；圖3是含Lac載體的0/Asia I基因工程菌(E. Coli)在發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)圖譜 (12hr，發(fā)酵罐瑞士比歐，100L)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本發(fā)明根據(jù)A及Asia I兩種類型FMDV的VPl免疫決定簇及VP4的T-細(xì)胞helper 的氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成DNA基因片段。其基因工程菌是A/Asia I。A/Asia I基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A型VPl 蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，1個(gè)重復(fù)片段的核苷酸排列序列參見圖1。本發(fā)明的新型A/Asia I 口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其含有21^1個(gè)串聯(lián)的 SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽，其中η為1-5的整數(shù)。SEQ ID含有口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA編碼序列，其可以編碼正向表達(dá)的A型和Asia I 口蹄疫病毒的抗原決定簇，其表達(dá)產(chǎn)物可以刺激產(chǎn)生抗A型和Asia I 口蹄疫病毒的抗體。優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有211—1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所編碼的多肽，其中，η為2_4的整數(shù)。最優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有211—1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所編碼的多肽，其中，η為4。為提高生物利用率并增強(qiáng)免疫效果，本發(fā)明的疫苗還可以含有藥學(xué)上可以接受的載體、輔料和或免疫佐劑等物質(zhì)。免疫佐劑是一種可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)的物質(zhì)，其能夠和抗原混合使用，有助于注射物質(zhì)的沉積或匯集，還能增強(qiáng)抗體反應(yīng)?？勺鳛槊庖咦魟┑奈镔|(zhì)有1)微生物及其產(chǎn)物，如分枝桿菌、短小棒狀桿菌、 百日咳桿菌以及處左蘭氏陰性桿菌的提取物脂多糖，自分枝桿菌的提取物胞壁酰二肽等。2)多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚腺苷酸、多聚左旋谷氨酸等。3)福氏佐劑 (Freund' sadjuvant)，包括不完全福氏佐劑(將抗原水溶液與油劑(石蠟油或植物油)等量混合，再加乳化劑(羊毛脂或吐溫80)制成的油包水抗原乳劑)和完全福氏佐劑(在不完全佐劑中加入分枝桿菌如卡介苗)。4)無機(jī)物，如明礬及氫氧化鋁等。近年來，發(fā)現(xiàn)以下物質(zhì)也可作為免疫佐劑，包括1)細(xì)菌毒素，如霍亂毒素(CT)和大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)?；肅T和LT的減毒衍生物或變異體?；萌藘?nèi)生性免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-2、IL-12、GM-GSF。4)激素。5)脂肽。6)皂角苷，皂角苷衍生物QS-21。7)含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG 0DN)。8)類脂A的衍生物，如脂多糖衍生物單磷酰脂A (MPL)。9)胞壁酰二肽(MDP)的衍生物。此外，某些具有內(nèi)在的免疫刺激活性的遞送系統(tǒng)也可作為免疫佐劑用于疫苗構(gòu)建，這些遞送系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)體、乳劑、螺狀體(cochleate)、病毒顆粒、微粒子和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)。上述各種類型的免疫佐劑均可用于本發(fā)明。佐劑可以以合適的劑量與本發(fā)明具有免疫源性的多肽配合使用，形成本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有不完全福氏佐劑或氫氧化鋁，更優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗含有不完全福氏佐劑作為免疫增強(qiáng)劑。不完全福氏佐劑中羊毛脂和石蠟油的比率隨季節(jié)的變化略有不同，如，春、夏、秋季羊毛脂和石蠟油的比率約為3 7，冬季二者的比率約為 1. 5 8. 5。本發(fā)明的A/Asia I 口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法，包括將21^1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核苷酸序列，可以直接合成，也可先合成若干個(gè)DNA片段，連接后產(chǎn)生如SEQ ID所示的DNA序列。為了后續(xù)操作的方便，在設(shè)計(jì)DNA片段時(shí)，可以將合適的酶切位點(diǎn)引入序列兩端，以便將靶序列克隆入合適的載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為合成A/Asia I基因工程菌的載體，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A 型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為一個(gè)重復(fù)片段，由10個(gè)DNA片段連接產(chǎn)生，每個(gè)重復(fù)片段Fl含有SEQ ID所示的核酸序列和合適的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)。利用基因工程的方法將Fl克隆到載體，然后，通過酶切后具有相互匹配的粘性末端的限制性內(nèi)切酶，將F2 (含有 2個(gè)串聯(lián)的Fl序列)克隆入載體，表達(dá)后的多肽含有2個(gè)重復(fù)片段(VP4+A型VPl+Asia I型VPl)。按照類似的方法，可以依次將F4、F8、F16克隆入載體，它們依次含有4個(gè)、8個(gè)、16 個(gè)串聯(lián)的Fl序列，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)后，得到的多肽分別含有4個(gè)、8個(gè)、16個(gè)串聯(lián)的重復(fù)片段(VP4+A型VPl+Asia I型VPl)。在本發(fā)明的制備方法中，用于多肽表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)可以是原核表達(dá)系統(tǒng)，還可以是真核表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)包括合適的宿主細(xì)胞，以及能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定存在的質(zhì)?；蜉d體。可以作為宿主細(xì)胞的例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌等；真核細(xì)胞，如酵母等。可以使用的載體可以包括染色體來源的、非染色體來源的及合成的DNA序列。如 噬菌體DNA、桿狀病毒、細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒以及由質(zhì)粒、噬菌體和病毒DNA組合衍生的載體。優(yōu)選的，在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的多肽。更優(yōu)選的，可以將本發(fā)明的多肽克隆入高效率的表達(dá)載體(如市售的表達(dá)載體)與載體蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。本發(fā)明還涉及一種A/Asia I基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒分別含有2114個(gè)串聯(lián)的 SEQ ID所示的核酸序列，其中η為1-5的整數(shù)。優(yōu)選的，所述A/Asia I基因工程菌攜帶的質(zhì)粒含有2114個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，，其中η為2-4的整數(shù)。更優(yōu)選的，所述A/Asia I基因工程菌攜帶的質(zhì)粒含有211—1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為4。本發(fā)明的A/Asia I 口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗在預(yù)防和治療口蹄疫中的用途?？梢詫⒈景l(fā)明的疫苗注射給動(dòng)物，刺激動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗A型及抗Asia I型兩種口蹄疫的抗體，故本發(fā)明的疫苗可以用于區(qū)分免疫接種動(dòng)物和感染動(dòng)物。