專(zhuān)利名稱(chēng)：干細(xì)胞的產(chǎn)生和保持的制作方法
干細(xì)胞的產(chǎn)生和保持
背景技術(shù)：
盡管從1981年就已經(jīng)由小鼠建立了胚胎干細(xì)胞(ESCs)，但是由各種其它哺乳動(dòng)物(包括大鼠)衍生它們的對(duì)應(yīng)體的嘗試尚未成功。近來(lái)，從小鼠和大鼠的植入后卵圓柱期上胚層衍生了多能干細(xì)胞(Brons等，Nature (自然)448，191-195 ^)07) ；Tesar等， Nature (自然)448，196-199 Q007))。這些新型的干細(xì)胞被命名為上胚層干細(xì)胞(EpiSCs)。 在群落形態(tài)和對(duì)保持多能性的培養(yǎng)/信號(hào)傳導(dǎo)需要方面，EpiSCs似乎非常接近地對(duì)應(yīng)于人胚胎干細(xì)胞(hESCs)，但是表現(xiàn)出一定范圍的與小鼠ES細(xì)胞(mESCs)不同的顯著的表型和信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)差異。白血病抑制因子(LIF)是在存在血清的條件下通過(guò)JAK-STAT3途徑保持mESCs 多能性所必需的(Niwa等，Genes Dev (基因發(fā)育)12，2048-2060 (1998))。然而，在不含血清的培養(yǎng)基中，還需要BMP4，以及LIF，以通過(guò)誘導(dǎo)分化(Id)蛋白表達(dá)的抑制劑(Ying 等，Cell (細(xì)胞)115，281-292 Q003))和抑制 ERK 激活(Qi 等，Proc Natl Acad Sci U S A(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))101,6027-6032^)05))來(lái)保持mESC的自我更新。與mESCs相反，LIF不能支持EpiSCs/hESCs，其典型地需要堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)/激活蛋白A(ACtivin Α)進(jìn)行長(zhǎng)期的自我更新。未分化的hESCs通過(guò)bFGF信號(hào)傳導(dǎo)表現(xiàn)出高水平的基本 ERK 活性(Dvorak 等，Stem Cells (干細(xì)胞)23，1200-1211 (2005))。BMP4 也不支持EpiSC/hESC自我更新，但是相反誘導(dǎo)EpiSC/hESC分化成滋養(yǎng)層或原始內(nèi)胚層(Brons 等，Nature (自然)448，191-195 (2007) ；Tesar 等，Nature (自然)448,196-199(2007)； Xu 等，Nat Biotechnol(自然生物技術(shù))20，1261-1^4(2002))。除了 bFGF 之外，已經(jīng)表明激活蛋白A/Nodal信號(hào)傳導(dǎo)支持hESCs/EpiSCs的未分化狀態(tài)(Brons等，Nature (自然)448，191-195(2007) ；Sato 等，Dev Biol (發(fā)育生物學(xué))260，404-413 (2003) ；Tesar 等， Nature (自然)448，196-199 Q007))，而對(duì)于mESCs不是必要的。這些結(jié)果強(qiáng)烈支持下述觀(guān)點(diǎn)=EpiSCs和hESCs本質(zhì)上是相似的，并且提出一種吸引人的假說(shuō)，即，mESCs和EpiSCs/ hESCs代表兩種不同的多能狀態(tài)表示植入前內(nèi)細(xì)胞群(ICM)的mESC-樣狀態(tài)，和表示后期上胚層細(xì)胞的EpiSC-樣狀態(tài)。mESCs通?？梢允褂没谧甜B(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)條件而來(lái)源于某些小鼠品系 (Martin, G. R. ,Proc Natl Acad Sci U S A (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))78，7634-7638 (1981))。 然而，已經(jīng)證明在相似條件下很難由大鼠衍生真正的ES細(xì)胞。已經(jīng)報(bào)道了大鼠ESC-樣細(xì)胞的建立(Demers 等，Cloning Stem Cells (克隆干細(xì)胞)9，512-522 Q007) ；Ruhnke 等，Stem Cells(干細(xì)胞)21，428-436Q003) ；Schulze 等，Methods Mol Biol (分子生物學(xué)方法)329， 45-58(2006)山eda等，PLoS ONE 3，^80(^2008))，但是這些細(xì)胞不能穩(wěn)定地保持或者缺少真正的體內(nèi)多能性(例如，不能形成畸胎瘤或?qū)η逗象w沒(méi)有/有很少的貢獻(xiàn))。類(lèi)似地， 盡管已經(jīng)衍生了(體外)多能性大鼠EpiSCs，但是大鼠和小鼠EpiSCs都表現(xiàn)出很少的能力或沒(méi)有能力再結(jié)合到植入前的胚胎中并且形成嵌合體(Brons等，Nature (自然)448， 191-195(2007) Jesar 等，Nature (自然)448，196-199 Q007))。最近，通過(guò)確定的遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)由小鼠和人體細(xì)胞產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSCs)吸引了眾多興趣(Dimos 等，Science (科學(xué))321，1218-1221 (2008) ；Han, J.，和 Sidhu， K. S. Curr Stem Cell Res Ther (現(xiàn)代干細(xì)胞研究和治療)3，66-74 O008) ;Takahashi 等，Cell (細(xì)胞)131,861-872(2007) ；Takahashi, K.，禾口 Yamanaka，S.，Cell (細(xì)胞)126， 663-676 (2006) ；Yu 等，Science (科學(xué))318，1917-1920 (2007))。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供經(jīng)過(guò)至少一次細(xì)胞分裂培養(yǎng)多能細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在充足量的a. ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；和C.充分的營(yíng)養(yǎng)足夠的時(shí)間；存在時(shí)培養(yǎng)多能動(dòng)物細(xì)胞，以允許至少一次細(xì)胞分裂同時(shí)保持細(xì)胞的多能性。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟還包括在存在一定量的GSK3i3抑制劑時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述GSK3 β抑制劑是CHIR99021。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述MEK 抑制劑是PD0325901。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟在還存在白血病抑制因子(LIF)時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5抑制劑是Α-83-01。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5 抑制劑是SB431542。在一些實(shí)施方案中，所述多能細(xì)胞通過(guò)至少5次細(xì)胞分裂培養(yǎng)同時(shí)保持細(xì)胞多能性。