專利名稱：一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變性梯度凝膠電泳技術(shù)在海洋浮游植物種類和/或數(shù)量檢測中的應(yīng) 用的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法。
背景技術(shù)：
浮游生物是一個在水體中營隨波逐流生活方式的獨特類群，易于在風和水流的作 用下做被動運動，沒有或僅有微弱的游動能力；浮游生物包括浮游植物和浮游動物兩大類。 浮游生物個體小，生活周期短，繁殖速度快，對環(huán)境的變化十分敏感，對水體的營養(yǎng)狀態(tài)的 變化能夠迅速地做出反應(yīng)。在水質(zhì)好的水域，浮游生物的多樣性指數(shù)及均度指數(shù)均較大；反 之，浮游生物的種類多樣性下降，分布呈現(xiàn)不均勻的情況。因此浮游生物群落結(jié)構(gòu)特征的變 化可作為指示生態(tài)環(huán)境變化的重要生物學參數(shù)。赤潮浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生動物或細菌在一定的環(huán)境條件 下爆發(fā)性增殖或聚集在一起而引起水體變色的一種生態(tài)異常現(xiàn)象。在我國海域中，赤潮發(fā) 生的區(qū)域分布很不均勻，浙江沿海及長江口臨近海域的赤潮災害最為嚴重，此外發(fā)生赤潮 比較集中的海區(qū)還有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域發(fā)生一次 特大面積米氏凱倫藻赤潮，所影響到的海區(qū)養(yǎng)殖魚類幾乎全部死亡，造成了珠江口海域三 地(深圳、珠海和香港)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)損失逾4億元之多；2000年長江口海域發(fā)生大面積具 齒原甲藻赤潮，危害面積達7000平方千米，2004年5月東海長江口海域發(fā)生大規(guī)模東海原 甲藻赤潮，面積達10000平方千米，世界罕見。近年來，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆發(fā) 越來越頻繁，且涉及的范圍也越發(fā)廣泛。赤潮嚴重破壞了海洋生態(tài)平衡，給漁業(yè)及旅游業(yè)等 造成了巨大的損失。除此之外，有些赤潮生物體內(nèi)或代謝產(chǎn)物中含有生物毒素，通過食物鏈 富集，會嚴重危害人類的健康。在眾多的分子多態(tài)性技術(shù)中，變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)以其顯著的優(yōu)點得 到了廣泛的應(yīng)用。DGGE技術(shù)不僅結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、操作簡便快速，而且可以同時對大量 的樣品進行分析，并能對微生物的時空變化進行檢測，已經(jīng)成為研究微生物生態(tài)的一種重 要技術(shù)。此外，充分了解該技術(shù)的局限性并綜合使用PCR-DGGE技術(shù)與其它生物學技術(shù)，可 以更加詳盡地了解微生物群落的結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，獲得全面可靠的生物學信息。近年來DGGE之所以得到了如此廣泛的應(yīng)用，是由于它具有其它分子多態(tài)性技術(shù) 不能比擬的優(yōu)點第一，操作簡便、快速，加樣量小，重復性好；第二，可以對大量的樣品同 時進行分析，通過對回收的DNA條帶進行測序確定群落的組成；第三，可以用于研究微生物 群落的時空分布；第四，可以確定復雜的樣品中的特定的DNA序列。但是，同時該技術(shù)也存 在缺陷(1)僅能檢測到環(huán)境中的主要微生物，占總量以上的微生物才可以被檢測到；
(2)DGGE可分離的片段大小位于200-700bp之間，大于700bp的片段不能進行很好的分離；
(3)不同序列的DNA有可能遷移到膠的同一位置，有時即使對條帶進行回收，重新擴增，重 新電泳也不能得到很好的分離；(4)有些物種基因的不同拷貝之間存在異質(zhì)性問題，即使 它們僅有微小的差異，DGGE也能將其分開，因此一個種在DGGE圖譜上不僅顯示一條帶，這
5樣就過高地估計了環(huán)境中的微生物多樣性；(5)此外整個分析過程的各個步驟本身都存在 一定的局限性樣品的收集及保存過程中，可能會損失部分微生物種類；由于不同物種的 細胞壁組成不同，相同的提取方法對不同物種的提取效率不同；PCR本身存在擴增的偏好 性問題，并且擴增過程中可能產(chǎn)生嵌合體及異源雙鏈，這些對實驗結(jié)果均有一定影響。鑒于上述所述，研究浮游植物赤潮的爆發(fā)機制，探索預警、預報乃至防治赤潮的方 法已成為一個極具挑戰(zhàn)性的課題，其中在檢測浮游植物群落結(jié)構(gòu)的過程中，如何改進并使 用變性梯度凝膠(DGGE)技術(shù)，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)運用到微藻 的鑒定中，并運用該技術(shù)對浮游植物多樣性進行研究，分析多樣性組成與環(huán)境因子的關(guān)系。