專利名稱：：Dna序列在造紙或紡織領域中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及多肽
技術領域：
，具體涉及一條DNA序列在造紙或紡織領域中的應用。
背景技術：
：漆酶(Iaccase)是一類含銅的多酚氧化酶，作為一種具有重要應用潛力的工業(yè)酶制劑，漆酶能催化不同類型的底物達250多種，而且催化效率很高。漆酶在環(huán)境保護、造紙工業(yè)、食品工業(yè)和新能源開發(fā)等諸多領域具有廣泛的應用價值。漆酶可用于生物修復和生物漂白，它可以降解應用于染料、顏料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑和殺菌劑中的氯酚類化合物和苯胺取代物，減輕環(huán)境污染。在制漿造紙工業(yè)，尤其是紙漿生物漂白方面漆酶可以脫除紙漿中的木素、改善紙漿的可漂性并提高紙漿白度。近幾年，漆酶的新功能和新用途不斷被發(fā)現(xiàn)和拓展，從而使漆酶具有更高的研究價值和更廣闊的應用前景。漆酶廣泛分布于真菌和高等植物中，由于植物漆酶的檢測和純化比較困難，因此目前在工業(yè)中應用的漆酶主要來自真菌。最近，人們發(fā)現(xiàn)漆酶也廣泛分布于細菌中，與目前在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用的真菌漆酶相比，細菌漆酶更容易實現(xiàn)高效表達，而且生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝更成熟。此外，由于大部分真菌漆酶的最適PH都是酸性或中性的，因此不適用于造紙、紡織等堿性工業(yè)環(huán)境。而細菌漆酶中不但已發(fā)現(xiàn)了一些具有堿性最適PH值的漆酶，而且這些漆酶通常比真菌漆酶具有更高的熱穩(wěn)定性。因此細菌漆酶的研究和開發(fā)目前已成為國際上漆酶研究的一個新的熱點。盡管細菌漆酶與真菌漆酶相比具有眾多的優(yōu)勢，但由于其研究起步較晚，目前國際上已經(jīng)報道的細菌漆酶并不多，而且其中僅有幾種細菌漆酶已被純化和進行了酶學特性的研究。因此目前迫切需要從自然界中發(fā)現(xiàn)更多新的、具有工業(yè)應用潛力的細菌漆酶，尤其是適于造紙、紡織等行業(yè)應用的堿性細菌漆酶。宏基因組學是指直接提取環(huán)境中所有微生物的基因組DNA，將其克隆到合適的載體，構建宏基因組文庫，將環(huán)境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的酶、抗生素、活性物質等。宏基因組技術完全不依賴于環(huán)境中微生物的分離和培養(yǎng)，為從不同自然生境中的未培養(yǎng)微生物中尋找新的基因資源和活性物質提供了有力的技術手段。應用宏基因組策略已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多具有新的酶學特性和新的用途的酶制劑，因此宏基因組技術的誕生也為發(fā)現(xiàn)具有新的酶學特性和工業(yè)應用潛力的細菌漆酶提供了可能。然而迄今國內尚未有利用宏基因組技術發(fā)現(xiàn)新的細菌漆酶的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種來自于宏基因組的DNA序列在造紙或紡織領域中的應用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明人從廣東省深圳市的紅樹林土壤樣品所構建的宏基因組文庫中得到一條新的DNA序列，并將該序列提交GenBank，其登錄號為GQ468313，接著本發(fā)明人采用基因工程技術對該DNA序列進行功能研究，結果發(fā)現(xiàn)該DNA序列所表達的重組蛋白具有堿性漆酶的酶學特點，而且該重組蛋白還具有高可溶性表達的特點，因此可應用于造紙或紡織領域中。本發(fā)明的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，該DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明人將SEQIDNO:1所示DNA序列先克隆到原核表達載體上，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過對陽性轉化子的誘導表達得到重組蛋白。對該重組蛋白進行了酶學性質研究，結果如下(1)該重組蛋白在大腸桿菌中具有高可溶性表達的特點。