專利名稱：迷你皮膚結構及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及迷你皮膚結構領域，涉及其制備方法及其在醫(yī)藥、化妝品領域的用途。
背景技術：
1.人工皮膚替代品皮膚是人體的生理/物理屏障，防止外界有毒物質和微生物對人體的侵襲，以及 水分的流失。臨床大面積燒傷，皮膚脫套傷病人如果皮膚的完整性不能得到及時修復，就會增 加感染，水分流失機會，瘢痕增生，影響機體功能恢復，重則危及生命。為了促進創(chuàng)傷愈合， 降低感染機率以及改善預后，對機體創(chuàng)傷微環(huán)境和人工皮膚代用品的研究日趨炙熱。目前 比較流行的應用于實驗研究組織工程人工皮膚代用品，基本上采用如下通用程序在人工 合成的真皮(主要成分為膠原，透明質酸)/脫細胞處理的人體真皮(含或不含真皮成纖維 細胞)表面，植入大量表皮角質細胞(百萬以上細胞數)，應用特殊的液氣面培養(yǎng)環(huán)境，和含 特殊成分的培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)三周以上時間直至形成分化表皮結構模擬在體皮膚。該模型 目前被廣泛應用于檢測創(chuàng)傷愈合過程中細胞因子，生化物質等相關因素對細胞本身及細胞 分泌的細胞外基質的合成的影響，一些學者也正試圖將該結構應用于臨床創(chuàng)傷修復治療， 然而，像其他同類或類似結構，該模型在很大程度上還有待改進，包括耗時長，費用高，制 作復雜，模型形成后貨架壽命短，制作過程中添加的生物材料可能對實驗的準確性及潛在 的臨床應用產生相關影響，以及該產品移植人體后的再生能力存在不確定性(ref Liu et al.，2010 ；Xie et al.，2010)。2.藥物檢測工具對制藥工業(yè)，發(fā)展一個新型藥品可能耗費大量的時間、物力和財力。其中至關重 要的環(huán)節(jié)是在藥物臨床應用前期檢測藥物的潛在毒性和其他副反應，然而一種新型藥物對 人體的危害經常是在臨床實驗后才被發(fā)現。當前，作為檢測藥物成分的副反應方面的一個 重要工具，動物模型尤其是基因調控動物模型耗資昂貴，而且其臨床相關性也受到質疑。實 際上，只有50%的動物模型可以有效的預測藥物對人體心臟、肝臟以及發(fā)育的毒副反應，而 且，動物模型的應用也受到倫理和政治因素的限制?，F狀是，目前還沒有一種有效的人體細 胞系統(tǒng)，可以真實模擬人體生理病理系統(tǒng)，從而提供真實可信的藥物臨床前期應用的支持 數據。盡管人體胚胎干細胞(HES)的應用提供了一個新的平臺，由HES衍生的多分支母細胞 系統(tǒng)，理論上可以根據需要分化成人體所有類型細胞。然而，倫理和司法上的考慮圍繞HES， 限制了 HES的研究和臨床應用，對此，多數國家和地區(qū)制定了明確的方針條例來規(guī)范HES 的應用。另外，在HES衍生過程中應用的基因調控技術和其他生物因子對細胞和實驗結果 的影響也不可忽視。HES的應用和保養(yǎng)耗資昂貴，更為重要得是，實驗結果反映的是人體單 一細胞對藥物和生化制品的反應，而人體是一個復雜的多器官整合體，理想的藥物實驗工 具，應該是一種反映細胞間相互作用的，類似人體器官的復合體(ref Klimanskaya etal.， 2007 ；Sartipy，et al.，2007)。
3
3.疾病模型，皮膚疾病模型目前大約有2000種以上已知的皮膚疾病，隨著轉基因技術成功應用于皮膚疾病 病理研究領域，已經有上百種基因調控的小鼠疾病模型可以應用于人體皮膚疾病的研究。 其中有的病因明確已經發(fā)展了有效的治療方案，然而，由于動物模型的局限性，很多人類疾 病無法在動物身上得到相應復制，人類目前對他們還一無所知。另外，從倫理學和研究經費 的角度，更需要一個有效可靠的生物系統(tǒng)/產品，由人體本身的疾病細胞或組織構成，能夠 近似真實的模擬相應的疾病組織，可以用來研究疾病的病理以及相關治療手段，同時具有 制作簡便，費用低廉的優(yōu)勢。為更好地理解本發(fā)明，本領域技術人員可參考以下文獻Guo A，Jahoda CA. An improved method of human keratinocyteculture from skin explants :cell expansion is linked to markers ofactivated progenitor cells (應用皮膚組織塊的人角化細胞的改進方法細胞增殖與祖細胞標記活性密切關 聯).Exp Dermatol. 