專利名稱：一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及薇藻細胞的培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種兩階段高效 生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)，學(xué)名是發(fā)狀念珠藻，俗稱發(fā)菜，是一種絲狀聚合體 陸生藍細菌(藍藻)，主要分布于我國西北和華北的荒漠_半荒漠地區(qū)。發(fā)菜進行光合作 用，固定二氧化碳，同時具有固氮能力，可將大氣中的分子態(tài)氮固定為生物可利用的氮素化 合物，是荒漠地區(qū)土壤中氮元素的主要來源，能為其它土壤微生物的生長提供碳源和氮源， 因此，人們稱其為荒漠中的“先鋒生物”，在生態(tài)脆弱帶的能量與物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用。長期以來，發(fā)菜作為一種食用藍細菌，受到廣大消費者尤其是閩粵、港澳臺及東南 亞地區(qū)消費者的青睞。發(fā)菜對惡劣環(huán)境具有極強的適應(yīng)性，其生長過程中向細胞外分泌大 量的膠狀物質(zhì)，包裹于發(fā)菜細胞及藻絲外，形成膠質(zhì)鞘，保護發(fā)菜細胞不受干旱、高溫、紫外 輻射的損傷。膠狀物質(zhì)的主要成分為多糖，發(fā)菜多糖是一類酸性雜多糖，初步研究表明，發(fā) 菜多糖對流感病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒等多種具封套的病毒均具有抗病毒活性。 發(fā)菜多糖能阻斷病毒對寄主細胞的吸附，阻止病毒在寄主細胞內(nèi)的復(fù)制，具有直接的抗病 毒活性。日本等國對發(fā)菜多糖的生理功能進行了多方面的研究，開展了有關(guān)藥物和保健品 的研發(fā)工作。由于發(fā)菜具有很高的經(jīng)濟和藥用價值，因此，發(fā)菜和發(fā)菜多糖的需求量不斷上升， 巨大的市場需求導(dǎo)致過渡采收造成發(fā)菜資源瀕臨枯竭，從保護生態(tài)的角度出發(fā)，我國政府 從2000年7月起就已禁止了對發(fā)菜的采收和銷售，導(dǎo)致作為一種具有良好應(yīng)用前景的生物 活性物質(zhì)發(fā)菜多糖因原料資源匱乏而難以得到大規(guī)模的開發(fā)和生產(chǎn)。為了解決市場需求不足和保護生態(tài)環(huán)境這一兩難問題，人們對人工培養(yǎng)發(fā)菜進行 了深入的研究，主要包括固態(tài)培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法，在不消耗天然發(fā)菜資源、不破壞發(fā)菜生 長地生態(tài)環(huán)境的情況下擴大發(fā)菜的生產(chǎn)，能夠基本滿足市場需求。根據(jù)檢索，發(fā)現(xiàn)有以下幾篇專利文獻與本發(fā)明相關(guān)，分別是1、專利(02138828. 8) “一種培養(yǎng)發(fā)菜細胞的方法”，該方法提供了一種發(fā)菜細胞的 培養(yǎng)方法，其特點是從原種發(fā)菜勻漿獲得勻漿液，經(jīng)逐步擴大用于發(fā)菜細胞培養(yǎng)，為發(fā)菜細 胞的液體培養(yǎng)提供了一個新的途徑，但是該方法只采用發(fā)菜藻絲體而非發(fā)菜細胞進行光合 自養(yǎng)培養(yǎng)，并且沒有涉及利用發(fā)菜細胞生產(chǎn)胞外多糖。2、專利(CN12144690C) “一種發(fā)菜細胞培養(yǎng)聯(lián)產(chǎn)發(fā)菜多糖的方法”，該方法從野生 發(fā)菜藻體中分離獲得離體細胞，將分離得到的發(fā)菜細胞作為種子進行長期保藏，用于發(fā)菜 細胞進一步培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中提取發(fā)菜多糖或直接作為功能性食品、藥物的生產(chǎn)胞外多糖 方法。該方法與野生發(fā)菜相比，生長速度有了較大的提高，該方法改變了只能從發(fā)菜藻體中 提取發(fā)菜多糖的現(xiàn)狀，但由于該方法采用光合自養(yǎng)培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)的后期受到光衰減的 影響，使最終收獲的發(fā)菜細胞量和胞外多糖的產(chǎn)量都較低。
3、專利(200510122059.9) “發(fā)菜細胞的固態(tài)培養(yǎng)方法”，并在日本申請兩項專利 “髪菜細胞 培餐i髪菜多糖 抽出&彡 > 夕$姑T行)t “方法(C12m/12PF5483)、 髪菜細胞O固體培餐方法(C12m/12PF5482) ”，該方法是將液體懸浮培養(yǎng)獲得的發(fā)菜細胞 培養(yǎng)物接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，在人工或自然條件下培養(yǎng)發(fā)菜細胞，并進行干濕節(jié)律培養(yǎng)，提 供可控的適宜培養(yǎng)條件，實現(xiàn)完全人工培養(yǎng)或野外擴大培養(yǎng)，該方法突破了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式， 加快了生產(chǎn)速度，但該方法還不能實現(xiàn)發(fā)菜的人工種植產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。