專利名稱：檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸是一種廣泛應(yīng)用于飲料、食品以及醫(yī)藥等行業(yè)的有機(jī)酸，檸檬酸的制備一般包括將原料進(jìn)行預(yù)處理并發(fā)酵得到發(fā)酵清液，并進(jìn)一步從發(fā)酵清液中提純檸檬酸，并進(jìn)行后處理?，F(xiàn)有技術(shù)的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液中，碳源多以淀粉質(zhì)原料(如玉米粉)為主，適量添加有機(jī)的氮源，少量或不加無機(jī)鹽成分，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率較低且成分復(fù)雜，發(fā)酵液中的雜質(zhì)對后續(xù)檸檬酸的提取存在很大的影響。另一方面，淀粉質(zhì)原料隨著產(chǎn)地、品種等不同而存在一定的差異，導(dǎo)致各批次制備的培養(yǎng)基的差異較大，從而導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵效率的不穩(wěn)定。因此，迫切需要開發(fā)一種新型的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檸檬酸發(fā)酵液存在的發(fā)酵效率低、雜質(zhì)含量高、并且易受淀粉質(zhì)原料產(chǎn)地、品質(zhì)等因素影響而導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵效率不穩(wěn)定的缺點，提供一種發(fā)酵效率高、雜質(zhì)含量低且發(fā)酵效率穩(wěn)定的新型的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液及使用該發(fā)酵液的發(fā)酵方法。本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為 0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為本發(fā)明提供的發(fā)酵液。本發(fā)明提供的發(fā)酵液由于無需使用淀粉質(zhì)原料作為碳源，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率高且成分簡單，發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5 重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。優(yōu)選情況下，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為 80-90重量％，所述氮源的含量為0. 05-0. 15重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 05-0. 15 重量％，硫酸鎂的含量為0. 005-0. 1重量％，水的含量為9. 6-19重量％，在此優(yōu)選范圍內(nèi)能夠更進(jìn)一步地提高發(fā)酵的效率。根據(jù) 本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料液化清液是指淀粉質(zhì)原料經(jīng)過酶解之后故也分離后得到的液化清液，所述淀粉質(zhì)原料液化清液可以通過多種方法制備得到，例如，可以通過如下方法制備得到的將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘渣，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘渣的固含量為5-50重量％，更優(yōu)選為20-40重量％。所述淀粉質(zhì)原料的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如可以玉米、木薯、高粱等， 優(yōu)選為玉米。所述粉碎的條件沒有特別的限制，只要能夠使淀粉質(zhì)原料充分破碎即可，優(yōu)選情況下，所述粉碎的條件使淀粉質(zhì)原料的粒度為20-50目。所述酶解步驟可以通過本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計，所述淀粉酶的用量為10-60酶活力單位， 更優(yōu)選以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計，所述淀粉酶的用量為15-50酶活力單位。本發(fā)明所述酶的酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫克淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。所述酶解的溫度可以為淀粉酶的任何最適作用溫度，一般為70_98°C，更優(yōu)選 80-90°C。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選所述酶解的時間為 60-180分鐘，更優(yōu)選為100-130分鐘。所述酶解的pH值可以為淀粉酶的任何最適作用pH， 一般為5. 0-6. 5，更優(yōu)選pH值為5. 6-6. 2。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。本發(fā)明所述酶包括淀粉酶。α-淀粉酶又稱淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。糖化酶又稱淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非還原性末端，以葡萄糖為單位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖。糖化酶作用于支鏈淀粉后的產(chǎn)物有葡萄糖和帶有α-1，6_糖苷鍵的寡糖；作用于直鏈淀粉后的產(chǎn)物幾乎全部是葡萄糖。此酶產(chǎn)生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、 擬內(nèi)孢霉、紅曲霉。