200918(8) :720_6·Havlickova B,et al. ,A Human Folliculoid Microsphere Assay forExploring Epithelial-Mesenchymal Interactions in the Human HairFollicle. Journal of Investigative Dermatology (用于研究上皮細胞的人類雌酮微球體測定法-人毛囊中的 間葉細胞相互作用)(2009) 129,972-983.Kurosawa H :Methods for inducing embryoid body formation :in vitro differentiation system of embryonic stem cells ( 帛白勺力夕去！$月臺zF^ffl 胞的體外分化系統(tǒng))· J. Biosci. Bioeng. 103，389-398 (2007) ·Klimanskaya I, Rosenthal, N and Lanza,R. Derive and conquer :Sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications (用于治療白勺干細白勺純源 化禾口分化)· Nat Rev Drug Discov, Epub 2007, December 14.Liu J, Bian Ζ, Kui jpers-Jagtman AM, Von den Hoff Jff. Skin andoral mucosa equivalents :construction and performance (皮膚和口 腔粘膜等同物構造和性 能).Orthod Craniofac Res. 2010Feb ； 13(1) 11-20. Review.Ramos ML,Gragnani A,Ferreira LM. Is there an ideal animal modeIto study hypertrophic scarring ？(是否有研究疤痕過度生長的理想的動物模型)J Burn Care Res. 2008. 29(2) 363-8.Sartipy, P,Bjorquist, P, Strehl，R and Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery(人胚胎干細胞技術對于藥物開 發(fā)的應用).Drug Discov Today, 2007,12 688-699.Xie Y, Rizzi SC, Dawson R, Lynam Ε, Richards S, Leavesley DI, Upton Ζ.Development of a Three-Dimensional Human Skin Equivalentffound Model for Investigating Novel Wound Healing Therapies(用于研究新的創(chuàng)傷愈合的三維人皮膚等 同物創(chuàng)傷模型的開發(fā)).Tissue EngPart C Methods. 20IOMar 2.以上公開的文獻通過引用結合至本文中。本發(fā)明提供了一種由表皮細胞和真皮細胞體外整合的迷你皮膚結構及其制備方 法，從而解決了以上技術問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明一方面提供了一種由上皮細胞(例如表皮細胞)和間葉細胞(例如真皮細 胞)體外整合的迷你皮膚結構；例如，其中所述間葉細胞可以為真皮細胞，例如真皮成纖維 細胞，所述上皮細胞可以為表皮細胞，例如為表皮角質細胞。本發(fā)明一方面提供了一種由表皮細胞和真皮細胞體外整合的迷你皮膚結構。在一個實施方案中，本發(fā)明所述真皮細胞可以為真皮成纖維細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明所述表皮細胞可以為表皮角質細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明所述上皮細胞如表皮細胞和間葉細胞如真皮細胞優(yōu)選 為哺乳動物的細胞，更優(yōu)選為人的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的細胞可以是正常細胞，或利用某些疾病組織提 取的細胞。本發(fā)明所述真皮細胞可以來自間葉細胞。本發(fā)明所述表皮細胞可以來自上皮細胞。