4、專利(200610013589.4) “穩(wěn)定高產(chǎn)發(fā)菜多糖的發(fā)菜細胞高密度培養(yǎng)方法”提供 了一種發(fā)菜細胞高密度培養(yǎng)的方法，采用混合營養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)的模式，能在較短的時間內(nèi) 獲得大量發(fā)菜細胞和胞外多糖，該方法突破了傳統(tǒng)的發(fā)菜細胞生長的光合自養(yǎng)培養(yǎng)模式， 減少了培養(yǎng)過程中對光的依賴性，通過添加有機碳源可以提高發(fā)菜細胞的生長速度，縮短 了發(fā)菜細胞的培養(yǎng)周期，同時可以提高發(fā)菜多糖的產(chǎn)量，但由于該培養(yǎng)方法在培養(yǎng)開始時 就在培養(yǎng)基中添加了葡萄糖，極易染菌，使培養(yǎng)過程中對無菌生產(chǎn)條件要求非常嚴格，從而 大大提高了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)的風險性，不利于發(fā)菜細胞及其胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。目前文獻報道的發(fā)菜培養(yǎng)方法都是采用單一階段方式培養(yǎng)，包括光合自養(yǎng)、混合 營養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)，光合自養(yǎng)培養(yǎng)法存在對光照的依賴性、細胞生長速度慢、細胞密度低、胞 外多糖產(chǎn)量低等缺點，混合營養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)存在原料利用率低、容易污染雜菌、無菌條件要 求高、風險性高、生產(chǎn)成本高等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細 胞及其胞外多糖的方法，該方法采用光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)培養(yǎng)相結(jié)合的兩階段培養(yǎng)模式， 有效提高了發(fā)菜細胞的生長速度和培養(yǎng)基中葡萄糖的利用率，同時降低染菌幾率和生產(chǎn)成 本，簡化生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，(1)第一階段取發(fā)菜細胞種子液接種到培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng) 基，培養(yǎng)8-10天，當發(fā)菜細胞濃度達到0. 5 0. 7g/L時進行第二階段培養(yǎng)；(2)第二階段在第一階段相同的培養(yǎng)條件下，向上述培養(yǎng)液中加入終濃度為1 20g/L的葡萄糖，培養(yǎng)2-8天，將發(fā)菜細胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細胞，取離心上清液提取培 養(yǎng)液中的胞外多糖。而且，所述改良的BG11培養(yǎng)基成分及含量為NaN03 1. 5g/L, K2HP04 0. 04g/L，MgS04 7H20 0. 075g/L，CaCl2 2H20 0. 036g/ L, Na2Si03 9H20 0. 058g/L,檸檬酸 0. 60mg/L, FeS04 H20 4. 80mg/L, H3B04 2 . 86mg/L, MnCl2 4H201. 81mg/L, ZnS04 7H20 0. 20mg/L, EDTA 2Na lmg/L, Na2Mo04 0. 39mg/L, CuS04 5H200. 079mg/L, CoCl2 0. 0lmg/L 而且，所述步驟(1)的培養(yǎng)方法為取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種到培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基是改良 的BG11培養(yǎng)基，初始pH9. 0，溫度為20-30°C，轉(zhuǎn)速80-120r/min或通風比0. 06-1. Ovvm，光 照強度為2500-35001UX，培養(yǎng)8_10天，當發(fā)菜細胞濃度達到0. 5 0. 7g/L時進行下一階段培養(yǎng)。而且，在步驟(1)前還包括制備發(fā)菜細胞種子液的步驟是將保存的發(fā)菜種細胞種接入培養(yǎng)液，在20-30°C靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基是改良的BG11 培養(yǎng)基，初始PH9. 0，光照強度為800-12001UX，培養(yǎng)10_15d后結(jié)束培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)液至細胞 完全沉底，棄去上清液，細胞用無菌水重新懸浮，制成發(fā)菜細胞種子液。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是1、本發(fā)明建立了一種發(fā)菜及其胞外多糖的兩階段高效生產(chǎn)方法，即第一階段是光 合自養(yǎng)培養(yǎng)，第二階段是光合自養(yǎng)培養(yǎng)與異養(yǎng)培養(yǎng)混合培養(yǎng)，本方法突破了傳統(tǒng)的發(fā)菜細 胞生長和多糖積累只采用單一階段的培養(yǎng)模式，充分利用了光合自養(yǎng)與混合營養(yǎng)的優(yōu)點， 提高了發(fā)菜細胞的生長速度和培養(yǎng)基中葡萄糖的利用率。