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述多能細(xì)胞中引入異源核酸，并且培養(yǎng)所得到的細(xì)胞，以允許至少一次另外的細(xì)胞分離，同時(shí)保持多能性。在一些實(shí)施方案中，將異源核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞中，然后誘導(dǎo)多能性，再然后進(jìn)行培養(yǎng)步驟。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞或人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)、羊、牛、貓、狗、或豬的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述多能細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述多能細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非人動(dòng)物細(xì)胞，并且所述方法還包括將所述多能細(xì)胞引入到胚泡中，其中所述胚泡與所述細(xì)胞來(lái)自相同的動(dòng)物物種，并且將所述胚泡引入到相同物種的動(dòng)物的子宮內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括基于來(lái)自所述多能細(xì)胞的核酸的存在而選擇所述動(dòng)物的嵌合后代。本發(fā)明還提供多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物包括充足量的下述a. ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；以允許至少一次細(xì)胞分裂，同時(shí)保持細(xì)胞多能性。
在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物還包括LIF。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物還包括一定量的GSK3 β抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述GSK3 3抑制劑是CHIR99021。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述MEK 抑制劑是PD0325901。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5 抑制劑是Α-83-01。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5抑制劑是SB431542。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞或人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、牛、貓、狗、或豬的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包括充足量的下述a. ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；從而在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞時(shí)，允許至少一次細(xì)胞分裂，同時(shí)保持細(xì)胞多能性。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包括LIF。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包括一定量的GSK3 β抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述GSK3 3抑制劑是CHIR99021。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是MEK抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述MEK 抑制劑是PD0325901。在一些實(shí)施方案中，所述第二化合物是Erk抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5 抑制劑是Α-83-01。在一些實(shí)施方案中，所述ALK5抑制劑是SB431542。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基在預(yù)先包裝的、密封容器中。在一些實(shí)施方案中， 所述培養(yǎng)基包括DMEM或其它對(duì)生長(zhǎng)人、大鼠、小鼠或其它動(dòng)物的細(xì)胞相容的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供分離的多能動(dòng)物細(xì)胞，所述細(xì)胞在存在白血病抑制因子(LIF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)時(shí)，或在抑制TGFi3和激活蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制MAH(信號(hào)傳導(dǎo)途徑，和任選地抑制FGF途徑時(shí)，進(jìn)行復(fù)制并且保持多能性。在一些實(shí)施方案中，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞不是鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人iPS細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是大鼠胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是大鼠iPS細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在抑制ALK5和 MEK時(shí)保持多能性。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括異源表達(dá)盒，其包括但不限于，編碼可選擇或可檢測(cè)的標(biāo)記(例如，堿性磷酸酶)的表達(dá)盒。與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、上胚層干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，本發(fā)明的分離的多能細(xì)胞表達(dá)更高水平的E-鈣粘著蛋白(E-cadherin)。例如，與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、上胚層干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)2倍更高水平的E-鈣粘著蛋白。在一些實(shí)施方案中，與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、上胚層干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)更高水平的標(biāo)記，其中所述標(biāo)記包括(Λχ2，Dppa3, Klf4，和Rexl。