本發(fā)明另一方面涉及一種制造本發(fā)明所述的迷你皮膚結構的方法，所述方法包 括由間葉細胞如真皮細胞球結體和上皮細胞如表皮細胞制成迷你皮膚結構。所述真皮細胞和表皮細胞可以由市售產品獲得，或者通過分離培養(yǎng)獲得。本發(fā)明另一方面涉及一種制造本發(fā)明所述的迷你皮膚結構的方法，所述方法包 括(1)分離培養(yǎng)間葉細胞，如真皮細胞，如真皮成纖維細胞；(2)分離培養(yǎng)上皮細胞，如表皮細胞，如表皮角質細胞；(3)制造間葉細胞如真皮細胞球結體；和(4)由間葉細胞如真皮細胞球結體和上皮細胞如表皮細胞制成迷你皮膚結構。在一個實施方案中，本發(fā)明制造所述的迷你皮膚結構的方法中，所述分離培養(yǎng)真 皮細胞包括真皮細胞的原代培養(yǎng)和傳代，所述分離培養(yǎng)表皮細胞包括表皮細胞的原代培養(yǎng) 和傳代。在一個實施方案中，在真皮細胞，如真皮成纖維細胞(PMFB)的原代培養(yǎng)中，可將 正常皮膚組織去除皮下結締組織和表皮，例如用含青鏈霉素的PBS沖洗，例如沖洗3次，從 而盡量去除皮下結締組織和表皮；接種真皮，例如可將真皮剪成小塊，接種于例如35mm培 養(yǎng)皿中；然后培養(yǎng)，例如置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)例如lh，例如可加入少量含 10%優(yōu)等胎牛血清(FCS)的MEM，次日加入足量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3d換一次液。在一個實施方案中，在真皮細胞，如真皮成纖維細胞(PMFB)的傳代中，顯微鏡下 觀察細胞從組織塊中生長移出，逐漸長滿培養(yǎng)皿的基底?？上?，如用0. 25%胰酶/0. 02% EDTA消化約Imin ；在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙增大；終止消化，例如加入含 10%優(yōu)等胎牛血清的MEM終止消化；傳代培養(yǎng)，例如用吸管吹打細胞，以例如1 3的比例 傳代培養(yǎng)，待用。在一個實施方案中，在表皮細胞，如表皮角質細胞(正常皮膚/皮膚疾病組織) (PMHK)的原代培養(yǎng)中，可將皮膚組織去除條狀表皮組織連帶少許真皮，例如用含青鏈霉素的PBS沖洗3次，表皮面向上置于IOOmm培養(yǎng)皿中，在組織分離顯微鏡下剪除條狀表皮組織 連帶少許真皮；接種，例如將此條狀組織剪成細小組織塊，接種于35mm培養(yǎng)皿中，表皮面向 上；然后培養(yǎng)，例如置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)如20分鐘，可以加入少量含20%優(yōu) 等胎牛血清的MEM，次日加入足量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3d換一次液(ref，GU0 et al)。在一個實施方案中，在表皮細胞，如表皮角質細胞(正常皮膚/皮膚疾病組織) (PMHK)的傳代中，顯微鏡下觀察角質細胞從組織塊中成片狀生長移出，逐漸長滿培養(yǎng)皿的 基底?？上缬?. 25%胰酶/0. 02% EDTA消化約Imin ；在顯微鏡下觀察到細胞回縮 變圓、細胞間隙增大；終止消化，例如加入含10%優(yōu)等胎牛血清的MEM終止消化；傳代培養(yǎng)， 例如用吸管吹打細胞，以例如1 3比例傳代培養(yǎng)于表皮細胞培養(yǎng)液中(例如Epilife ， 也可用其他表皮細胞培養(yǎng)液替代，例如PR0M0CELL的KM2)，待用。在一個實施方案中，本發(fā)明制造所述的迷你皮膚結構的方法中，所述制造真皮細 胞球結體包括(1)制成真皮細胞的單一細胞混懸液，例如應用含10%的優(yōu)等胎牛血清的MEM制 成單一細胞混懸液；(2)使所述真皮細胞的單一細胞混懸液小滴懸浮，讓細胞落到懸浮小滴的底部，例如移植10 μ 1/滴細胞懸液到IOOmm培養(yǎng)皿的蓋子上，每滴懸液含有3000細胞， 小心將蓋子翻轉，覆蓋于培養(yǎng)皿的基底上，當蓋子翻轉后，每一滴細胞懸液懸浮，細胞落到 懸浮小滴的底部；以及(3)在防止真皮細胞的單一細胞混懸液小滴風干的同時孵育，從而使小滴中的單 一細胞形成致密的真皮細胞球結體。其中所述真皮細胞的單一細胞混懸液小滴可以懸浮在培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)皿中可以加 入PBS以防止小滴風干，所述孵育的條件例如為37°C和5% CO2，培養(yǎng)皿上可以放有重物以 保持下方的懸浮小滴承受壓力，例如，可在該培養(yǎng)皿上方再壓上一個裝滿PBS的IOOmm培養(yǎng) 皿以保持下方的懸浮小滴承受適當的壓力。