2、本發(fā)明在第一階段培養(yǎng)8-10后，向培養(yǎng)體系中添加葡萄糖，使培養(yǎng)基能夠及時 補充碳源和能源，發(fā)菜細胞進如快速生長期，同時由于中后期添加葡萄糖，提高了葡萄糖的 利用率，減少了雜菌的污染機會，降低了發(fā)菜細胞培養(yǎng)對無菌生產(chǎn)條件的要求，從而有效降 低了生產(chǎn)風險和生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝，為發(fā)菜細胞及胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)探索出一 條新的途徑。3、本發(fā)明涉及的方法中采用兩階段培養(yǎng)模式與單一光合自養(yǎng)培養(yǎng)方法相比，在相 近的培養(yǎng)時間內(nèi)生產(chǎn)的發(fā)菜細胞的干重提高5-8倍，胞外多糖產(chǎn)量提高近15-31倍，細胞干 重達3. 0 5. Og/L，多糖產(chǎn)量達1. 0 2. 3g/L，在有效縮短了發(fā)菜細胞的培養(yǎng)周期同時提 高了胞外多糖的產(chǎn)量，與單一混養(yǎng)培養(yǎng)方法相比有效降低染菌率，顯著降低生產(chǎn)成本。4、本發(fā)明培養(yǎng)過程中采用改良的BG11培養(yǎng)基，在原來BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)基中添加 了 Na2Si03 9H20，添加該物質(zhì)后，使發(fā)菜細胞的生長更加快速，有效提高了發(fā)菜細胞和胞外 多糖的產(chǎn)量。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的培養(yǎng)機理是第一階段是將生長旺盛的發(fā)菜細胞接種到改良的BG11培養(yǎng)基中進行液體懸浮培 養(yǎng)，其中改良的BG11培養(yǎng)基中不添加有機碳源，發(fā)菜細胞僅以空氣中的C02為碳源，通過光 合作用固定C02，為細胞的生長繁殖提供碳源，當細胞培養(yǎng)到8 10d后，其光合作用受到光 衰減的影響，單位細胞的光合作用效率下降，不能為發(fā)菜細胞的生長和胞外多糖生成提供 充足能源時，因此細胞的生長和胞外多糖的生成開始受到抑制，這時需轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的第二階 段，此時的細胞濃度達到0. 5 0. 7g/L。第二階段是光合作用受到光衰減的影響后，添加終濃度為1 20g/L的葡萄糖，為 細胞提供充足的碳源和能源，細胞繼續(xù)快速分裂生長，并且開始生成大量的胞外多糖，繼續(xù) 培養(yǎng)2 8天，停止培養(yǎng)，分離收集細胞，提取培養(yǎng)液中的胞外多糖，添加葡萄糖后促進胞外 多糖的大量分泌，多糖產(chǎn)量達1. 0 2. 3g/L，細胞干重達到3. 0 5. Og/L。本發(fā)明實施例采用的發(fā)菜細胞種是本實驗室從野生發(fā)菜中分離純化并保存的離 體發(fā)菜單細胞種，利用發(fā)菜單細胞種培養(yǎng)發(fā)菜細胞種子液的方法為
將保存的發(fā)菜細胞種接入裝有200mL培養(yǎng)液的三角瓶(500mL)中，在25°C靜置培 養(yǎng)，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng)基，初始pH9. 0，光照強度為lOOOlux，細胞從緩慢生長過渡到 快速生長狀態(tài)，培養(yǎng)15d后結(jié)束培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)液，等細胞完全沉底，將上清液棄去，細胞再 用200mL無菌水重新懸浮，制成發(fā)菜細胞種子液。上述改良的BG11培養(yǎng)基成分及含量為NaN03 1. 5g/L, K2HP04 0. 04g/L, MgS04 7H20 0. 075g/L, CaCl2 2H20 0. 036g/ L, Na2Si03 9H20 0. 058g/L,檸檬酸 0. 60mg/L, FeS04 H20 4. 80mg/L, H3B04 2 . 86mg/L, MnCl2 4H201. 81mg/L, ZnS04 7H20 0. 20mg/L, EDTA 2Na lmg/L, Na2Mo04 0. 39mg/L, CuS04 5H200. 079mg/L, CoCl2 0. 0lmg/L 實施例1 :—種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，步驟如下(1)發(fā)菜細胞第一階段培養(yǎng)取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種 到裝有200mL培養(yǎng)液的三角瓶(500mL)中，培養(yǎng)基是改良BG11培養(yǎng)基，初始pH9. 0，在25°C 的搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，光照強度為30001UX，培養(yǎng)10天，當發(fā)菜細胞濃度達到0. 5 0. 