專利名稱：內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的制作方法
內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2002年06月06日、申請(qǐng)?zhí)枮?2811352. 7 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/ DK02/00381)、發(fā)明名稱為“內(nèi)切鄰-1，4-葡聚糖酶”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及為芽孢桿菌屬種DSM 12648菌株的內(nèi)源酶的具有內(nèi)切-0 _1，4_葡聚 糖酶活性的酶，涉及編碼該內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶的分離多核苷酸分子，以及涉及該酶在 去污劑、紙和紙漿、石油鉆探、油的提取、酒和果汁、食物成分、動(dòng)物飼料或紡織工業(yè)中的應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
纖維素為通過(guò)0 -1，4_糖苷鍵連接的葡萄糖多聚體。纖維素鏈形成眾多分子內(nèi)和 分子間氫鍵，這導(dǎo)致形成不溶性的纖維素微絲。微生物將纖維素水解為葡萄糖涉及以下三 類主要的纖維素酶(i)在纖維素分子中隨機(jī)切割0-1，4_糖苷鍵的內(nèi)切-葡聚糖酶(EC 3. 2.1.4),也稱作內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶；(ii)從非還原末端消化纖維素而釋放纖維二糖 的纖維二糖水解酶(EC 3.2. 1.91)；以及(iii)水解纖維二糖和低分子量纖維糊精以釋放 葡萄糖的3 -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)。0 -1，4-糖苷鍵也存在于其他天然多聚體內(nèi)，例如存在于來(lái)自如大麥和燕麥等植 物的葡聚糖中。在一些情況下，內(nèi)切葡聚糖酶也可以水解此類非-纖維素多聚體。纖維素酶由多種微生物產(chǎn)生且經(jīng)常以多種形式存在。對(duì)酶促降解纖維素的經(jīng)濟(jì) 學(xué)重要性的認(rèn)識(shí)已推動(dòng)了可工業(yè)應(yīng)用的微生物纖維素酶的廣泛研究。結(jié)果是，已對(duì)大量纖 維素酶的酶學(xué)特性和一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。根據(jù)對(duì)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的疏水簇的分 析結(jié)果，這些纖維素酶已被歸入不同的糖基水解酶家族；真菌和細(xì)菌糖基水解酶已被劃分 成35個(gè)家族(Henrissat，B.基于氨基酸序列相似性對(duì)糖基水解酶的分類，生物化學(xué)雜志 (Biochem. J.) 280 (1991)，309-316 ；Henrissat, B.，和 Bairoch，A.基于氨基酸序列相似性 的糖基水解酶分類中的新家族，生物化學(xué)雜志(Biochem. J) 293 (1993)，781-788.)。大多 數(shù)纖維素酶由纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和催化結(jié)構(gòu)域(CAD)組成，二者由可富含脯氨酸和 羥基氨基酸殘基的連接物分開(kāi)。已經(jīng)基于CBD的類似性建立了纖維素酶的另一分類方法 (Gilkes等.(1991))，此方法將糖基水解酶分成5個(gè)家族。纖維素酶可以由多種微生物合成，包括真菌、放線菌、粘細(xì)菌和真細(xì)菌，也可以由 植物合成。特別是已鑒定出具有各種專一性的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶。許多細(xì)菌內(nèi)切 葡聚糖酶已有描述(Gilbert, H. J.和Hazlewood，G. P. (1993)普通微生物學(xué)雜志(J. Gen. Microbiol.) 139 187-194 ；Henrissat, B.，和 Bairoch, A.基于氨基酸序列相似性的糖基 水解酶分類中的新家族，生物化學(xué)雜志(Biochem. J.) 293 (1993)，781-788.)。纖維素水解酶的一個(gè)重要工業(yè)應(yīng)用是用于處理紙漿，如用于改善濾水或用于再生 紙的脫墨。纖維素水解酶的另一重要工業(yè)應(yīng)用是用于處理纖維素紡織品或織物，如用作去 污劑組合物或織物柔軟組合物中的組分，用于新織物的生物拋光(衣件后處理)，以及用于 獲得含纖維素織物(特別是粗斜紋棉布)的“石洗”外觀，且已提出了用于此類處理的幾種 方法，例如，在 GB-A-1368599、EP-A-0307564、EP-A-0435876、W0 91/17243、W0 91/10732、 W0 91/17244、W0 95/24471 和 W0 95/26398 中。JP 專利申請(qǐng)?zhí)?13049/1999 公開(kāi)了一種適用于去污劑的來(lái)自芽孢桿菌屬種KSM-S237(保藏號(hào)FERMP-16067)的耐熱堿性纖維素酶。但仍持續(xù)需要提供新的纖維素酶或者酶制品以用于需要纖維素酶，優(yōu)選地內(nèi) 切-3-1，4_葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的應(yīng)用中。本發(fā)明的目的為提供新的酶和酶組合物，所述酶和酶組合物在微酸到堿性環(huán)境中 具有實(shí)質(zhì)上的3 -1,4-葡聚糖酶活性，并在紙漿加工、織物處理、洗衣過(guò)程、提取過(guò)程或在 動(dòng)物飼料中具有改進(jìn)的性能；優(yōu)選地此新的性能優(yōu)良的葡聚糖酶通過(guò)(或可以通過(guò))應(yīng)用 重組技術(shù)以高產(chǎn)量產(chǎn)生。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了具有實(shí)質(zhì)上內(nèi)切_ 3 -1，4葡聚糖酶活性(根據(jù)酶命名法分類為EC 3. 2. 1. 4)的新酶，該酶為芽孢桿菌屬種AA349(DSM 12648)菌株的內(nèi)源酶；此外本發(fā)明人已 成功克隆和表達(dá)了編碼該酶的DNA序列。本發(fā)明的內(nèi)切0-1，4_葡聚糖酶所具有的穩(wěn)定性 和活性特征使其特別適用于涉及含表面活性劑和/或漂白劑的堿性水溶液的應(yīng)用中。該應(yīng) 用條件非常普遍，既存在于家庭和工業(yè)去污劑及織物整理中亦存在于纖維素紙漿的生產(chǎn)或 再循環(huán)中。由于本發(fā)明的0-1，4-葡聚糖酶可以在此相關(guān)應(yīng)用條件下異常高程度地維持其 活性，因此認(rèn)為當(dāng)例如用于去污劑、用于紙/紙漿加工或用于織物處理時(shí)它將較其它已知 的酶更為有用。此外應(yīng)指出的是，本發(fā)明的0-1，4_葡聚糖酶不會(huì)被Fe(II)離子顯著失活。酶活 性對(duì)鐵離子存在的敏感性可限制酶的應(yīng)用，所述應(yīng)用如在金屬容器中實(shí)施的方法。因此，本發(fā)明的第一方面涉及具有內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的 酶，所述酶選自以下之一 (a)SEQ ID N0:1中全部或部分DNA序列編碼的多肽；(b)通過(guò)培 養(yǎng)包含SEQ ID NO :1序列的細(xì)胞而產(chǎn)生的多肽，所述培養(yǎng)在該DNA序列得以表達(dá)的條件下 進(jìn)行；(c)具有如下序列的內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶，當(dāng)通過(guò)GCG程序包中提供的GAP測(cè)定 同一性時(shí)(使用的GAP創(chuàng)建罰分(creation penalty)為3.0且GAP延伸罰分(extension penalty)為0. 1)，該序列與(I)SEQ ID NO 2中1-773位或其具有內(nèi)切-葡聚糖酶活性的 片段、(II)SEQ ID NO :2中1到約340位氨基酸序列和(III) SEQ ID NO 2中從1位到約 540和773位之間的氨基酸序列有至少97%、優(yōu)選地98%、更優(yōu)選地98. 5%、甚至更優(yōu)選地 99%的同一性；和(d)具有內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶活性的多肽，其中編碼該多肽的多核苷 酸可以與SEQ ID NO :1第1-2322位中所示核苷酸序列雜交，雜交條件包括45°C時(shí)5x SSC， 洗滌條件包括60°C時(shí)2xSSC。在一優(yōu)選實(shí)施方案中所述片段為由1到663士50位氨基酸、 優(yōu)選地由1到663 士 25位氨基酸組成的多肽。本發(fā)明的第二方面涉及分離的多核苷酸分子，優(yōu)選地DNA分子，所述分子編碼具 有內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶活性的酶的催化活性結(jié)構(gòu)域，該分子選自(a)包含SEQ ID NO 1第1到2322位核苷酸中所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b) (a)的物種同系物；(c) 編碼如下多肽的多核苷酸分子，所述多肽與SEQ ID NO :2第1到773位氨基酸殘基的氨基 酸序列的同一性為至少97%、優(yōu)選地為98%、更優(yōu)選地為98. 5%、甚至更優(yōu)選地為99%;和 (d) (a)或(b)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；優(yōu)選能夠與變性雙鏈DNA探針在嚴(yán)緊的介質(zhì)條件下進(jìn)行 雜交的多核苷酸分子，其中所述探針選自包含SEQ ID NO :1中1-2322位所示序列的DNA 探針以及包含SEQ ID N0:1的1-2322位中長(zhǎng)度至少約100個(gè)堿基對(duì)的亞序列的DNA探針。
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本發(fā)明的第三、第四和第五方面提供了包含DNA片段(例如，本發(fā)明的多核苷酸分 子)的表達(dá)載體；包含該DNA片段或該表達(dá)載體的細(xì)胞；以及生產(chǎn)具有內(nèi)切_葡聚糖酶活 性的酶的方法，所述方法包括在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞并從培養(yǎng)物中回收該酶。而在本發(fā)明的另一方面中提供了具有內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶活性的分離的酶， 所述酶的特征在于(i)不含同源雜質(zhì)，以及(ii)該酶由以上描述的方法產(chǎn)生。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明內(nèi)切-葡聚糖酶在5-11的pH范圍內(nèi)(優(yōu) 選地具有最適PH 6-10. 5)，及20°C到60°C溫度下顯示出活性。該內(nèi)切_葡聚糖酶可以包含屬于糖基水解酶家族5的催化活性結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域 與SEQ ID NO 2的約1位到約340位對(duì)應(yīng))以及屬于家族17的纖維素酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD) (該結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :2的約341位到約540位對(duì)應(yīng))。SEQ ID NO :2的其余部分為功 能未知的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶對(duì)多種工業(yè)應(yīng)用是有利的，特別是由于其具有改進(jìn)的抗 再沉積作用和去垢效果而可有利地用在去污劑組合物中，并可有利地用在織物處理中。本發(fā)明具體涉及如下各項(xiàng)1.具有內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的酶，所述酶選自下列之一(a) SEQ ID NO 1的第1到2322位DNA序列編碼的多肽；(b)通過(guò)將包含SEQ ID NO 1序列的細(xì)胞在該DNA序列可以得以表達(dá)的條件下培 養(yǎng)而產(chǎn)生的多肽；(c)具有如下序列的內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶，所述序列與SEQ ID NO 2中第1到 773位氨基酸序列或其具有內(nèi)切-0 -1，4-葡聚糖酶活性的片段有至少97 %的序列同一性， 其中所述同一性通過(guò)GCG程序包中提供的GAP進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用的GAP創(chuàng)建罰分為3. 0且GAP 延伸罰分為0. 1。2.具有內(nèi)切-0_1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的酶，所述酶包含具有內(nèi) 切-0-l，4-葡聚糖酶活性的多肽，且編碼該多肽的多核苷酸可以與SEQ IDN0:1第1到 2322位中顯示的核苷酸序列雜交，雜交條件包括45°C下5X SSC，洗滌條件包括60 °C下 2XSSC。3.根據(jù)項(xiàng)1或2的酶，該酶包含芽孢桿菌屬種DSM 12648的內(nèi)源多肽。4.根據(jù)項(xiàng)1到3任何一項(xiàng)的酶，所述酶在至少4-11的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選地在pH 5. 5-10. 5之間具有活性。5.編碼具有內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸分子，其選自(a)包含SEQ ID NO :1第1到2322位核苷酸中顯示的核苷酸序列的多核苷酸分 子；(b) (a)的物種同系物；(c)多核苷酸分子，其編碼與SEQID N0 2中第1到773位氨基酸序列或該序列的 具有內(nèi)切_葡聚糖酶活性的片段有大于97%的同一性的多肽；(d)與(a)、(b)或(c)互補(bǔ)的分子；以及(e) (a)或(b)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。6.根據(jù)項(xiàng)5的分離的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸為DNA。