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特 征在于，包括以下步驟(1)藻細胞搜集(2)總DNA的提取(3)PCR引物設(shè)計及優(yōu)化(4)瓊脂糖電泳檢測(5)變性梯度凝膠的制備(6)電泳條件的優(yōu)化(7)運用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對微藻進行分析。所述步驟(1)為當目標藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，進行目標藻的收集，采用離心收 集的方法(4000rmp，lOmin)，棄上清夜，將藻細胞移至2ml離心管中并置于_80°C保存待用。所述步驟⑵為a、收集和洗滌藻細胞在收集的藻細胞中中加入750 yl TE緩沖液洗滌藻細胞， lOOOOrpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清；加入250 u 1 TE緩沖液懸浮藻細胞；b、裂解藻細胞加入500 ill預熱55°C的抽提緩沖液，混和均勻，放入55°C水浴中 一小時，直到藻液呈透明狀；放進4°C冰箱冷卻3分鐘；c、抽提加入lml氯仿異戊醇(24 1)，輕柔顛倒，使之呈乳濁液；14000rpm 4°C離心10分鐘，小心用微量吸頭取出上清液(約600 ill)至印pendorf管中，重復抽提一 次；d沉淀加二倍體積的冰冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分鐘；14000rpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清；e洗滌DNA沉淀用預冷的70%酒精洗兩次；f溶解自然風干，溶于20-40 ill TE緩沖液中，置于_20°C待用。所述步驟(3)為從GenBank中下載常見微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS區(qū)序 列；運用DNAStar軟件進行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè)的保守區(qū)用 Primer premier 5. 0進行引物設(shè)計；然后對所設(shè)計的引物用Oligo軟件對各參數(shù)進行評 估，選出最優(yōu)引物進行合成。PCR反應(yīng)體系(50ul)包括約50ng模板DNA，
200 uM dNTP,
1.5mM MgC12,
0. 3iiM 引物，
2.5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa),
IXEx Taq Buffer。
引物EuklA Euk516的PCR反應(yīng)程序為
94°C，變性 130s ；
94°C,變性 30 s, XX°C,退火45 s, L 35個循環(huán)； 72°C,延伸 130 s，^72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取54°C，56°C，58°C，60°C四個溫度進行優(yōu)化。引物Eukl209 1649R的PCR反應(yīng)采用降落PCR 94°C，變性 4min;
94°C,變性 lmin，
XX。C ,退火1 min, L 10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1°C )； 72 °C,延伸 3min，^
94°C,變性 lmin，)
XX°C ,退火1 min, I 20個循環(huán)；
72°C,延伸 3 min,
__^72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取65 55°C，67 57°C，69 59°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。引物28SD1F 28SD1R的PCR反應(yīng)采用降落PCR 94°C，變性 4min;
94°C,變性 lmin,、
XX°C ,退火1 min, l 10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1 °C )； 72°C,延伸 lmin, ^
94°C,變性 lmin, i
XX°C，退火1 min, L 20個循環(huán)；
72°C，延伸 lmin。72°C，延伸 lOmin
退火溫度分別取60 55°C，55 50°C，48 43°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。引物18SF 5. 8SR的PCR反應(yīng)采用降落PCR PCR反應(yīng)程序同引物28SD1F 28SD1R，退火溫度分別取60 55°C，55 50°C， 50 45°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。所述步驟(4)為將5ul PCR擴增的產(chǎn)物與lul Loading buffer混合后上樣，1 % 瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0. 5iig/ml EB的1XTAE緩沖液中染色10 30min，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。所述步驟(5)進一步包括垂直膠的制備和平行膠的制備，所述垂直膠的凝膠尺 寸7. 