在一些實(shí)施方案中，在存在A(yíng)LK5抑制劑，存在選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑的第二化合物時(shí)，培養(yǎng)本發(fā)明所述分離的多能細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多能細(xì)胞通過(guò)在存在A(yíng)LK5抑制劑，和選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、 P38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種的第二化合物時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞獲得或可通過(guò)在存在A(yíng)LK5抑制劑，和選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種的第二化合物時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞獲得。例如，本發(fā)明的分離的多能細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、EpiSCs、大鼠ESCs、或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物ESCs而獲得或可通過(guò)培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)的 hESCs、EpiSCs、大鼠ESCs、或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物ESCs而獲得。本發(fā)明還提供了增加部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多能性至更加完全多能的細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施例中，所述方法包括(a)使所述部分多能細(xì)胞與外遺傳修飾劑接觸，所述外遺傳修飾劑選自組蛋白脫乙酰酶抑制劑、組蛋白H3K4去甲基化抑制劑或H3K4甲基化激活劑；(b)在步驟(a)后，在不存在所述外遺傳修飾劑時(shí)和用下述中的兩種或多種培養(yǎng)所述細(xì)胞(i)ALK5抑制劑，(ii) MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和(iii)FGF受體抑制劑，由此產(chǎn)生比所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞更加完全多能的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括(c)在步驟(b)后用下述培養(yǎng)所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞(i)ALK5抑制劑，(ii) MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和(iii) FGF受體抑制劑和(iv)GSK3抑制劑。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟(a)和/或(b)和/或(C)還包括在存在白血病抑制因子(LIF)時(shí)培養(yǎng)所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述部分多能細(xì)胞是上胚層干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述部分多能細(xì)胞不表達(dá)至少一種下述標(biāo)記，所述標(biāo)記選自由0ct4，NanOg，SSEA-UP REX-I組成的組，并且所述更加完全多能的細(xì)胞表達(dá)一種或多種或所有所述標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述部分多能細(xì)胞不表達(dá)ALP-1，并且所述更加完全多能的細(xì)胞表達(dá)ALP-I。在一些實(shí)施方案中，所述外遺傳修飾劑是丙戊酸或硫酸反苯環(huán)丙胺(parnate)。附圖簡(jiǎn)述圖l.mESC-樣riPSCs可以由通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)0ct4，Sox2和Klf4后的大鼠 WB-F344 細(xì)胞產(chǎn)生，并且在 LIF，0. 5μΜ PD0325901，0. 5 μ ΜΑ-83-01 和 3 μ M CHIR99021 的組合下捕獲/保持。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后10天觀(guān)察到ESC-樣的群落(A)，但是不能在常規(guī)mESC培養(yǎng)條件下保持(B)。在存在0. 5 μ M PD0325901和3 μ M CHIR99021時(shí)，riPSCs可以短期保持在培養(yǎng)物中但是表現(xiàn)出廣泛的自發(fā)性分化(C)。使用0. 5μΜ PD0325901,3yMCHIR99021, 和0.5μΜΑ-83-01的組合，riPSCs可以長(zhǎng)期且同質(zhì)自我更新(D)，并且在培養(yǎng)物中形成 mESC-樣圓頂群落(E)。免疫細(xì)胞化學(xué)揭示riPSCs表達(dá)典型的mESC標(biāo)記，諸如0ct4(F)， Sox2 (G)，SSEA-I (H，綠色)和Nanog (H，紅色)。4個(gè)克隆的riPSC株系的RT-PCR分析證實(shí)內(nèi)源性典型多能標(biāo)記的表達(dá)(I)，但是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在很大程度上被沉默。riPSC克隆的 0ct4啟動(dòng)子表現(xiàn)出去甲基化模式并且與親本W(wǎng)B-F344細(xì)胞的模式明顯不同(J)。
圖2. riPSCs在體外和體內(nèi)具有多能發(fā)育潛能。免疫染色顯示riPSCs在體外可以分化成內(nèi)胚層(白蛋白和Pdxl) (A和B)，神經(jīng)外胚層(β III-微管蛋白，Tujl) (C)和中胚層 (Brachyury) (D)衍生物。并且，在SCID小鼠中，riPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三個(gè)胚層組成(E H)。另外，在注射到Brown-Norway大鼠胚泡中后，具有WB F344背景的 riPSCs能夠產(chǎn)生嵌合體大鼠(I)。相對(duì)放大倍率A E(100X)，F(xiàn) H和J ζΚ200Χ)。圖3.產(chǎn)生新型“mESC-樣"hiPSCs。將IMR90人成纖維細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)0ct4， Sox2, Nanog，和Lin28。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3周觀(guān)察到hiPSC群落(A)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第4周挑取群落并且穩(wěn)定保持在hLIF，0. 5μΜ PD0325901,0. 5μΜ Α-83-01，和 3μΜ CHIR99021 的混合物中。這樣的hiPSCs與mESCs類(lèi)似形成圓頂群落(B)。在這樣的條件下，hiPSCs對(duì)ALP(C)和其它典型的多能標(biāo)記(D I)是陽(yáng)性的。4個(gè)克隆的riPSC株系的RT-PCR分析證實(shí)內(nèi)源性多能基因的表達(dá)(J)，但是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在很大程度上被沉默。hiPSCs克隆的0ct4啟動(dòng)子表現(xiàn)出與常規(guī)培養(yǎng)的人ES細(xì)胞相似的去甲基化模式，但是與親本IMR90成纖維細(xì)胞的模式明顯不同⑷。提供了 hiPSCs的核型分析(L)。圖4.免疫染色顯示hiPSCs在體外可以有效地分化成內(nèi)胚層(白蛋白)(A)，神經(jīng)外胚層(β III-微管蛋白，Tuj 1) (B)和中胚層(Brachyury) (C)衍生物。