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7.編碼具有內(nèi)切-0-l，4_葡聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸分子，該多核 苷酸分子可以在中等嚴(yán)緊條件下與變性的雙鏈DNA探針雜交，其中該探針選自包含SEQ ID NO :1第1到2322位中所示序列的DNA探針和包含SEQ ID NO :1第1-2322位中長(zhǎng)度至 少大約100個(gè)堿基對(duì)的亞序列的DNA探針。8.根據(jù)項(xiàng)5的分離的多核苷酸分子，其是從原核生物分離的或是基于原核生物的 DNA文庫(kù)產(chǎn)生的，所述原核生物優(yōu)選為細(xì)菌、更優(yōu)選為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。9.根據(jù)項(xiàng)8的分離的多核苷酸分子，其是從芽孢桿菌屬的菌株分離的或是基于芽 孢桿菌屬的菌株的DNA文庫(kù)產(chǎn)生的，所述菌株特別是芽孢桿菌屬種的菌株、尤其是芽孢桿 菌屬種DSM 12648。10.包含根據(jù)項(xiàng)5到9任何一項(xiàng)的多核苷酸分子的多核苷酸構(gòu)建體。11.包含以下可操作連接的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自以下的DNA片段(a)編碼具有內(nèi)切_1，4_葡聚糖酶活性的多肽且包含 SEQ ID N0:1第1到2322位核苷酸中所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)編碼具有內(nèi) 切-0_1，4-葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸分子，其中所述多肽與SEQ ID N0:2第1到 773位氨基酸序列或該序列具有內(nèi)切-葡聚糖酶活性的片段有大于97%的同一性；和(c) (a)或(b)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；以及轉(zhuǎn)錄終止子。12.已經(jīng)導(dǎo)入根據(jù)項(xiàng)11的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中該細(xì)胞表達(dá)由所述DNA片段 編碼的多肽。13.根據(jù)項(xiàng)12的細(xì)胞，該細(xì)胞為原核細(xì)胞，特別是細(xì)菌細(xì)胞，或者是編碼具有內(nèi) 切-0-1，4_葡聚糖酶活性的多肽的DNA片段所來(lái)源的內(nèi)源細(xì)胞。14.根據(jù)項(xiàng)13的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬菌株，優(yōu)選地枯草芽孢桿菌或遲 緩芽孢桿菌菌株。15.根據(jù)項(xiàng)13的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于地衣芽孢桿菌菌株，優(yōu)選地地衣芽孢桿菌 ATCC 14580。16.根據(jù)項(xiàng)13的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于假單胞菌屬菌株，優(yōu)選地?zé)晒饧賳伟蜷T 多薩假單胞菌菌株。17.根據(jù)項(xiàng)13的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于鏈霉菌菌株。18.根據(jù)項(xiàng)13的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于酵母菌株，優(yōu)選地釀酒酵母菌株。19.產(chǎn)生具有內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)已經(jīng) 導(dǎo)入根據(jù)項(xiàng)12的表達(dá)載體的細(xì)胞，由此該細(xì)胞表達(dá)所述DNA片段編碼的多肽；以及回收該 多肽。20.包含根據(jù)項(xiàng)1的酶的酶組合物。21.根據(jù)項(xiàng)20的組合物，其還包含一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶 (內(nèi)切-葡聚糖酶)、葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、a-淀粉酶、 葡糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂 解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、 果膠裂解酶、其它甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或它們的混合物。22.具有內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶活性的分離的酶，其中該酶⑴不含同源雜質(zhì)，和 (ii)由根據(jù)項(xiàng)19的方法產(chǎn)生。23.用于降解含纖維素的生物質(zhì)的方法，其中所述生物質(zhì)用根據(jù)項(xiàng)1到4和22之 任一項(xiàng)的酶或根據(jù)項(xiàng)20或21的酶組合物的有效量進(jìn)行處理。24.具有內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶活性的雜合內(nèi)切_葡聚糖酶，所述酶包含a)SEQ ID NO 2中第340到540位的CBD，以及b)非芽孢桿菌屬種AA349菌株DSM12648來(lái)源的催 化結(jié)構(gòu)域(CAD)。25.根據(jù)項(xiàng)24的雜合內(nèi)切-3-l，4-葡聚糖酶，其中催化結(jié)構(gòu)域(CAD)為源自選自 如下的來(lái)源的內(nèi)切_葡聚糖酶(a)燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)菌株 NCIMB 40250,(b)特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)菌株 DSM1800，
(c)尖鐮孢菌株DSM2672或(d)芽孢桿菌屬種AC13菌株NCIMB 40482。26.包含根據(jù)項(xiàng)1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶或包含項(xiàng)24或25的雜 合內(nèi)切-0-l，4-葡聚糖酶的組合物。27.根據(jù)項(xiàng)1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶或項(xiàng)24或25的雜合內(nèi) 切-0 -1，4-葡聚糖酶在去污劑組合物中的用途。28.根據(jù)項(xiàng)1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶或項(xiàng)24或25的雜合內(nèi) 切-1，4-葡聚糖酶在織物整理工序中的用途。發(fā)明詳述芽孢桿菌屬種AA349菌株分離自源于希臘的土壤樣本，其由本發(fā)明人根據(jù)國(guó)際承 認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約于1999年1月25日保藏在德意志微生物保 藏中(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,Mascheroder ffeg lb，D-38124Braunschweig，聯(lián)邦德國(guó))，保藏號(hào)為 DSM 12648。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“功能性酶學(xué)特性”意指具有一種或多種催化活性的多肽的物理 和化學(xué)特性。功能性酶學(xué)特性的示例為酶活性、酶比活性、與最大活性的相對(duì)酶活性(作為 PH或溫度的函數(shù)測(cè)定)、穩(wěn)定性(隨時(shí)間的過(guò)去酶活性的降低)、DSC熔解溫度、N端氨基酸 序列、分子量(通常用SDS-PAGE測(cè)定)、等電點(diǎn)(pi)。本文中的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指線性或環(huán)狀的DNA分子，所述分子包含編碼目的多肽 的片段，該片段可操作地與用于其轉(zhuǎn)錄的額外片段連接。此額外片段可包括啟動(dòng)子和終止 序列，并可任選地包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化 信號(hào)等。表達(dá)載體通常源自質(zhì)粒或病毒DNA，或也可同時(shí)含有二者的元件。本發(fā)明的表達(dá)載 體可以為可方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何表達(dá)載體，并且載體的選擇常常依賴于載體將 要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。這樣，載體可為自主復(fù)制載體，即載體作為染色體外實(shí)體存在，載體的 復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒。備選地，載體可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，與宿主細(xì)胞 基因組整合并與所整合的染色體一同復(fù)制。此處應(yīng)用的與多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)的”或“進(jìn)行重組表達(dá)的” 根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)定義進(jìn)行限定。蛋白質(zhì)的重組表達(dá)通常通過(guò)應(yīng)用如以上描述的表達(dá)載體進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“分離的”，當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸分子時(shí)，指該多核苷酸已經(jīng)從其天然遺傳環(huán)境 中移出并因此不含其他外來(lái)或不需要的編碼序列，并且該多核苷酸的存在形式適于在遺傳 工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中應(yīng)用。此分離分子為那些從其天然環(huán)境中分離的分子并包括cDNA 和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA不含通常與之關(guān)聯(lián)的其他基因，但可包含天然存在的 5'和3'非翻譯區(qū)如啟動(dòng)子和終止子。關(guān)聯(lián)區(qū)域的鑒定對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言是 顯而易見(jiàn)的(參見(jiàn)例如，Dynan和Tijan，自然(Nature) 316 =774-78,1985)。術(shù)語(yǔ)“分離的 多核苷酸”或可稱為“克隆的多核苷酸”。當(dāng)用于蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”表示該蛋白質(zhì)在非其天然環(huán)境的條件下存 在。在一優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本不含其他蛋白質(zhì)，特別是基本不含其他同源蛋白 質(zhì)(即"同源雜質(zhì)"(參見(jiàn)以下))。優(yōu)選提供純度大于40%，更優(yōu)選純度大于60%的蛋白 質(zhì)。甚至更為優(yōu)選的是提供高純化形式的蛋白質(zhì)，即，通過(guò)SDS-PAGE所測(cè)定的純度大 于80%、更優(yōu)選地純度大于95%且甚至更優(yōu)選地大于99%的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白質(zhì)/多肽”或可稱為“純化的蛋白質(zhì)/多肽”。術(shù)語(yǔ)“同源雜質(zhì)”指源自最初獲得本發(fā)明多肽的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如，非本 發(fā)明多肽的另一多肽)。此處應(yīng)用的與特定微生物來(lái)源關(guān)聯(lián)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，指多核苷酸和/或多肽由此 特定來(lái)源產(chǎn)生，或由已插入來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”，當(dāng)涉及DNA片段時(shí)，指排列這些片段以使它們能協(xié)同地行使 功能以達(dá)到它們的預(yù)期目的，例如，轉(zhuǎn)錄從啟動(dòng)子內(nèi)開(kāi)始并經(jīng)過(guò)編碼片段達(dá)到終止子。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指從5響3'末端閱讀的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸堿基的多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，并可從天然來(lái)源分離、在體外合成或通過(guò)天然 分子和合成分子的組合來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子的互補(bǔ)物”指具有與參考序列相比而言的互補(bǔ)堿基序列和相 反方向的多核苷酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'與5' CCCGTGCAT 3'互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)"簡(jiǎn)并核苷酸序列"指包括一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并密碼子(與編碼多肽的參考多 核苷酸分子相比而言)的核苷酸序列。簡(jiǎn)并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同 的氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼Asp)。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指這樣的基因部分，其包含用于結(jié)合RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄的 DNA序列。啟動(dòng)子序列通常，但并非總是，存在于基因的5'非編碼區(qū)。術(shù)語(yǔ)“分泌信號(hào)序列”是指編碼多肽(“分泌多肽”)的DNA序列，所述多肽作為一 較大多肽的成分可以指導(dǎo)該較大多肽通過(guò)合成該多肽的細(xì)胞的分泌途徑。在通過(guò)分泌途徑 的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，分泌肽通常從此較大多肽上切除。多核苷酸在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸可以與SEQ IDN0 1中類似 大小的區(qū)域或其互補(bǔ)序列雜交，所述雜交在至少中等嚴(yán)緊的條件下進(jìn)行。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多核苷酸可在至少中等嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選高嚴(yán)緊條件(見(jiàn)下 述)下與下述探針雜交，所述探針為包含編碼具SEQ ID NO :1第1-2322位所示序列的酶的催化結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)序列的變性雙鏈DNA探針或?yàn)榘琒EQ ID N0:1中長(zhǎng)至少大約100個(gè) 堿基對(duì)的亞序列的任何探針。用于在中等或高嚴(yán)緊條件下確定核苷酸探針和同源DNA或 RNA序列之間雜交的合適實(shí)驗(yàn)條件包括將含有需雜交的DNA片段或RNA的濾膜預(yù)浸泡于 5XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning A Labortory Manual), Cold Spring HarborLab. , Cold Spring Harbor,NY)中 10 分鐘，并 于具有 5XSSC、5XDenhardt 溶液(Sambrook 等，1989) ,0. 