專利名稱：一種水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子在培育新品種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子0sHsfA2b在培育晚熟高品 質(zhì)耐儲(chǔ)存植物品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著國民生活水平的提高，人們對糧食品質(zhì)的要求也越來越高，培育高品質(zhì)水稻 新品種就成了科研工作者面臨的一個(gè)迫切的課題。眾所周知，水稻品質(zhì)與生育期成一定程 度的正相關(guān)關(guān)系，延長生育期是實(shí)現(xiàn)水稻高品質(zhì)的途徑之一。同時(shí)隨著全球變暖，我國很多 地區(qū)水稻可利用積溫增大，這就為我們栽培水稻晚熟新品種提供了很好的自然條件。所以 闡明水稻晚成熟的分子機(jī)制，盡快地分離、鑒定出一批致水稻晚開花晚成熟的基因，是我們 利用基因工程手段改良粳稻和早熟品種、加快作物品種改良進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一。糧食種子貯存過程中會(huì)因?yàn)橐恍┓N子的霉變或者發(fā)芽而造成生產(chǎn)上的損失進(jìn)而 影響糧食安全。故若能找到抑制種子發(fā)芽的基因使種子發(fā)芽受損或者喪失發(fā)芽能力可為種 子貯存提供一個(gè)安全保障。熱脅迫是許多植物在高溫夏季每天都必需面臨的環(huán)境因素，雖然水稻為喜溫作 物，但是水稻在開花期和灌漿期對高溫非常敏感，容易形成“高溫逼熟”，使產(chǎn)量銳減。研究 發(fā)現(xiàn)，對高溫的耐受差異性是品種固有的遺傳特性決定的，含有粳稻基因的親本組合和含 有早熟基因的親本組合均表現(xiàn)為不耐高溫?zé)岷?，而常?guī)稻、中等穗型的水稻，其高溫?zé)岷γ?顯輕發(fā)，主要原因是粳稻基因不耐高溫，早熟基因不耐高溫，大穗型對營養(yǎng)要求高，對環(huán)境 要求嚴(yán)，也不耐高溫。陸地植物在長期的進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了一系列的措施以便適應(yīng)環(huán)境的快速變化， 由于陸生植物不能移動(dòng)，植物對于低溫、高溫、鹽脅迫、重金屬和極端缺水干旱的極端環(huán)境， 能夠迅速做出反應(yīng)，使它們得以生存和繁衍。其中，熱脅迫蛋白(heat stress proteins, Hsps)廣泛存在于所有真核生物和原核生物中，它們在各種脅迫反應(yīng)中都起著重要的作用 組成型表達(dá)的熱脅迫蛋白是一類分子伴侶(Molecular Chaperones)，它們參與維持蛋白質(zhì) 的合成、折疊、運(yùn)輸、功能和降解等過程。熱脅迫蛋白的表達(dá)直接受熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子(heat stresstranscription factors，Hsfs)的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子是熱脅迫反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié) 因子。根據(jù)熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)，高等植物的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子分為三類，A，B和 C類。和其它的轉(zhuǎn)錄因子一樣，熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子的大小和序列各不相同，但它們具有一定 的結(jié)構(gòu)模式N末端具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)，它可以特異性地識別熱脅迫蛋白啟動(dòng)子 上的序列(heatstress promoter elements，HSE)。HSE由具有二折對稱結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列 (5，-AGAAnnTTCT-3')組成，存在于受熱誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子TATA Box的上游。與DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域相鄰的是HR-A/B區(qū)以及核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)以及激活肽結(jié)構(gòu)域 (AHA)。在高等植物中，對于熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子只在擬南芥和番茄有著較為系統(tǒng)的研究，對于番茄20多個(gè)Hsfs的研究發(fā)現(xiàn)，HsfAU A2和Bl代表了三個(gè)最重要的家族，它們分別在 熱脅迫發(fā)生的三個(gè)階段，誘發(fā)、維持和恢復(fù)中起著不同的作用。在番茄中，HsfAla是熱脅迫 反應(yīng)中最主要的調(diào)節(jié)蛋白，它參與誘導(dǎo)包括HsfA2和HsfBl在內(nèi)的熱誘導(dǎo)蛋白；過量表達(dá) HsfAla的轉(zhuǎn)基因番茄，比野生型對照耐熱性增加；而降低HsfAla表達(dá)的番茄，對于高溫脅 迫超敏感，并伴有Hsp70轉(zhuǎn)錄的減少和果實(shí)成熟的延緩，因此HsfAla在耐高溫脅迫反應(yīng)中 是必不可少的；。HsfA2只在熱誘導(dǎo)后表達(dá)，是最主要的Hsf，在炎熱的夏天參與多次的熱脅 迫和恢復(fù)過程；HsfA2的活性受到一系列蛋白，通過調(diào)控其溶解性、細(xì)胞內(nèi)的定位以及激活 功能實(shí)現(xiàn)的；Hspl7-CII可以與HsfA2 C末端相互作用，形成特異的共抑制子，兩者在胞質(zhì) 中形成大的顆粒聚合物，該聚合物可以在Hspl7-CI存在下、或者HsfA2與HsfAl形成異源 二聚體進(jìn)入細(xì)胞核后解聚，解聚過程需要依賴于ATP的Hsp70和HsplOl分子伴侶的活性； HsfBl與HsfAl協(xié)同作用，招募包括組蛋白乙?；窰ACl轉(zhuǎn)錄共激活子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻一種熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子0sHsfA2b在培育晚熟高品質(zhì)耐儲(chǔ) 存植物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子，來源于水稻(Oryza sativa L.)