7g/L時進行下一步；(2)發(fā)菜細胞第二階段培養(yǎng)當?shù)谝浑A段培養(yǎng)10天后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為 5g/L的葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)5天，取200mL發(fā)菜細胞培養(yǎng)液4000r/min離心lOmin收集發(fā)菜細 胞，用無菌水洗滌兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，在80°C烘干至恒重，測定發(fā)菜細胞的產(chǎn)量，取 發(fā)菜細胞培養(yǎng)液的離心上清液用醇沉法分離提取發(fā)菜多糖，測定粗多糖的產(chǎn)量。本實施例得到發(fā)菜細胞的干重是3. 974g/L，胞外多糖產(chǎn)量是1120. lmg/L。醇沉法提取發(fā)菜多糖的方法為向發(fā)菜細胞培養(yǎng)液離心上清中加入發(fā)菜細胞培養(yǎng) 液離心上清液4倍體積的無水乙醇，4°C靜置12h，4000r/min離心15min收集胞外多糖，冷 凍干燥獲得多糖產(chǎn)品，稱重。實施例2 一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，步驟如下(1)發(fā)菜細胞第一階段培養(yǎng)取發(fā)菜細胞種子液，以5 10% (v/v)的接種量接 種到裝有200mL培養(yǎng)液的三角瓶(500mL)中，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng)基，初始pH9. 0，在 25°C的搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrprn，光照強度為30001ux，培養(yǎng)10天；(2)發(fā)菜細胞第二階段培養(yǎng)當?shù)谝浑A段培養(yǎng)10天后，向培養(yǎng)液中加入終濃度 10g/L的葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)5天，取200mL發(fā)菜細胞培養(yǎng)液4000r/min離心lOmin收集發(fā)菜 細胞，用無菌水洗滌兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，在80°C烘干至恒重，測定發(fā)菜細胞的產(chǎn)量。 取發(fā)菜細胞培養(yǎng)液離心上清液用醇沉法分離提取發(fā)菜多糖，測定粗多糖的產(chǎn)量。本實施例中得到細胞的干重是4. 910g/L，胞外多糖產(chǎn)量是2210. 2mg/L。實施例3 一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，步驟如下(1)發(fā)菜細胞第一階段培養(yǎng)取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種 到裝有2. 5L培養(yǎng)液的3L光照生物反應(yīng)器，通氣量為0. 8vvm,培養(yǎng)基是改良BG11培養(yǎng)基， 初始pH9. 0，培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速lOOrprn，光照強度為35001ux，培養(yǎng)8天后細胞產(chǎn)量達到 0.6g/L。
(2)發(fā)菜細胞第二階段培養(yǎng)當?shù)谝浑A段8天后，向培養(yǎng)液中加入終濃度5g/L的 葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)7天，取200mL發(fā)菜細胞培養(yǎng)液4000r/min離心lOmin收集發(fā)菜細胞，用 無菌水洗滌兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，在80°C烘干至恒重，測定發(fā)菜細胞的產(chǎn)量。取發(fā)菜 細胞培養(yǎng)液用醇沉法分離提取發(fā)菜多糖，測定粗多糖的產(chǎn)量。本實施例中得到發(fā)菜細胞的干重是5. 040g/L，胞外多糖產(chǎn)量是1520. lmg/L。產(chǎn)量對比試驗發(fā)菜細胞經(jīng)單一的光合自養(yǎng)培養(yǎng)獲得細胞干重和多糖產(chǎn)量對比， 步驟如下取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種到裝有200mL培養(yǎng)液的三角 瓶(500mL)中，培養(yǎng)基是改良BG11培養(yǎng)基，初始pH9.0，在25°C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrpm，光 照強度為30001uX，培養(yǎng)15天，取200mL發(fā)菜細胞培養(yǎng)液4000r/min離心lOmin收集發(fā)菜 細胞，用無菌水洗滌兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基，在80°C烘干至恒重，測定發(fā)菜細胞的產(chǎn)量； 取發(fā)菜細胞培養(yǎng)液離心上清液用醇沉法分離提取發(fā)菜胞外多糖，冷凍干燥后測定粗多糖的 產(chǎn)量，據(jù)檢測經(jīng)單一培養(yǎng)得到發(fā)菜細胞的干重是0. 711g/L，胞外多糖產(chǎn)量是72. 9mg/L。