在大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行誘導表達時(30°C，OD600=2.4)，重組蛋白表達量最高可達380!^/1，而且重組蛋白高度可溶，無包涵體形成；(2)該重組蛋白對幾種經(jīng)典的漆酶底物均具有較強的活性。對漆酶底物2，6-DMP(2，6-二甲氧基苯酚)的酶活為12.73U/mg，對漆酶底物α-萘酚的酶活為5.43U/mg，對漆酶底物兒茶酚的酶活為7.35U/mg，對漆酶底物愈創(chuàng)木酚的酶活為1.02U/mg，對漆酶底物SGZ(丁香醛連氮)的酶活為0.5川/11^，對漆酶底物4815[2，2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)，2，2，-連氮基-雙_(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]的酶活為0.15U/mg；(3)該重組蛋白的分子量約為75kDa；(4)該重組蛋白在對前述幾種漆酶底物進行酶解反應時，其最適反應pH均為堿性(7.49.0)，且在pH7.010.0的范圍內保持穩(wěn)定酶活，其酶活為最大酶活的80%以上；(5)該重組蛋白在對前述漆酶底物愈創(chuàng)木酚進行酶解反應時，其最適溫度為55°C，且在50°C以下能夠保持穩(wěn)定酶活；(6)該重組蛋白在對前述漆酶底物愈創(chuàng)木酚進行酶解反應時，IOOmMCa2+可使酶活增加到原來的2倍，而IOOmMCo2+、Zn2+、Fe2+、Ni+、Al3+可完全抑制重組蛋白的活性；(7)該重組蛋白在對前述幾種漆酶底物進行酶解反應時，酶的最適底物依次是2，6-DMP>兒茶酚>α-萘酚>愈創(chuàng)木酚>SGZ>ABTS。通過上述研究結果可以看出，SEQIDNO1所示DNA序列所表達的重組蛋白具有堿性漆酶的酶活，同時該DNA序列還具有在原核表達系統(tǒng)中高可溶性表達的特性，因此能夠作為新的酶源應用于造紙或紡織等多種需要堿性漆酶的領域中。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果；本發(fā)明人首先通過宏基因組學技術，從土壤宏基因組中得到新的尚未有功能研究的DNA序列，然后對該DNA序列所編碼蛋白的結構和功能進行了研究分析，結果發(fā)現(xiàn)該DNA序列表達的重組蛋白具有較好的堿性漆酶活性，而且該DNA序列還具有在原核表達系統(tǒng)中高可溶性表達的特點，其表達產(chǎn)物可作為一種新的酶源用于造紙或紡織等需要堿性漆酶的領域中，并具有廣闊的工業(yè)應用前景。圖1為實施例3中的SDS-PAGE電泳其中，M為標準蛋白分子量標記，1為重組蛋白粗提物，2為純化后的重組蛋白；圖2為重組蛋白降解漆酶底物愈創(chuàng)木酚的最適pH值及pH穩(wěn)定性研究結果折線圖；其中，1為最適pH值的折線圖，2為pH穩(wěn)定性的折線圖；圖3為重組蛋白降解漆酶底物愈創(chuàng)木酚的最適溫度及溫度穩(wěn)定性研究結果折線圖；其中，1為溫度穩(wěn)定性的折線圖，2為最適溫度的折線圖。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1土壤樣品中宏基因組DNA的獲得土壤樣品采集自廣東省深圳市紅樹林。稱取5g土壤樣品，加入離心管中，與13.5mlDNA提取液(含有IOOmMTris-HCl、IOOmMEDTAUOOmM磷酸鈉、1.5MNaCl和1%CTAB，pH8.0)混合后，再加入100μL蛋白酶K(10mg/ml)，于37°C、225rpm的搖床上搖動溫育30min，接著加入1.5ml20%SDS,65°C水浴2h，每隔1520min輕輕顛倒離心管幾下，室溫6000g離心lOmin，收集上清，轉移到新的離心管中，然后土壤沉淀中再加入4.5ml前述DNA提取液和0.5ml20%的SDS，渦旋10s，65°C水浴lOmin，室溫6000g離心IOmin后，收集上清并與上次上清合并。重復上述操作，收集上清與前兩次上清合并。將合并后的上清與氯仿-異戊醇(Vlwν.Λι=241)按照等體積比混合，離心，吸取水相轉移至另一離心管中。以0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀Ih后，室溫16000g離心20min。收集核酸沉淀，用冷的70%乙醇洗滌沉淀，重懸于滅菌的去離子水中，最終獲得體積為500μL的土壤樣品宏基因組DNA。實施例2土壤宏基因組文庫的構建和DNA序列的獲得用Sau3AI部分酶切實施例1所提取的土壤宏基因組DNA，并電泳回收2.57.5kb的酶切片段。