，名稱為 0sHsfA2b，是如下(a)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；其中，序列表中的序列1由372個(gè)氨基酸殘基組成。自序列1的氨基末端第84位到第114位氨基酸殘基為DBD結(jié)構(gòu)域，自序列1的氨 基末端第159位至223位氨基酸殘基為HR-A/B結(jié)構(gòu)域，自序列1的氨基末端第239位至第 253位氨基酸殘基為NLS結(jié)構(gòu)域，自序列1的氨基末端第3 位至第336位氨基酸殘基為 AHA結(jié)構(gòu)域。所述熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子0sHsfA2b蛋白的編碼基因，具體可為如下1)或2~)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子0sHsfA2b蛋白 的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜 交，并用該溶液洗膜。序列表中的序列2由1955個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，是0sHsfA2b的cDNA基因序列， 序列表中序列2的自5'末端第502位至1617位脫氧核糖核苷酸為編碼序列。含有上述熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子0sHsfA2b蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體具體可為如圖 1 所示的 pCAMBIA2300-W3iqutin-FLAG-0sHsfA^。所述重組植物表達(dá)載體可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞或組 織，并將轉(zhuǎn)化的水稻組織培育成植株。實(shí)驗(yàn)證明，pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG-0sHsfA2b轉(zhuǎn)基因水稻長日照、短日照和 中日照下均表現(xiàn)為晚花，且造成種子萌發(fā)受抑制。說明0sHsfA2b基因能夠影響水稻開花時(shí) 間和種子萌發(fā)。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖 1 為 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2b 的物理圖譜圖 2 為 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2b 轉(zhuǎn)基因植株的 Southern 雜交結(jié)果圖 3 為 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2b 轉(zhuǎn)基因植株的 Northern 雜交結(jié)果圖 4 為 pCAMBIA2300-W3iqutin-FLAG-0sHsfA^ 轉(zhuǎn)基因植株的 Western 雜交結(jié)果圖5為pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2b轉(zhuǎn)基因水稻長日照、短日照和中日 照下均表現(xiàn)為晚花表型(A 長日照下，B 中日照下，C 短日照下)圖 6 為 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG_0sHsfA2b 轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)受抑制(A 28°C, B 24°C )
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建以pCAMBIA1302-FLAG(XF0349)為模板，用下面的引物擴(kuò)增出FLAG的全長片段，用 KpnI和BamHI分別單切此PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2302-Ubiqutin_ocs (XF0422)，回收后連接得 到 pCAMBIA2302-Ubiqutin_FLAG(XF0426)水稻過表達(dá)載體。擴(kuò)增后含 FLAG 的 sequence :G GTACCATGGACTACAAGGACGATGATGACAAGGGCGACTATAAGGATGACGACGATAAGACTAGTCCCGGGACGCGT GGATCC以引物 P1 5，-GCGTCTAGA ATGGATGATCCAATGCTGAATGCG-3，和 P2 5，-ATAAGATCTC TATTCCCCAGCCGTTGGGCCATT-3，(含有XbaI和BglII識別位點(diǎn))從水稻cDNA中擴(kuò)增出相應(yīng) 的OsHsfA^全長cDNA基因，用)(bal和BglII酶切載體XFO似6，用T4DNA連接酶鏈接，將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，相應(yīng)抗性平板上篩選抗性菌落，進(jìn)行PCR鑒定，得到含有植 物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG-0sHsfA2b的陽性菌落。提取陽性菌落中的質(zhì)粒， 得到植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300-Ubiqutin-FLAG-0sHsfA2b(圖 1)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物株Soutern檢測分別提取常溫下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因的水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片 總DNA，選取0sHsfA2b DNA的一段保守序列為探針，通過BglII和EcoRV雙酶切水稻基因組 DNA。Southern方法檢測0sHsfA2b基因插入水稻基因組個(gè)數(shù)。結(jié)果如圖2所示，5個(gè)不同 的轉(zhuǎn)基因株系的0sHsfA2b基因的插入數(shù)均為單拷貝。