在植入到SCID 小鼠中后，hiPSCs可以形成畸胎瘤，所述畸胎瘤由所有三個(gè)胚層組成，包括神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)(外胚層)(D)，微管樣結(jié)構(gòu)(內(nèi)胚層)(D)，軟骨樣結(jié)構(gòu)(中胚層)(E)。相對(duì)放大倍率 A(IOOX)，B 以200X)。圖5.不同的小分子組合對(duì)保持riPSCs在培養(yǎng)中的多能性的作用。將riPSCs胰蛋白酶化為單細(xì)胞，并且以103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6-孔板中，并且用不同的抑制劑組合處理。5天后，進(jìn)行ALP染色以顯現(xiàn)riPSC群落(A)。從10個(gè)隨機(jī)的40 X視野計(jì)數(shù)每種條件的ALP陽(yáng)性群落，并且相對(duì)群落數(shù)目總結(jié)在B中。圖6. EpiSCs在mESC生長(zhǎng)條件下分化，并且不容易轉(zhuǎn)化為ICM/mESC-樣狀態(tài)。(A) 在補(bǔ)充了 LIF的常規(guī)mESC生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，鼠ESCs Rl生長(zhǎng)為致密的圓頂群落，并且所述群落表現(xiàn)出陽(yáng)性ALP活性(上左圖)。在補(bǔ)充了 bFGF的常規(guī)hESC培養(yǎng)基中，EpiSCs生長(zhǎng)為大而扁平的群落，并且所述群落表現(xiàn)出陰性ALP活性(上右圖)。EpiSCs在補(bǔ)充了 LIF的常規(guī) mESC生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分化(下左圖)；EpiSCs在補(bǔ)充了 LIF和0. 5μΜ MEK抑制劑PD0325901， 0. 1 μ M EGFR 抑制劑 PD173074 與 3 μ M GSK3 抑制劑 CHIR99021 (m/MFGi)的常規(guī) mESC 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分化(下右圖)。(B)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的示意圖。將EpiSCs胰蛋白酶化成單細(xì)胞， 并且在mESC自我更新條件下接種到飼養(yǎng)細(xì)胞上，補(bǔ)充所示的化學(xué)化合物約4天，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，然后再選擇4天。隨后再次平板接種培養(yǎng)物并且進(jìn)一步選擇和再擴(kuò)增2周，在該時(shí)間過(guò)程中挑取穩(wěn)定的克隆。(C)通過(guò)選擇性ALK4/5/7抑制劑A-83-01 (0. 5 μ Μ)抑制TGF β信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)EpiSCs形成表達(dá)ALP的更致密的圓頂群落。(D)這些群落可以在補(bǔ)充了 LIF和 0. 5μΜ Α-83-01，0· 5μ M PD0325901，0· 1 μ M PD173074 與 3 μ MCHIR99021 (mAMFGi)的 mESC 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)一步穩(wěn)定擴(kuò)增。(E)LSD抑制劑硫酸反苯環(huán)丙胺誘導(dǎo)EpiSCs形成表達(dá)ALP 的更致密的圓頂群落。這些群落可以在mMFGi或(F)mAMFGi條件下進(jìn)一步穩(wěn)定擴(kuò)增。注意 mESC-樣圓頂群落和陽(yáng)性ALP活性。刻度條，50 μ m。圖7.通過(guò)用硫酸反苯環(huán)丙胺與ALK4/5/7，MEK, FGFR和GSK3的抑制劑處理， EpiSCs轉(zhuǎn)化為ICM/mESC-樣狀態(tài)。(A)由三種類(lèi)型的化合物-處理的細(xì)胞產(chǎn)生嵌合體的效率。⑶在將聚集的胚胎植入到假孕小鼠中后，在成體小鼠中通過(guò)硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi 的條件由EpiSCs轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定的mESC-樣細(xì)胞形成嵌合體。野鼠色涂膜色源自硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞。(C)在多個(gè)成體組織中存在GFP整合的PCR基因型。(D)通過(guò)由用GFP 標(biāo)記的硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞產(chǎn)生的熒光檢查E13. 5胚胎，并且在多個(gè)胚胎組織中觀(guān)察到GFP-陽(yáng)性細(xì)胞(較高分辨率的圖片顯示在圖IOA中)。(E)通過(guò)FACS分離性腺中的 GFP/SSEA-1雙重陽(yáng)性細(xì)胞，并且通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢驗(yàn)種系標(biāo)記。結(jié)果證明在硫酸反苯環(huán)丙胺 /mAMFGi細(xì)胞-形成的種系譜系中種系標(biāo)記Blimpl和Mella的特異性表達(dá)。條士STDV。圖8.轉(zhuǎn)化的硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞的分子表征。(A)免疫細(xì)胞化學(xué)表明多能標(biāo)記0ct4 (綠色)，Nanog (紅色)，和SSEA-I (紅色)在硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞中的均勻表達(dá)。(B)通過(guò)半定量RT-PCR分析特異性ICM標(biāo)記基因(Rex-I，Pecaml，Dax l，Dppa5， Esrrb，F(xiàn)gf4，禾口 Fbxol5)、禾中系能力相關(guān)的標(biāo)記基因(germline competence associated marker genes) (Mella 和 Stra8)、和 Epiblast 基因(fgf5)在 mESCs，EpiSCs，和硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞中的表達(dá)。(C)mESCs，EpiSCs，和硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)分析表明，與EpiSCs相比，硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞要與mESCs相似得多。兩種生物學(xué)復(fù)本用于所有三種細(xì)胞類(lèi)型。(D)通過(guò)亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序甲基化分析Mella和Fgf4啟動(dòng)子。空心圓和實(shí)心圓分別表示未甲基化的和甲基化的Cpk。(E) 多種細(xì)胞中在stella基因座中所示的組蛋自修飾的ChIP-QPCR分析。用所示的抗體由不含飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的EpiSCs，Rl-mESCs，和硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞免疫沉淀基因組DNAs， 然后使用對(duì)編碼Mella的內(nèi)源性基因組基因座特異性的引物組進(jìn)行Q-PCR分析。將組蛋白修飾的水平表示為插入(input)的百分?jǐn)?shù)。IgG作為無(wú)抗體對(duì)照。圖9.