5% SDS 和 100 u g/ml 變性的超 聲處理的鮭魚(yú)精子DNA (Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交該濾膜，然后在含lOng/ml隨 機(jī)引發(fā)的(Feinberg, A. P.和 Vogelstein，B. (1983)分析生物化學(xué)(Anal. Biochem.) 132 6-13)、32P-dCTP標(biāo)記的(比活性高于1 X 109cpm/ u g)探針的同樣溶液中約45°C雜交12小 時(shí)。濾膜隨后在2X SSC、0. 5% SDS中洗兩次，30分鐘，洗滌溫度至少60°C (中等嚴(yán)緊條件)， 更優(yōu)選至少65°C (中等/高嚴(yán)緊條件)，甚至更優(yōu)選至少70°C (高嚴(yán)緊條件)，甚至更優(yōu)選 至少75°C (極高嚴(yán)緊條件)。用X-射線膠片檢測(cè)在這些條件下與寡核苷酸探針雜交上的分子。如前面所提到的，本發(fā)明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法 在本領(lǐng)域是眾所周知的?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法從Gene Bank或DNA文庫(kù)中克隆編碼目的 基因的DNA和RNA。隨后用例如雜交或PCR方法鑒定和分離編碼具有本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶活性的多 肽的多核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)自不同細(xì)菌菌株的多肽和多核苷酸對(duì)應(yīng)物(直向同系物 (ortholog)或共生同系物(paralog))。特別有意義的是來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性嗜堿菌株，包括芽 孢桿菌屬種的內(nèi)切葡聚糖酶多肽。將本發(fā)明提供的信息和組合物與常規(guī)克隆技術(shù)相結(jié)合可克隆具有本發(fā)明內(nèi)切葡 聚糖酶活性的多肽的物種同系物。例如，本發(fā)明的DNA序列可用來(lái)自表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞 類型的染色體DNA進(jìn)行克隆。可用按此處公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)的探針通過(guò)探測(cè)Northern印跡 鑒定DNA的合適來(lái)源。隨后從陽(yáng)性細(xì)胞系的染色體DNA制備文庫(kù)。編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶 活性的多肽的本發(fā)明DNA序列可隨后用各種方法分離，諸如用按本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中 公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行探測(cè)，或用基于公開(kāi)序列的一或多套簡(jiǎn)并探針進(jìn)行探測(cè)。本發(fā) 明的DNA序列也可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR (Mullis，美國(guó)專利號(hào)4，683，202)，用基于本 文公開(kāi)序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行克隆。在另外的方法中，可用DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并 用針對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的抗體(單克隆或多克隆抗體)檢測(cè)目的DNA的表達(dá)，所述酶按材料 和方法及實(shí)施例1和2中所述方法克隆自芽孢桿菌屬種DSM12648、并表達(dá)和純化；或者可 利用與具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽有關(guān)的活性試驗(yàn)檢測(cè)目的DNA的表達(dá)。SEQ ID NO :1所示DNA序列中編碼內(nèi)切-葡聚糖酶的部分和/或本發(fā)明的類似DNA 序列可從產(chǎn)生具有內(nèi)切_葡聚糖酶活性的酶的細(xì)菌芽孢桿菌屬種的菌株中克隆，優(yōu)選地從 DSM12648菌株中克隆，或從如此處描述的其它或相關(guān)生物體中克隆。應(yīng)用本發(fā)明的序列獲得其他相關(guān)序列的方式是可將此處公開(kāi)的編碼本發(fā)明內(nèi) 切H4-葡聚糖酶的多核苷酸序列的有關(guān)序列信息作為工具用以鑒定其他同源內(nèi)切葡 聚糖酶。例如，可應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增編碼各種微生物，特別是不同的芽孢桿 菌屬種來(lái)源的其他同源內(nèi)切_葡聚糖酶的序列。
多肽SEQ ID NO :2第1到773位氨基酸的序列為成熟內(nèi)切-葡聚糖酶序列，其計(jì)算分 子量為86kDa。SEQ ID NO 2的1到約340位被認(rèn)為是本發(fā)明內(nèi)切-葡聚糖酶的催化活性 結(jié)構(gòu)域。此外，從約340位到約540位被認(rèn)為是本發(fā)明內(nèi)切_葡聚糖酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。該序列其余部分(即從約540位到773位)的功能目前仍然未知。本發(fā)明提供包含(i)SEQ ID N0:2的1到773位氨基酸序列或其具有內(nèi)切-葡聚 糖酶活性的片段的內(nèi)切-葡聚糖酶。SEQ ID NO :2的1位到773位序列的片段為從該氨基 酸序列的氨基和/或羧基端缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供 包含(ii)SEQ ID NO :2的1位到約340位氨基酸序列的內(nèi)切-葡聚糖酶，這是由于預(yù)期該 單結(jié)構(gòu)域內(nèi)切-葡聚糖酶也可用于此處描述的工業(yè)應(yīng)用中。本發(fā)明的另一實(shí)施方案中提供 包含(iii)SEQ IDN0 2的1位到約540和773間位置的氨基酸序列的內(nèi)切葡聚糖酶，這是 由于預(yù)期包含此催化活性結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的該內(nèi)切-葡聚糖酶也可用于此處 描述的工業(yè)應(yīng)用中。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該片段為由1位到663士50位氨基酸組成的多 肽，優(yōu)選地為由1到663士25位氨基酸組成的多肽。本發(fā)明也提供了與以上(i)、(ii)或(iii)的多肽和它們的物種同系物(直向同 系物或共生同系物)基本同源的內(nèi)切-葡聚糖酶多肽。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“基本同源”是指 這樣的多肽，該多肽與SEQ ID NO :2第1-773位氨基酸所示序列、或其具有內(nèi)切-葡聚糖酶 活性的片段、或其直向同系物或共生同系物有至少97%，優(yōu)選地98%，更優(yōu)選地98.5%，且 最優(yōu)選地99%或更高程序的同一性。序列同一性百分?jǐn)?shù)通過(guò)常規(guī)方法，利用本領(lǐng)域內(nèi)公知 的計(jì)算機(jī)程序如 GCG 程序包中提供的 GAP (Program Manual for the Wisconsin Package, 第 8 版，1994 年 8 月，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin, USA 53711)，按 Needleman，S. B 和 Wunsch，C. D. ((1970)，分子生物學(xué)雜志(Journal ofMolecular Biology)，48，443-453，在此將所述文獻(xiàn)全部引用作為參考)公開(kāi)的方式確 定。GAP用于多肽序列比較時(shí)應(yīng)用以下的設(shè)置值GAP創(chuàng)建罰分為3. 0且GAP延伸罰分為 0. 1。多核苷酸分子的序列同一性的測(cè)定通過(guò)應(yīng)用GAP以類似的方法進(jìn)行，用于DNA序 列比較時(shí)GAP具有如下設(shè)置值GAP創(chuàng)建罰分為5. 0且GAP延伸罰分為0. 3。對(duì)于基本同源的蛋白質(zhì)和多肽，其特征在于具有一或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添 加。這些改變優(yōu)選為性質(zhì)較小的那種，即保守氨基酸替換(見(jiàn)表2)和其它不會(huì)顯著影響 蛋白質(zhì)或多肽的折疊或活性的替換；小的缺失，通常是1至約30個(gè)氨基酸的小缺失；及小 的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基、長(zhǎng)度不超過(guò)約20-25個(gè)殘基的小連 接肽或利于純化的小延伸(親和標(biāo)記物)，如多聚組氨酸序列、蛋白A(NilSSOn等，EMB0J, 4 =1075,1985 ；Nilsson等，酶學(xué)方法，198 :3，1991)。通常參閱，F(xiàn)ord等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純 化(Protein Expression and Purification) 2 :95_107，1991，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。 編碼親和標(biāo)記物的DNA可從產(chǎn)品供應(yīng)商(如，Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ；New England Biolabs, Beverly, MA)處購(gòu)買至Ij。然而，即便上述的變化優(yōu)選是性質(zhì)較小的改變，這些改變也可以是性質(zhì)較大的改 變，如將長(zhǎng)達(dá)300個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)的較大多肽作為氨基或羧基末端延伸融合到本發(fā)明的具 有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽上。
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表 1保守氨基酸替換堿性 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性 谷氨酸天冬氨酸極性 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲石智氨酸除了 20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，也可用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨 酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)替換本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。也可用有 限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸及非天然氨基酸替換氨基酸殘基。在蛋 白質(zhì)合成后“非天然氨基酸”已經(jīng)被修飾，和/或其在它們的側(cè)鏈上有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸側(cè) 鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可以化學(xué)合成，或優(yōu)選地購(gòu)買得到，包括六氫吡啶羧酸、四氫 噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3_ 二甲基脯氨酸。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行鑒別，如定 點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham 和 Wells，科學(xué)(Science) 244 1081-1085，1989)。 在后一技術(shù)中，在分子的每個(gè)殘基位置處導(dǎo)入單個(gè)丙氨酸突變，檢測(cè)所產(chǎn)生的突變分子的 生物學(xué)活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活性)以鑒別對(duì)分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。也可參 閱，Hilton等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem) 271 :4699_4708，1996。酶或其它生物學(xué)相互作 用的活性位點(diǎn)也可通過(guò)對(duì)用諸如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記等技術(shù)測(cè)定的 結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理分析以及對(duì)推定的接觸位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行突變而確定，參閱，例如，de Vos等， 科學(xué) 255 :306-312，1992 ；Smith 等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 224 :899_904，1992 ； Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett. 309 :59_64，1992。必需氨基酸的身份也可通過(guò)分析與本發(fā)明多肽 相關(guān)的多肽的同源性來(lái)推斷。可用已知的突變、重組和/或改組方法及隨后的相關(guān)篩選方法進(jìn)行多個(gè)氨基酸替 換和檢測(cè)，這些方法例如有Reidhaar-Olson和Saner (科學(xué)241 :53_57，1988)、Bowie和 Sauer(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào) 86 :2152_2156，1989)、W095/17413 或 W095/22625 所公開(kāi)的技術(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些作者公開(kāi)了使多肽中兩個(gè)或多個(gè)位置同時(shí)發(fā)生隨機(jī)化或進(jìn)行不同突 變的重組/改組(W095/17413，W095/22625)、隨后選擇功能多肽、然后將誘變多肽測(cè)序以 確定每個(gè)位置可允許的替換譜的方法。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等， 生物化學(xué) 30 10832-10837，1991 ；Ladner 等，美國(guó)專利號(hào) 5，223，409 ；Huse, WIP0 出版物 WO 92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire 等，基因 46 145，1986 ；Ner 等，DNA 7 127，1988)。