專利名稱：一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因動物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因動物的方法。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)70年代，Jaenich等將SV40的DNA導(dǎo)入小鼠囊胚，并在子代小鼠組織中檢 測到了 SV40 DNA，證明了外源性基因?qū)肱咛ゼ?xì)胞并實現(xiàn)整合是可能的，上世紀(jì)80年代， Gordon等又建立了顯微注射轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。此后，該技術(shù)迅速發(fā)展，先后出現(xiàn)了多種建 立轉(zhuǎn)基因動物的方法，其應(yīng)用滲透到多個研究領(lǐng)域，成為人們深入了解生物的遺傳物質(zhì)、研 究基因功能、建立人類疾病的動物模型以研究疾病的診斷與治療的一個有力工具。雖然轉(zhuǎn) 基因動物具有誘人的應(yīng)用前景，但早期得到的轉(zhuǎn)基因陽性動物，轉(zhuǎn)入基因在胚胎早期即得 到持續(xù)性表達，無法保證轉(zhuǎn)基因表達的組織和/或發(fā)育階段特異性，當(dāng)所研究的基因?qū)ε?胎發(fā)育具有毒性或致死作用時，胚胎在發(fā)育早期即發(fā)生死亡，致使后續(xù)研究無法進行。因 而，要實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用價值，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達的階段及組織特異性就成為一個關(guān)鍵 問題。為此，人們在深入了解生物基因調(diào)控機制的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出一系列可調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達 的系統(tǒng)，使所轉(zhuǎn)基因可按研究者的意愿以時空特異的方式進行表達。目前存在的調(diào)控系統(tǒng) 很多，其中研究較多、應(yīng)用最為廣泛的是四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(簡稱tet調(diào)控系統(tǒng))。將該系統(tǒng) 用于制備轉(zhuǎn)基因家畜(豬、牛及羊)能在家畜體內(nèi)實現(xiàn)定時表達外源基因，可以實現(xiàn)外源基 因在家畜體內(nèi)的定時整合，為制備能隨時調(diào)控外源基因表達轉(zhuǎn)基因家畜的一種新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因胚胎的方法。本發(fā)明提供的培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將如下1)或 2)的重組表達載體導(dǎo)入目的胚胎中，得到豬生長激素表達量高于所述目的胚胎的轉(zhuǎn)基因胚 胎1) TRE-GH 和 ΤΕΤ-0Ν ；2)TRE-GH-TET-0N,其中，TRE-GH是將序列表中序列2所示的DNA片段插入TRE載體的多克隆位點構(gòu) 成的重組表達載體，所述TRE載體是將序列表中序列1所示的DNA片段插入pUC19質(zhì)粒的 多克隆位點構(gòu)成的重組載體；TRE-GH-TET-0N是將Nhel和HindIII雙酶切ΤΕΤ-0Ν得到2. 5Kb大小的片段與 Nhel和HindIII雙酶切TRE-GH得到的3. 3KB大小的片段連接，得到的重組表達載體。TET-ON 載體是 pTet-On-Advanced 的簡稱，購自 clontech 公司，貨號 630930。上述胚胎為原核期胚胎。上述胚胎可以是除人以外的任何一種動物的胚胎，具體可為豬、牛、羊、貓、狗、兔 或鼠的胚胎。本發(fā)明的另一目的在于提供一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因動物的方法。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因動物的方法，是將上述的方法制備的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到 雌性的目的動物的體內(nèi)，得到豬生長激素表達量高于所述目的動物的轉(zhuǎn)基因動物。上述目的動物為除人以外的任何一種動物，具體可為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。實驗證明4號，22號，37號，55號轉(zhuǎn)基因豬在加DOX前血液中GH的表達值分別為 36，32，40，34，而加DOX后血液中GH的表達值分別為225，318，265，423，加DOX后轉(zhuǎn)基因豬 血液內(nèi)GH急劇增加。結(jié)果表明分開型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)及整合型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)均能有效 制備轉(zhuǎn)基因家畜。