5cmX lOcmX 1mm,其制備方法為用洗滌劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗三遍，晾干；取相同厚度的隔板，帶槽的一側(cè)面向大玻璃板，兩個隔板的凹面相對應(yīng)；插入梳 子，兩側(cè)及中間的隔板與玻璃板底部平齊；垂直放置制膠板系統(tǒng)，松梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲，將兩系統(tǒng)放置至兩者剛好完全匹 配，擰襯墊系統(tǒng)的螺絲直到碰到玻璃板，再擰1/4圈；平放壓力夾，松螺絲；帶螺絲的一面朝下，出氣口一面朝上；將壓力夾放置于制膠板系統(tǒng)中間位置，擰壓力夾的螺絲直到碰到梳子襯墊系統(tǒng)， 再擰兩圈；再擰梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲一圈，移走壓力夾；按上旋塞，將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進行校正，以 免漏膠)垂直放在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己；一邊擰開旋塞，打開出氣口，另一側(cè)關(guān)上；將傾斜桿調(diào)到最高的刻度線處；用梯度 傳送系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個過程要恒定勻速且緩慢；灌膠完畢后，關(guān)上旋塞和出氣口，將傾斜桿放平；聚合60min后，取下梳子襯墊系統(tǒng)，在另一側(cè)添加含有催化劑的丙烯酰胺溶液，聚 合60min，此時打開循環(huán)泵及加熱器，預熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，用雙蒸水清洗點樣孔三次，隨后加 樣；用20V預電泳lOmin，隨后按照優(yōu)化的電泳參數(shù)進行電泳。電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗，使膠和玻 璃板脫離；倒掉去離子水，將膠放入0. 5 u g/ml的EB溶液中，搖床上搖蕩染色15min ；凝膠成像系統(tǒng)拍照。所述水平膠的凝膠尺寸為16cmX 16cmX 1mm，其制備步驟如下用洗滌劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗三遍，晾干；將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進行校正，以免漏膠)垂 直放在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己；將兩根長的聚乙烯細管(15. 5cm)分別連上30ml注射器，短的(9cm)聚乙烯細管 連于Y形三通的一端；在兩個注射器上分別標記“高濃度”與“低濃度”，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度
8傳送系統(tǒng)的刻度到適當?shù)奈恢帽驹囼炛惺褂玫臑?6CmX16CmXlmm的膠板，調(diào)整裝置到 體積刻度為14. 5處；分別將15ml兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液倒入兩個塑膠管中，每管加入15 yl TEMED (1/1000)，150 ill 10% APS (1/100)，顛倒數(shù)次混勻，吸入到標有濃度的注射器中；分別將標有高濃度和低濃度的注射器正確安裝在梯度傳送系統(tǒng)上，再將注射器的 聚丙烯管連于Y形三通；用梯度傳送系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個過程要恒定勻速且緩慢；小心斜插入梳子，凝膠聚合大約兩小時；待膠凝固一小時后，打開循環(huán)泵及加熱 器，預熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。步驟(6)為對DGGE的變性梯度和電泳時間進行優(yōu)化，電泳溫度均為60°C。所述步驟(7)進一步包括⑶DE鑒定分析的步驟，DGGE特征性圖譜構(gòu)建的步驟和 條帶穩(wěn)定性分析的步驟。使用Quantity One軟件對圖像進行處理，基于DGGE圖譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平 均法聚類分析對相似性進行分析，根據(jù)各條帶的亮度，計算多樣性指數(shù)(H)，進而對物種結(jié) 構(gòu)多樣性進行分析；所述多樣性指數(shù)的計算公式為H = E (ni/N) ln(ni/N)，其中ni為每條 帶的亮度峰值，N為每個泳道中所有條帶亮度峰值的和本發(fā)明的優(yōu)點如下本發(fā)明將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)運用到微藻的鑒定中，并運用該技術(shù)對 浮游植物多樣性進行了研究，分析了多樣性組成與環(huán)境因子的關(guān)系。主要如下(1)本發(fā)明分別針對核糖體基因的18S rDNA、28S rDNA及ITS區(qū)序列設(shè)計引物，經(jīng) 過PCR退火溫度的優(yōu)化，選擇了特異性較好的三對引物(分別針對18S rDNA和28S rDNA 序列)，對微藻進行了 DGGE分析，獲得了每種藻每對引物的擴增片段在變性梯度凝膠上的 遷移率。(2)本發(fā)明在變性梯度凝膠上的遷移率，可以較好地將其區(qū)分鑒定；而將其中的 兩對或三對引物相結(jié)合，可以得到更為滿意的區(qū)分效果。(3)基于DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果與環(huán)境特征較為一致；證明溫度是影響研究海 域浮游植物分布的主要因子，其次是溶解無機氮和硅酸鹽。(4)運用DGGE技術(shù)浮游植物多樣性研究，了解營養(yǎng)鹽、溫度等環(huán)境因子對浮游植 物群落組成的影響?；贒GGE圖譜的相似性進行聚類分析。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，包括以下步 驟(1)藻細胞搜集(2)總DNA的提取(3) PCR引物設(shè)計及優(yōu)化(4)瓊脂糖電泳檢測(5)變性梯度凝膠的制備(6)電泳條件的優(yōu)化
