專利名稱：一種植物砷抗性相關(guān)的蛋白及編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物砷抗性相關(guān)的蛋白及編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中，是植物生命活動(dòng)中一類重要的活性蛋白質(zhì)，占細(xì)胞可溶性蛋白的4%。在高等植物中， LTPs具有低分子量、高的位置保守性的特點(diǎn)。典型的LIPs是由4個(gè)二硫鍵連接而成的α 螺旋形成的肽鏈折疊結(jié)構(gòu)，內(nèi)部的疏水穴貫穿于整個(gè)分子，疏水穴的存在有利于它結(jié)合疏水配體(如?；?、磷脂)，并為配體的結(jié)合與釋放提供信息。LIPs的等電點(diǎn)接近9，具有8 個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)位點(diǎn)，在N端具有典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。植物L(fēng)IPs —級(jí)結(jié)構(gòu)在不同物種間的同源性相差較大，氨基酸序列同源性在30% -70%之間。盡管存在這種多態(tài)性，但它們都具有LIPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和特性。LTPs是在高等植物中廣泛存在的一類小分子堿性蛋白。最初人們認(rèn)為L(zhǎng)IPs的主要功能是在膜的合成過程中參與胞內(nèi)脂質(zhì)流的傳遞，具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的特性，然而N 端信號(hào)肽的發(fā)現(xiàn)和胞外定位的研究證實(shí)了它們并非脂質(zhì)流的傳遞所必需，已有研究表明 LTPs在植物抵抗和適應(yīng)脅迫環(huán)境中有著重要的作用，如水脅迫、重金屬處理、寒冷、干旱或病原物侵染和鹽脅迫等都會(huì)誘導(dǎo)LIPs基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果充分表明了 LIPs有對(duì)生物和非生物脅迫的防御功能。目前已從多種植物中分離到LIPs基因。隨著研究的深入，其不同水平的轉(zhuǎn)錄本在不同植物的不同發(fā)育階段和生理?xiàng)l件下的不同組織中被發(fā)現(xiàn)，但LTPs 體內(nèi)確切的生理、生化功能和作用機(jī)制尚不明確。蜈蚣草(Pteris vittata L.)是一種超富集砷的蕨類植物。我們?cè)靡种葡麥p雜交技術(shù)，分離到了一個(gè)與砷吸收相關(guān)的基因PvABCTI (已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利)。發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所獲得的PvABCTI蛋白具有結(jié)合和水解ATP的活性，但其在酵母中作用依賴于砷不同價(jià)態(tài)相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在。那么，在蜈蚣草中又是哪些(個(gè))蛋白在砷的轉(zhuǎn)運(yùn)、 積累和解毒中與PvABCTI轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)同作用呢？目前并沒有相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種植物砷抗性相關(guān)的蛋白，命名為PvLTPl，來源于蜈蚣草(Pteris vittata L )。本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗砷性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列2由132個(gè)氨基酸組成，分子量為13(^8kD，等電點(diǎn)為8. 47。為了使1)中的PvLTPl便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1.標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗砷性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第9-404位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在載體pFL61的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組表達(dá)載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因酵母的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的酵母菌株中，得到砷抗性強(qiáng)于所述目的酵母菌株的轉(zhuǎn)基因酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的酵母菌株中的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的酵母菌株是啤酒酵母菌株或啤酒酵母菌株的突變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述啤酒酵母菌株是BY4742，在Thermo Fisher kientific公司的貨號(hào)是YSC1049 ；啤酒酵母菌株的突變體是pho84 Δ、fpsl Δ、 acr3A ^ycfl Δ ；Δ 、fpsl Δ >acr3A ^ycfl Δ ^Thermo FisherScientific^ 司的貨號(hào)分別為 YSC1021-549348, YSC1021-546458, YSC1021-548603 和 YSC1021-547307。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物砷抗性相關(guān)的蛋白及編碼基因及其應(yīng)用。該蛋白來源于蜈蚣草(Pteris vittata L.)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗砷性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明PvABCT1與PvLTP1在酵母體內(nèi)，洋蔥體內(nèi)均是相互作用的，并且通過砷抗性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)將PvLTP1基因轉(zhuǎn)入酵母菌株中，酵母菌株的砷抗性增強(qiáng)了，該結(jié)果表明PvLTP1基因與蜈蚣草砷抗性相關(guān)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102190715SQ20101011639
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者何振艷, 徐文忠, 陳宏林, 麻密 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所