圖1 :TRE-GH質(zhì)粒圖譜。圖2 胚胎水平誘導(dǎo)GH的表達。圖3 =TRE-GH和ΤΕΤ-0Ν轉(zhuǎn)基因豬基因組DNA的PCR檢測，M為IOObp ladder DNAmark ； 1-23為制備的待檢測后代豬；+為陽性對照(以TRE-GH質(zhì)粒、TET-ON為模板)。圖4 半定量檢測轉(zhuǎn)TRE-GH和TET-ON基因豬以及轉(zhuǎn)TRE-GH-TET-0N基因豬中rtTA 的表達,M 為 IOObp ladder DNA mark、1、4、7、11、13、15、18、19、22 為轉(zhuǎn) TRE-GH 和 ΤΕΤ-0Ν 基 因豬；37、38、39、43、48、49、52、55、57、58 為轉(zhuǎn) TRE-GH-TET-ON 基因豬；Y1、Y2、Y3、Y4 為非轉(zhuǎn) 基因豬；K為空白對照(以水為模板擴增)。圖 5 TRE-GH-TET-ON 圖譜。圖 6 TRE-GH-TET-ON 轉(zhuǎn)基因豬基因組 DNA 的 PCR 檢測(M 為 IOObp ladder DNAmark ； 1-23為制備的待檢測后代豬；+為陽性對照(以TRE-GH-TET-ON為模板))。圖7 強力霉素(DOX)誘導(dǎo)正常豬及轉(zhuǎn)基因豬GH的表達，22、37、4、55表示不同的 轉(zhuǎn)基因豬未經(jīng)強力霉素處理的GH表達；22+D0X、37+D0X等表示不同的豬經(jīng)強力霉素處理后 的GH表達。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、轉(zhuǎn)基因胚胎的獲得一、重組表達載體的獲得1、線性化的TRE-GH和TET-ON的獲得合成含TRE啟動子，多克隆位點及SV40 polyA的DNA片段(命名為TRE_MSC_SV40 polyA基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，北京奧科生物技術(shù)有限公司合成)。上 述合成的DNA片段在95°C 10分鐘，立即置于冰水中，處理后用ZraI.(購自NEB公司，貨號 R0659L)及PciI (購自NEB公司，貨號R0655L)雙酶切后備用；pUC19質(zhì)粒(購自寶生物， 貨號FD3219)ZraI.及PciI雙酶切后和前述TRE-MSC-SV40polyA片段進行連接(連接酶購 自promega公司，貨號M1804)；按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5 α (購自北京全式金公司，貨 號CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接 種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結(jié)果
4正確的載體(命名為TRE載體)備用。提取豬(大白豬品系，購自唐山市新基源種豬有限公司)耳靜脈血，按照試劑盒 操作程序提取總RNA(購自百泰克，貨號RP4002)；按照試劑盒操作程序?qū)⒖俁NA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA(購自Τ0Υ0Β0公司，貨號TRT-101)以表1中列舉的擴增GH的引物擴增豬生長激 素基因(GH)片段(核苷酸序列如序列表中序列2)。反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50 μ 1，5 μ L 10XBuffer,8y L 2. 5mM dNTPU μ L 20 μ M弓丨物GH cDNA-LUl μ L 20 μ M引物GH-Rl (序列 見表1)、0. 5 μ L 5U/ μ L高保真Tag聚合酶，IOOng豬cDNA為模板，加超純水至50 μ L (高保 真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增程序98°C 10s,68°C 2min，循環(huán)30次。PCR擴增產(chǎn)物送公司測序(invitrogen北京公司)正確后PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊 脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用KpnI、MluI雙酶切純化產(chǎn)物；同時 用KpnI、MluI雙酶切上述制備的TRE載體；將PCR擴增產(chǎn)物和酶切后的載體連接、轉(zhuǎn)化(操 作步驟及試劑同前)，挑取單菌落送公司測序，選取測序正確的載體(命名為TRE-GH)備用 (載體圖件圖1)。本發(fā)明中TET-ON載體購自clontech公司，貨號630930。