專利名稱：甘藍型油菜粒重主效QTLs的分子標記及其應用的制作方法
甘藍型油菜粒重主效QTLs的分子標記及其應用技術領域
本發(fā)明屬于油菜分子育種和生物技術領域，具體涉及甘藍型油菜粒重有關QTL 的發(fā)現(xiàn)和分離，以及有關分子標記的開發(fā)和應用。
背景技術：
甘藍型油菜(Brassica napus L.，以下簡稱油菜)是世界上最重要的油料作物之 一。油菜的種子不僅是油和蛋白質的儲藏器官，同時也是植物生命周期延續(xù)的器官。 種子大小或重量是非常重要的經(jīng)濟性狀。首先粒重是構成植物單株產(chǎn)量的三大因素之 一(單株有效角果數(shù)、每角果粒數(shù)、粒重)，因此也決定著產(chǎn)量(Clarke and Simpson， 1978 ； Butraille et al.，1999 ； Shietal.，2009)；其次，種子大小也與含油量和蛋白質含 量有關系(Morgan et al., 1998 ； Lionneton et al.，2004)；再次，大種子通常在萌發(fā)過程 中有更好的適應性。因此，弄清種子大小或重量形成的遺傳基礎，對油菜產(chǎn)量和品質的 改良十分重要。此外，從進化的角度來看，弄清種子大小的變化也有著非常重要的意 義。
盡管油菜的種子大小非常重要，但目前對其遺傳控制仍缺乏深入的了解。和 其它產(chǎn)量相關性狀相比，粒重的遺傳力較高(Liuet al.，1987 ； Qi et al., 2004 ； Shiet al., 2009)。隨著分子標記技術的發(fā)展，目前也定位了一些油菜粒重的數(shù)量性狀位點 (Quantitative Trait Loci, QTL)。Quijada et al. (2006)利用四個群體的二年二點試驗定位 了三個和粒重有關的QTLs(位于N7，N17和N19)，但在不同群體間沒有相同的QTL存 在；Udall et aU2006)分別在Hua Double Haploid(DH)群體、SYN DH群體和測交群體等 三個不同群體間分別檢測到6個、4個和5個粒重有關的QTLs，只有一個位于N14上的 QTL能在不同群體和不同環(huán)境間穩(wěn)定檢測到；最近，Shi et al.(2009)利用油菜的二個群 體在10個不同環(huán)境下一共檢測到159個粒重QTLs，這些QTLs分布在除了 Cl以外的其 它所有染色體上。
利用模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)，在過去的十多年中利用突變體分 析等手段，對種子大小的分子調控機理進行了研究。Alonson-Blanco et al.，(1999)定 位了 11個和種子大小有關的QTLs，第一次揭示了這個性狀在不同材料間的遺傳復雜 性。最近，對大量突變體的分析，進一步闡明了許多決定種子大小的分子機理。例 如TTG2 (Transparent Testa Glabrous 2)基因突變體，影響種皮中的類黃酮素的積累，通 常會減少粒重(Debeaujon et al., 2000, 2003)。而 AP2 (APETELA2)或者 ARF2 (Auxin Response Factor 2)等轉錄因子的突變可使種子變大(Jofuku et al.，2005 ； Ohto et al., 2005 ； Schruffet al., 2005)。Luo et al. (2005)鑒定了二個小種子突變體 IKU2 (HAIKU2) 和MINI3 (MINISEED3)，并首次提出種子大小遺傳控制的可能代謝途徑。鑒于油菜和擬 南芥非常相近的同源關系，預期可以利用擬南芥的信息，從油菜基因組中獲得有關控制 種子大小的同源基因。
過去的幾年中，利用不同類型的標記構建了多張遺傳連鎖圖譜。但由于缺乏足夠的共線性標記，圖譜的整合目前尚進展緩慢。目前，多個從事蕓薹屬(Brassica)研究的 團體在致力于微衛(wèi)星標記MSRmarker)的開發(fā)。運用SSR標記可使遺傳連鎖圖的構建更 加容易并增強可重復性(Loweet al.，2004 ； Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe等，2002; Chen等.，2009)。但是目前為止，由于SSR標記的數(shù)目仍有限，使得QTL定位研究在 不同群體間的橫向對比還比較困難。
目前在油菜中未見能在不同遺傳背景下穩(wěn)定檢測到的粒重有關的主效QTLs的報 道，對粒重有關基因的克隆和分析的報道也非常少。鑒于粒重性狀的重要性，對油菜中 粒重有關的QTLs的鑒定，以及緊密連鎖分子標記的開發(fā)對促進油菜產(chǎn)量和品質育種是十 分必要的。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供甘藍型油菜粒重主效QTLs及其緊密連鎖的分子標記及用于 甘藍型油菜粒重性狀的選育。本發(fā)明為油菜粒重育種提供新手段，加速油菜粒重性狀改 良進程，提高育種的準確性和選擇效率。
本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的。