例如，2-3天后，小滴中的單一細胞形成一個致 密的細胞球體。在一個實施方案中，本發(fā)明制造所述的迷你皮膚結構的方法中，所述由真皮細胞 球結體和表皮細胞制成迷你皮膚結構包括(1)消化分離培養(yǎng)的表皮細胞，產品所用角質細胞優(yōu)選為原代培養(yǎng)的細胞5代以 內，優(yōu)選此時的角質細胞處于70-80%融合狀態(tài)，消化酶的濃度優(yōu)選為0. 025-0. 25%胰蛋 白酶(trypsin) -EDTA ；(2)離心消化后所得的表皮細胞懸浮液，例如離心速=IOOOrpm x3分鐘；(3)將離心后的表皮細胞用表皮細胞生長液，例如Epilife 生長液稀釋成表皮細 胞的單細胞混懸液；(4)向真皮細胞球結體小滴植入所述表皮細胞的單細胞混懸液，例如，從孵箱中取出含有真皮細胞懸浮體的培養(yǎng)皿，小心翻轉培養(yǎng)皿蓋，液滴面向 上置于操作臺上。向每個液滴植入IOul含3000表皮角質細胞的混懸液。此時每個液滴含 有20ul培養(yǎng)液，含3000真皮成纖維細胞和3000表皮角質細胞；(5)使所述表皮細胞的單細胞混懸液小滴懸浮，在防止小滴風干的同時與真皮細 胞球結體接觸培養(yǎng)，直到形成顯微皮膚結構，
6
例如，小心翻轉培養(yǎng)皿蓋，置于培養(yǎng)皿底座之上。該培養(yǎng)皿上方再壓上一個裝滿 PBS的IOOmm培養(yǎng)皿以保持下方的懸浮小滴承受適當的壓力(同上)。孵箱繼續(xù)培養(yǎng)2_3 天直到形成顯微皮膚結構。冷凍儲存收集迷你皮膚于Iml appendorf，直立靜置appendorf約5-10分鐘以使 迷你皮膚沉積于appendorf基底，小心吸出上清液，置換為細胞冷藏液(FCS/DMS0 9 1)， 將其轉移至細胞冷凍瓶，以每分鐘降低1度的速度冷凍，然后儲存于液氮中以作長期保存 和運輸。保養(yǎng)迷你皮膚可以長期存活于懸浮液培養(yǎng)中。懸浮液可以每5天更換一次。新 鮮培養(yǎng)液為含10% FCS的MEM Epilife 1 1，總量為20ul)。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可試用于臨床燒傷，創(chuàng)傷的創(chuàng)傷修復治療，所述迷你皮 膚已證實可用于植入活體內或有活性的體外培養(yǎng)器官中，作為細胞庫提供健康細胞進一步 生長繁殖。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可用于制備醫(yī)療用品，所述醫(yī)療用品可用于植入活體內 或有活性的體外培養(yǎng)器官，作為細胞庫提供健康細胞。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可用于檢測藥物或化妝品的安全性和有效性的用途。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可用于開發(fā)體外疾病模型的用途。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可用于研究毛發(fā)再生的用途。本發(fā)明所述迷你皮膚結構可用于研究人體各種器官組織，以及疾病組織中真皮和 表皮細胞的相互作用的用途。本發(fā)明的各個實施方案可以根據需要相互組合。本發(fā)明相對于現有技術具有顯著的創(chuàng)新和進步，例如1.該產品應用人體細胞，采用特殊技術體外合成顯微皮膚，不需添加其他生物合 成材料，準確真實地在細胞，分子水平模擬人體皮膚生理/病理環(huán)境；2.該產品生產過程簡易快捷，需要極少量細胞數，耗時短，投資小，可以轉化為機 械化批量生產，體外存活時間長于3周-1月時間，大大優(yōu)于市場上人工皮膚產品的存活 期；3.該產品可冷凍保存，復蘇程序操作簡便，運輸安全；4.該產品體外轉化培養(yǎng)或體內移植后，可以繁殖產生可觀的子細胞，作為特殊的 細胞來源；5.該產品應用的細胞可以推廣到應用人體皮膚之外的表皮和真皮細胞，體外模擬 除皮膚之外的其他器官，研究他們的生理病理狀態(tài)；6.該產品的細胞來源可以擴展到從人體疾病組織分離出來的表皮和真皮細胞，從 而模擬體外人體疾病模型。本發(fā)明的工業(yè)實用性例如1.該產品可作為動物實驗的替代品/延展品，應用于臨床藥品，生化試劑的臨床 應用前期檢測，在細胞和分子，基因水平探測藥品/試劑的安全性，有效性，毒副效應，為臨 床推廣應用提供真實可靠的依據；2.實驗證明，利用某些疾病組織提取的細胞，可以整合模擬出特定疾病類型，并表 達相關疾病標記。該產品可以擴展應用于發(fā)展多種人體體外疾病模型，尋求靈敏，早期，有