上述兩質(zhì)粒TET-ON和TRE-GH載體進行質(zhì)粒去內(nèi)毒素大提(購自O(shè)MEGA公司，貨 號D6948)，質(zhì)粒提取后，ScaI (購自Fermanta公司，貨號ER0431)酶切線性化后按照說明 書對基因純化回收(購自QIAGEN公司，貨號12562)，至此得到線性化的TRE-GH和ΤΕΤ-0Ν。2、TRE-GH-TET-0N (見圖 5)的獲得線性化的TRE-GH-TET-0N載體的構(gòu)建將TET-ON載體用NheI (購自NEB公司，貨 號:R0131S)和HindIII (購自NEB公司，貨號:R0104V)雙酶切，膠回收2. 5Kb大小處的條 帶；同時用NheI和HindIII雙酶切步驟1中的TRE-GH載體，回收3. 3Kb大小處的條帶，和 上述回收的片段進行連接、轉(zhuǎn)化(操作步驟及試劑同前)。挑單菌落，質(zhì)粒小提試劑盒進行 質(zhì)粒提取(購自百泰克公司，貨號DP1002)NheI、HindIII雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。選取酶切 以及測序鑒定結(jié)果和預(yù)期一致的重組質(zhì)粒，進行質(zhì)粒去內(nèi)毒素大提，質(zhì)粒提取后，ScaI酶切 線性化后按照說明書對基因純化回收，得到線性化的TRE-GH-TET-0N載體。二、轉(zhuǎn)基因胚胎的獲得1、線性化的TRE-GH和ΤΕΤ-0Ν注射胚胎通過傳統(tǒng)原核期胚胎顯微注射法注射將含有線性化的TRE-GH和TET-ON (摩爾比 為1 1)的混合液到原核期豬(大白豬品系)胚胎原核內(nèi)，在NCSU 23培養(yǎng)基中(購自 miIlipore公司，貨號MR-182-D)培養(yǎng)至8細(xì)胞期。取正常胚胎及顯微注射雙基因的胚胎，在NCSU 23培養(yǎng)液中加入600ng/ml的強力 霉素(DOX)，36小時后以胚胎為模板按照ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR試劑盒(購自 NEB公司，貨號E6400S)操作說明(引物為表1所列舉檢測GH定量引物)，擴增反應(yīng)為28個 循環(huán)，將PCR產(chǎn)物取5微升進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，通過比較電泳條帶亮度來初步比較GH 的表達水平?？梢娤啾容^正常胚胎的GH表達水平而言，顯微注射雙基因后的胚胎內(nèi)3號和5 號胚胎的GH表達水平在DOX誘導(dǎo)后有了極大提高(結(jié)果見圖2，M :mark ；1-10 為顯微注射 TRE-GH,TET-ON混合基因后加入強力霉素后的GH表達；11-20 為顯微注射TRE-GH-TET-0N 混合基因后加入DOX后的GH表達；21-24 正常胚胎加入DOX后的GH表達)。2、線性化的TRE-GH-TET-0N注射胚胎
通過顯微注射法將線性化的TRE-GH-TET-0N注射到原核期豬(大白豬品系)胚胎 原核內(nèi)，在NCSU 23培養(yǎng)基中(購自millipore公司，貨號MR-182-D)培養(yǎng)至8細(xì)胞期。取部分正常胚胎及顯微注射的胚胎，在NCSU 23培養(yǎng)液中加入600ng/ml的D0X， 36小時后以胚胎為模板按照ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR試劑盒(購自NEB公司，貨 號E6400S)操作說明(引物為表1所列舉檢測GH定量引物)，直接檢測胚胎中GH的表達。 可見相比較正常胚胎的GH表達水平而言，顯微注射TRE-GH-TET-0N基因后的第12，17號胚 胎內(nèi)的GH在DOX誘導(dǎo)后有了極大提高(結(jié)果見圖2，M :mark ；1-10 為顯微注射TRE-GH、 TET-ON混合基因后加入強力霉素后的GH表達；11-20 為顯微注射TRE-GH-TET-0N混合基 因后加入DOX后的GH表達；21-24 正常胚胎加入DOX后的GH表達)。實施例2、轉(zhuǎn)基因動物的獲得及其檢測一、轉(zhuǎn)基因動物的獲得1、轉(zhuǎn) TRE-GH 和 ΤΕΤ-0Ν 基因豬重復(fù)實施例1步驟二中步驟1，將線性化的TRE-GH和TET-ON注射原核期豬胚胎， 培養(yǎng)至8細(xì)胞期。在體外通過陰道子宮頸移植到發(fā)情同步的母豬子宮角。按照試劑盒操作說明(購自百泰克，貨號DP1901)提取轉(zhuǎn)基因豬耳組織基因 組DNA，經(jīng)PCR篩選出同時整合有TRE-GH及TET-ON的豬。PCR反應(yīng)體系為50 μ 1，5 μ L 10XBuffer,8y L 2. 5mM dNTPU μ L 20 μ M 引物 PL、1 μ L 20 μ M 引物 PR、0. 5 μ L 5U/yL 高 保真Tag聚合酶，加超純水至50 μ L，以獲得的豬基因組DNA為待檢測模板，PCR擴增程序 950C 5min ；94°C 20s，退火溫度 56°C，72°C lm，循環(huán) 30 次，最后 72°C延伸 5min。