a)用甘藍型油菜甲A254(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢 市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO : P200909)與甘 藍型油菜甲A177(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的 中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNO P200908)雜交，得到Fl ；
b)種植步驟a)的F1，從所述的Fl植株的花蕾中通過小孢子培養(yǎng)(余鳳群等， 1997)獲得分離的雙單倍體(DH)系群體；
C)對DH系群體的每一個株系進行分子標記分析，并對每個株系的基因型進行 描述；具體方法分離DH群體每一個系的基因組DNA，采用SSR引物進行PCR擴增， 擴增產(chǎn)物在6% (100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-雙丙烯酰 胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個株系基因型；
d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用步驟C)中得到的每個株系基因 型構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖，遺傳連鎖圖的構建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.， 1992)軟件進行；
e)測定DH群體每個系的成熟種子的千粒重數(shù)值；
f)將DH群體每個株系的千粒重與甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖 和QTL分析，QTL檢測采用QTL Cartographer V2.0 (Wang et al., 2007)軟件中的復合區(qū) 間作圖法(CIM)進行，以2.0為LOD閾值，大于2.0說明存在一個QTL位點，從而確定 和粒重主效QTLs連鎖的SSR分子標記BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID NO 5 和 SEQ IDNO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示；
g)對上述DH群體檢測到的粒重主效QTLs的驗證利用和甲A254、甲A177不 同遺傳背景和來源的大粒材料甲7046和小粒材料甲7005雜交，得到Fl ；由雜種Fl套袋 自花授粉獲得F2代，獲得F2群體；利用和上述DH群體同樣方法檢測粒重QTL;發(fā)現(xiàn) 和在DH群體中檢測到的二個粒重主效QTLs在不同來源和遺傳背景下均能穩(wěn)定存在；
h)利用上述步驟f)的二個QTLs峰值最近的標記即BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫(http://www.brassica_rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源區(qū)段，得到白菜A7上 的二個 BAC KBrB084P16 和 KBrH001J06 ；利用在線軟件 Batchprimer3 設計二對 BAC 特異性SSR標記；根據(jù)序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的引物對進行PCR擴增，分別得到能夠區(qū)分甘藍型油菜大粒種子與小粒種 子的共顯性SSR分子標記，即10509和J0609，所述的分子標記10509和J0609的核苷酸 序列分別如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2以及SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
i)利用分子標記10509、J0609對DH系的基因型進行分析，同時存在10509、 J0609標記基因型和甲A2M帶紋一致的判定為大粒材料；同時存在10509、J0609標記基 因型和甲A177帶紋一致的判定為小粒材料。
在上述方法中，所用分子標記引物對的核苷酸序列如下所示
引物對(1)，編號為10509
正向引物5' -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3‘，
反向引物5' -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3‘。
引物對O)編號為J0609
正向弓丨物5' -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3‘，
反向引物5' -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3‘。
其中，引物對10509是序列表中SEQ IDNO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸 序列，引物對J0609是序列表中SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的積極效果