轉(zhuǎn)化的硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞的功能表征。㈧硫酸反苯環(huán)丙胺/ mAMFGi具有與mESCs相似的生長(zhǎng)速率。將Rl-mESCs和硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞每3 天傳代，并且每M小時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。(B)硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞在體外可以有效地分化成三個(gè)胚層中的細(xì)胞，包括特征性的神經(jīng)細(xì)胞(β III-微管蛋白和MAP2ab陽(yáng)性的)， 心肌細(xì)胞(心臟肌鈣蛋白和MHC陽(yáng)性的)，和內(nèi)胚層細(xì)胞(Soxl7或白蛋白陽(yáng)性的)。細(xì)胞核用DAPI染色。(D)BMP4對(duì)在EpiSCs，mESCs，和硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞中引入中胚層標(biāo)記(Brachyury)，滋養(yǎng)層標(biāo)記(Cdx2)，和原始內(nèi)胚層標(biāo)記(feita6)表達(dá)有不同的影響。 (E)在單層和化學(xué)限定的條件下的定向逐步心肌細(xì)胞分化表明，硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi 細(xì)胞與Rl-mESCs共有相似的分化反應(yīng)，并且與EpiSCs不同。將細(xì)胞用CT3染色和搏動(dòng)表型(beating phenotype)進(jìn)行表征。

圖10.硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞有效地形成嵌合體小鼠。(A)來(lái)自嵌合體胚胎的組織。在性腺、腦、心臟、腸、肺和腎中觀(guān)察到由硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞形成的GFP 陽(yáng)性細(xì)胞。⑶嵌合體成體小鼠的GFP基因型。隨機(jī)挑選5只小鼠，并且通過(guò)基因組PCR分析在5種不同的組織，即，心臟、肺、肝、腦、和脾中的GFP整合。在2只成體小鼠的所有5種組織，在3只小鼠的4種組織中的GFP整合的陽(yáng)性檢測(cè)，證實(shí)硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞在體內(nèi)可能形成三個(gè)胚層(中胚層、內(nèi)胚層和外胚層)。圖11.在有飼養(yǎng)細(xì)胞或無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，多能標(biāo)記在轉(zhuǎn)化的硫酸反苯環(huán)丙胺 /mAMFGi細(xì)胞中的均勻表達(dá)。(A)將硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞用GFP標(biāo)記，并且在飼養(yǎng)細(xì)胞上增殖。免疫染色結(jié)果表明GFP和多能標(biāo)記0ct4 (紅色)，Nanog (紅色)，和SSEA-I (紅色)的均勻表達(dá)。(B)由單一的硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞發(fā)育未分化的0ct4-陽(yáng)性群落與由單一的0G2-ES細(xì)胞發(fā)育一樣有效。在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和N2B27-化學(xué)限定的條件下進(jìn)行單細(xì)胞接種后，將群落擴(kuò)增幾代。刻度條，50ym。(C)在不存在LIF時(shí)，硫酸反苯環(huán)丙胺 /mAMFGi細(xì)胞分化并且失去0ct4表達(dá)。在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和N2B27-化學(xué)限定的條件下進(jìn)行單細(xì)胞接種后，硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞擴(kuò)增；顯示補(bǔ)充生長(zhǎng)因子。圖12.在轉(zhuǎn)化的硫酸反苯環(huán)丙胺/mAMFGi細(xì)胞和Rl_mESC細(xì)胞中檢測(cè)到STELLA 表達(dá)，但是在EpiSCs中沒(méi)有檢測(cè)到。免疫染色結(jié)果顯示STELLA和DAPI的表達(dá)。定義術(shù)語(yǔ)“多能”或“多能性”指具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細(xì)胞，所述后代能夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類(lèi)型。多能干細(xì)胞可以形成出生前、出生后或成年動(dòng)物的許多或全部組織。標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公認(rèn)測(cè)試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力， 可以用于確定細(xì)胞群的多能性，然而，不同多能干細(xì)胞特征的鑒定也可以用于檢測(cè)多能細(xì)胞。細(xì)胞多能性是一種連續(xù)體，范圍從可以正確形成每種胚胎細(xì)胞的完全多能細(xì)胞(例如， 胚胎干細(xì)胞和iPSCs)到不完全或部分多能細(xì)胞，所述不完全或部分多能細(xì)胞可以形成所有三種胚層，但是可能不表現(xiàn)出完全多能細(xì)胞的所有特征，諸如例如，種系傳遞(germline transmission)或產(chǎn)生完整的生物體的能力。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞的多能性由不完全或部分多能細(xì)胞增加至更加多能的細(xì)胞，或者，在某些實(shí)施方案中，增加至完全多能細(xì)胞。 例如，多能性可以通過(guò)畸胎瘤形成、種系傳遞、和四倍體配體互補(bǔ)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中， 多能性基因或多能性標(biāo)記的表達(dá)，如本文其它地方所討論的，可以用來(lái)測(cè)定細(xì)胞的多能性?！岸嗄芨杉?xì)胞特征”意指將多能干細(xì)胞與其他細(xì)胞相區(qū)別的細(xì)胞特征。產(chǎn)生能夠在適當(dāng)條件下經(jīng)歷分化成為共同展示與來(lái)自全部三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類(lèi)型的后代的能力是多能干細(xì)胞特征。表達(dá)或不表達(dá)某些分子標(biāo)記物組合也是多能干細(xì)胞特征。例如，人多能干細(xì)胞表達(dá)來(lái)自以下非限制性列表的標(biāo)記物中的至少一些，且任選地表達(dá)其全部SSEA_3，SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-鈣粘著蛋白，UTF-I，0ct4，RexlJP Nanog。與多能干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)也是多能干細(xì)胞特征。術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”，根據(jù)其在本領(lǐng)域中的一般用法，用于表示分子集合，其任選地以可以鑒別各成員的方式來(lái)組織和/或分類(lèi)。文庫(kù)可以包括，但不僅限于，組合化學(xué)藥品文庫(kù)，天然產(chǎn)物文庫(kù)，和肽文庫(kù)?！