PCR 擴增 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出分別能擴增出TRE-GH基因及rt-TA基因的陽性豬 (圖3中的1、4、7、11、13、15、18、19和22)，兩基因的檢測引物見表1 (檢測引物分別是表1 中 rtTA 的 rtTA-RTLl 和 rtTA-RTRl ；TRE-GH =TRE-Ll 和 TRE-L2)。提取上述轉(zhuǎn)基因陽性豬(1、4、7、11、13、15、18、19和22)的豬耳靜脈采200微升血 液，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(操作步驟及試劑同前)，以豬GAPDH基因為內(nèi)參(引物為 mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，進行半定量PCR測定rtTA的表達，PCR加樣體系及反應(yīng)體系同 轉(zhuǎn)基因檢測rtTA (rtTA引物為表1所示的rtTA-RTLl和rtTA-RTRl)。將所篩選出能表達 rtTA的轉(zhuǎn)基因豬4號及22號進行轉(zhuǎn)基因豬強力霉素誘導(dǎo)實驗(圖4)。2、轉(zhuǎn) TRE-GH-TET-0N 基因豬重復(fù)實施例1步驟二中步驟2，將線性化的TRE-GH和TET-ON注射原核期豬胚胎， 培養(yǎng)至8細(xì)胞期。在體外通過陰道子宮頸移植到發(fā)情同步的母豬子宮角。按照試劑盒操作說明提取轉(zhuǎn)基因豬耳組織基因組DNA(試劑盒及操作步驟同 前)，經(jīng)PCR篩選出同時整合有TRE-GH-TET-0N基因的豬。PCR反應(yīng)體系為50μ l，5yL 10XBuffer,8y L 2. 5mM dNTPU μ L 20 μ M 引物 PL、1 μ L 20 μ M 引物 PR、0. 5 μ L 5U/yL 高 保真Tag聚合酶，加超純水至50 μ L，以獲得的豬基因組DNA為待檢測模板，PCR擴增程序 950C 5min ；94°C 20s，退火溫度56°C，72°C lm，循環(huán)30次，最后72°C延伸5min (檢測引物分 別是表 1 中 rtTA 的 rtTA-RTLl 和 rtTA-RTRl ；TRE-GH =TRE-Ll 和 TRE-L2)。PCR 擴增產(chǎn)物 用瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出分別能擴增出TRE-GH基因及rt-TA基因的陽性豬(圖 6中的37、38、39、43、48、49、52、55、57和58)，兩基因的檢測引物見表1。提取轉(zhuǎn)基因陽性豬(37、38、39、43、48、49、52、55、57和58)的豬耳靜脈采200微升血液，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(操作步驟及試劑同前)，以豬GAPDH基因為內(nèi)參(引物為 mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，進行半定量PCR測定rtTA的表達(圖4)，PCR加樣體系及反應(yīng) 體系同轉(zhuǎn)基因檢測rtTA (rtTA引物為表1所示的rtTA-RTLl和rtTA-RTRl)。將所篩選出能 表達rtTA的轉(zhuǎn)基因豬37號及55號進行轉(zhuǎn)基因豬強力霉素誘導(dǎo)實驗。二、轉(zhuǎn)基因豬進行強力霉素誘導(dǎo)實驗開展對上述鑒定的轉(zhuǎn)基因豬(4號、22號、37號及55號)進行強力霉素誘導(dǎo)實驗， 在飲水中添加強力霉素(購自clontech公司，貨號631311終濃度600ng/毫升)，分別在加 強力霉素之前及之后36小時，通過耳靜脈采200微升血液，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA (操 作步驟及試劑同前)，以豬GAPDH基因為內(nèi)參(引物為表1中的mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)， 進行實時熒光定量PCR測定GH(GH引物為表1所示的pGH-RTLl和pGH-RTRl)表達量，上 樣體系按照ABI定量試劑說明書上樣，反應(yīng)體系為20μ l，10yL 2XMixturer(TAKARA，貨 號DRR041A)、1 μ L 20 μ M上游引物、1 μ L 20 μ M下游引物、1微升cDNA，加超純水至20 μ L。 PCR擴增程序95°C 5min ；94°C 20s，退火溫度56°C，72°C lm，循環(huán)40次，最后72°C延伸 5min。三只正常豬在加強力霉素前生長激素表達值分別為21，18，20，加強力霉素DOX后血 液中GH的表達值分別為25，22，22，加DOX前后血液中GH的表達無明顯差異(P < 0. 05)； 4號，22號，37號，55號轉(zhuǎn)基因豬在加DOX前血液中GH的表達值分別為36，32，40，34，而加 DOX后血液中GH的表達值分別為225，318，265，423，加DOX后轉(zhuǎn)基因豬血液內(nèi)GH急劇增加 (見圖7)。結(jié)果表明分開型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)及整合型四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)均能有效制備轉(zhuǎn)基因 家畜。表1 本發(fā)明中用于擴增載體構(gòu)件的引物