本發(fā)明的油菜粒重主效QTLs及其位點特異性標記與現(xiàn)有技術報道的不同，運用 這些標記可鑒別甘藍型油菜粒重主效QTLs位點，從而可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進行 選擇的缺點。利用本發(fā)明制備的分子標記可進行甘藍型油菜粒重性狀的分子標記輔助選 擇，其中本發(fā)明設計的兩對引物10509和J0609還可以用于甘藍型油菜粒重性狀的精細定 位和圖位克隆，可以明顯減少育種工作量，縮短育種年限，加快油菜育種的進程。
更詳細的技術方案如《具體實施方式
》所述。


圖1 本發(fā)明的技術流程圖。
圖2:利用引物對10509、J0609在甘藍型油菜甲A2M和甘藍型油菜甲A177及其 Fl的基因組DNA中的擴增結果。10509和J0609引物對的PCR擴增產(chǎn)物是在6% (IOOml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-雙丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠 上電泳分離的圖片。
圖3:不同群體間A7連鎖群上粒重QTL的定位結果。左圖為本發(fā)明涉及的DH 群體的A7遺傳連鎖圖和粒重QTL的定位結果；右圖為Shietal. ^)09)報道的TN群體上 A7遺傳連鎖群上的粒重QTL區(qū)間qSW.A7-2的定位結果。圖中帶下劃線的標記為不同 群體間的共同標記，虛線為不同群體間的共線性關系。
具體實施方式
實施例1 甘藍型油菜中粒重主效QTLs位點特異性分子標記的獲得
(1)甘藍型油菜粒重定位群體甲A254/甲A177的DH群體的構建及田間試驗和 千粒重分析采用以甘藍型油菜甲A254(大粒純系)為母本，甘藍型油菜甲A177(小粒純 系)為父本進行雜交得到Fl，種植F1，從Fl植株上取花蕾進行小孢子培養(yǎng)得到雙單倍體 (DH)分離群體，共得到238個系的DH系，隨機選取190個系用于全基因組的遺傳連鎖 圖的構建和粒重QTL的定位。
將上述得到的DH系和其親本甲A254/甲A177及F1，于2007-2008年度和 2008-2009年度種植到田間，田間試驗采取完全隨機區(qū)組設計，三次重復，每一個系種二 行，每行11-12個單株，株距平均Mcm左右，行間距30cm。所有材料種植于武漢華中 農(nóng)業(yè)大學油菜試驗田，為冬油菜種植環(huán)境。田間管理按一般育種大田管理。
每年5月份從田間收割回成熟的試驗材料，從自由授粉的單株上脫下種子，清 理掉雜質和不飽滿的種子，至少放置4周以上，在空氣中自然干燥。每個單株隨機取500 粒飽滿種子，三次重復，單株內誤差不超過O.lg，超過后放回混勻再取，然后算取平均 值折算成千粒重(1000粒種子的重量)數(shù)值，親本、Fl和DH每個系取10-15個單株， 算取平均值為其千粒重值(相關數(shù)據(jù)見表1)。
(2) DH群體的遺傳連鎖圖構建和粒重QTL分析
選取在二個親本間具有擴增多態(tài)性的SSR引物對190個DH系根據(jù)已有方法 (Plieske and Strass, 2001 ； Suwabe et al.，2002 ； Lowe et al.，2004 ； Chen et al.，2009) 進行分析，分離每個DH系的基因組DNA，采用上述篩選得到的有多態(tài)性的SSR引物進 行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在6% (100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克 甲叉-雙丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染、顯影后，獲得每個株系基 因型和群體的分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的群體基因型數(shù)據(jù)構建甘藍型油菜遺傳連鎖 圖。遺傳連鎖圖的構建采用MAPMAKER 3.0 (Lincoln et al.，1992)軟件進行，連鎖群劃 分的參數(shù)設置為LOD值為9.0，最大距離為30cM，每一個連鎖群的確定利用order，try 和ripple等命令。作圖群體中連鎖群中的共同標記和錨定標記來自Parkin et al. (1995)， Lowe et al. (2004)，Piquemal et al. (2005)，Qiu et al. (2006) and Chen et al. (2009)等文章中 的信息，二個位點間的遺傳距離的計算采用“hsambi”參數(shù)(Lincoln等，1992 ； Lowe 等，2004 ； Chen 等，2009)。
將DH群體每個株系的千粒重數(shù)據(jù)與甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子標記進行連 鎖和QTL分析，QTL的檢測采用QTL Cartographer V2.0 (Wanget al.，2007)軟件中的復合 區(qū)間作圖法(CIM)進行，QTL檢測前，其參數(shù)設定為選擇“forward-backward stepwise regression”模式，檢測間隔的窗口大小選擇10cM，參數(shù)設定為模式6 Pin = 0.05, Pout =0.05，檢測時，LOD值默認為2.0，QTL的置信區(qū)間的確定以在峰值所在的LOD-I所 包含的峰值二端所對應在遺傳連鎖圖上的位置。置信區(qū)間有重疊部分認為是在不同的環(huán) 境和群體間有相似位置的QTL。