上面公開(kāi)的誘變/改組方法可與高通量、自動(dòng)化篩選方法結(jié)合，以測(cè)定宿主細(xì)胞 中克隆的誘變多肽的活性。編碼活性多肽的誘變DNA分子可從宿主細(xì)胞中回收，并用現(xiàn)代 化設(shè)備快速測(cè)序。這些方法可快速確定目的多肽中各個(gè)氨基酸殘基的重要性，并可用于未 知結(jié)構(gòu)的多肽。應(yīng)用以上討論的方法，本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員可鑒定和/或制備出與以上(I)、 (II)或(III)的多肽基本同源并保留野生型蛋白質(zhì)的內(nèi)切-葡聚糖酶活性的多種多肽。本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶除了具有包含催化活性結(jié)構(gòu)域的酶核心，即SEQ ID NO 2的1到約340位外，還可以包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與催化活性 結(jié)構(gòu)域可操作地進(jìn)行連接。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)可以是以上及所附SEQ ID NO 2中描 述的編碼酶的一個(gè)組成部分；或可以是來(lái)自其他來(lái)源的CBD，該CBD導(dǎo)入內(nèi)切-葡聚糖酶中 而生成酶雜合體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”應(yīng)按Peter Tomme等(《不溶性碳水 化合物的BI促P華角軍〉〉(Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates) 一書(shū)中,‘‘纖 維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性”，John N. Saddler和Michael H. Penner (編)，ACS Symposium Series, No. 618，1996)的定義理解。這一定義將120多種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域歸為10個(gè)家 族(I-X)，并證實(shí)在諸如纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖 苷酶、乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶等多種酶中都存在CBD。在藻類如紅藻Porphyra purpurea中也 已找到以非水解性多糖結(jié)合蛋白質(zhì)形式存在的CBD，參閱Tomme等，出處同前。然而，大部 分的CBD來(lái)自纖維素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白質(zhì)的N和C末端或在其內(nèi)部。酶雜 合體是本領(lǐng)域已知的，參閱W090/00609和W095/16782，通過(guò)將如下DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至宿主 細(xì)胞中，其中所述DNA構(gòu)建體含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼DNA的至少一個(gè)片段及與之相 連(通過(guò)或不通過(guò)接頭)的內(nèi)切葡聚糖酶的編碼DNA序列，并培養(yǎng)此宿主細(xì)胞以表達(dá)融合 基因，可制備酶雜合體。酶雜合體可用下式描述CBD-MR-X其中CBD是相應(yīng)于至少纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū) 域;MR是中間區(qū)域(接頭)，可以是鍵或短的連接基團(tuán)，優(yōu)選約2-100個(gè)碳原子長(zhǎng)，更優(yōu)選 2-40個(gè)碳原子長(zhǎng)；或者M(jìn)R優(yōu)選具有約2-100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選2-40個(gè)氨基酸；而X是相應(yīng) 于至少本發(fā)明DNA序列編碼的催化活性結(jié)構(gòu)域的多肽的N-末端或C-末端區(qū)域。類似地，與SEQ ID NO 2的約340到約540位對(duì)應(yīng)的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域亦可用于 與非芽孢桿菌屬種AA349來(lái)源的內(nèi)切-葡聚糖酶以及與其他蛋白質(zhì)形成雜合體?？芍脫Q SEQ ID NO :2第1到約340位的內(nèi)切-葡聚糖酶的其他來(lái)源的內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括來(lái) 自如下來(lái)源的內(nèi)切-葡聚糖酶(a)Bacillus lautus，例如在W09110732中公開(kāi)的Bacillus lautus NCIMB 40250，(b)在 W09117243 中公開(kāi)的 Humicola insolens DSM 1800，(c)在 W09117243 中公開(kāi)的尖鐮孢(Fusarium Oxysporium)DSM2672,以及(d)在 EP0651785 中公 開(kāi)的芽孢桿菌屬種AC13NCIMB 40482。
免疫交叉反應(yīng)性用于測(cè)定免疫交叉反應(yīng)性的多克隆抗體，特別是單特異性多克隆抗體可以利用純 化的纖維素水解酶制備。更具體地說(shuō)，可以參照N. Axel sen等，定量免疫電泳指南(A manual of Quantitative Immunoelec trophoresis), Blackwell 科學(xué)出版社，1973,第 23 章；或 A. Johnstone 和 R. Thorpe,實(shí)用免疫化學(xué)(Immunochemistry in Practice), Blackwell 科學(xué)出版社，1982 (具體是27-31頁(yè))所述的方法，通過(guò)免疫兔子(或其它嚙齒類動(dòng)物)，得到 針對(duì)本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的抗血清。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過(guò)鹽沉 ((NH4) 2S04)，然后透析并在如DEAE-S印hadex上進(jìn)行離子交換層析而得到。蛋白質(zhì)的免疫化 學(xué)鑒定可以利用Ouchterlony雙向擴(kuò)散分析(0. Ouchterlony，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology) (D. M. Weir 編)，Blackwell 科學(xué)出版社，1967，655-706 頁(yè))、 火箭免疫電泳或交叉免疫電泳(N.Axelsen等，《定量免疫電泳指南》，Blackwell科學(xué)出版 社，1973，第2、3和4章)進(jìn)行。微生物來(lái)源對(duì)于本發(fā)明，此處應(yīng)用的與特定的來(lái)源相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”或“可獲得自”，意指 該酶由或可以由此特定來(lái)源或已插入了來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。目前預(yù)期本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶可從屬于芽孢桿菌屬菌株的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 中獲得，所述細(xì)菌特別是芽孢桿菌屬種AA349的菌株。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶獲得自芽孢桿菌屬種AA349菌株 DSM 12648。目前預(yù)期編碼與本發(fā)明的酶同源的酶的DNA序列可獲得自屬于芽孢桿菌屬的 其它菌株。本發(fā)明內(nèi)切-葡聚糖酶所克隆自的芽孢桿菌屬種AA349菌株已進(jìn)行了保藏，保藏 號(hào)為 DSM 12648。DNA構(gòu)建體本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于將本發(fā)明的多核苷酸整合到宿主細(xì)胞基因組中的DNA 構(gòu)建體。此構(gòu)建體必需包含兩翼存在兩段多核苷酸序列，即第一和第二 DNA序列的本發(fā)明 多核苷酸，其中所述側(cè)翼序列各必須包含至少一段與宿主細(xì)胞基因組中的區(qū)域充分同源的 亞序列以便實(shí)現(xiàn)有效重組。重組表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作 的任何載體。載體的選擇常取決于它將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載 體，即作為染色體外實(shí)體而存在、復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制的載體，如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以 是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，將會(huì)部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中并 與其所整合的染色體一起復(fù)制。所述載體優(yōu)選為這樣的表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地與該 DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段相連接。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體來(lái)自質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩 者的元件。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指將諸片段以使其能按它們的預(yù)期目的協(xié)同發(fā)揮功能的 方式排列，如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中弓丨發(fā)并持續(xù)通過(guò)編碼該酶的DNA序列。啟動(dòng)子可以是任何在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可以來(lái) 自編碼宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。
適用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子的例子包括以下基因的啟動(dòng)子嗜熱脂肪芽孢 桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) a -淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) a -淀粉 酶基因、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或\噬菌體的？！^或!^啟動(dòng)子或大腸桿菌的l^、im或M啟動(dòng) 子。如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接到適當(dāng)?shù)慕K止子上。本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述載體還可包含可選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因，或編碼 如對(duì)抗生素像卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等的抗性或?qū)χ亟饘倩虺輨?的抗性的基因。為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào) 序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。可以將分泌信號(hào)序列在正確閱讀框中連接到 編碼該酶的DNA序列上。分泌信號(hào)序列一般位于編碼此酶的DNA序列的5’端。所述分泌 信號(hào)序列可以是通常與該酶相關(guān)的序列或可以來(lái)自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選地終止子和/或分泌信 號(hào)序列，或通過(guò)適宜的PCR擴(kuò)增方案組裝這些序列和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信 息的適宜載體中的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的(參見(jiàn)例如，Sambrook等人， (1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY)。宿主細(xì)胞導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的克隆DNA分子可以與所討論的宿主同源或異源。如果與所述 宿主細(xì)胞同源，即由該宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，則該DNA序列一般可操作地與非其天然環(huán)境中 存在的另一啟動(dòng)子序列相連接，或者適當(dāng)時(shí)與另一分泌信號(hào)序列和/或終止序列相連接。 術(shù)語(yǔ)“同源的”旨在包括編碼天然存在于所討論的宿主生物體中的酶的DNA序列。術(shù)語(yǔ)“異 源的”旨在包括所述宿主細(xì)胞天然不表達(dá)的DNA序列。因此所述DNA序列可以來(lái)源于另一 生物體或者可以是合成的序列。能導(dǎo)入本發(fā)明的克隆DNA分子或重組載體的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生所期 望酶的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。通過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌，如芽孢桿菌菌株，尤其是嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(B. brevis)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)、遲緩芽 孢桿菌(B. lentus)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)、 凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、巨大芽孢桿菌(B. megatherium)、嗜熱脂肪芽孢 桿菌(B. stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和蘇云金芽孢桿菌 (B. thuringiensis)，乳桿菌屬(lactobacillus)菌株，鏈球菌屬(Streptococcus)菌 株，鏈霉菌(Str印tomyces)菌株，尤其是變鉛青鏈霉菌(S. lividans)和鼠灰鏈霉菌 (S. murinus)；或者該宿主細(xì)胞可以是革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(Echerichia coli)菌 株。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)本身已知的方式用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或使用感受