(7)運用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對微藻進行分析。步驟(1)為當目標藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，進行目標藻的收集，采用離心收集的 方法(4000rmp，lOmin)，棄上清夜，將藻細胞移至2ml離心管中并置于_80°C保存待用。步驟(2)為a、收集和洗滌藻細胞在收集的藻細胞中中加入750 yl TE緩沖液洗滌藻細胞， lOOOOrpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清；加入250 u 1 TE緩沖液懸浮藻細胞；b、裂解藻細胞加入500 u 1預熱55°C的抽提緩沖液，混和均勻，放入55°C水浴中 一小時，直到藻液呈透明狀；放進4°C冰箱冷卻3分鐘；c、抽提加入1ml氯仿異戊醇(24 1)，輕柔顛倒，使之呈乳濁液；14000rpm 4°C離心10分鐘，小心用微量吸頭取出上清液(約600 ill)至印pendorf管中，重復抽提一 次；d沉淀加二倍體積的冰冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分鐘；14000rpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清；e洗滌DNA沉淀用預冷的70%酒精洗兩次；f溶解自然風干，溶于20-40 ill TE緩沖液中，置于_20°C待用。步驟(3)為從GenBank中下載常見微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS區(qū)序列；運 用DNAStar軟件進行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè)的保守區(qū)用Primer premier 5.0進行引物設(shè)計；然后對所設(shè)計的引物用Oligo軟件對各參數(shù)進行評估，選出最 優(yōu)引物進行合成。PCR反應(yīng)體系(50ul)包括約50ng模板DNA，200 uM dNTP,1. 5mM MgC12,0. 3iiM 引物，2. 5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa),IXEx Taq Buffer。引物EuklA Euk516的PCR反應(yīng)程序為94 °C，變性 130s;
94°C,變性 30 s，1
XX°C,退火45 s, ^35個循環(huán)；
72°C,延伸 130 s,)72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取54°C，56°C，58°C，60°C四個溫度進行優(yōu)化。引物Eukl209 1649R的PCR反應(yīng)采用降落PCR 94°C，變性 4min;
1094°C,變性 lmin,
XX°C ,退火1 min, I 10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1°C )； 72°C,延伸 3 min,)
94°C,變性 lmin,
XX°C ,退火1 min, 1 20個循環(huán)；
72°C,延伸 3 min,
__‘72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取65 55°C，67 57°C，69 59°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。引物28SD1F 28SD1R的PCR反應(yīng)采用降落PCR <formula>formula see original document page 11</formula>72°C，延伸 lOmin退火溫度分別取60 55°C，55 50°C，48 43°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。引物18SF 5. 8SR的PCR反應(yīng)采用降落PCR PCR反應(yīng)程序同引物28SD1F 28SD1R，退火溫度分別取60 55°C，55 50°C， 50 45°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。步驟(4)為將5ul PCR擴增的產(chǎn)物與lul Loading buffer混合后上樣，1 %瓊脂 糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0. 