在二年的試驗中，一共在6條染色體上(Al，A2，A5，A7，AlO和C4)檢 測到9個千粒重的QTLs，這些QTLs分別能解釋3.66-20.76 %的表型變異(表2)。特 別指出的是，在A7染色體上的TSW7a和TSW7b，在二年中都能檢測到，而且表現(xiàn)出最大的效應，一共能解釋所有粒重變異的27.64-37.90%。TSW7a的QTL位點位于 BoGMS715-BnEMS858區(qū)間內，在2007年能解釋千粒重性狀的17.14%,在2008年能 解釋18%左右。二年的QTL峰值有些微移動，但都共同的置信區(qū)間。在二年中來自甲 A254的等位基因能對千粒重增加0.14-0.17g。TSW7b位點同樣有相當大的效應，在2007 年能解釋20.76%的變異，2008年能解釋9.86%的變異，來自甲A254的等位基因能對千 粒重增加0.12-0.15g，在二年中此QTL的位點都穩(wěn)定的存在于IOUcM處。除此之外仍 然還有7個QTLs僅在其中的一年能檢測到，這些QTLs位點的效應都非常的小，僅能解 釋表型變異的3.66%到8.86%。來自甲A254的等位基因對TSW5a，TSW5b, TSW5c, TSWlO和TSW14起正向作用，對TSWl和TSW2起負向作用。
(3)對DH群體中發(fā)現(xiàn)的粒重主效QTLs位點的驗證
搜尋粒重定位有關的文獻和最近的文章(Shi et al.，2009)，有一些粒重QTLs定 位在A7染色體上，其中有一個在共同的標記SR0282R上，和本研究中發(fā)現(xiàn)的TSW7b的 QTL位點吻合(見圖3)。
以上的結果說明在不同的遺傳背景下均能在A7染色體上檢測到千粒重的主效 QTLs,說明A7染色體上的千粒重位點是保守的，可以用來后續(xù)的粒重主效QTLs位點特 異性的標記開發(fā)。
(4)粒重主效QTLs位點特異性標記的獲得
為了開發(fā)A7連鎖群上離粒重主效QTLs位點連鎖更加緊密的標記，利用離這 二個粒重主效QTLs峰值最近的二個標記BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫 (http://www.brassica-rapa.org/BGP/blast.jsp)的同源區(qū)段，位于白菜 A7 上的二個 BAC KBrB084P16和KBrH001J06分別位于TSW7a和TSW7b 二個主效QTLs區(qū)段附近。因 此禾1J用在線軟件(http://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)設計了 二對BAC特異性SSR標記。來自KBrB084P16的10509和來自KBrHOO 1J06的J0609通 過按上述同樣的方法重新構建遺傳連鎖圖和QTL掃描，發(fā)現(xiàn)這二個標記分別定位在這二 個粒重主效QTLs位點峰值處。10509和J0609分別和這二個粒重主效QTLs位點緊密連 鎖；結果還顯示這二個標記分別對TSW7a (從10.36增加到11.4 和TSW7b (從10.37增 加到11.13)的LOD值有所增加。
實施例2 甘藍型油菜中粒重主效QTLs位點特異性標記的有效性驗證
(1)甘藍型油菜中粒重主效QTLs位點特異性標記的驗證
為了檢測在表型變異上10509和J0609 二個標記的主要效果，在DH群體中，每 一個系以這二個位點的基因型進行分組，并進行千粒重的平均值進行計算。對于10509位 點，在AA基因型(來自于甲A254的等位基因位點)組1在二年中包含來自于甲A254的 正向加性效應的等位基因數(shù)目明顯比來自于甲A177的要高。對于J0609有同樣的趨勢(表 3)。從表中的結果可以看出，在甘藍型油菜中位于A7的二個位點是決定粒重的主要因子。
(2)甘藍型油菜中粒重QTLs位點的組合效應驗證
在DH群體中檢測粒重QTLs位點的組合效應，DH群體的系以A5和A7上的 QTLs的基因型進行分組并比較其粒重的變化(表4)。由于A5上的三個QTLs緊密的連 鎖在一起，在DH群體中很少獲得重組系，則將A5上的三個位點簡化為一個位點用于基 因型的分類。從而三個位點在DH群體中應有8種基因型的組合(表4)。從表4的數(shù)據(jù)可以看出，當三個正向加性等位基因同時存在時，粒重明顯高于當僅有一個A7的主要位 點和A5位點存在與否時，非常清楚的說明二個A7位點的重要性和其效應大小。通過表 4的數(shù)據(jù)可以看出，第一組的千粒重數(shù)據(jù)(包含所有的三個正向加性等位基因)比其它所 有組的數(shù)值都要高。
利用10509、J0609對DH系的基因型進行分析，同時存在10509、J0609標記基因 型和甲A2M帶紋一致的為大粒材料；相反同時存在10509、J0609標記基因型和甲Al77 帶紋一致的為小粒材料。
通過檢查DH群體所有千粒重QTLs位點的基因型，第75#系擁有所有正向效應 的QTLs位點，其在二年的表型值中都具有最大的千粒重數(shù)值(表5)。相反，第87#系 擁有所有反向效應的QTLs位點，其在二年中都具有最小的千粒重數(shù)值。
以上的結果說明可以利用這些標記的信息用于粒重的分子標記輔助選擇，并且 應用這些標記對粒重的基因型選擇也是非常準確的。