將回收到的DNA片段與經(jīng)BamHI酶切和CIAP酶去磷酸化處理的pUC118載體(TaKaRa公司)連接，電擊轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，并涂布含有100μg/ml氨芐青霉素、40μg/mlX-Gal和0.5mMIPTG的LB固體平板，由此構建了一個庫容量達8000個轉化子、多樣性好的宏基因組文庫。然后平板上的每個克隆被隨機挑取并分別轉接到一個含有10mlLB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加入了100μg/ml的氨芐青霉素和ImMIPTG)的100ml三角瓶中，37°C過夜培養(yǎng)。取2ml上述培養(yǎng)液于5000rpm離心1分鐘以收獲菌體，菌體中加入200μ1溶解液(50mMTris-HCl.pH7.5,1%TritonX-100和lmg/ml溶菌酶)裂解細胞，然后加入終濃度為ImM的guaiacol，挑選紅褐色的克隆子，將該克隆子送交測序，測序結果表明克隆子中含有一條1503個堿基組成的全長的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，該DNA序列編碼500個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0:3所示。將SEQIDNO1所示DNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號為GQ468313。實施例3DNA序列表達的重組蛋白的獲得將實施例2篩選到的紅褐色克隆子接種于50mlLB培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素ΙΟΟμg/ml)，37°C，250rpm搖床培養(yǎng)1216小時，提取質粒。設計引物Pl和P2，引物兩端分別引入能插入表達載體pET32a(+)的EcoRI和HindIII酶切位點。引物Pl的核苷酸序列如SEQIDNO4所示引物P2的核苷酸序列如SEQIDNO5所示以提取的質粒為模板，采用引物Pl和P2進行PCR擴增。PCR擴增體系總體積為50μ1，含滅菌蒸餾水32μ1、5XPCRBuffer(Mg2+已力口)10yl、dNTPMixture4μ1(每種堿基各2.5mM)、兩種引物各1μ1(10μΜ)、模板DNA1μ1(Ing)利TaKaRaPrimeSTARHSDNAPolymerase1μ1(2.5U)。PCR擴增條件98°C10秒鐘，68°C2分鐘，反應30個循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物約1.5kb左右，采用常規(guī)方法回收目的片段，雙酶切后連接入pET32a(+)質粒中，繼而轉化宿主菌Ε.coliBL21(DE3)，轉化液涂布含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)，提取陽性菌落質粒，經(jīng)雙酶切鑒定后，對酶切正確的重組菌進行測序，測序結果證實該重組菌中含有SEQIDNO1所示DNA序列。對含有SEQIDNO1所示DNA序列的重組菌進行誘導表達研究，將該重組菌種接種到三角瓶中，瓶中含有IOmlLB液體培養(yǎng)基(含100yg/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)直至OD600達到0.61.0，然后加入終濃度分別為0.8mM的IPTG和0.ImM的CuSO4,30°C，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)810小時以誘導靶蛋白表達。4°C下6000g離心20min收獲細胞。將細胞沉淀用冷的50mMTris-HClbuffer(pH7.2)洗兩次，然后按照His·BindPurificationKit(NoVagen公司)說明書進行純化操作，最終得到純化的重組蛋白，該重組蛋白即為SEQIDNO1所示DNA序列表達的重組蛋白。將純化操作中的粗液和最終所得純化的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如圖1所示。從圖1可以看出，無論是粗液樣品，還是純化后的樣品，在對應靶蛋白位置處均有一條很粗的蛋白質條帶(箭頭所指處)。