異淀粉酶又稱淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝鏈淀粉分子分枝點處的α-1，6-糖苷鍵，將枝鏈淀粉的整個側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。此酶產(chǎn)生菌主要是嫌氣桿菌、芽孢桿菌及某些假單孢桿菌等細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明，所述固液分離的方法與裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，壓濾機(jī)或離心機(jī)。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為本發(fā)明提供的發(fā)酵液。本發(fā)明中，能夠發(fā)酵單糖如葡萄糖和/或果糖、寡糖如蔗糖和/或半乳糖的微生物都可以用于本發(fā)明的發(fā)酵過程，優(yōu)選使用黑曲霉作為發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的微生物。以每克淀粉質(zhì)原料液化清液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為IO4-L 5 X IO5個 菌落形成單位，更優(yōu)選5 X IO4-IO5個菌落形成單位。所述菌落形成單位的定義為將稀釋后的一定量的菌液通過澆注或涂布的方法，讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞一一分散在培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞就形成一個菌落。即每毫升菌液中含有的單細(xì)胞的數(shù)目。所述菌落形成單位可以通過本領(lǐng)域公知的方法測定， 例如，通過血球計數(shù)板計數(shù)。本發(fā)明發(fā)酵所使用的黑曲霉可以為商購的黑曲霉固體制劑或黑曲霉菌種，例如， 黑曲霉Co827 (上海新立工業(yè)微生物科技有限公司)、黑曲霉TOl (天津工業(yè)微生物所)和黑曲霉菌株(中科院微生物所)。所述黑曲霉可以采用常規(guī)的方法接種，例如，在被接種至發(fā)酵液中之前，將所述黑曲霉經(jīng)過種子培養(yǎng)處理，之后將得到的種子液加入到發(fā)酵液中。優(yōu)選情況下，所述種子培養(yǎng)處理的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉菌體的呼吸商為0. 7-1. 5，并在該呼吸商下保持2-8小時。術(shù)語“呼吸商”是指二氧化碳釋放速率除以氧消耗速率所得到的叫做呼吸商(在單位時間、單位發(fā)酵液體積內(nèi)細(xì)胞釋放的二氧化碳量，叫做二氧化碳釋放速率；以單位時間、單位發(fā)酵液體積內(nèi)細(xì)胞消耗的氧量表示的氧利用速率)所述呼吸商的檢測方法可以為各種能夠檢測微生物呼吸商的方法，例如，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。一方面，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉的呼吸商優(yōu)選為0.85-1.0，在此范圍內(nèi)的呼吸商能夠使培養(yǎng)的黑曲霉更適合于后續(xù)的發(fā)酵，使其發(fā)酵效率更為理想。另一方面，所述保持的時間優(yōu)選為3-5小時，本發(fā)明人驚奇地在這樣的保持時間范圍內(nèi)，能夠進(jìn)一步地提高黑曲霉在后續(xù)發(fā)酵中的效率，從而使其處于更適于發(fā)酵的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法沒有特別的限制，只要得到的培養(yǎng)液能夠適用于黑曲霉的培養(yǎng)即可，例如，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法可以包括在淀粉漿液中加入淀粉酶，以5-8°C /每分鐘的速度升溫至90-100°C并在該溫度下酶解淀粉0. 5-1小時，之后進(jìn)行閃蒸，待溫度降至80-95°C時在該溫度下保持90-120分鐘，之后加入氮源并滅菌。根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉漿液中，淀粉和水的含量以及漿液的pH可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，所述淀粉的含量為20-40重量％，水的含量為60-80重量％，所述淀粉漿液的PH值為5-7。
本發(fā)明中，所述淀粉酶的加入量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，相對于1000 重量份的淀粉漿液，所述淀粉酶的加入量可以為0. 2-0. 5重量份。根據(jù)本發(fā)明，所述氮源的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，所述氮源可以為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種，所述氮源的加入量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，以所述黑曲霉培養(yǎng)液的總重量為基準(zhǔn)，所述氮源的加入量為0. 05-0. 5重量％。根據(jù)本發(fā)明，所述閃蒸是指通過在真空條件下在閃蒸罐內(nèi)將物料溫度迅速下降到指定溫度。本發(fā)明中，所述黑曲霉的接種量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，所述黑曲霉的接種量可以為IO4-L 5X105。