表1 親本、Fl和分離群體的千粒重數(shù)據(jù)
權利要求
1.一種與甘藍型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標記，其特征在 于，它是通過如下方法獲得的用甘藍型油菜葉片分離的DNA，采用引物對 5 ‘ -ATCATGATGACTTTTGCAATG-3 '禾Π 5 ‘ -GCTCTTGGTAACATAAAATCG-3 ‘； 5 ‘ -GTTGGTTAAAATCGTGTATGC-3 '禾口 5 ‘ -CCTACAAAAAGCAATAACGTG-3 ‘分 別對甘藍型油菜甲Α2Μ和甲Α177進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上 電泳分離后，分別獲得分子標記10509和J0609，所述的分子標記的核苷酸序列分別如序 列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 所示。
2.用于擴增與甘藍型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標記10509和J0609的引物對 的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 1 和 SEQ IDNO 2、SEQ IDNO 3 禾口 SEQ IDNO 4所示。
3.—種與甘藍型油菜粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標記的制備方法，按照以下步驟a)用甘藍型油菜甲A254為母本與甲A177為父本雜交，得到Fl；b)種植步驟a)的F1，從所述的Fl植株的花蕾中通過小孢子培養(yǎng)獲得分離的雙單倍 體(DH)群體；c)對DH群體中的每一個株系進行分子標記分析，分離DH群體每一個株系的基因組 DNA,采用SSR引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)銀 染、顯影后，獲得每個株系的基因型；d)用步驟c)中獲得基因型構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖；e)測定DH群體每個株系的成熟種子的千粒重數(shù)值；f)將DH群體每個株系的千粒重與甘藍型油菜遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖和 QTL分析，得到粒重主效QTLs連鎖的SSR分子標記BnEMS1044和BrGMS5M，其核苷 酸序列如序列表 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 以及 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8所示；g)利用離步驟f)中的分子標記BnEMS1044和BrGMS5M搜尋白菜數(shù)據(jù)庫的同源區(qū) 段，找到白菜A7上的二個BAC，即KBrB084P16和KBrH001J06 ；h)利用在線軟件Batehprimed設計二對BAC特異性SSR引物，它的核苷酸序列分別 如序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示； 根據(jù)序列表 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的 引物對進行PCR擴增，分別得到能夠區(qū)分甘藍型油菜大粒種子與小粒種子的共顯性SSR 分子標記，即10509和J0609，所述的分子標記10509和J0609的核苷酸序列分別如序列表 SEQ IDNO 1 禾口 SEQ ID NO 2 以及 SEQ ID NO 3 和 SEQ IDNO 4 所示。
4.權利要求1所述的分子標記在甘藍型油菜粒重性狀標記輔助選擇中的應用。
5.權利要求2所述的引物對在甘藍型油菜粒重性狀標記輔助選擇中的應用。
6.權利要求5的應用，其中包括在甘藍型油菜粒重性狀的精細定位和圖位克隆中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于油菜分子育種和分子標記制備技術領域，具體涉及一種甘藍型油菜粒重主效QTLs位點特異性分子標記的制備，該標記可用于在甘藍型油菜粒重性狀改良中的分子標記輔助選擇以及在粒重性狀位點精細定位和圖位克隆。本發(fā)明的特征是，以甘藍型油菜甲A254(大粒純系材料)為母本與甘藍型油菜甲A177(小粒純系材料)為父本雜交構建雙單倍體(DH)，對該DH群體基因型和千粒重數(shù)據(jù)進行分析獲得了與粒重主效QTLs緊密連鎖的分子標記，將其命名為I0509和J0609。對該分子標記標記進行了相關驗證應用。本發(fā)明為油菜粒重的分子育種提供了一種新的遺傳標記，也為甘藍型油菜的千粒重性狀位點的精細定位和相關基因的圖位克隆提供了有用信息。
文檔編號C12N15/11GK102021235SQ20101012072
公開日2011年4月20日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權日2010年3月10日
發(fā)明者傅廷棟, 周永明, 范楚川, 蔡光勤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學