擴增片段名稱引物代號引物序列產(chǎn)物長 度(bp)5，端引入 的酶切位點GHcDNAGH cDNA-L 1ATAAGCTTCC4CCATGGCTGC AGGCCCTCGGACC*657KpnI (下劃 線標(biāo)注)GH-RlCGTCTAGAACTAGAAGGCAC AGCTGCTMlu I (下劃 線標(biāo)注)rtTA檢測rtTA-RTRlCGTGGATAGCGGTTTGACTC482■rtTA-RTLlGGGCAGAAGTGGGTATGATG_TRE-GH檢測TRE-LlAACCGTCAGATCGCCTGGAG100TRE-RlGCCATGGTGGAAGCTTATCGGH定量引物pGH-RTLlAACTGGCTGCTGACACCTAC220_pGH-RTRlTGAAGACCCTGCTGAGGAAC_豬內(nèi)參定量 PCR檢測Pig GAPDHmGAPDH -LlTACACAGCCACTCAGAAGAC249-mGAPDH -RlTTTCACAGCCTCCGTGATAG-注表中帶*的序列中斜體字部分為kozak序列。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
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catacctgcg ggtcatgaag tgtcgccgct tcgtggagag cagctgtgcc ttctagt65權(quán)利要求
一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將如下1)或2)的重組表達載體導(dǎo)入目的胚胎中，得到豬生長激素表達量高于所述目的胚胎的轉(zhuǎn)基因胚胎1)TRE GH和TET ON；2)TRE GH TET ON，其中，TRE GH是將序列表中序列2所示的GH DNA片段插入TRE載體的多克隆位點構(gòu)成的重組表達載體，所述TRE載體是將序列表中序列1所示的DNA片段插入pUC19質(zhì)粒的多克隆位點構(gòu)成的重組載體；TRE GH TET ON是將Nhel和HindIII雙酶切TET ON得到2.5Kb大小的片段與Nhel和HindIII雙酶切TRE GH得到的3.3KB大小的片段連接，得到的重組表達載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述胚胎為原核期胚胎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述胚胎為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠 的胚胎。
4.一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因動物的方法，是將權(quán)利要求1-3中任一所 述的方法制備的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到雌性的目的動物的體內(nèi)，得到豬生長激素表達量高于所 述目的動物的轉(zhuǎn)基因動物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述目的動物為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育豬生長激素表達量增強的轉(zhuǎn)基因動物的方法。本發(fā)明還公開了培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將如下1)或2)的重組表達載體導(dǎo)入目的胚胎中，得到豬生長激素表達量高于所述目的胚胎的轉(zhuǎn)基因胚胎1)TRE-GH和TET-ON；2)TRE-GH-TET-ON，其中TRE-GH是將序列表中序列2所示的DNA片段插入TRE載體的多克隆位點構(gòu)成的重組表達載體，所述TRE載體是將序列表中序列1所示的DNA片段插入pUC19質(zhì)粒的多克隆位點構(gòu)成的重組載體；TRE-GH-TET-ON是將Nhel和HindIII雙酶切TET-ON得到2.5Kb大小的片段與Nhel和HindIII雙酶切TRE-GH得到的3.3KB大小的片段連接，得到的重組表達載體。將該胚胎移植至動物中即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。實驗證明加DOX后轉(zhuǎn)基因豬血液內(nèi)GH急劇增加。
文檔編號C12N15/63GK101892256SQ20101010242
公開日2010年11月24日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者唐中林, 崔文濤, 李奎, 楊述林, 牟玉蓮, 白立景, 鄭新明, 鞠輝明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所