由此可見該重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達量非常高，經(jīng)計算，每升培養(yǎng)液最高可獲得380mg純的重組蛋白(0D_=2.4)。與文獻報道的其它細菌漆酶基因相比，本發(fā)明的重組蛋白表達量是最高的。尤其重要的是，本發(fā)明中的重組蛋白都是可溶的，無包涵體形成。這種重組蛋白的高可溶性表達特性非常適于今后利用原核系統(tǒng)進行該蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。^lJMQuantityOnesoftware(BioRadLaboratoriesInc.,Hercules,CA)Wii^SDS-PAGE照片進行分析，對SEQIDNO.1所示DNA序列表達的重組蛋白在總可溶性蛋白中的含量進行分析，結果顯示該重組蛋白在總可溶性蛋白中的含量高達52.7%。綜上所述，本發(fā)明的DNA序列所表達的重組蛋白具有高可溶性表達的特性。實施例4DNA序列表達的重組蛋白的性質研究本實施例選擇了幾種經(jīng)典的漆酶底物(2，6_DMP、兒茶酚、α-萘酚、愈創(chuàng)木酚、SGZ和ABTS)，對實施例3中制備、純化所得的重組蛋白進行了相關的酶學性質研究。將實施例3制備、純化所得重組蛋白分別和幾種典型的漆酶底物進行反應，結果發(fā)現(xiàn)該重組蛋白可有效酶解這幾種底物，其中，對漆酶底物2，6-DMP的酶活為12.73U/mg,對漆酶底物α“萘酚的酶活為5.43U/mg，對漆酶底物兒茶酚的酶活為7.35U/mg，對漆酶底物愈創(chuàng)木酚的酶活為1.02U/mg，對漆酶底物SGZ的酶活為0.51U/mg，對漆酶底物ABTS的酶活為0.15U/mg，根據(jù)該重組蛋白對不同漆酶底物的酶活數(shù)據(jù)，可以看出該重組蛋白的最適底物依次是2，6-DMP>兒茶酚>α-萘酚>愈創(chuàng)木酚>SGZ>ABTS。實施例5重組蛋白的分子量本實施例采用本領域的常規(guī)操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和NativegradientPAGE(非解離梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳)對實施例3中制備純化所得的重組蛋白進行分子量的研究。NativegradientPAGE電泳結果顯示該重組蛋白的分子量約為75KDa，考慮到該重組蛋白的N端帶有一個由156個氨基酸(約ISkDa)組成的融合片段[對應于pET32a(+)載體上的Trx·Tag,His·Tag,S·Tag和一個thrombin切除位點]，因此根據(jù)NativegradientPAGE電泳結果，推斷該重組蛋白不帶融合片段的分子量應該為57KDa，這與我們根據(jù)靶蛋白的氨基酸序列計算的理論分子量57.4kDa是一致的。SDS-PAGE電泳結果顯示該重組蛋白單亞基分子量也大概為75KDa，這表明該重組蛋白為一個單亞基蛋白。實施例6pH值和溫度對重組蛋白活性及穩(wěn)定性的影響通過實施例4的研究結果可以看出，實施例3制備、純化的重組蛋白可有效降解多種漆酶底物，本實施例研究PH值和溫度對該重組蛋白降解漆酶底物時的活性及穩(wěn)定性的影響。漆酶底物采用愈創(chuàng)木酚。最適pH和pH穩(wěn)定性研究中，用伯瑞坦-羅比森緩沖溶液(Britton-Robinsonbuffer)配制反應體系，在pH4.010.0范圍內，pH值每增加0.5為一個梯度，測定重組蛋白在這些PH下的相對活性，檢測結果如圖2所示。研究結果表明，該重組蛋白降解漆酶底物愈創(chuàng)木酚的最適PH為7.5，而在pH10.0時，仍有大約60%的最大活性被保留。此外，該重組蛋白對漆酶底物愈創(chuàng)木酚的降解活性在PH7.010.0范圍內很穩(wěn)定，其降解活性為最大活性的80%以上。由此可以說明實施例3制備、純化所得重組蛋白適于在堿性環(huán)境下對漆酶底物進行高效降解。最適溫度和溫度穩(wěn)定性研究中，用pH7.5的檸檬酸-磷酸緩沖液配制反應體系，在溫度3060°C范圍內，溫度每增加5°C為一個梯度，測定了重組蛋白在這些溫度下的相對活性。檢測結果如圖3所示，該重組蛋白降解漆酶底物愈創(chuàng)木酚的最適溫度是55°C，且該重組蛋白在50°C以下都保持穩(wěn)定的降解活性。本實施例中，重組蛋白對漆酶底物愈創(chuàng)木酚的降解活性的測定方法為在重組蛋白對愈創(chuàng)木酚(ε465nm=12，ΟΟΟΜ"1^1)活性的測定中，標準的分析溫度是55°C，使用的緩沖液是檸檬酸-磷酸緩沖液(pH7.5)，緩沖液中補加了ImMCuSO4,反應開始時愈創(chuàng)木酚的終濃度為10mM。