7效，安全的疾病診斷治療手段；3.利用人體表皮和真皮細胞整合的迷你皮膚結構，可以用來檢測化妝品，皮膚美 容產品的安全性，產品的皮膚天然屏障滲透率，細胞外基質的分泌變化，細胞凋亡幾率；4.利用人體皮膚毛囊表皮和真皮細胞整合的迷你結構，符合體外人工合成毛發(fā)器 官的基本要求(ref Halvlickova et al. ,2004) :a兩種類型細胞在自然環(huán)境中自發(fā)密切 接觸交流；b該結構包含基底膜結構成分；c表皮細胞顯示繁殖，角化和低水平的細胞凋亡； d真皮細胞顯示極低水平的增殖，凋亡，并表達特殊的毛囊分泌活性(后者正在通過進一步 研究證實)。該結構可以用于臨床毛發(fā)移植再生的應用研究，同時用于檢測臨床毛發(fā)再生藥 品的安全性，有效性檢測；5.實驗表明，該迷你皮膚植入活體內，或有活性的體外培養(yǎng)器官(例如角膜等) 后，可以作為細胞庫不斷產生提供健康細胞。該特點支持利用臨床病人自體細胞整合的該 迷你結構，移植回病人，作為一種有效的自體細胞生產基地，應用于臨床燒傷，皮膚缺損病 人的創(chuàng)傷修復。


圖1是形成迷你皮膚的簡易流程2是迷你皮膚形成后3天圖10x。圖3是迷你皮膚體外培養(yǎng)24天后OCT固定后冰凍切片后作免疫熒光染色，上圖顯 示的DAPI染色，提示迷你皮膚中細胞健康，無明顯細胞凋亡跡象，左圖20X，右圖40X。圖4是迷你皮膚形成后6天，樣品OCT包埋后冰凍切片，應用相應抗體進行免疫熒 光染色，20X。 圖5是迷你皮膚形成后6天，樣品OCT包埋后冰凍切片，應用相應抗體進行免疫熒 光染色，20X。圖6是迷你皮膚重新培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿基底。圖7是迷你皮膚植入裸鼠腎皮囊2天后，取出腎臟，固定切片，HE染色顯示細胞從 迷你皮膚結構中游出，向周圍組織蔓延生長。圖8是瘢痕疙瘩模型顯示TGF-beta陽性染色。圖9是利用毛囊真皮干細胞和表皮細胞整合形成的迷你毛囊結構，顯示DAPI和 P63熒光染色，圖左為真皮鞘細胞(dermal sheathcells)，圖右為真皮乳頭細胞(dermal papilla cells)。
具體實施例方式制作方法1.細胞培養(yǎng)1. 1.正常原代培養(yǎng)細胞正常皮膚和疾病組織(瘢痕疙瘩/血管瘤/肌肉進行性癱瘓病人的疾病組織/其 他腫瘤等等)真皮成纖維細胞(PMFB)的原代培養(yǎng)1. 1. IPMFB的分離培養(yǎng)1. 1. 1. 1原代培養(yǎng)正常皮膚組織，用含青鏈霉素的PBS沖洗3次，盡量去除皮下結締組織和表皮；將真皮剪成小塊，接種于35mm培養(yǎng)皿中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)lh，加入少量含10%優(yōu)等胎牛血清(FCS)的MEM，次日加入足量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后 每3d換一次液。1. 1. 1. 2 傳代·顯微鏡下觀察細胞從組織塊中生長移出，逐漸長滿培養(yǎng)皿的基底。用0. 25%胰酶 /0. 02% EDTA消化約lmin，在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙增大后，加入含10%優(yōu) 等胎牛血清的MEM終止消化，用吸管吹打細胞，以1 3比例傳代培養(yǎng)，待用。1. 1. 2人體表皮角質細胞(正常皮膚/皮膚疾病組織)PMHK的原代分離培養(yǎng)11. 2. 1原代培養(yǎng)皮膚組織，用含青鏈霉素的PBS沖洗3次，表皮面向上置于 IOOmm培養(yǎng)皿中，在組織分離顯微鏡下剪除條狀表皮組織連帶少許真皮，將此條狀組織剪成 細小組織塊，接種于35mm培養(yǎng)皿中，表皮面向上。置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 分鐘，加入少量含20%優(yōu)等胎牛血清的MEM，次日加入足量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3d換一 次液(ref，Guo et al.