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)的條件可以在很大范圍內(nèi)改變，例如所述培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度可以為25-45°C，pH值可以為1-7，通氣量可以為0. 05-0. 5體積體積 分鐘，培養(yǎng)的時間可以為45-65小時；更優(yōu)選的情況下，所述培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度可以為30-40°C，pH值可以為2-4，通氣量可以為0. 1-0. 3體積體積 分鐘，所述培養(yǎng)的時間可以為50-60小時。術(shù)語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(V/V · min)，例如通氣比為1 0. 05-0. 5，簡稱通氣量為0. 05-0. 5體積體積·分鐘。 所述培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明中，所述發(fā)酵的條件沒有特別的限制，例如，所述發(fā)酵的條件可以包括溫度為30-40°C，更優(yōu)選為30-35°C ；pH值為1_7，優(yōu)選為2_4，通氣量為0. 1-1體積體積·分鐘；更優(yōu)選為0. 2-0. 8體積體積·分鐘；時間為40-70小時，更優(yōu)選50-60小時。發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如蒸餾、濃縮、除水。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明提供的檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液。(1)原料的去皮及粉碎將收獲的100重量份玉米通過粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按40單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α "淀粉酶)?？焖偕郎刂?2°C，維持 120分鐘后(pH = 5. 5)利用壓濾機(jī)過濾得到液化清液和酶解殘渣(固含量為10重量％ )。(3)將90重量份的上述液化清液、0. 1重量份的硝酸銨、0. 05重量份的磷酸二氫鉀、0. 005重量份的硫酸鎂和10重量份的水混合，得到發(fā)酵液Al。對比例1根據(jù)與實施例1相同的方法制備參比發(fā)酵液CA1，不同在于使用酶解后固液分離得到的殘渣作為氮源。實施例2(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為25目)(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?5°C，維持 140分鐘后(pH = 6. 0)利用壓濾機(jī)過濾得到液化清液和酶解殘渣(固含量為40重量％ )。(3)將76重量份的上述液化清液、0. 4重量份的硝酸銨、0. 3重量份的磷酸二氫鉀、 0. 3重量份的硫酸鎂和23重量份的水混合，得到發(fā)酵液A2。實施例3(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 8的比例調(diào)漿，按45單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?5°C，維持 160分鐘后(pH = 6. 5)利用壓濾機(jī)過濾得到液化清液和酶解殘渣(固含量為50重量％ )。(3)將85重量份的上述液化清液、0. 2重量份的硝酸銨、0. 2重量份的磷酸二氫鉀、 0. 1重量份的硫酸鎂和14. 5重量份的水混合，得到發(fā)酵液A3。實施例4(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 6的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?0°C，維持 170分鐘后(pH = 5. 0)利用壓濾機(jī)過濾得到液化清液和酶解殘渣(固含量為30重量％ )。(3)將90重量份的上述液化清液、0. 15重量份的硝酸銨、0. 1重量份的磷酸二氫鉀、0. 05重量份的硫酸鎂和9. 7重量份的水混合，得到發(fā)酵液A4。實施例5(1)原料的粉碎將收獲的100重量份玉米通過粉碎機(jī)(江蘇牧羊集團(tuán)有限公司，968-3型)進(jìn)行粉碎，得到100重量份粉碎產(chǎn)物(粒度為40目)。(2)在室溫25°C下，將粉碎產(chǎn)物與水按照重量比1 2. 6的比例調(diào)漿，按30單位淀粉酶/克粉碎產(chǎn)物的量添加淀粉酶(諾維信公司，α “淀粉酶)?？焖偕郎刂?5°C，維持 140分鐘后(pH = 5. 5)利用壓濾機(jī)過濾得到液化清液和酶解殘渣(固含量為40重量％ )(3)將84. 8重量份的上述液化清液、0. 05重量份的硝酸銨、0. 05重量份的磷酸二氫鉀、0. 1重量份的硫酸鎂和15重量份的水混合，得到發(fā)酵液A5。實施例6本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵方法。(1)將實施例1步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10% (術(shù)語總糖是指酶解液化液中所含糖的總含量)投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種 (黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個菌落形成單位)，在37°C、0. 4體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和 PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2.0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，