15態(tài)細(xì)胞進(jìn)行(參見(jiàn)Sambrook等人，(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, NY)。當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)酶時(shí)，該酶可以典型地以不溶性顆粒(稱作包函體) 形式駐留于細(xì)胞質(zhì)中，或可以由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞裂 解，回收所述顆粒，變性，其后通過(guò)稀釋變性劑使酶重新折疊。后一種情況下，該酶可以通過(guò) 以下操作從周質(zhì)間隙中回收利用如超聲或滲透壓休克破壞細(xì)胞，使所述的周質(zhì)間隙的內(nèi) 容物釋放，再回收該酶。當(dāng)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達(dá)該酶時(shí)，該酶可以駐留 于細(xì)胞質(zhì)中，或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。通過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例是如曲霉屬(Aspergillus) 或鐮孢霉屬(Fusarium)菌株，尤其是泡盛曲霉(A. awamori)、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)、黑曲 霉(A. niger)、米曲霉(A. oryzae)和尖鐮孢(F. oxysporum)，和木霉菌屬(Trichoderm)菌 株，優(yōu)選哈茨木霉(T. harzianum)、里氏木霉(T. reesei)和綠色木霉(T. viride)。真菌細(xì)胞可通過(guò)以下過(guò)程轉(zhuǎn)化，所述過(guò)程涉及以實(shí)質(zhì)上已知的方式進(jìn)行原生質(zhì) 體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及隨后的細(xì)胞壁再生。曲霉屬菌株作為宿主細(xì)胞的用途可見(jiàn)于 EP238, 023 (Novozymes A/S)，其內(nèi)容在此一并引用作為參考。通過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的酵母來(lái)源宿主細(xì)胞的實(shí)例是如漢遜酵母屬 菌株(Hansenula sp.)；克魯維酵母屬菌株(Kluyveromyces sp.)，尤其是乳酸克魯 維酵母(K. lactis)和馬克斯克魯維酵母(K. marcianus)；畢赤酵母屬菌株(Pichia sp)；酵母屬菌株(Saccharomyces)，尤其是卡爾酵母(S. carlsbergensis)、釀酒酵母 (S. cerevisae)、克魯弗酵母(S. kluyveri)和葡萄汁酵母(S. uvarum)；裂殖酵母屬菌 株(Schizosaccharomyces sp.)，尤其是栗酒裂殖酵母(S. pombe)；和耶氏酵母屬菌株 (Yarrowia sp.)，尤其是解脂耶氏酵母(Y. lipolytics)。通過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的植物來(lái)源宿主細(xì)胞的實(shí)例是如來(lái)自馬鈴薯 (Solanum tuberosum)或煙草(Nicotiana tabacum)的植物細(xì)胞。生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的方法本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)已 轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收得到的酶。如本文中的定義，分離的多肽(如酶)是基本不含有其它多肽的多肽，如按 SDS-PAGE測(cè)定，至少約20%純，優(yōu)選至少約40%純，更優(yōu)選約60%純，甚至更優(yōu)選約80% 純，最優(yōu)選約90%純，再最優(yōu)選高于95%的純度。術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”也可稱為“純化的多肽”。當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時(shí)，就有可能異 源重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶。由此，有可能制備出高純化的或單組分的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶組合物，其特征 在于不含同源雜質(zhì)。本文中，同源雜質(zhì)是指來(lái)源于最初獲得本發(fā)明的酶的同源細(xì)胞的任何雜質(zhì)(例如 除本發(fā)明的酶之外的其它多肽)。本發(fā)明中，同源宿主細(xì)胞可以是芽孢桿菌屬種AA349菌株。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于所討論的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的 常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的纖維素水解酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中，然后可以通過(guò)眾所周知的 方法回收，所述方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，再利用鹽如硫酸銨沉淀培 養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接下來(lái)進(jìn)行層析，如離子交換層析、親和層析等。酶組合物在再一方面，本發(fā)明涉及包含如上所述的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的酶組合 物。本發(fā)明的酶組合物除了包含本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶之外，還可以包含一或多種其 它類型的酶，例如半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶、其它纖維素酶或內(nèi)切-0-1，4_葡 聚糖酶成分、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、角質(zhì)酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶(過(guò)氧化 物酶、鹵素過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、氧化酶、漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、還原酶、酚氧化 酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、 鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠裂解酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或它們 的混合物。酶組合物可以依照本領(lǐng)域已知的方法制備，可以是液態(tài)或干燥組合物。例如，該酶 組合物可以是粒狀或微粒狀。包含在組合物中的酶可以用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)穩(wěn)定化。內(nèi)切葡聚糖酶在許多的工業(yè)和應(yīng)用領(lǐng)域具有潛在的用途。如下給出的例子是本發(fā) 明的酶組合物的優(yōu)選用途。基于本領(lǐng)域的已知技術(shù)，本發(fā)明的酶組合物的用量和使用該組 合物的其它條件可以被確定。應(yīng)用生物質(zhì)降解根據(jù)本發(fā)明的酶或酶組合物可有利地用于例如以下的多種用途-用于去皮，S卩，在用機(jī)械鼓去皮前用可部分降解富含果膠的形成層的水解酶前處 理，以利于能量節(jié)約。-用于脫纖維(精練或開(kāi)棉)，即在精練或開(kāi)棉前用水解酶處理含纖維素纖維的材 料，這樣會(huì)由于此酶在纖維表面的水解效應(yīng)而導(dǎo)致能量消耗減少。-用于修飾纖維，即在需要跨纖維壁部分水解(這要求更深層滲入的酶)的情況下 改進(jìn)纖維的特性(例如以便使粗糙纖維更具柔性)。-用于濾水造紙紙漿的濾水能力可通過(guò)用水解酶處理紙漿而得到提高。應(yīng)用本 發(fā)明酶或酶組合物可能更為有效，例如可導(dǎo)致更高程度地松散細(xì)小部分中的強(qiáng)水合微纖維 束——正是此微纖維束可通過(guò)在纖維間以及在造紙機(jī)器的絲網(wǎng)中阻塞空洞而限制濾水速度。木質(zhì)纖維紙菜的處理可根據(jù)例如在W0 93/08275、W0 91/02839和W092/03608中 所描述的進(jìn)行。洗衣本發(fā)明的酶或酶組合物可用于進(jìn)行紡織品和衣物的家庭或工業(yè)洗滌的去污劑組 合物中，以及用于機(jī)洗織物的過(guò)程中，所述過(guò)程包括在機(jī)洗過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)洗滌循環(huán)中 用含有本發(fā)明的酶或酶組合物的洗滌溶液處理織物。通常，用于洗滌過(guò)程的去污劑組合物包含常規(guī)成分，例如表面活性劑(陰離子、非離子、兩性離子、兩性的)、助洗劑、漂白劑(過(guò)硼酸鹽、過(guò)碳酸鹽或過(guò)氧化氫)以及其他成 分，例如在W0 97/01629中所描述的，該文獻(xiàn)在此全部引用作為參考。本發(fā)明的內(nèi)切-0-1，4_葡聚糖酶具有多種優(yōu)點(diǎn)，如改進(jìn)的污物清除以及減少的 污垢再沉積。某些污物，例如某些食品污物含有葡聚糖，這使得完全去除污物非常困 難。此外，織物的纖維素纖維也可能具有(特別是在“非結(jié)晶”和表面區(qū)域)能被該酶降解 的葡聚糖多聚體。對(duì)此葡聚糖的水解，無(wú)論是在污物中還是在織物上，均可以在洗 滌過(guò)程中減少污垢與織物的結(jié)合。家庭洗衣過(guò)程可在一系列條件下進(jìn)行。通常，洗滌時(shí)間從5分鐘到60分鐘且洗滌 溫度為15-60°C之間，最通常地在20-40°C之間。洗滌溶液通常為中性或堿性，最常用的pH 為7-10. 5。通常應(yīng)用漂白劑，特別是對(duì)于白色織物的洗滌。這些漂白劑一般為過(guò)氧化物漂 白劑，例如過(guò)硼酸鈉、過(guò)碳酸鈉或過(guò)氧化氫。紡織應(yīng)用在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶在織物整理工序中的應(yīng) 用，所述整理如生物拋光。生物拋光為紗線表面的特殊處理，該處理改進(jìn)織物的手感和外觀 而不損失織物的可濕性。生物拋光的最重要效果可描述為減少起毛和起球、增加光澤/光 亮、改進(jìn)織物手感、增加耐久柔軟度以及改變吸水性。生物拋光通常在針織和機(jī)織織物生產(chǎn) 過(guò)程的濕處理中進(jìn)行。濕處理包括步驟，如退漿、煮煉、漂白、洗滌、染色/印花和整理。在 這些步驟的每一步中，織物或多或少要受到機(jī)械作用。通常，在紡織原料進(jìn)行針織或機(jī)織過(guò) 后，織物進(jìn)入任選的退漿階段，之后進(jìn)入煮煉階段，等。退漿為將漿料從織物上移除的作用。 在機(jī)械織機(jī)上織造之前，經(jīng)紗常用淀粉或淀粉衍生物組成的漿料包被，以增加其抗張強(qiáng)度。 織造后，在織物進(jìn)一步處理前必須除去漿料包衣以確保得到均一性和耐洗性。在煮煉過(guò)程 中雜質(zhì)從織物中去除。本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶可有利地用于纖維素和棉紡織品以及韌皮 纖維的煮煉，并可提高雜質(zhì)去除的效率。對(duì)纖維素紡織品進(jìn)行耐久壓燙的最常采用的方法之一是應(yīng)用纖維素交聯(lián)化學(xué)進(jìn) 行整理。交聯(lián)使纖維素在分子水平上固定并實(shí)質(zhì)上降低纖維素衣物的收縮和起皺。用本發(fā) 明的內(nèi)切_葡聚糖酶對(duì)經(jīng)耐久壓燙處理的纖維素織物進(jìn)行處理可導(dǎo)致受壓區(qū)域的選擇性 松弛以最大限度降低邊緣磨損。此外，本發(fā)明的內(nèi)切_葡聚糖酶可用于有效地將多余的印 花過(guò)程中應(yīng)用的基于羧甲基纖維素的印花漿從織物和設(shè)備上除去。已知為達(dá)到生物拋光的效果，需聯(lián)合纖維素水解作用和機(jī)械作用。此外，還已知當(dāng) 將纖維素酶處理和常規(guī)柔軟劑處理聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可取得“超柔軟”的效果。預(yù)期將本發(fā)明的 內(nèi)切-葡聚糖酶和該酶與其他酶的聯(lián)合用于纖維素制品(天然及加工的纖維素制品、織物、 衣服、紗線和纖維)的生物拋光是有利的，例如可取得更徹底的拋光效果。據(jù)認(rèn)為，通過(guò)應(yīng) 用例如在W0 93/20278中描述的方法可實(shí)現(xiàn)生物拋光。可進(jìn)一步考慮將本發(fā)明的內(nèi)切葡聚 糖酶應(yīng)用到同時(shí)或順序的織物濕處理(包括退漿、煮煉、漂白、生物拋光、染色和整理的不 同組合)中。石洗已知在染色的織物(特別是粗斜紋棉布或勞動(dòng)布)上的“石洗”外觀(顏色的區(qū) 域性磨損)，可通過(guò)在浮石存在的條件下洗滌由此織物制成的粗斜紋棉布或勞動(dòng)布以獲得 所需的織物顏色的區(qū)域性減輕來(lái)實(shí)現(xiàn)，或可通過(guò)用酶處理織物，特別是用纖維素水解酶處理織物來(lái)實(shí)現(xiàn)。用本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶處理，不論單獨(dú)地或是聯(lián)合其他酶，均可單獨(dú)實(shí) 施(如在US 4，832，864中所公開(kāi)的)，或與較傳統(tǒng)方法中所需量少的浮石聯(lián)合實(shí)施，或與 在W095/09225中所公開(kāi)的珍珠巖聯(lián)合實(shí)施。用本發(fā)明的內(nèi)切-葡聚糖酶處理粗斜紋棉布 織物與傳統(tǒng)方法相比可減少返沾色(back-staining)。材料和方法菌株和供體生物上述芽孢桿菌屬種DSM 12648包含SEQ ID NO 1所示編碼內(nèi)切-0 _1，4_葡聚糖 酶的DNA序列?？莶菅挎邨U菌PL2306 該菌株是具有被破壞的apr和npr基因的枯草芽孢桿 菌 DN 1885(Diderichsen, B. , ffedsted, U. , Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , Sj 4 holm, C. (1990)，編碼來(lái)自于短芽孢桿菌的胞外酶a-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆，細(xì)菌雜 志(J. Bacteriol.)，172，4315-4321)，這種破壞發(fā)生于已知枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的 轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素酶陰性細(xì)胞?