，2009)。1. 1. 2. 2傳代。顯微鏡下觀察角質細胞從組織塊中成片狀生長移出，逐漸長滿培養(yǎng) 皿的基底。用0. 25%胰酶/0. 02% EDTA消化約lmin，在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞 間隙增大后，加入含10%優(yōu)等胎牛血清的MEM終止消化，用吸管吹打細胞，以1 3比例傳 代培養(yǎng)于表皮細胞培養(yǎng)液中(Epilife )，待用。2.制作由表皮和真皮細胞體外整合的迷你皮膚結構2. 1真皮細胞球結體的制作制作過程參照懸浮液體小滴的方法(Kurosawa， 2007)。簡言之，應用含10% FCS的MEM制成單一細胞混懸液，移植10 μ 1/滴細胞懸液到 IOOmm培養(yǎng)皿的蓋子上，每滴懸液含有3000細胞。小心將蓋子翻轉，覆蓋于培養(yǎng)皿的基底 上。當蓋子翻轉后，每一滴細胞懸液懸浮，細胞落到懸浮小滴的底部。為防止小滴風干，培 養(yǎng)皿中加入適量的PBS，該培養(yǎng)皿上方再壓上一個裝滿PBS的IOOmm培養(yǎng)皿以保持下方的懸 浮小滴承受適當的壓力。繼續(xù)孵育該結構于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，2-3天后，小滴中的 單一細胞形成一個致密的細胞球體。2. 2制作迷你皮膚結構真皮細胞球結體孵育2-3天后，消化分離培養(yǎng)的表皮角質細胞(產品所用角質細 胞應為原代培養(yǎng)的細胞5代以內)，此時的角質細胞應處于70-80%融合狀態(tài)。消化酶的濃 度應為0. 025%胰蛋白酶(trypsin)-EDTA。離心消化后所得的細胞懸液(離心速=IOOOrpm x3分鐘)，將離心后的細胞用Epilife 生長液稀釋成單細胞混懸液。從孵箱中取出含有真 皮細胞懸浮體的培養(yǎng)皿。小心翻轉培養(yǎng)皿蓋，液滴面向上置于操作臺上。向每個液滴植入 IOul含3000表皮角質細胞的混懸液。此時每個液滴含有20ul培養(yǎng)液，含3000真皮成纖維 細胞和3000表皮角質細胞。小心翻轉培養(yǎng)皿蓋，置于培養(yǎng)皿底座之上。該培養(yǎng)皿上方再壓 上一個裝滿PBS的IOOmm培養(yǎng)皿以保持下方的懸浮小滴承受適當的壓力(同上)。孵箱繼 續(xù)培養(yǎng)2-3天直到形成顯微皮膚結構。3.冷凍儲存和保養(yǎng)3. 1冷凍儲存收集迷你皮膚于Iml appendorf，直立靜置appendorf約5-10分 鐘以使迷你皮膚沉積于appendorf基底，小心吸出上清液，置換為細胞冷藏液(FCS/DMS0 9 1)，將其轉移至細胞冷凍瓶，以每分鐘降低1度的速度冷凍，然后儲存于液氮中以作長期保存和運輸。3. 2 保養(yǎng):迷你皮膚可以長期存活于懸浮液培養(yǎng)中。懸浮液可以每5天更換一次。新鮮培養(yǎng) 液為 10% FCS MEM Epilife 1 1，總量為 20ul)。4.迷你皮膚作為細胞生長來源的能力檢測4. 1.體外培養(yǎng)收集迷你皮膚，將其置于含有10% FCS MEM的35mm培養(yǎng)皿中(5 個/每皿)靜置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4天以上。4. 2體外培養(yǎng)?、?小鼠一只，取出雙眼全層角膜，利用EDTA剝除上皮細胞 (印ithelium)，用16g注射針頭在基質(stroma)上形成一個直線傷口，將迷你皮膚植入傷 口，將基質(stroma)置于含有Agar營養(yǎng)基的器官培養(yǎng)皿中，靜置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng) 箱中孵育2天后，結束孵育，取出標本，固定，用含有DAPI的封片液封片，在共聚焦顯微鏡下 觀察細胞從迷你皮膚游出情況。4. 3活體移植取裸鼠一只，麻醉后，切開腹部，暴露腎臟，小心在腎皮囊表面作一 微創(chuàng)切口，將迷你皮膚輕柔植入，確認移植物安全存在于腎臟和腎皮囊之間后，將腎臟歸 位，關閉腹腔。2天后，處死小鼠，取出腎臟進行切片檢測。5.迷你皮膚的組織切片染色及免疫熒光檢測，以鑒定其模擬人體皮膚的真實性5. IHE 染色收集迷你皮膚樣品，OCT包埋，在液氮中快速冷凍。切片機制作7-lOum冰凍切片。 丙酮(Acetone)低溫固定后，作蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin) (HE)染色。