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植物株Noutern檢測分別提取常溫下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因的水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片 總RNA，選取0sHsfA2b DNA的一段保守序列為探針，通過Nouthern方法檢測0sHsfA2b基因 的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，表明在常溫下某些轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因植株的0sHsfA2b基因表達(dá) 量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。圖3中，0E-8、OE-15和0E-18的OsHsfA^基因表達(dá)量明顯高 于對照野生型日本晴(CK)此基因表達(dá)量。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植物株Wfestern檢測分別提取常溫下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因的水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片 總RNA，各取50 μ g蛋白于SDS聚丙烯凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫 脂奶粉封閉1小時(shí)，分別加入抗flag蛋白等抗體(稀釋濃度依照說明書)，過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗作用1小時(shí)(稀釋濃度為1 50000)，底物顯色壓片實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因植物株開花延遲鑒定將驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因單拷貝的3個(gè)不同株系分別種植于三種不同的日照情況下北京(5 月份-10月份)長日照下，海南(12月-3月)中日照下，和人工氣候箱內(nèi)短日照處理9小 時(shí)光照/15小時(shí)黑暗，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出比對照晚開花的表型。如圖5，說明長日照、 短日照和中日照下過表達(dá)0sHsfA2b基因均造成水稻植株晚花。實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)和發(fā)芽受抑制選取野生型和轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因各約40粒的水稻種子放在經(jīng)水浸濕的鋪有雙層濾 紙的培養(yǎng)皿中，用紗布覆蓋，同時(shí)放置于最適合水稻種子萌發(fā)的溫度下，每天用已經(jīng)準(zhǔn)備好 的清水早晚換水，觀察種子萌發(fā)和發(fā)芽情況，直到11天。如圖6可見轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因種子 萌發(fā)和發(fā)芽遲緩甚至受抑制。說明轉(zhuǎn)0sHsfA2b基因的水稻種子影響種子發(fā)芽甚至使種子
喪失發(fā)芽能力。本實(shí)施例可為培育耐儲(chǔ)存種子提供理論依據(jù)候選基因。
SEQUENCE LISTING
<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
<120> 一種水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子在培育新品種中的應(yīng)用
<130>cxfl
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>372
<212>PRT
<213>水稻屬水稻(Oryza sativa L.)
<400>1
Met AspAspProMetLeuAsnAlaValLysGluGluGluSerHisGly
151015
Asp GlyGlyGlyLeuGluValValAlaGlyGluAspGlyAlaAlaAla
202530
Val AlaAlaGlyValAlaProArgProMetGluGlyLeuHisAspAla
354045
Gly ProProProPheLeuThrLysThrTyrAspMetValAspAspAla
505560
Gly ThrAspAlaAlaValSerTrpSerAlaThrSerAsnSerPheVal
65707580
Val TrpAspProHisAlaPheAlaThrValLeuLeuProArgPhePhe
859095
Lys HisAsnAsnPheSerSerPheValArgGlnLeuAsnThrTyrGly
100105110
Phe ArgLysValAspProAspArgTrpGluPheAlaAsnGluAsnPhe
1151201250068]LeuArgGlyGlnArgHisLeuLeuLysAsnlieLysArgArgLysPro0069]1301351400070]ProSerHisThrAlaSerAsnGlnGlnSerLeuGlyProTyrLeuGlu0071]1451501551600072]ValGlyHisPheGlyTyrAspAlaGlulieAspArgLeuLysArgAsp0073]1651701750074]LysGlnLeuLeuMetAlaGluValValLysLeuArgGlnGluGlnGln0075]1801851900076]AsnThrLysAlaAsnLeuLysAlaMetGluAspArgLeuGlnGlyThr0077]1952002050078]GluGlnArgGlnGlnGlnMetMetAlaPheLeuAlaArgValMetLys0079]2102152200080]AsnProGluPheLeuLysGlnLeuMetSerGlnAsnGluMetArgLys0081]2252302352400082]GluLeuGlnAspAlalieSerLysLysArgArgArgArglieAspGln0083]2452502550084]GlyProGluValAspAspValGlyThrSerSerSerlieGluGlnGlu0085]2602652700086]SerProAlaLeuPheAspProGlnGluSerValGluPheLeulieAsp0087]2752802850088]GlylieProSerAspLeuGluAsnSerAlaMetAspAlaGlyGlyLeu0089]2902953000090]ValGluProGlnAspPheGlyValGlyAlaSerGluGlnGlnGlnlie0091]3053103153200092]GlyProGlnGlyGluLeuAsnAspAsnPheTrpGluGluLeuLeuAsn0093]3253303350094]GluGlyLeuValGlyGluGluAsnAspAsnProValValGluAspAsp0095]3403453500096]MetAsnValLeuSerGluLysMetGlyTyrLeuAsnSerAsnGlyPro0097]3553603650098]ThrAlaGlyGlu0099]3700100]<210>10101]<211>19550102]<212>DNA0103]<213> 7jC稻屬水稻(Oryza sativa L.)0104]<400>10105]gagtagcatt caccttctcc gccctcccccctccgccgcc tccgccgctcccccaccttc0106]cagaaccttc ctttcccgaa atagccacccctaccctacc ctaccctacc