；旧先鏓ds.A.L. Sonenshein，J. A. Hoch和 Richard Losick((1993)枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Bacillus substillis and other Gram-PositiveBacteria)，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)，p. 618)所述進(jìn)行這種基因破壞。按Yasbin，R. E.，Wilson, G. A.和 Young，F(xiàn). E. ((1975)枯草芽孢桿菌溶原 性菌株的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染選擇性誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞中的原噬菌體的證據(jù)，細(xì)菌學(xué)雜志， (J. Bacteriol.) 121 :296_304)所述的方法制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。常規(guī)分子生物學(xué)方法除非另作說(shuō)明，所有的DNA操作和轉(zhuǎn)化都采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(Sambrook 等.(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，(Molecular cloning :A laboratorymanual)冷泉港實(shí) 驗(yàn)室，冷泉港，NY ；Ausubel, F. M.等.(編)“最新分子生物學(xué)手冊(cè)” (Current Botocots in Molecular Biology). John Wiley and Sons,1995 ；Harwood, C. R., 禾口 Cutting, S. M.(編)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法”(MolecularBiological Methods for Bacillus). John Wiley 和 Sons,1990)。用于DNA操作的酶按制造商說(shuō)明書(shū)使用(如可從New England Biolabs，Inc獲得 限制性內(nèi)切酶、連接酶等)。質(zhì)粒pM0L944 該質(zhì)粒是pUBllO的衍生物，基本上包含使該質(zhì)粒能在枯草芽孢桿菌內(nèi) 增殖的元件和卡那霉素抗性基因，并具有克隆自地衣芽孢桿菌ATCC14580的amyL基因的強(qiáng) 啟動(dòng)子和信號(hào)肽。該信號(hào)肽包含一個(gè)SacII位點(diǎn)，這使得可以方便地對(duì)編碼蛋白質(zhì)成熟部 分的DNA進(jìn)行克隆使其與信號(hào)肽融合。這就導(dǎo)致前蛋白的表達(dá)，該蛋白質(zhì)將被引導(dǎo)到細(xì)胞 外部。該質(zhì)粒用普通的基因工程方法構(gòu)建而成，簡(jiǎn)述如下。PM0L944 的構(gòu)建用單限制性內(nèi)切酶Neil消化pUBllO質(zhì)粒(McKenzie，T等，1986，質(zhì)粒 (Plasmid) 15 :93_103)。將擴(kuò)增自質(zhì)粒 pDN1981 (P. L. Jorgensen 等 ，1990，基因，96， P37-41.)上之a(chǎn)myL啟動(dòng)子的PCR片段用Neil消化，并插入Neil消化的pUBllO中，產(chǎn)生質(zhì) 粒 PSJ2624。
所用的兩個(gè)PCR引物具有如下序列#LWN5494(SEQ ID NO 3)5 ‘ -GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3‘#LWN5495(SEQ ID NO 4)5 ‘ -GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3‘引物#LWN5494向質(zhì)粒中插入一個(gè)NotI位點(diǎn)。質(zhì)粒pSJ2624隨后用SacI和NotI消化，且用SacI和NotI消化擴(kuò)增自pDN1981 上的amyL啟動(dòng)子的新PCR片段，將該DNA片段插入SacI-NotI消化的pSJ2624，從而產(chǎn)生質(zhì) 粒 PSJ2670。該克隆將第一次克隆的amyL啟動(dòng)子替換為方向相反的同一啟動(dòng)子。用于PCR擴(kuò) 增的兩個(gè)引物具有如下序列#LWN5938(SEQ ID NO 5)-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3‘#LWN5939(SEQ ID NO 6)-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3‘質(zhì)粒pSJ2670用限制性內(nèi)切酶PstI和Bell消化，將擴(kuò)增自編碼堿性淀粉酶 SP772 (專利#W09526397-A1)的克隆DNA序列的PCR片段用PstI和Bell消化后插入上述 質(zhì)粒，從而產(chǎn)生質(zhì)粒PM0L944。用于PCR擴(kuò)增的兩個(gè)引物具有如下序列#LWN7864(SEQ ID NO 7) -AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3‘#LWN7901(SEQ ID NO 8)5 ~-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3‘引物#LWN7901向質(zhì)粒中插入一個(gè)Sac II位點(diǎn)?；蚪MDNA制備菌株DSM 12648在含羧甲基纖維素+(0. 1M Na2C03+0. 1M NaHC03，分別高壓滅 菌并在冷卻到室溫后在無(wú)菌條件下加入)的2xTY液體培養(yǎng)基中增殖。30°C以300rpm孵育 16 小時(shí)后，收獲細(xì)胞，按 Pitcher 等[Pitcher, D. G.，Saunders, N. A.，Owen, R. J ；用硫氰酸 胍快速抽提細(xì)菌基因組DNA ；應(yīng)用微生物學(xué)通訊(Lett Appl Microbiol) 1989，8 151-156] 的方法分離基因組DNA。培養(yǎng)基TY(如Ausubel，F(xiàn).M.等.(編.)"最新分子生物學(xué)手冊(cè)"(Current Protocolsin Molecular Biology). John Wiley 禾口 Sons，1995 中所述)。2xTY (如 Ausubel，F(xiàn).M.等.(編.)"最新分子生物學(xué)手冊(cè)".John Wiley 和 Sons， 1995中所述)。LB瓊脂(如Ausubel, F. M.等 (編 )“最新分子生物學(xué)手冊(cè)" John Wiley和 Sons, 1995 中所述)。LBPG是補(bǔ)充有0. 5%葡萄糖和0. 05M磷酸鉀，pH7. 0的LB瓊脂。
AZCL-HE-纖維素被加入LBPG-瓊脂中至0. 5 % AZCL-HE-纖維素，其來(lái)自 Megazyme (澳大禾丨J亞)。BPX 培養(yǎng)基描述于 EP 0 506 780 (W0 91/09129)中。Cal 18-2培養(yǎng)基在專利申請(qǐng)WO 00/75344A1中描述。內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶活性的測(cè)定ECU 方法ECU方法中測(cè)定酶樣本減小羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力，且結(jié)果以ECU給 出。粘度的減小與內(nèi)切-纖維素酶活性成正比。條件7LFD型CMC來(lái)自Hercules，于0. 1M 磷酸鹽緩沖液中，PH 7.5《1 濃度為每升反應(yīng)物31.18;在401反應(yīng)30分鐘。用振動(dòng)粘度 計(jì)測(cè)定粘度，所述粘度計(jì)如MIVI 3000, Sofraser,法國(guó)。Cellazyme C 方法Cellazyme C為內(nèi)切-葡聚糖酶試驗(yàn)底物，以片劑形式由Megazymelnternational Ireland Ltd提供。參見(jiàn)Megazyme小冊(cè)子CZC 7/99，其中描述有“此底物通過(guò)染色和交聯(lián) HE-纖維素以產(chǎn)生可在水中水合但不溶于水的材料來(lái)制備。由內(nèi)切-0 -1，4-葡聚糖酶水解 可產(chǎn)生水溶性染色片段，并且其釋放速率(在590nm處的吸光度增加)可與酶活性直接相
關(guān)。，，。酶樣本加入到試管中的6ml適宜的緩沖液中，加入一片Cellazyme C并通過(guò)振蕩 試管分散藥片，然后試管置40°C水浴中。在約15、30、45和60分鐘后短暫振蕩以混勻內(nèi)容 物。60分鐘后，溶液用9cm直徑的Whatman GF/C濾紙過(guò)濾。測(cè)定濾過(guò)液在590nm處的吸光度。以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明。實(shí)施例1克隆和表達(dá)芽孢桿菌屬種的內(nèi)切-1，4_葡聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中亞克隆和表達(dá)成熟內(nèi)切葡聚糖酶用以下兩個(gè)寡核苷酸組成的PCR引物組對(duì)本發(fā)明的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列 做PCR擴(kuò)增#168684 (SEQ ID NO 9)5' -CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA GAA GGA AAC ACT CGT GAA GAC—3’#168685 (SEQ ID NO: 10)5' -GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAC TCT TCT TTC TCT TCT TTC TC-3’限制性位點(diǎn)Sac II和Not I加有下劃線。上述寡核苷酸用于PCR反應(yīng)，該反應(yīng)于補(bǔ)充有dNTP各200iiM、2.6單位的H iFidelity Expand 酶混合物及引物各 200pmol 的 H iFidelity PCR 緩沖液(Boehringer Mannheim，德國(guó))中進(jìn)行。將上述分離自芽孢桿菌種DSM12648的染色體DNA作為模板。用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。94°C溫育1分鐘進(jìn)行1個(gè)循 環(huán)；然后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C變性15秒，60°C退火60秒，72°C延伸120秒；然 后進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C變性15秒，60°C退火60秒及72°C延伸120秒(在此延 伸步驟，每個(gè)循環(huán)增加20秒)。在0.7%瓊脂糖凝膠(Nusieve,FMC)上電泳分析5iU擴(kuò)增 產(chǎn)物試樣。大小為2. 4kb的DNA片段的出現(xiàn)表明基因片段得到正確擴(kuò)增。
亞克降PCR片段用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，USA)按制造商說(shuō)明書(shū)純化上述產(chǎn)生的PCR 產(chǎn)物的45 u 1等分試樣。純化的DNA洗脫于50 u l、pH8. 5的10mMTris-HCl中。用Sac II和 Not I消化5ii g pM0L944和25iil純化的PCR片段，在0. 7%瓊脂糖凝膠(Nusieve，F(xiàn)MC)上 電泳，將相關(guān)片段從膠上切下，按制造商說(shuō)明書(shū)用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，USA) 進(jìn)行純化。隨后將分離的PCR DNA片段連接到經(jīng)Sac II-Not I消化并純化的pM0L944上。 用每種DNA片段各0. 5 ii g、1U T4DNA連接酶和T4連接酶緩沖液(BoehringerMannheim，德 國(guó))16°C過(guò)夜完成連接。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌PL2306。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于含10 u g/ ml卡那霉素的LBPG瓊脂平板上。37°C溫育18小時(shí)后，菌落出現(xiàn)于平板上。通過(guò)從過(guò)夜肉 湯培養(yǎng)液分離質(zhì)粒DNA，分析幾個(gè)克隆。一個(gè)這樣的陽(yáng)性克隆重劃線幾次于如上所用的瓊脂平板上；該克隆被稱為 MB1181-7。將MB1181-7克隆在含10 y g/ml卡那霉素的TY中37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天用 Qiaprep Spin質(zhì)粒小量制備試劑盒#27106，按制造商為枯草芽孢桿菌質(zhì)粒制備推薦的方 法，從1ml細(xì)胞中分離質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序并揭示和SEQ ID NO 1的l_2322bp中編碼 成熟內(nèi)切葡聚糖酶的內(nèi)切葡聚糖酶基因相同的DNA序列。衍生的蛋白質(zhì)序列顯示在SEQ ID NO :2 中。實(shí)施例2表達(dá)和回收芽孢桿菌屬種DSM 12648的內(nèi)切-葡聚糖酶將按實(shí)施例1所述獲得的MB1181-7培養(yǎng)在含10 y g/ml卡那霉素的15x200ml Cal-18-2培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)在500ml帶雙檔板的搖瓶中進(jìn)行，37 °C 300rpm培養(yǎng)4天后， 獲得約2500ml的培養(yǎng)物。通過(guò)加入50%的CaCl2 (每升培養(yǎng)液加入10ml)以及11%的鋁 酸鈉(每升培養(yǎng)液加入10ml)，并加入20%的甲酸將pH維持在7. 0和7. 5之間，使培養(yǎng)液 絮凝。在攪拌的過(guò)程中加入陽(yáng)離子試劑Superfloc C521 (每升培養(yǎng)液加入25ml的10% v/ v稀釋液)和陰離子試劑Superfloc A130 (每升培養(yǎng)液加入75ml的在水中的0.稀 釋液)，以完成絮凝。應(yīng)用Sorval RC 3B離心機(jī)在6°C于lOOOOrpm離心30分鐘分離絮凝 物。得到的上清中含有內(nèi)切-葡聚糖酶活性。應(yīng)用Whatman玻璃濾紙GF/D和C使上清澄清。然后超濾以濃縮并減小溶液的離 子強(qiáng)度。超濾膜為具有l(wèi)OkDa截?cái)嘀档腇iltron UF。超濾后溶液的電導(dǎo)率< 3mS/cm。將 pH值調(diào)整到8.0。然后用Q-S印harose陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化。將來(lái)自超濾的溶液加 載到含 Q-S印harose (Pharmacia)的 300ml 柱子上，所述 Q-Sepharose 柱已用 25mmol 的 Tris(pH 8. 0)進(jìn)行過(guò)平衡。內(nèi)切-葡聚糖酶與Q-S印harose結(jié)合，然后用0. 5M的NaCl梯 度洗脫。合并具有高內(nèi)切-葡聚糖酶活性的級(jí)分。最終的合并內(nèi)切-葡聚糖酶溶液的內(nèi) 切_葡聚糖酶活性為大約每毫升1000ECU。實(shí)施例3本發(fā)明內(nèi)切_葡聚糖酶的表征將來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切_葡聚糖酶樣本加載到大小層析柱上，所述層析柱為以 0. 1M乙酸鈉緩沖液(pH 6. 0)平衡的100ml的Superdex 200柱。內(nèi)切-葡聚糖酶洗脫為單