5i! g/ml EB的1 XTAE緩沖液中染色10 30min， 用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。所述步驟(5)進一步包括垂直膠的制備和平行膠的制備，所述垂直膠的凝膠尺 寸7. 5cmX lOcmX 1mm,其制備方法為用洗滌劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗三遍，晾干；取相同厚度的隔板，帶槽的一側(cè)面向大玻璃板，兩個隔板的凹面相對應(yīng)；插入梳 子，兩側(cè)及中間的隔板與玻璃板底部平齊；垂直放置制膠板系統(tǒng)，松梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲，將兩系統(tǒng)放置至兩者剛好完全匹 配，擰襯墊系統(tǒng)的螺絲直到碰到玻璃板，再擰1/4圈；平放壓力夾，松螺絲；帶螺絲的一面朝下，出氣口一面朝上；將壓力夾放置于制膠板系統(tǒng)中間位置，擰壓力夾的螺絲直到碰到梳子襯墊系統(tǒng)，
11再擰兩圈；再擰梳子襯墊系統(tǒng)的螺絲一圈，移走壓力夾；按上旋塞，將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進行校正，以 免漏膠)垂直放在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己；一邊擰開旋塞，打開出氣口，另一側(cè)關(guān)上；將傾斜桿調(diào)到最高的刻度線處；用梯度 傳送系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個過程要恒定勻速且緩慢；灌膠完畢后，關(guān)上旋塞和出氣口，將傾斜桿放平；聚合60min后，取下梳子襯墊系統(tǒng)，在另一側(cè)添加含有催化劑的丙烯酰胺溶液，聚 合60min，此時打開循環(huán)泵及加熱器，預熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，用雙蒸水清洗點樣孔三次，隨后加 樣；用20V預電泳lOmin，隨后按照優(yōu)化的電泳參數(shù)進行電泳。電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗，使膠和玻 璃板脫離；倒掉去離子水，將膠放入0. 5 u g/ml的EB溶液中，搖床上搖蕩染色15min ；凝膠成像系統(tǒng)拍照。所述水平膠的凝膠尺寸為16cmX 16cmX 1mm，其制備步驟如下用洗滌劑徹底擦洗玻璃板，先用自來水沖洗干凈，后用雙蒸水沖洗三遍，晾干；將海綿墊放在制膠架上，把制膠板系統(tǒng)(一定要用校正板進行校正，以免漏膠)垂 直放在海綿上方并固定好，將短玻璃的一面對著自己；將兩根長的聚乙烯細管(15. 5cm)分別連上30ml注射器，短的(9cm)聚乙烯細管 連于Y形三通的一端；在兩個注射器上分別標記“高濃度”與“低濃度”，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度 傳送系統(tǒng)的刻度到適當?shù)奈恢帽驹囼炛惺褂玫臑?6CmX16CmXlmm的膠板，調(diào)整裝置到 體積刻度為14. 5處；分別將15ml兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液倒入兩個塑膠管中，每管加入15 yl TEMED (1/1000)，150 ill 10% APS (1/100)，顛倒數(shù)次混勻，吸入到標有濃度的注射器中；分別將標有高濃度和低濃度的注射器正確安裝在梯度傳送系統(tǒng)上，再將注射器的 聚丙烯管連于Y形三通；用梯度傳送系統(tǒng)將凝膠注入到兩玻璃板之間，保證整個過程要恒定勻速且緩慢；小心斜插入梳子，凝膠聚合大約兩小時；待膠凝固一小時后，打開循環(huán)泵及加熱 器，預熱電泳緩沖液到60°C，迅速清洗用完的設(shè)備。步驟(6)為對DGGE的變性梯度和電泳時間進行優(yōu)化，電泳溫度均為60°C。步驟(7)進一步包括⑶DE鑒定分析的步驟，DGGE特征性圖譜構(gòu)建的步驟和條帶 穩(wěn)定性分析的步驟。使用Quantity One軟件對圖像進行處理，基于DGGE圖譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平 均法聚類分析對相似性進行分析，根據(jù)各條帶的亮度，計算多樣性指數(shù)(H)，進而對物種結(jié) 構(gòu)多樣性進行分析；所述多樣性指數(shù)的計算公式為H = E (ni/N) ln(ni/N)，其中ni為每條 帶的亮度峰值，N為每個泳道中所有條帶亮度峰值的和。
本發(fā)明中PCR進行擴增所使用的引物為FP-5’ CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’， RP-5’ ACGGGCGGTGTGTRC3’，PCR擴增所用引物或者為F1427-5 ’ CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTT CTGGG3，，R1616-5，GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3，，引物EuklA Euk516, Eukl209 Unil392均針對18S rDNA，該兩對引物為真核 生物核糖體小亞基的通用引物，通過與序列庫中已有藻的ISSrDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，將反向 引物Unil392的簡并堿基R改為A后可以得到更好的匹配結(jié)果，因此為了避免擴增過程中 錯配堿基的出現(xiàn)，減少錯配的幾率，反向引物改為5’ -ACGGGCGGTGTGTAC-3’，命名為1649R。 引物28SD1F 28SD1R，18SF 5. 8SR為發(fā)明中設(shè)計，分別針對核糖體28S rDNA的D1區(qū)和 ITS1區(qū)。如下表