5. 2免疫熒光染色從步驟5. 1獲得冰凍切片后，應用下列免疫熒光抗體作組織免疫熒光染色來檢測 是否迷你皮膚具有特定的皮膚組織功能標志?？贵w4' -6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘ -6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI))細胞核 DNA標記抗體KlO抗人皮膚外層表皮角質細胞分化標記抗體⑶34人體造血祖細胞標記抗體，在毛囊干細胞上有陽性表達。P63人體皮膚表皮干細胞標記抗體纖連蛋白(Fibronectin)，層粘連蛋白(Laminin)，膠原(collagen) VII人體皮膚 表皮基底層組成成分標記抗體波形蛋白(Vemintin)抗人體皮膚真皮細胞標記抗體內披蛋白(Involucrin)，聚絲蛋白(Filaggrin)抗人體皮膚表皮細胞分化，角質 化標記抗體6.應用從疾病組織中提取的細胞，按照步驟2的相應程序，制作相應疾病的體外 合成迷你模型，并比較這些迷你模型和由正常細胞構成的迷你皮膚之間形態(tài)上和功能上的 區(qū)別。從疾病組織中提取的細胞種類目前包括瘢痕疙瘩成纖維細胞，血管瘤成纖維細胞，進行性肌肉萎縮病人的肌肉成纖維細 胞。結果
1.簡易流程圖。見圖1。真皮細胞球結體形成于24小時內，2-3天后，形態(tài)接近完美的圓球形，細胞之間形 成致密接觸。表皮細胞植入后最早可在一天后，形成一個有組織的迷你皮膚結構。模擬人 體皮膚的結構，真皮細胞球結體位于結構的中心，表皮細胞形成多層細胞層環(huán)繞在真皮細 胞外圍。2-3天后，該結構日趨緊湊，明確。見圖2，圖2是迷你皮膚形成后3天圖(光學顯 微鏡IOx)。2.迷你皮膚結構中的細胞活性檢測在體外培養(yǎng)的迷你皮膚中，細胞可以存活至24天(我們的最長觀察日，可以相信 細胞可以存活更長時間)，沒有可見的細胞凋亡跡象。這里提供的圖片顯示在不同的時間段 迷你皮膚結構中的細胞活性。見圖3，圖3是迷你皮膚體外培養(yǎng)24天后OCT固定后冰凍切 片后作免疫熒光染色，該圖顯示的DAPI染色，提示迷你皮膚中細胞健康，無明顯細胞凋亡 跡象，左圖熒光顯微鏡20X，右圖40X。對照組的單一真皮細胞球結體只能體外存活至6天 左右，位于中心的細胞最先出現壞死跡象。3.免疫熒光染色證明迷你皮膚真實地反映正常人體皮膚結構，功能。迷你皮膚真實地有組織地模擬皮膚結構，晚期分化的表皮細胞(內披蛋白(Involucrin)， 聚絲蛋白(Filaggrin))位于結構的最外層，依次為分化早期的表皮細胞(K10)，表皮干細 胞位于基底細胞層(P63，⑶34)，真皮細胞構成的基底層成分(纖連蛋白(Fibronectin)，層 粘連蛋白(Laminin)，膠原(collagen) VII)，真皮細胞團(波形蛋白(Vemintin))，分泌細胞 外基質(纖連蛋白(Fibronectin)，層粘連蛋白(Laminin)).表皮和真皮細胞之間有明確的 分界線基底膜。見圖4、圖5。圖4是迷你皮膚形成后6天，樣品OCT包埋后冰凍切片，應 用相應抗體進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡20X。圖5是迷你皮膚形成后6天，樣品OCT包 埋后冰凍切片，應用相應抗體進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡20X。4.迷你皮膚作為細胞庫提供細胞持續(xù)生長的能力。4. 1.迷你皮膚在孵箱內靜置培養(yǎng)5-7天后，沉積附著于培養(yǎng)皿基底，真皮細胞不 斷從結構中游出，并生長繁殖，逐漸融合，可以作傳代持續(xù)培養(yǎng)。見圖6，圖6是迷你皮膚重 新培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿基底。4. 2迷你皮膚移植入角膜傷口 3天后，可見其融和于角膜的基質(stroma)傷口，真 皮細胞呈全方位生長滲透入周邊的宿主組織中。4. 3迷你皮膚移植入活體裸鼠腎皮囊2天后，可見細胞從結構中移出，生長遷移分 布于周圍組織中。見圖7，圖7是迷你皮膚植入裸鼠腎皮囊2天后，取出腎臟，固定切片，HE 染色顯示細胞從迷你皮膚結構中游出，向周圍組織蔓延生長。5.以疾病細胞替代正常皮膚真皮表皮細胞，利用迷你皮膚的制作技術可以制作 相關的疾病模型，供臨床藥理學和實驗室研究。見圖8，圖8下圖顯示瘢痕疙瘩模型呈 TGF-beta陽性染色。6.以人體毛囊真皮干細胞替代正常皮膚真皮表皮細胞，利用迷你皮膚的制作技術 可以制作迷你毛囊模型，以供毛發(fā)異常疾病和脫發(fā)藥物的研制輔助研究，在此基礎上進一 步發(fā)展，可以有望形成毛發(fā)移植的突破性工具。見圖9，圖9是利用毛囊真皮干細胞和表 皮細胞整合形成的迷你毛囊結構，顯示DAPI和P63熒光染色，圖左為真皮鞘細胞(dermal sheath cells)，圖右為真皮乳頭細胞(dermalpapilla cells)。