表1是抗原抗體反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果，抗體為0型及A型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)血清及0型口蹄疫治療后牛血清均由上海市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供，抗原為自行制備的本發(fā)明的A/ Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗。表1 抗原抗體反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中基因工程菌是A/ Asia I，口蹄疫病毒FMDV外殼蛋白有四種即VP1、VP2、VP3、VP4，A/Asia I基因工程菌是口蹄疫病毒毒株編碼VP4的T-細(xì)胞helper的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)重復(fù)片段，A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗含有2114個(gè)串聯(lián)的SEQID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為1_5的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中A/ Asia I基因工程菌含有211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為2_4 的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求2所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中A/ Asia I基因工程菌含有211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其中η為4。
4.如權(quán)利要求3所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中A/ Asia I基因工程菌含有8個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的蛋白，其分子量分別是 60352. 8。
5.如權(quán)利要求3所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中A/ Asia I基因工程菌中含有串聯(lián)的基因以大腸桿菌中攜帶的Lac質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中所述的疫苗還包括藥學(xué)上可接受的載體、輔料和/或免疫佐劑。
7.如權(quán)利要求6所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是福氏不完全佐劑。
8.如權(quán)利要求6所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是Al (OH) 3。
9.如權(quán)利要求6所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是Y-多聚谷氨酸ploy-γ-glutamic acid。
10.一種權(quán)利要求1所述的A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法，包括將A/Asia I基因工程菌的2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中η為1-5的整數(shù)。
11.如權(quán)利要求10所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法， 包括將A/Asia I基因工程菌的2114個(gè)串聯(lián)的SEQID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中η為2-4的整數(shù)。
12.如權(quán)利要求11所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法， 包括將A/Asia I基因工程菌的211-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體并在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)的步驟，其中η為4。
13.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法，其中所述核酸序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。
14.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法，其中所述核酸序列在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。
15.一種權(quán)利要求1所述的A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的A/ Asia I基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒分別含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQID所示的核酸序列，其中η為1-5的整數(shù)。
16.如權(quán)利要求15所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的一種A/ Asia I基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為 2-4的整數(shù)。
17.如權(quán)利要求16所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的一種A/ Asia I基因工程菌株，其攜帶的質(zhì)粒含有2"-1個(gè)串聯(lián)的SEQ ID所示的核酸序列，其中η為 4。
18.權(quán)利要求1所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗用于預(yù)防和治療 A型及Asia I 口蹄疫。
19.權(quán)利要求1所述的A/AsiaI型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗用于區(qū)分感染動(dòng)物和被免疫動(dòng)物。
20.一種偶蹄類家畜A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗的制備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的制備，其特征在于(1)為合成A/AsiaI基因工程菌，用化學(xué)合成的方法合成編碼VP4的T-細(xì)胞helper 的15個(gè)氨基酸片段的DNA序列連接A型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列連接Asia I型VPl蛋白中有免疫源性的免疫決定簇區(qū)域的DNA序列作為1個(gè)A/Asia I 重復(fù)片段，串聯(lián)8次；(2)為合成A/AsiaI基因工程菌，將A/Asia I的8個(gè)重復(fù)片段插入Lac質(zhì)粒載體；(3)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，得到A/AsiaI基因工程菌株；(4)將A/AsiaI基因工程菌株置于營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時(shí)間為12- 小時(shí)，發(fā)酵液中加入氨芐西林使其最后濃度為5(^8/!111，及1 16，濃度為 0. 5mM,發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體，經(jīng)細(xì)胞粉碎，包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，與佐劑勻漿形成A/Asia I型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗。
全文摘要
一種A/AsiaⅠ型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗及制備方法和用途。選擇A型及AsiaⅠ型兩種血清型，取VP1的B細(xì)胞決定簇及VP4的T-細(xì)胞helper15個(gè)氨基酸的片段，串聯(lián)，克隆，不含有載體蛋白，構(gòu)建A/AsiaⅠ基因工程菌。經(jīng)過高密度發(fā)酵，細(xì)胞破碎、包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化，凍干即可獲得抗原蛋白產(chǎn)品，與佐劑勻漿形成A/AsiaⅠ型口蹄疫病毒兩價(jià)基因工程多肽疫苗。本發(fā)明的疫苗含有2n-1個(gè)串連的SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽，其中，n為1-5的整數(shù)。本發(fā)明的疫苗安全性好，免疫效價(jià)高，半年內(nèi)一次免疫即可；適于大規(guī)模生產(chǎn)，保存運(yùn)輸便利；能夠有效地防治A型及AsiaⅠ型兩種血清型口蹄疫，對(duì)于我國適用；不產(chǎn)生口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A.B.，易與感染動(dòng)物區(qū)分。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102274497SQ20101019971
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者吳曉琰, 孫玉琨, 趙泓 申請(qǐng)人:吳曉琰, 孫玉琨, 趙泓