引物正向(F)/反向(R)序列(5，-3’)來源EuklAFCTGGTTGATCCTGCCAGDiez etEuk516aRACCAGACTTGCCCTCCal.,2001Eukl209bFCAGGTCTGTGATGCCCDiez etUnil392RACGGGCGGTGTGTRCal.,200128SDlFbFCGGAGGAAAAGAAACTAAC28SD1RRACTCTCTTTTCAAAGTCCTT本發(fā)明設(shè)計18SFaFACAAGGTTTCCGTAGGTG5.8SRRCGCTGCGTCCTTCATCG本發(fā)明設(shè)計a 在引物的 5，端加一個 40bp 的 GC 夾，序列為 CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGb 在引物的 5，端加一個 40bp 的 GC 夾，序列為 CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCG CCCCCGCCCG綜上所述，本發(fā)明將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)運用到微藻的鑒定中，并運用 該技術(shù)對浮游植物多樣性進行了研究，分析了多樣性組成與環(huán)境因子的關(guān)系。本發(fā)明分別 針對核糖體基因的18S rDNA、28S rDNA及ITS區(qū)序列設(shè)計引物，經(jīng)過PCR退火溫度的優(yōu)化， 選擇了特異性較好的三對引物(分別針對18S rDNA和28S rDNA序列)，對微藻進行了 DGGE 分析，獲得了每種藻每對引物的擴增片段在變性梯度凝膠上的遷移率。本發(fā)明在變性梯度 凝膠上的遷移率，可以較好地將其區(qū)分鑒定；而將其中的兩對或三對引物相結(jié)合，可以得到 更為滿意的區(qū)分效果。基于DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果與環(huán)境特征較為一致；證明溫度是影 響研究海域浮游植物分布的主要因子，其次是溶解無機氮和硅酸鹽。運用DGGE技術(shù)浮游植
13物多樣性研究，了解營養(yǎng)鹽、溫度等環(huán)境因子對浮游植物群落組成的影響?；贒GGE圖譜 的相似性進行聚類分析。
權(quán)利要求
一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，包括以下步驟(1)藻細胞搜集(2)總DNA的提取(3)PCR引物設(shè)計及優(yōu)化(4)瓊脂糖電泳檢測(5)變性梯度凝膠的制備(6)電泳條件的優(yōu)化(7)運用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對微藻進行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(1) 為當目標藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，進行目標藻的收集，采用離心收集的方法(4000rmp， lOmin)，棄上清夜，將藻細胞移至2ml離心管中并置于_80°C保存待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(2)為a、收集和洗滌藻細胞在收集的藻細胞中中加入750yl TE緩沖液洗滌藻細胞， lOOOOrpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清；加入250 u 1 TE緩沖液懸浮藻細胞；b、裂解藻細胞加入500yl預熱55°C的抽提緩沖液，混和均勻，放入55°C水浴中一小 時，直到藻液呈透明狀；放進4°C冰箱冷卻3分鐘；c、抽提加入lml氯仿異戊醇(24 1)，輕柔顛倒，使之呈乳濁液；14000rpm 4°C離 心10分鐘，小心用微量吸頭取出上清液(約600 ill)至印pendorf管中，重復抽提一次；d沉淀加二倍體積的冰冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱30分 鐘；14000rpm 4°C離心10分鐘，小心棄上清； e洗滌DNA沉淀用預冷的70%酒精洗兩次； f溶解自然風干，溶于20-40 yl TE緩沖液中，置于-20°C待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(3) 為從GenBank中下載常見微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS區(qū)序列；運用DNAStar軟件進 行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè)的保守區(qū)用Primer premier 5.0進行 引物設(shè)計；然后對所設(shè)計的引物用Oligo軟件對各參數(shù)進行評估，選出最優(yōu)引物進行合成。