一個活性單位定義為每分鐘氧化Iymol的愈創(chuàng)木酚所需的重組蛋白的量。實施例7部分金屬離子和化合物對重組蛋白降解漆酶底物活性的影響本實施例使用IOmM的愈創(chuàng)木酚為底物，研究不同的金屬離子對實施例3制備、純化所得重組蛋白的降解漆酶底物活性的影響，結果如表1所示。表1金屬離子對重組蛋白降解漆酶底物活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表ι可以看出，這些金屬離子對重組蛋白降解漆酶底物活性的影響截然不同。當加入低濃度(ImM)的金屬離子時，Ca2+和Fe2+明顯增加了重組蛋白降解漆酶底物的活性，而Mn2+、Mg2+、Co2+、Ni+、Na+和K+輕微降低了重組蛋白的降解活性，Zn2+和Al3+則顯著降低了重組蛋白的降解活性。當加入高濃度(IOOmM)的金屬離子時，Ca2+顯著增加了重組蛋白降解漆酶底物活性，使得降解活性達到了原來的兩倍。此外，Mg2+、Na+和K+輕微增加了重組蛋白的降解活性，可是，C02+、Zn2+、Fe2+、Ni+和Al3+的加入則完全抑制了重組蛋白對漆酶底物的降解活性。實施例8重組蛋白降解漆酶底物的動力學參數(shù)和底物專一性研究實施例3制備、純化所得重組蛋白降解幾種漆酶底物(2，6-DMP、兒茶酚、α-萘酚、愈創(chuàng)木酚、SGZ和ABTS)的動力學參數(shù)如表2所示。表2重組Lac591的動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2可以看出，實施例3制備、純化所得重組蛋白對各種漆酶底物的動力學參數(shù)與別的細菌漆酶類似。此外，該重組蛋白對愈創(chuàng)木酚的Km值(1037μΜ)類似于它對α-萘酚的Km值(1419μΜ)，而該重組蛋白對α-萘酚的k。at/Km值(0.025s—1·μΜ-1)是它對愈創(chuàng)木酚的kcat/Km值(0.OlOiT1·μΜ-1)的兩倍比較該重組蛋白對各種漆酶底物的k。at/Km值可發(fā)現(xiàn)，2，6-DMP的值(0.28s-1·μΜ"1)最高，因此2，6-DMP是重組蛋白的最佳底物，而其它的最佳底物根據(jù)其1^乂Km值的大小，依次是兒茶酚>α-萘酚>愈創(chuàng)木酚>SGZ>ABTS。綜上所述，本發(fā)明SEQIDNO=I所示DNA序列所表達的重組蛋白具有堿性漆酶的酶活，而且該DNA序列還具有在原核表達系統(tǒng)中高可溶性表達的特性，因此可用于高效、廉價、大規(guī)模的生產(chǎn)重組堿性漆酶，在造紙、紡織等經(jīng)典漆酶不適宜的行業(yè)中具有重要的應用潛力。權利要求一條DNA序列在造紙或紡織領域中的應用，其特征在于所述DNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.根據(jù)權利要求1所述應用，其特征在于所述DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQIDNO3所示。3.根據(jù)權利要求1所述應用，其特征在于所述應用是將該DNA序列表達的重組蛋白應用于造紙或紡織領域中。4.根據(jù)權利要求3所述應用，其特征在于所述DNA序列表達的重組蛋白是將DNA序列先克隆到原核表達載體上，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過對陽性轉化子的誘導表達制備而得。全文摘要本發(fā)明公開一條DNA序列在造紙或紡織領域中的應用，該DNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO3所示。本發(fā)明人通過宏基因組學技術，從土壤宏基因組中得到新的尚未有功能研究的DNA序列，對該DNA序列所編碼蛋白的結構和功能研究結果表明該DNA序列表達的重組蛋白具有較好的堿性漆酶活性，而且該DNA序列還具有在原核表達系統(tǒng)中高可溶性表達的特點，其表達產(chǎn)物可作為一種新的酶源用于造紙或紡織等需要堿性漆酶的領域中，并具有廣闊的工業(yè)應用前景。文檔編號C12S11/00GK101818160SQ201010136348公開日2010年9月1日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權日2010年3月26日發(fā)明者劉玉煥,李剛申請人:中山大學