22峰。該純化的酶溶液用于進(jìn)一步的表征，見(jiàn)如下。從大小層析純化中獲得的酶在SDS-PAGE中在對(duì)應(yīng)于約70到80kDa分子量的位置 處給出單一條帶，估計(jì)為73kDa。純化的內(nèi)切-葡聚糖酶的等電點(diǎn)為約4. 2。測(cè)定了 N端的序列。結(jié)果如下XEGNTRE(SEQ ID NO: 11)X是注射物(injection)，并可能如基于DNA序列的序列中存在的為A。這樣該N 端序列確與SEQ ID NO 2的N端序列一致。用摩爾消光系數(shù)145800 (基于從序列推導(dǎo)的氨基酸組成)測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。應(yīng)用常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生針對(duì)此純化酶的兔多克隆單特異血清。血清在瓊脂糖凝膠中與 本發(fā)明的內(nèi)切_葡聚糖酶形成單一沉淀物。實(shí)施例440°C條件下在含去污劑和漂白劑的溶液中的穩(wěn)定性在以下的條件下評(píng)估了來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切_葡聚糖酶的穩(wěn)定性。制備了帶有漂白劑的粉末去污劑的溶液。此粉末去污劑為IEC-A去污劑，由wfk Testgewebe GmbH，D_41379 (德國(guó))提供。該去污劑為IEC 60456洗衣機(jī)參考基礎(chǔ)去污劑， 類型A。漂白劑為IEC 60456四水合過(guò)硼酸鈉，類型SPB，也由wfk Testgewebe提供。濃度粉末去污劑，IEC-A 每升4. 0g四水合過(guò)硼酸鈉每升1. 0g重碳酸鈉每升0. 5g水硬度15° dH(通過(guò)加入氯化鈣和氯化鎂溶液)溶液 pH:10. 0將5ml此去污劑溶液的等分試樣轉(zhuǎn)移到試管中，且在40°C水浴中預(yù)熱10分鐘。用水稀釋來(lái)自實(shí)施例2的樣本，制備活性為2. 4E⑶/ml的酶溶液。將100 u 1的酶稀釋液加入到每一預(yù)熱試管中并混勻。溶液在40°C保持規(guī)定的時(shí) 間，然后在冰水中快速冷卻，然后冷凍保存。室溫下將0、50、100、150iil的相同酶溶液加入到5ml的去污劑溶液樣本中，然后
冷卻并冷凍以制備參考樣本。然后測(cè)定熱處理樣本及參考樣本中的活性。融解溶液，然后加入lmlpH9. 5的緩沖 液(參見(jiàn)以下)，使總體積達(dá)到6ml。用Cellazyme C片劑方法測(cè)定活性，所述測(cè)定按以上 材料和方法部分中所描述的進(jìn)行。通過(guò)將a)和b)混合以達(dá)到pH9. 5來(lái)制備pH 9. 5的緩沖液a) 0. 25M 的磷酸鹽緩沖液 pH7. 0 (用 NaH2P04. H20 和 NaOH 制備)，含 5. 0g/l 的 Berol 537 (來(lái)自Akzo Nobel的非離子表面活性劑)b)0. 25M的碳酸鈉，含5. 0g/l的Berol 537 (來(lái)自Akzo Nobel的非離子表面活性 劑)熱處理樣本中的活性表示為在非熱處理的標(biāo)準(zhǔn)品中存在的活性的百分比。結(jié)果如 下40 °C的時(shí)間，分鐘 ％活性
0991596309245916090在此含漂白劑的去污劑溶液中40°C條件下一小時(shí)后僅損失約10%的活性。實(shí)施例550°C條件下在含漂白劑的堿性溶液中的穩(wěn)定性在以下條件下評(píng)估了實(shí)施例2中獲得的內(nèi)切_葡聚糖酶的穩(wěn)定性。制備過(guò)硼酸鈉漂白劑(過(guò)硼酸鈉四水合物，類型SPB，來(lái)自wfkTestgewebe)的溶 液。濃度為過(guò)硼酸鈉四水合物每升1. 25g甘氨酸緩沖液，pH 9 0. 1M將5ml該溶液試樣轉(zhuǎn)移到試管中，并將其在水浴中50°C預(yù)熱10分鐘。通過(guò)用水稀釋來(lái)自實(shí)施例2的樣本，制備活性為2. 5E⑶/ml的酶溶液。將1001的酶稀釋液加入到每一預(yù)熱的試管中，并混勻溶液。溶液在50°C保持規(guī)定 的時(shí)間，然后在冰水中冷卻，并冷凍保存。室溫條件下將0、50、100、150iil的相同酶溶液加入到5ml的漂白溶液樣本中，然
后冷卻并冷凍以制備參考樣本。測(cè)定熱處理樣本和參考樣本的活性，所述測(cè)定按照實(shí)施例4中的相同方法進(jìn)行。熱處理樣本中的活性表示為在非熱處理的標(biāo)準(zhǔn)品中存在的活性的百分比。結(jié)果如 下50 °C的時(shí)間，分鐘％ 活性01011576306945536044在此堿性漂白劑溶液中50°C條件下30分鐘后損失不到50%的活性。實(shí)施例6鐵(II)離子抑制作用的試驗(yàn)用如下方法評(píng)估鐵(II)離子對(duì)來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切-葡聚糖酶的失活作用。A在0. 1M的甘氨酸緩沖液(pH9)中溶解FeS04. 7H20 (Merck, p. a.)制備ImM的硫 酸鐵(II)溶液。用a) 0. 1M的甘氨酸緩沖液，和b)含ImM Fe (II)的0. 1M甘氨酸緩沖液稀釋來(lái)自 實(shí)施例2的樣本制備兩種其計(jì)算活性為2. 6ECU/ml的酶溶液。然后將0、50、100、150iil的來(lái)自這兩種溶液的樣本在6ml的緩沖液(5ml水加1ml 實(shí)施例4中描述的pH 9. 5的緩沖液)中稀釋，并用Cellazyme C片劑方法測(cè)定活性。在甘氨酸緩沖液中制備的樣本和在加有FeS04. 7H20的甘氨酸緩沖液中制備的相應(yīng)樣本之間沒(méi)有顯著的活性差異。用ImM的鐵(II)離子處理不能滅活酶。實(shí)施例7洗滌性能試驗(yàn)該試驗(yàn)證明在實(shí)施例2中獲得的內(nèi)切葡聚糖酶的去污和抗再沉積效果。此外，該 試驗(yàn)證明當(dāng)包括過(guò)硼酸鈉漂白劑時(shí)，酶的性能基本不發(fā)生改變。棉布樣本用葡聚糖(來(lái)自大麥)和炭黑染污。污染的樣本和清潔樣本一同洗 滌。洗滌后樣本漂洗并干燥。污染樣本上的污物去除和清潔樣本上的污物再沉積通過(guò)反射 率測(cè)量進(jìn)行測(cè)定。比較洗滌后加入和不加入內(nèi)切-葡聚糖酶的情況下的污物去除和污物再 沉積。樣本剪自型號(hào)#2003的100%棉織品(Tanigashira，Osaka,日本)，在40°C預(yù)洗 滌以預(yù)防性去除任何水溶性污染物，大小5x5cm，重約0. 3g。洗滌設(shè)備攪拌的燒杯，燒杯體積250ml，用水浴加熱控制溫度。此設(shè)備為多燒杯 微型帶攪拌器的洗衣機(jī)。去污劑溶液通過(guò)將以下試劑加入到去離子水中制備碳酸鈉，每升0. 5g重碳酸鈉，每升0. 7gCa2+/Mg2+，使水的硬度達(dá)到12° dH陽(yáng)離子表面活性劑，Surfac SDBS80 (烷基苯磺酸鈉)，每升0. 5g非離子表面活性劑Berol 537 (Akzo Nobel)，每升1. 0g過(guò)硼酸鈉，型號(hào)SPB，來(lái)自wfk Testgewebe，每升0或1. 0g溶液的pH為約9. 5。洗滌方法每一燒杯中加入100ml去污劑溶液。水浴溫度為40°C。機(jī)械攪拌器以 約125rpm運(yùn)轉(zhuǎn)。去污劑溶液預(yù)熱10分鐘，然后加入內(nèi)切-葡聚糖酶和樣本。在每一情況 下，三塊污染樣本(如以下描述制備)和三塊清潔樣本加入到每一燒杯中。洗滌30分鐘后， 從去污劑溶液中取出樣本，在自來(lái)水的流水下漂洗5分鐘，展平放在吸水紙上并晾干。反射率測(cè)定應(yīng)用Macbeth 7000Color Eye反射分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于污染 樣本，每一樣本在污染區(qū)域的中央進(jìn)行一次測(cè)定，然后計(jì)算平均值。對(duì)于清潔樣本，每一樣 本在每一面進(jìn)行一次測(cè)定，然后計(jì)算平均值。反射率測(cè)定均在500nm處進(jìn)行。污染樣本用葡聚糖(來(lái)自大麥)和炭黑(“用于去污試驗(yàn)的炭”，由Sentaku Kagaku Kyokai, Tokyo,日本提供)制備污染樣本。通過(guò)攪拌和加熱至> 50°C在100ml的 自來(lái)水中溶解約0. 67g的0 -葡聚糖。用UltraTurrax T25攪拌器以4000rpm速度攪拌2 分鐘。將250iU的葡聚糖/炭加到每一樣本的中央。室溫過(guò)夜干燥。用于該實(shí)施例的樣本在污染前的平均反射值為93. 5，而污染后為17. 5。內(nèi)切-葡聚糖酶的加入加入來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切-葡聚糖酶，以使每升去污劑溶 液中的活性濃度為0、20或100ECU。結(jié)果無(wú)漂白劑的去污劑(洗滌后反射率測(cè)量的平均值)加入的內(nèi)切-葡聚糖酶 污染樣本 清潔樣本025. 133. 5
每升20ECU35. 746. 7每升100ECU40. 259. 1結(jié)果帶漂白劑的去污劑(洗滌后反射率測(cè)量的平均值)加入的內(nèi)切-葡聚糖酶 污染樣本 清潔樣本024. 627. 7每升20ECU36.852.6每升100ECU39. 363. 2與不用內(nèi)切-葡聚糖酶洗滌的結(jié)果相比，內(nèi)切_葡聚糖酶洗滌后污染樣本的反射 值增加，這說(shuō)明內(nèi)切-葡聚糖酶增加了污物從織物上的去除。此外，內(nèi)切-葡聚糖酶可降低 污物的再沉積，這可由內(nèi)切_葡聚糖酶洗滌后清潔樣本的反射值增加所證實(shí)。內(nèi)切_葡聚 糖酶對(duì)污物去除和抗再沉積作用的改進(jìn)在加入漂白劑后基本未發(fā)生變化。實(shí)施例8洗滌性能試驗(yàn)在家用去污劑的溶液中將清潔棉織物與污染的棉織物一同洗滌。洗滌在 Terg-0-Tometer中進(jìn)行。在洗滌過(guò)程中，污物從污染織物上釋放到去污劑液體中。該污物 可再沉積到清潔棉布上。洗滌后，漂洗并晾干這些棉織物，然后用反射分光光度計(jì)測(cè)量以檢 測(cè)污物再沉積的程度。去污劑家用粉末去污劑，亞洲。去污劑濃度0. 67g/l的水溶液，硬度4° dH。每個(gè)T-0-T燒杯中有1000ml的去污劑溶液。棉織物每個(gè)T-0-T燒杯中共33g織物，包含適宜大小的白色機(jī)織棉布，#2003(Tanigashira，Osaka,日本)，總重量為llg白色棉毛布，總重量為13g污染的棉織物，型號(hào)EMPA101 (EMPA，瑞士)，總重量為9g。洗滌溫度25°C，洗滌時(shí)間40分鐘，轉(zhuǎn)速125rpm。洗滌后，#2003棉布在自來(lái)水下 流水漂洗10分鐘，然后晾干。反射率測(cè)定。用Macbeth 7000反射分光光度計(jì)在500nm處測(cè)定#2003機(jī)織棉布
的每一面。計(jì)算來(lái)自每一個(gè)T-0-M燒杯的測(cè)量值的平均結(jié)果。酶的加入在此試驗(yàn)中將如實(shí)施例2中描述所制備的內(nèi)切_葡聚糖酶在洗滌步驟 開(kāi)始前加入到去污劑液體中。結(jié)果加入的內(nèi)切-葡聚糖酶#2003的反射值每升的ECU在500nm處076.67
076.05
181.86
584.30
2084.85
5085.99
從結(jié)果中可得出結(jié)論，本發(fā)明內(nèi)切_葡聚糖酶的加入可減少污物的再沉積。實(shí)施例9內(nèi)切-葡聚糖酶活性的pH和溫度函數(shù)應(yīng)用40°C的反應(yīng)溫度在一系列pH值范圍內(nèi)測(cè)定了來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切-葡聚糖 酶的活性。首先用水稀釋酶以使溶液的活性為約0. 07E⑶/ml。在試管中將750 u 1的CMC溶液(Hercules，類型7LFD，濃度為2% w/w，溶解于水 中)和1000 iil的緩沖溶液混合，并預(yù)熱到40°C。應(yīng)用的緩沖液如以下所描述。然后加入 250 ill的0. 07E⑶/ml酶溶液并在40°C孵育混合物20分鐘。然后加入1000 u 1的PHBAH 試劑(以下描述)，并將試管置沸水中加熱10分鐘。最后在冰水中冷卻溶液并應(yīng)用分光光 度計(jì)在410nm處測(cè)定吸光度。從中減去在加入酶溶液之前通過(guò)加入PHBAH試劑測(cè)定的空白 吸光度值。PHBAH試劑按以下制備在100ml的2% w/w氫氧化鈉水溶液中溶解1. 5g的羥苯 甲酰胼和5. 0g的酒石酸鉀鈉。
應(yīng)用以下的緩沖液。在所有情況中緩沖液的濃度均為0. 1M。
乙酸鹽緩沖液，PH4. 0,4. 5、5. 0、5. 5。
MES緩沖液，pH 6. 0 (MES為2_[N_嗎啉代]乙磺酸)
MOPS緩沖液，pH 6. 5、7. 0,7. 5 (MOPS為3_[N_嗎啉代]丙磺酸)
巴比妥酸鹽緩沖液，PH8. 0,8. 5
甘氨酸緩沖液，PH9. 0,9. 5、10. 0,10. 5
410nm處的吸光度(減去空白值)為酶活性的測(cè)量值。
結(jié)果如下
孵育期間PH值(測(cè)量) 吸光度，410nm(減去空白) 4. 20. 0
4.60. 0
5.10. 1
5.70. 2
6.10. 3
6.50. 4
7.10. 6
7.50. 8
8.10. 9
8.51. 0
9.20. 9
9.61. 0
10.0 1. 0 10. 50.9
結(jié)果顯示在堿性pH條件下酶具有最大的活性。在從8. 1到10.5的pH范圍內(nèi)酶
具有約90%或更高的最大活性。
應(yīng)用10.0的反應(yīng)pH在一系列溫度下測(cè)定來(lái)自實(shí)施例2的內(nèi)切-葡聚糖酶的活性。首先用水稀釋酶以使溶液的活性為約0. 07E⑶/ml。在試管中混合750 u 1的CMC溶液(Hercules，類型7LFD，濃度2 % w/w，溶于水 中)和10001的0. 1M甘氨酸緩沖液(pH10. 0)，并將其預(yù)熱到規(guī)定溫度。然后加入250 u 1 的0. 07E⑶/ml酶溶液并在規(guī)定溫度下孵育混合物20分鐘。然后加入10001的PHBAH試劑 (以上描述)，并將試管置沸水中加熱10分鐘。最后在冰水中冷卻溶液并用分光光度計(jì)在 410nm處測(cè)量吸光度。從中減去在加入酶溶液之前通過(guò)加入PHBAH試劑測(cè)定的空白吸光度 值。410nm處的吸光度(減去空白值)為酶活性的測(cè)量值。結(jié)果如下
孵育溫度，°c吸光度，」
200.26
300.52
400.78
500.82
600.23