1權利要求
一種由上皮細胞(例如表皮細胞)和間葉細胞(例如真皮細胞)體外整合的迷你皮膚結構；例如，其中所述間葉細胞可以為真皮細胞，例如真皮成纖維細胞，所述上皮細胞可以為表皮細胞，例如為表皮角質細胞。
2.根據權利要求1的迷你皮膚結構，其中所述上皮細胞(例如表皮細胞)和間葉細胞 (例如真皮細胞)來源于哺乳動物組織，例如人體。
3.—種制造權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構的方法，所述方法包括 由間葉細胞，例如真皮細胞球結體和上皮細胞，例如表皮細胞制成迷你皮膚結構。
4.根據權利要求3的方法，所述方法包括 分離培養(yǎng)間葉細胞，例如真皮細胞； 分離培養(yǎng)上皮細胞，例如表皮細胞；制造間葉細胞，例如真皮細胞球結體；和由間葉細胞，例如真皮細胞球結體和上皮細胞，例如表皮細胞制成迷你皮膚結構。
5.根據權利要求4的方法，例如，權利要求4的方法中所述分離培養(yǎng)真皮細胞包括真皮細胞的原代培養(yǎng)和傳代， 所述分離培養(yǎng)表皮細胞包括表皮細胞的原代培養(yǎng)和傳代；例如，權利要求4的方法中所述制造真皮細胞球結體包括 制成真皮細胞的單一細胞混懸液；使所述真皮細胞的單一細胞混懸液小滴懸浮，讓細胞落到懸浮小滴的底部；以及 在防止真皮細胞的單一細胞混懸液小滴風干的同時孵育，從而使小滴中的單一細胞形 成致密的真皮細胞球結體；在所述制造真皮細胞球結體中，例如，其中所述真皮細胞的單一細胞混懸液小滴懸浮 在培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)皿中加入PBS以防止小滴風干，所述孵育的條件為37°C和5% CO2,培養(yǎng)皿 上放有重物以保持下方的懸浮小滴承受壓力；例如，權利要求4的方法中所述由真皮細胞球結體和表皮細胞制成迷你皮膚結構包括消化分離培養(yǎng)的表皮細胞； 離心消化后所得的表皮細胞懸浮液；將離心后的表皮細胞用生長液稀釋成表皮細胞的單細胞混懸液； 向真皮細胞球結體小滴植入所述表皮細胞的單細胞混懸液；使所述表皮細胞的單細胞混懸液小滴懸浮，在防止小滴風干的同時與真皮細胞球結體 接觸培養(yǎng)，直到形成顯微皮膚結構。
6.權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構在制備醫(yī)療用品中的用途，所述醫(yī)療用品 用于植入活體內或有活性的體外培養(yǎng)器官，作為細胞庫提供健康細胞。
7.權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構用于檢測藥物或化妝品的安全性和有效性 的用途。
8.權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構用于開發(fā)體外疾病模型的用途。
9.權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構用于研究毛發(fā)再生的用途。
10.權利要求1至2中任一項的迷你皮膚結構用于研究人體各種器官組織，以及疾病組 織中真皮和表皮細胞的相互作用的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由表皮細胞和真皮細胞體外整合的迷你皮膚結構，及其制備方法和在醫(yī)藥和化妝品領域的用途。該迷你皮膚結構制備簡單，易于推廣，所述迷你皮膚可用于植入活體內或有活性的體外培養(yǎng)器官，作為細胞庫提供健康細胞；該迷你皮膚結構還可用于檢測藥物或化妝品的安全性和有效性；或用于開發(fā)體外疾病模型，并可作為一種三維細胞立體模型研究真皮和表皮細胞在病理和生理環(huán)境條件下的相互作用。
文檔編號C12Q1/02GK101912636SQ20101018800
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權日2010年5月19日
發(fā)明者郭愛華 申請人:深圳市冠威海事服務有限公司