爸亟M”多核苷酸是不以其天然狀態(tài)存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸處于除其天然存在的背景以外的背景中， 例如，與其在自然界中典型接近的核苷酸序列分開(kāi)，或與其典型不接近的核苷酸序列相鄰 (或相連)。例如，可以將研究的序列克隆至載體中，或否則與一種或多種另外的核酸重組。“表達(dá)盒”指包括啟動(dòng)子或與編碼蛋白的序列可操作相連的其他調(diào)控序列的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”和“表達(dá)控制序列”在本文中用于指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列陣列。用于本文中時(shí)，啟動(dòng)子包括接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的必需核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情形中，包括TATA元件。啟動(dòng)子還任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑子元件，其可以位于距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)多至數(shù)千堿基對(duì)處。啟動(dòng)子包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作相連”指核酸表達(dá)控制序列(諸如啟動(dòng)子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄?！爱愒葱蛄小被颉爱愒春怂帷?，用于本文中時(shí)，是來(lái)源于與特定宿主細(xì)胞異源的來(lái)源的序列或核酸，或如果來(lái)自相同來(lái)源，則由其初始形式進(jìn)行修飾。因此，細(xì)胞中的異源表達(dá)盒不是特定宿主細(xì)胞內(nèi)源的表達(dá)盒，例如通過(guò)與來(lái)自表達(dá)載體的核酸序列而非染色體DNA 相連，與異源啟動(dòng)子相連，與報(bào)道基因相連等。術(shù)語(yǔ)“試劑”或“測(cè)試化合物”指用于本文所述的篩選測(cè)定中的任一化合物。試劑可以是，例如，有機(jī)化合物，多肽(例如，肽或抗體)，核酸(例如，DNA、RNA、雙鏈、單鏈、 寡核苷酸、反義RNA、小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶等)，寡糖，脂質(zhì)。通常，本發(fā)明篩選方法中使用的試劑具有小于10，000道爾頓，例如，小于8000，6000，4000，2000道爾頓，例如，50-1500，500-1500, 200-2000, 500-5000之間道爾頓的分子量。測(cè)試化合物可以采用測(cè)試化合物文庫(kù)的形式，諸如提供充足多樣性范圍的組合文庫(kù)或隨機(jī)文庫(kù)。測(cè)試化合物任選地與融合配偶體，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，穩(wěn)定化合物，可尋址化合物 (addressable compounds)，和其他功能結(jié)構(gòu)部分相連。常規(guī)地，具有有用特性的新化學(xué)個(gè)體通過(guò)下述來(lái)產(chǎn)生鑒定具有一些理想特性或活性，例如在某些條件下諸如本文中所述的條件下誘導(dǎo)多能性的能力的測(cè)試化合物(稱(chēng)為“前導(dǎo)化合物”)，產(chǎn)生所述前導(dǎo)化合物的變體，和評(píng)估那些變體化合物的特性和活性。通常，將高通量篩選(HTQ方法用于所述分析。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換地用于指采用單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括包含已知的核苷酸類(lèi)似物或修飾的主鏈殘基或連鎖的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有與參照核酸類(lèi)似的結(jié)合特性，且其以與參照核苷酸類(lèi)似的方式代謝。所述類(lèi)似物的實(shí)例包括，但不僅限于，硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯(methyl phosphonates)，手性-甲基膦酸酯，2-0-甲基核糖核酸，肽-核酸(PNAs)。除非另外指出，特定核酸序列還包括其保守修飾變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換) 和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子置換可以通過(guò)產(chǎn)生這樣的序列來(lái)獲得，在所述序列中，一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes (分子細(xì)胞探針)8 :91-98 (1994))。表達(dá)或活性的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”分別用來(lái)指利用關(guān)于所述靶蛋白 (或編碼多核苷酸)表達(dá)或活性的體外和體內(nèi)測(cè)定所鑒定的抑制分子、活化分子或調(diào)節(jié)分子，例如，配體、激動(dòng)劑、拮抗劑、及其同系物和模擬物。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，抑制所述靶蛋白表達(dá)或與之結(jié)合，部分或全部阻斷刺激或蛋白酶抑制劑活性，降低、防止、延遲活化，失活，脫敏，或下調(diào)所述靶蛋白活性的試劑，例如拮抗劑。活化劑是例如，誘導(dǎo)或活化所述靶蛋白表達(dá)或與之結(jié)合，刺激、增加、開(kāi)放、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化或蛋白酶抑制劑活性，致敏或上調(diào)所述靶蛋白(或編碼多核苷酸)的活性，例如，激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑包括天然存在的和合成的配體，拮抗劑和激動(dòng)劑(例如，起激動(dòng)劑或拮抗劑功能的小化學(xué)分子、抗體等)。所述關(guān)于抑制劑和活化劑的測(cè)定包括，例如，將推定的調(diào)節(jié)劑化合物應(yīng)用到表達(dá)所述靶蛋白的細(xì)胞，然后確定對(duì)所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。將用潛在的活化劑、抑制劑、或調(diào)節(jié)劑處理的包括所述靶蛋白的樣品或測(cè)定與無(wú)抑制劑、活化劑、或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢驗(yàn)作用程度。對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)被賦予100%的相對(duì)活性值。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照為約80%，任選50%或25，10%，5%或時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的抑制。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照為約110 %，任選150 %，任選200，300 %， 400 %，500 %，或1000-3000 %或更高時(shí)，實(shí)現(xiàn)所述靶蛋白的活化。"Oct多肽”指Octomer轉(zhuǎn)錄因子家族的任一天然存在成員，或其保留與最接近的相關(guān)天然存在家族成員相類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內(nèi))的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。