aagatccccgccgccggcgagctcgagcccttggtggtgctccggcgggcgttgtcgcgg180
tcggatcagctgctgctggtgctggtgatgccgctctctctttcttgcgtgtacttccgg240
gtgggaggttgatggcgatggtgaggtgttCtttggCgCggttgccctcgcccccactct300
tatctcctctcctcgcccatgctacctaccttcctcccccgccggagctgctctgctgct360
cgtactagcgtgggagctgcctcttcttgttgagccatttcttgcctacaaggacagggt420
gcctcgccgtcgccattgccggcgtcggagccggacaaggaggttcagtgtactgtaccg480
tggttttgggccttctgagctatggatgatccaatgctgaatgcggtgaaggaggaggag540
agccacggggacggaggagggttggaggtggtggcgggagaggatggggcggcggcggtg600
gcggcgggggtggcgccgaggccgatggaggggctgcacgacgccgggccgccgccgttc660
ctgaccaagacgtacgacatggtggacgacgccggcaccgacgccgccgtgtcgtggagc720
gcgacgagcaacagcttcgtggtgtgggatccccacgccttcgccaccgtcttgctcccc780
aggttcttcaagcacaacaacttctccagcttcgtcaggcagctcaacacctatggtttc840
agaaaggtggatcctgatcggtgggaatttgcaaatgagaattttctgcggggacagaga900
catcttctcaagaacatcaagcgtagaaaaccaccttcccatactgcttcaaaccagcaa960
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gcctccgaacagcagcagatcgggccccagggggagttgaacgacaatttctgggaggag1500
ctgctgaacgaagggcttgttggtgaggagaacgacaacccggtcgtcgaggacgacatg1560
aatgtgttgtcggagaagatgggttacctcaactcaaatggcccaacggctggggaatag1620
ctaatttcatccacattgctgtcagctttcgccatgtgaatttaactgaa1680
ttttagttgaatttctgcttgctactggcatgcctccctccctgtgttactgaccgtagt1740
gatttgttcgttgttaggccatatagcctgccagtcatgtaaaatgagtaaaggtgttga1800
tgatccacaaatgttctgttCCgtgttgtCagatggtctgcctgtatttgtagtcgtgct1860
tagtgtgtgcaatgttgtaatgatatctaatattaatctgtacttctcgtaatgacatct1920
gatcttaatctgattgcagaagtgctttgaattgc195權(quán)利要求
1.一種熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因在培育晚熟植物品種中的應(yīng)用，其堿基序列如 SEQ ID NO 2所示，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因在培育耐儲(chǔ)存種子育種中的應(yīng)用，其堿基序列如 SEQ ID NO 2所示，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.一種熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因在培育高品質(zhì)植物品種中的應(yīng)用，其堿基序列如 SEQ ID NO 2所示，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻、玉米、小麥、大豆和番茄。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述植物為水稻、玉米、小麥、大豆和番茄。
8.含有權(quán)利要求1所述的水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的植物表達(dá)載體。
9.含有權(quán)利要求1所述的水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明公開水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子OsHsfA2b在培育晚熟、高品質(zhì)和種子耐儲(chǔ)存育種中的應(yīng)用。本發(fā)明人通過構(gòu)建過表達(dá)OsHsfA2b的水稻突變株，發(fā)現(xiàn)該突變株在長日照、短日照和中日照條件下均較野生型水稻晚花，且該突變株種子萌發(fā)和發(fā)芽受抑制甚至喪失發(fā)芽能力。這一結(jié)果為培育晚熟、高品質(zhì)和種子耐儲(chǔ)存的水稻新品種提供了一個(gè)可利用的新基因資源。
文檔編號C12N15/29GK102134272SQ20101010118
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者亓建飛, 儲(chǔ)成才, 馮明姬, 劉春艷, 曹曉風(fēng), 李杭序 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所