70< 0. 05酶在20到60°C的溫度下具有高活性，在約40-50°C溫度下具有最高活性。實(shí)施例10在連續(xù)式設(shè)備中應(yīng)用本發(fā)明的內(nèi)切_葡聚糖酶進(jìn)行生物拋光。使用的織物為針織織物460 (Test Fabrics Inc.)，其為100%棉的漂白棉毛布?？?物剪成20x30厘米的條，每條重約12. 5g。在65士2%相對(duì)濕度和21 士2°C (70士3° F)溫 度下放置至少24小時(shí)后測(cè)定每一樣本的重量。將實(shí)施例2中獲得的本發(fā)明內(nèi)切-葡聚糖酶在15mM磷酸鈉中進(jìn)行配制。試驗(yàn)在 多種酶濃度和不同的PH條件下進(jìn)行。樣本接觸酶溶液不足45秒，然后通過(guò)墊浸軋(pad)，之后稱重并立即懸掛在 Math is steam range (PSA-HTF 型)(Werner Math is USA Inc. Concord, NC)中。測(cè)定溶 液在織物上的百分比(％吸濕率(wet pick-up)以及內(nèi)切-葡聚糖酶活性與織物的比 率。在90°C和100%相對(duì)濕度條件下處理織物樣本90分鐘。然后轉(zhuǎn)移所有樣本并在去離 子水中漂洗至少5分鐘，之后空氣干燥。最后，在評(píng)價(jià)前將樣本置于65士2%相對(duì)濕度和 21 士2°C (70士3° F)溫度下至少24小時(shí)。根據(jù)ASTM D3786-87 用于針織品和非織造織物的水壓爆破強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方 法_隔膜爆破強(qiáng)度測(cè)試儀方法，在C型Mullen Burst測(cè)試儀上測(cè)量織物強(qiáng)力，并且確定強(qiáng) 力損失。根據(jù)ASTM D 4970-89:用于紡織織物的抗起球性和其他相關(guān)表面改變的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn) 方法，測(cè)量起球情況。500轉(zhuǎn)以后，肉眼評(píng)價(jià)織物表面的起球情況，所述評(píng)價(jià)相對(duì)1到5標(biāo)準(zhǔn) 級(jí)進(jìn)行，其中1表示為非常嚴(yán)重的起球而5表示沒(méi)有起球。實(shí)施例11在連續(xù)式設(shè)備中應(yīng)用本發(fā)明的內(nèi)切_葡聚糖酶進(jìn)行生物拋光。生物拋光基本如實(shí)施例10中所描述的進(jìn)行，區(qū)別之處在于緩沖液由9. 53g的十水合四硼酸鈉溶解在2. 5升去離子水中組成，且調(diào)整其pH至9. 2。如實(shí)施例10中描述浸軋樣本并進(jìn)行處理?？椢镂鼭衤蕿?4%。在pH 9. 2,90V以及相對(duì)濕度100%的條件下處理織物90分鐘。漂洗、干燥、評(píng)估 的方法與在實(shí)施例10中的相同。實(shí)施例12聯(lián)合處理進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)以評(píng)估實(shí)施例2中獲得的內(nèi)切-葡聚糖酶在煮煉和生物拋光聯(lián)合 中的效果。使用的織物為Fabric 4600，其為未煮練和未漂白的100%棉織物。織物制備以及 緩沖液與如以上實(shí)施例11中描述的相同。本體(Bulk)溶液包含(a)如以上實(shí)施例2中描述的于緩沖液中的實(shí)施例2的內(nèi) 切_葡聚糖酶，濃度為6. 12CMCU/ml以及4. 9CMCU/g織物；以及(b)熱穩(wěn)定果膠酸裂解酶， 濃度為1. 93mV-m0l/ml/min。按實(shí)施例10中所述浸軋樣本并進(jìn)行處理?？椢锏奈鼭衤蕿?80%。處理?xiàng)l件為pH 9. 2、90°C、相對(duì)濕度(RH) 100%，并且處理90分鐘。漂洗、干燥、評(píng)估方法與以上在實(shí)施例10中所描述的相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)AATCC(美國(guó)紡織化學(xué)和染色學(xué)學(xué)會(huì)(American Association ofTextile Chemists and Colorists))試驗(yàn)方法79-1995 “漂白織物的吸光度”，評(píng)估吸水速度。從1 厘米高的滴管中滴一滴水到拉緊的織物樣本表面。水在織物表面消失的時(shí)間記作吸水時(shí) 間。實(shí)施例13粗斜紋棉布磨損(abrasion)以下的實(shí)施例舉例說(shuō)明實(shí)施例2中獲得的本發(fā)明內(nèi)切_葡聚糖酶在粗斜紋棉布牛 仔服裝或其他衣物的處理中以及在具有均一局部顏色變化(粗斜紋棉布磨損)的粗斜紋棉 布衣物的生產(chǎn)中的用途。磨損是指由于纖維素酶處理和機(jī)械作用的聯(lián)合效果導(dǎo)致的經(jīng)紗染 色的粗斜紋棉布的褪色。產(chǎn)生的效果是織物外觀與用浮石獲得的石洗粗斜紋棉布的外觀類 似。在以下條件下進(jìn)行洗滌試驗(yàn)_藍(lán)粗斜紋棉布DAKOTA，141/2盎司(oz)，100%棉。裁剪并縫制粗斜紋棉布成約 37. 5xl00cm(每個(gè)約 375g)的“褲腿”。^淀粉酶AQUAZYM ULTRA 1200L(來(lái)自 Novozymes A/S)本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶。粗斜紋棉布的磨損方法設(shè)備TonelloG130 洗滌 / 染色 / 石洗機(jī)器(Tonello S. r. 1.，Via dellaFisica, 1/3，Sarcedo (VI)-意大利)?？椢镙d量8kg的粗斜紋棉布〃褲腿〃。退漿步驟0. 2 % AQUAZYM ULTRA (織物重量的% )0. 05% Tergitol 15_S_9 (織物重量的％ )
lOmin75°CLR(浴比)10 1洗滌步驟3min，60°C，LR15 1磨損步驟10ECU內(nèi)切葡聚糖酶/g粗斜紋棉布60min50°CLR 8 1失活步驟2%碳酸鈉(織物重量的％ )80°C20minLR 10 1洗滌步驟2X3min，LR15 1提取步驟在110g' s進(jìn)行5min轉(zhuǎn)籠干燥粗斜紋棉布樣本。在評(píng)估前在20°C、65%相對(duì)濕度條件下處理樣本24小 時(shí)。測(cè)試/分析耜斜紋棉布磨損和返沾代測(cè)定粗斜紋棉布樣本的反射值以確定磨損和返沾色的水平。粗斜紋棉布磨損用平 均L*評(píng)定(較高的L*對(duì)應(yīng)于較大的磨損)，且返沾色用平均b*評(píng)定(更負(fù)的b*，S卩“更藍(lán)”， 與更高的返沾色對(duì)應(yīng))，測(cè)定使用HunterLab LabscanXE分光光度計(jì)(Hunter Associates Laboratory, Inc.，Reston, VA 20190 USA)進(jìn)行。粗斜紋棉布磨損和返沾餼的視覺(jué)評(píng)估粗斜紋棉布評(píng)估領(lǐng)域內(nèi)的5名技術(shù)人員被要求對(duì)這些粗斜紋棉布褲腿進(jìn)行視覺(jué) 評(píng)分，并按等級(jí)1 (低效)到5 (高效)分級(jí)。重量損失在處理前和處理后稱重樣本以測(cè)定重量損失。撕破強(qiáng)度應(yīng)用Elmendorf撕破測(cè)試儀測(cè)定粗斜紋棉布樣本的撕破強(qiáng)度，所述測(cè)試根據(jù)ASTM D 1424-83 “通過(guò)落錘式織物撕破強(qiáng)力測(cè)試儀(Elmndorf)用于機(jī)織織物抗撕裂性的標(biāo)準(zhǔn)試 驗(yàn)方法”進(jìn)行。
30
權(quán)利要求
根據(jù)酶命名法分類為EC 3.2.1.4的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶，且所述酶選自下列之一(a)SEQ ID NO1的第1到2322位DNA序列編碼的多肽；(b)由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞表達(dá)SEQ ID NO1的序列而產(chǎn)生的多肽，所述培養(yǎng)在允許該酶得以產(chǎn)生的條件下進(jìn)行；(c)SEQ ID NO2中第1到773位氨基酸序列的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶；(d)由(a)、(b)或(c)通過(guò)取代、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的多肽，其中所述多肽保持內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性。(e)與SEQ ID NO2中第1到773位氨基酸序列有至少98.5％的序列同一性的多肽，其中所述同一性通過(guò)GCG程序包中提供的GAP進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用的GAP創(chuàng)建罰分為3.0且GAP延伸罰分為0.1。
2.根據(jù)酶命名法分類為EC3.2. 1.4的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶，且所述酶為 由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸為SEQ ID NO :1第1到2322位中顯示的核苷酸序 列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的酶，該酶包含芽孢桿菌屬種DSM12648的內(nèi)源多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任何一項(xiàng)的酶，所述酶在至少5.5-10. 5的pH范圍內(nèi)具有活性。
5.編碼權(quán)利要求1的內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸分子。
6.權(quán)利要求5的分離的多核苷酸分子，其編碼SEQID NO :2中第1到773位所示的酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸為DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6的分離的多核苷酸分子，其是從原核生物分離的或是基于原核 生物的DNA文庫(kù)產(chǎn)生的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的多核苷酸分子，其是從芽孢桿菌屬的菌株分離的或是基于 芽孢桿菌屬的菌株的DNA文庫(kù)產(chǎn)生的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的分離的多核苷酸分子，其是從芽孢桿菌屬菌種DSM12648分離的 或是基于芽孢桿菌屬菌種DSM 12648的DNA文庫(kù)產(chǎn)生的。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求5到10任何一項(xiàng)的多核苷酸分子的多核苷酸構(gòu)建體。
12.包含以下可操作連接的元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；選自以下的DNA片段(a)編碼內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽且序列為SEQ ID N0:1第1到2322位核苷酸中所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)由SEQ ID NO :2中 的第1到773位氨基酸殘基通過(guò)取代、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的編碼內(nèi) 切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸分子；和(c) (a)或(b)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；以及轉(zhuǎn)錄終止子。
13.已經(jīng)導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求12的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中該細(xì)胞表達(dá)由所述DNA片 段編碼的多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，該細(xì)胞為原核細(xì)胞，或者是編碼內(nèi)切-β-1，4-匍聚糖酶 活性的多肽的DNA片段所來(lái)源的內(nèi)源細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于地衣芽孢桿菌菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于假單胞菌屬菌株。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于鏈霉菌菌株。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于酵母菌株。
20.產(chǎn)生具有內(nèi)切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)已經(jīng)導(dǎo)入 根據(jù)權(quán)利要求12的表達(dá)載體的細(xì)胞，由此該細(xì)胞表達(dá)所述DNA片段編碼的多肽；以及回收 該多肽。
21.包含根據(jù)權(quán)利要求1的酶的酶組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其還包含一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素 酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質(zhì) 酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、 木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠裂解酶、其它甘 露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；或它們的混合物。
23.包含內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的分離酶的酶組合物，其中該酶(i)不含同源雜 質(zhì)，和(ii)由根據(jù)權(quán)利要求20的方法產(chǎn)生。
24.用于降解含纖維素的生物質(zhì)的方法，其中所述生物質(zhì)用根據(jù)權(quán)利要求1到4和23 之任一項(xiàng)的酶或根據(jù)權(quán)利要求21或22的酶組合物的有效量進(jìn)行處理。
25.包含根據(jù)權(quán)利要求1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶的組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶在去污劑組合物中的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求1到4之任一項(xiàng)的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶在織物整理工序中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，更具體地涉及具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的酶在去污劑和紡織應(yīng)用中的用途，所述酶選自以下之一a)由SEQ ID NO1中第1到2322位DNA序列編碼的多肽；b)通過(guò)培養(yǎng)包含SEQ ID NO1序列的細(xì)胞而產(chǎn)生的多肽，所述培養(yǎng)在該DNA序列得以表達(dá)的條件下進(jìn)行；c)具有如下序列的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，該序列與SEQID NO2第1到773位氨基酸序列和其具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的片段有至少97％同一性；和d)具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽由與SEQ ID NO1第1到2322位中所示核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101864406SQ20101016724
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2002年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月6日
發(fā)明者H·烏特魯普, K·吉布森, M·B·埃斯凱林德, M·許萊因 申請(qǐng)人:諾維信公司