示范性 Oct 多肽包括，例如，Oct-1, 0ct-2, 0ct-3/4, 0ct-6, 0ct-7, 0ct-8, 0ct-9，和Oct-11。0ct3/4(本文中稱(chēng)為〃 0ct4 〃)，其包含POU結(jié)構(gòu)域，其為在Pit_l， Oct-1, 0ct-2，和 uric-86 之間保守的 150 個(gè)氨基酸序列。參見(jiàn) Ryan，Α. K. &Rosenfeld, Μ. G. Genes Dev.(基因發(fā)育)11，1207-1225 (1997)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Oct 多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號(hào)NP_002692. 2 (人0ct4)或 NP_038661. 1(小鼠0ct4)列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85%,90%^ 95%的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如，0ct3/4)可以來(lái)自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動(dòng)物。一般地，將使用與所操作的細(xì)胞物種為相同物種的蛋白。"Klf多肽”指Krilppel樣因子(Klfs)家族的任一天然存在成員，含有與果蠅 (Drosophila)胚胎模式調(diào)控子KrUppel類(lèi)似的氨基酸序列的鋅指蛋白，或保留與最接近相關(guān)的天然存在家族成員相類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內(nèi))的天然存在的成員的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn)，Dang，D.T.，Pevsner，J.Mang，V. W. .Cell Biol.(細(xì)胞生物學(xué))32,1103-1121 (2000)。示范性 Klf 家族成員包括，Klf 1，Klf2，Klf3，Klf_4，Klf5， Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, KlflO, Klfll, Klfl2, Klfl3, Klfl4, Klfl5, Klf 16,^P Klfl7。發(fā)現(xiàn) Klf2和Klf-4是能夠在小鼠中產(chǎn)生iPS細(xì)胞的因子，并且相關(guān)的基因Klfl和Klf5也能夠在小鼠中產(chǎn)生iPS細(xì)胞，雖然效率降低。參見(jiàn)，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))26 =101-106 (2007)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Klf多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號(hào)CAX16088 (小鼠Klf4)或CAX14962 (人Klf4)列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85 %、90 %或95 %的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klfl，Klf4，和Klf5)可以來(lái)自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動(dòng)物。一般地，將使用與所操作的細(xì)胞物種為相同物種的蛋白。就本文中描述的KLF多肽而言，其可以用雌激素-相關(guān)受體β (Essrb)多肽替換。因此，意欲對(duì)于本文中所述的各種Klf多肽實(shí)施方案同等地描述使用Essrb替代Klf4多肽的相應(yīng)的實(shí)施方案。"Myc多肽”指Myc家族的任一天然存在成員(參見(jiàn)，例如Adhikary，S. &Eilers, Μ. Nat. Rev. Mol Cell Biol.(自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述)6 :635-645 Q005))，或其保留與最接近相關(guān)的天然存在家族成員相類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內(nèi))的變體，或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。示范性Myc多肽包括，例如，c-MyC，N-MyC和L-Myc。在一些實(shí)施方案中， 與天然存在Myc多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號(hào)CAA25015(人 Myc)列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如，c-Myc)可以來(lái)自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動(dòng)物。一般地，將使用與所操作的細(xì)胞物種為相同物種的蛋白。"Sox多肽”指SRY-相關(guān)的HMG-box (Sox)轉(zhuǎn)錄因子的任一天然存在成員，其特征在于存在高運(yùn)動(dòng)基團(tuán)(high-mobility group) (HMG)結(jié)構(gòu)域，或其保留與最接近相關(guān)的天然存在家族成員相類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄因子活性(在至少50%，80%，或90%活性之內(nèi))的變體， 或至少包括天然存在家族成員的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，并且可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn)，例如，Dang, D. Τ.，等ht. J. Biochem. Cell Biol.(國(guó)際生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)雜志)32 :1103-1121 (2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, SoxlO, Soxll, Soxl2, Soxl3, Soxl4, Soxl5, Soxl7, Soxl8, Sox-21, 和Sox30。已經(jīng)表明Soxl以與Sox2相似的效率產(chǎn)生iPS細(xì)胞，并且還已經(jīng)表明基因Sox3， Soxl5和Soxl8也產(chǎn)生iPS細(xì)胞，雖然其效率略低于Sox2。參見(jiàn)，Nakagawa,等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))26 :101-106 Q007)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在Sox 多肽家族成員諸如與以上列出的那些或諸如Genbank登記號(hào)CAA83435 (人Sox2)列出的那些相比，變體在其整個(gè)序列上具有至少85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。Sox多肽 (例如，Soxl, Sox2, Sox3, Soxl5，或Soxl8)可以來(lái)自于人、小鼠、大鼠、牛、豬、或其它動(dòng)物。 一般地，將使用與所操作的細(xì)胞物種為相同物種的蛋白。發(fā)明詳述I.