停止培養(yǎng)。(2)使用實施例1得到發(fā)酵液Al，并將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液5 X IO4個菌落形成單位， 在37°C、120轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌、1 0.4通氣的條件下培養(yǎng)60小時，發(fā)酵結(jié)束。

對比例2根據(jù)與實施例6相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于使用對比例1中得到的參比酶解產(chǎn)物CAl配制發(fā)酵液。實施例7(1)將實施例2步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個菌落形成單位)，在37°C、0. 4體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。(2)使用實施例2得到發(fā)酵液A2，并將步驟⑴培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1) 中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液IO5個菌落形成單位，在37°C、0. 4體積體積·分鐘的條件下培養(yǎng)50小時，發(fā)酵結(jié)束。實施例8(1)將實施例3步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液2X IO5個菌落形成單位)，37°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、 酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。(2)使用實施例3得到發(fā)酵液A3，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. 5X105個菌落形成單位，在30°C、0. 8體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)60小時，發(fā)酵結(jié)束。實施例9(1)將實施例4步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液IO5個菌落形成單位)，在36°C、0. 5體積體積 分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在2. 0、酸度1%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。(2)使用實施例4得到發(fā)酵液A4，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. OX IO5個菌落形成單位，在32°c、0. 8體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)65小時，發(fā)酵結(jié)束。
實施例10 (1)將實施例5步驟(2)中得到的酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養(yǎng)液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20 分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，接種量為每克酶解液化清液2X IO5個菌落形成單位)，在36°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進(jìn)行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)pH在 2. 0、酸度1 %、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。(2)使用實施例5得到發(fā)酵液A5，將步驟(1)培養(yǎng)黑曲霉菌種加入到步驟(1)中的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中的總糖，接種量為每克酶解液化清液1. 5X105個菌落形成單位，在35°C、0. 6體積體積·分鐘的通氣的條件下培養(yǎng)52小時，發(fā)酵結(jié)束。實施例11根據(jù)與實施例10相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于步驟(1)中通過以下方法控制黑曲霉的培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)尾氣接入質(zhì)譜儀，在線記錄二氧化碳釋放速率和氧消耗速率，并在線計算呼吸商，在呼吸商在0. 75下維持7小時。實施例12根據(jù)與實施例10相同的方法進(jìn)行發(fā)酵，不同在于步驟(1)中通過以下方法控制黑曲霉的培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)尾氣接入質(zhì)譜儀，在線記錄二氧化碳釋放速率和氧消耗速率，并在線計算呼吸商，在呼吸商在1. 2下維持3小時。實施例13-19根據(jù)GB 1987-2007標(biāo)準(zhǔn)檢測實施例6_12中發(fā)酵后發(fā)酵液的濃度(簡稱酸度)，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率(％)=發(fā)酵液的濃度(簡稱酸度)X發(fā)酵液的體積/總糖的重量X 100%，結(jié)果如表1所示。對比例3根據(jù)與實施例13-19相同的方法檢測，對比例2發(fā)酵后的酸度和轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表 1所示。表 1
編號I實施I實施I實施I實施I實施I實施I實施I對比
例13 例14 例15 例16 例17 例18 例19 例3
濃度14. 5% 14.7% 14.6% 15. 5% 15. 7% 15. 1% 15. 3% 13. 5%~
(酸度)