染菌率對比發(fā)菜細胞經(jīng)單一的混養(yǎng)培養(yǎng)的染菌率對比，步驟如下取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種到裝有200mL培養(yǎng)液的三角瓶 (500mL)中，培養(yǎng)基是在改良BG11培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0. 5 10g/L葡萄糖，初始pH9. 0，在 25°C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速lOOrprn，光照強度為30001ux，培養(yǎng)15天。進行10批次，每次20瓶，共 200瓶，培養(yǎng)結(jié)束后共有15瓶染菌，染菌率7. 5 %，而采用實施例1兩階段法培養(yǎng)10批次， 每次20瓶，培養(yǎng)結(jié)束后共染菌3瓶，染菌率1. 5%，比混養(yǎng)培養(yǎng)染菌率降低了 80%。
權(quán)利要求
一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，其特征在于(1)第一階段取發(fā)菜細胞種子液接種到培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)8-10天，當發(fā)菜細胞濃度達到0.5～0.7g/L時進行第二階段培養(yǎng)；(2)第二階段在第一階段相同的培養(yǎng)條件下，向上述培養(yǎng)液中加入終濃度為1～20g/L的葡萄糖，培養(yǎng)2-8天，將發(fā)菜細胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細胞，取離心上清液提取培養(yǎng)液中的胞外多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，其特征 在于所述改良的BG11培養(yǎng)基成分及含量為NaN03 1. 5g/L, K2HP04 0. 04g/L, MgS04 7H20 0. 075g/L, CaCl2 2H20 0. 036g/L, Na2Si03 9H20 0. 058g/L,檸檬酸 0. 60mg/L, FeS04 H20 4. 80mg/L, H3B04 2 . 86mg/L, MnCl2 4H201. 81mg/L, ZnS04 7H20 0. 20mg/L, EDTA 2Na lmg/L, Na2Mo04 0. 39mg/L, CuS04 5H200. 079mg/L, CoCl2 0. 0lmg/L
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，其特征 在于所述步驟(1)的培養(yǎng)方法為取發(fā)菜細胞種子液以5 10% (v/v)的接種量接種到培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基是改良的 BG11培養(yǎng)基，初始pH9. 0，溫度為20-30°C，轉(zhuǎn)速80_120r/min或通風比0. 06-1. Ovvm，光照 強度為2500-35001UX，培養(yǎng)8_10天，當發(fā)菜細胞濃度達到0. 5 0. 7g/L時進行下一階段培 養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩階段高效生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法其特征 在于在步驟(1)前還包括制備發(fā)菜細胞種子液的步驟是將保存的發(fā)菜種細胞種接入培養(yǎng)液，在20-30°C靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng) 基，初始pH9. 0，光照強度為800-12001UX，培養(yǎng)10_15d后結(jié)束培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)液至細胞完全 沉底，棄去上清液，細胞用無菌水重新懸浮，制成發(fā)菜細胞種子液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效兩階段生產(chǎn)發(fā)菜細胞及其胞外多糖的方法，步驟為(1)取發(fā)菜細胞種子液接種到培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基是改良的BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)8-10天，(2)向上述培養(yǎng)液中加入終濃度為1～20g/L的葡萄糖，培養(yǎng)2-8天，收集發(fā)菜細胞，取離心上清液提取培養(yǎng)液中的胞外多糖。本發(fā)明涉及的方法中，在相近的培養(yǎng)時間內(nèi)生產(chǎn)的發(fā)菜細胞的干重提高5-8倍，胞外多糖產(chǎn)量提高近15-31倍，細胞干重達3.0～5.0g/L，多糖產(chǎn)量達1.0～2.3g/L，在有效縮短了發(fā)菜細胞的培養(yǎng)周期同時提高了胞外多糖的產(chǎn)量，與單一混養(yǎng)培養(yǎng)方法相比可提高葡萄糖的利用率，有效降低染菌率，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N1/12GK101845395SQ20101016830
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者張峰, 張照明, 戴玉杰, 楊洪江, 譚之磊, 賈士儒 申請人:天津科技大學(xué)