PCR反應(yīng)體系(50ul)包括約50ng模板DNA， 200 uM dNTP, 1.5mM MgC12, 0. 3iiM 引物，2. 5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa), IXEx Taq Buffer。引物EuklA Euk516的PCR反應(yīng)程序為 94°C，變性 130s ；94°C,變性 30 s， XX°C,退火45 s, L 35個循環(huán)； 72°C,延伸 130 s, ^72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取54°C，56°C，58°C，60°C四個溫度進行優(yōu)化。 引物Eukl209 1649R的PCR反應(yīng)采用降落PCR 94°C，變性 4min ；94°C,變性 lmin,XX。C ,退火1 min, L 10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1°C )；72°C,延伸 3 min,)94°C,變性 lmin,XX°C，退火1 min, I 20個循環(huán)；72°C,延伸 3 min,」72°C，延伸 lOmin。退火溫度分別取65 55°C，67 57°C，69 59°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。 引物28SD1F 28SD1R的PCR反應(yīng)采用降落PCR 94°C，變性 4min ；94°C,變性 lmin,XX°C,退火1 min, y 10個循環(huán)(每個循環(huán)降低1°C )； 72延伸 lmin, 一94°C,變性 lmin,，XXV ,退火1 min, L 20個循環(huán)； 72V,延伸 lmin，〉72°C，延伸 lOmin退火溫度分別取60 55°C，55 50°C，48 43°C三個溫度梯度進行優(yōu)化。 引物18SF 5. 8SR的PCR反應(yīng)采用降落PCR PCR反應(yīng)程序同引物28SD1F 28SD1R，退火溫度分別取60 55°C，55 50°C，50 45 °C三個溫度梯度進行優(yōu)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(4) 為將5ul PCR擴增的產(chǎn)物與lul Loading buffer混合后上樣，1 %瓊脂糖凝膠電泳，100V 恒壓電泳30min，在含0. 5 ii g/ml EB的1XTAE緩沖液中染色10 30min，用凝膠成像系統(tǒng) 進行拍照。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(5) 進一步包括垂直膠的制備和平行膠的制備，所述垂直膠的凝膠尺寸7. 5cmX 10cmX 1mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述水平膠 的凝膠尺寸為16cmX16cmXl匪。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(6) 為對DGGE的變性梯度和電泳時間進行優(yōu)化，電泳溫度均為60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，所述步驟(7)進一步包括GDDE鑒定分析的步驟，DGGE特征性圖譜構(gòu)建的步驟和條帶穩(wěn)定性分析的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述變性梯度凝膠電影技術(shù)的使用方法，其特征在于，使用 Quantity One軟件對圖像進行處理，基于DGGE圖譜，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法聚類分析 對相似性進行分析，根據(jù)各條帶的亮度，計算多樣性指數(shù)(H)，進而對物種結(jié)構(gòu)多樣性進行 分析；所述多樣性指數(shù)的計算公式為H = E (ni/N)ln(ni/N)，其中ni為每條帶的亮度峰 值，N為每個泳道中所有條帶亮度峰值的和。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)的使用方法，其特征在于，包括以下步驟(1)藻細胞搜集，(2)總DNA的提取，(3)PCR引物設(shè)計及優(yōu)化，(4)瓊脂糖電泳檢測，(5)變性梯度凝膠的制備，(6)電泳條件的優(yōu)化，(7)運用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對微藻進行分析。從GenBank中下載常見微藻的18S rDNA，28S rDNA及ITS區(qū)序列；運用DNAStar軟件進行MegAlign分析，選擇序列高變區(qū)；針對高變區(qū)兩側(cè)的保守區(qū)用Primerpremier 5.0進行引物設(shè)計；然后對所設(shè)計的引物用Oligo軟件對各參數(shù)進行評估，選出最優(yōu)引物進行合成。本發(fā)明可精確檢測浮游植物群落的結(jié)構(gòu)組成，有利于浮游植物赤潮的爆發(fā)預警。
文檔編號C12Q1/04GK101831502SQ20101018481
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者于志剛, 孫靜, 甄毓, 米鐵柱 申請人:中國海洋大學