轉(zhuǎn)化率(% ) 95. 7%95. 9%~~96. 5%~~96. 0%96. 2% 97. 5%~~97. 7%91. 8%~從上表1的數(shù)據(jù)可以看出，與使用淀粉質(zhì)原料作為氮源的實施例1制得的參比發(fā)酵液CAl相比，使用本發(fā)明提供的發(fā)酵液(A1-A5)的發(fā)酵效率高，并且由于成分簡單發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。此外，與實施例13-17檢測的數(shù)據(jù)相比，實施例18和19的發(fā)酵效率(酸度和轉(zhuǎn)化率)更好，由此可以看出，根據(jù)呼吸商來判斷黑曲霉種子的培養(yǎng)狀態(tài)，能夠使黑曲霉的生長狀態(tài)更加適合后續(xù)的發(fā)酵，并且這種方法受人為因素的影響很小，能夠保持批次之間黑曲霉培養(yǎng)的 穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種檸檬酸發(fā)酵用發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為 75-95重量％，所述氮源的含量為0. 01-0. 5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 01-0. 5重量％，硫酸鎂的含量為0. 001-0. 5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵液，其中，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為80-90重量％，所述氮源的含量為0. 05-0. 15重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0. 05-0. 15重量％，硫酸鎂的含量為0. 005-0. 1重量％，水的含量為9. 6-19. 6重量％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵液，其中，所述淀粉質(zhì)原料液化清液是通過如下方法制備得到的將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進(jìn)行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘渣，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘渣的固含量為5-50重量％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其中，所述粉碎使淀粉質(zhì)原料的粒度為20-60目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其中，所述酶解使用的酶包括淀粉酶，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計，所述淀粉酶的用量為10-60酶活力單位；所述酶解的溫度為70-98°C，所述酶解的時間為60-180分鐘，所述酶解的pH值為5. 0-6. 5。
6.一種生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵方法，其中，該方法包括將黑曲霉接種至發(fā)酵液中，之后發(fā)酵以產(chǎn)生檸檬酸，其中，所述發(fā)酵液為權(quán)利要求1-6中的任意一項所述的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中，所述發(fā)酵液中，以每克淀粉質(zhì)原料液化清液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為IO4-L 5X IO5個菌落形成單位，所述發(fā)酵條件包括溫度為 30-40°C，通氣量為0. 1-1體積體積·分鐘，時間為40-70小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其中，在被接種至發(fā)酵液中之前，所述黑曲霉經(jīng)過種子培養(yǎng)處理，該種子培養(yǎng)處理的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的條件使黑曲霉菌體的呼吸商為0. 7-1. 5，并在該呼吸商下保持2-8小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述呼吸商為0.85-1. 0，所述保持的時間為3-5 小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵液，其中，該發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料液化清液、氮源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水，以所述發(fā)酵液的總重量為基準(zhǔn)，所述淀粉質(zhì)原料液化清液的含量為75-95重量％，所述氮源的含量為0.01-0.5重量％，所述磷酸二氫鉀的含量為0.01-0.5重量％，硫酸鎂的含量為0.001-0.5重量％，水的含量為4-24重量％，所述氮源為尿素、硫酸銨和硝酸銨中的一種或幾種。本發(fā)明提供的發(fā)酵液中由于無需使用淀粉質(zhì)原料作為氮源，這種發(fā)酵液的發(fā)酵效率高且成分簡單，發(fā)酵液中的雜質(zhì)少而有利于后續(xù)檸檬酸的提取。另一方面，克服了淀粉質(zhì)原料的產(chǎn)地、品種等影響，從而提高了后續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。
文檔編號C12P7/48GK102260716SQ201010186009
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者盧宗梅, 周勇, 周永生, 張繼學(xué), 章輝平 申請人:安徽豐原生物化學(xué)股份有限公司