介紹本發(fā)明基于意外的發(fā)現(xiàn)，即，ALK5抑制劑顯著提高細(xì)胞的保持，且任選地在細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。組合ALK5抑制劑和MAPK抑制劑(例如，MEK抑制劑，Erk抑制劑或p38抑制劑)或組合ALK5抑制劑與FGF途徑抑制劑(例如，F(xiàn)GF受體抑制劑)允許以新的功能特征保持細(xì)胞的多能性，所述新的功能特征在下文中定義，并且顯著不同于常規(guī)的人胚胎干細(xì)胞或先前所述的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(例如，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，843 ； 6，200，806 ；和7，029，913中)，并且更類(lèi)似于mESC特征；和例如，與先前已知的保持多能性的方法(例如，包括GSK3和MEK抑制劑-參見(jiàn) W02008/015418)相比，極大地提高細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性。實(shí)際上，令人驚訝的是，ALK5的抑制劑有效地部分提高多能性的保持，因?yàn)楸绢I(lǐng)域目前集中在激動(dòng)而不是拮抗TGFii途徑從而刺激多能性。參見(jiàn)，例如，WO 2008/056173。本發(fā)明部分提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含ALK5抑制劑(或其它TGF β /激活蛋白途徑抑制劑)和MAPK抑制劑或FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑，任選地包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在存在所述抑制劑的條件下已經(jīng)是多能性的或?qū)⑹嵌嗄苄缘幕蛞呀?jīng)被誘導(dǎo)為多能性的。任選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)物還可以包括GSK3 β抑制劑和/或白血病抑制因子(LIF)。 其它培養(yǎng)基成分和條件可以是本領(lǐng)域通常已知的且包括，例如，基本培養(yǎng)基成分，維生素， 礦物質(zhì)等。保持細(xì)胞為多能性的能力允許以另外將是不可能的多種方式研究和使用所述細(xì)胞。例如，多種多能干細(xì)胞在培養(yǎng)中迅速分化或死亡，并且因此不允許進(jìn)行篩選測(cè)定、遺傳改造、和其它需要或便利地保持多能性某段時(shí)間或經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代(例如，細(xì)胞分裂)的應(yīng)用。本發(fā)明允許人們克服這樣的問(wèn)題。II.培養(yǎng)物提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括ALK5抑制劑(或其它TGFi3 /激動(dòng)蛋白途徑抑制劑)，任選地具有MAPK (例如，MEK或Erk或p38抑制劑)或FGF信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(例如，F(xiàn)GF受體抑制劑)，從而誘導(dǎo)或保持哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多能性。在一些實(shí)施方案中，用所述抑制劑培養(yǎng)的細(xì)胞具有在實(shí)施例中所述的特征，包括但不限于，在培養(yǎng)物中形成圓頂群落，表達(dá)ESC 標(biāo)記(例如，0ct4, Sox2，和Nanog)，具有幾乎完全的0ct4啟動(dòng)子去甲基化，表達(dá)Rex-I和 ALP (例如，在植入后階段的上胚層和EpiSCs中不存在的ESCs和早期上胚層標(biāo)記)，在體外分化為內(nèi)胚層、神經(jīng)外胚層、和中胚層的能力以及體內(nèi)多能性特征，諸如形成畸胎瘤(例如，在SCID小鼠中)的能力，并且對(duì)于非人細(xì)胞，當(dāng)注射到胚泡中并且植入到接受體子宮內(nèi)時(shí)，形成嵌合體后代的能力。此外，在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)中的細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件中時(shí)保持所述特征持續(xù)多次細(xì)胞傳代，例如，至少1，2，3，4，5，7，10，20，30，或更多代。所述細(xì)胞培養(yǎng)物可以任選地還包括GSk3 β抑制劑和LIF中的一種或兩種。如在實(shí)施例中所解釋的，在一些實(shí)施方案中，存在LIF可以提高多能細(xì)胞的長(zhǎng)期保持(例如，超過(guò)10代)，并且因此充足量的LIF可以包含在培養(yǎng)物中，從而允許長(zhǎng)期保持多能性。此外， 有或無(wú)LIF，還可以包括充足量的GSK3i3抑制劑。在一些實(shí)施方案中，GSK3i3抑制劑的量足以提高培養(yǎng)效率，即，提高所形成的陽(yáng)性多能群落的數(shù)量。每種抑制劑的量可以不同，并且可以取決于精確的培養(yǎng)條件、所用的具體抑制劑、和培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型，為最佳優(yōu)點(diǎn)而確定。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)物包括 0. 05-10 μ Μ,例如，0. 1-1 μ Μ,例如，0. 5 μ M 的 ALK5 抑制劑(例如，Α-83-01，和 0. 1 20 μ Μ, 例如，2 10 μ M SB431542) 0本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β RI激酶抑制劑II [2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-IH-吡唑-4-基)-1，5_ 二氮雜萘]可以用作ALK5抑制劑，如本文所述，例如以約1. 5 μ M的濃度使用。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)物包括0. 05-20 μ Μ, 例如，0. 1-ΙΟμΜ的TGF-i3RI激酶抑制劑II。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)物包括 10ηΜ-5μΜ，例如，50ηΜ-1μΜ的FGF途徑抑制劑(例如，PD173074)。在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明的培養(yǎng)物包括0. 05-50 μ Μ,例如，0. 1-5 μ Μ,例如，0. 5 μ M的MEK抑制劑(例如， PD0325901)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)物包括0. 05-20 μ Μ,例如，0. 5-5 μ Μ,例如， 3 μ M 的 GSK3 β 抑制劑(例如，CHIR99021)。TGFβ受體(例如，ALK5)抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向TGFβ 受體(例如，ALK5)的反義核酸。示例性的TGF β受體/ALK5抑制劑包括，但不限于，SB431542(參見(jiàn)，例如，Inman，等，Molecular Pharmacology (分子藥理學(xué))62 (1) 65-74(2002))，A-83-01，也已知為3-(6-甲基-2-吡啶基)-N_苯基~4~ (4-喹啉基)-IH-吡唑-1-硫代酰胺(參見(jiàn)，例如，Tojo，等，Cancer kience (癌癥科學(xué))96 (11) 791-80(^2005)，并且例如可從 iToicris Bioscience (Toicris 生物科學(xué))商購(gòu)獲得)； TGF-^RI激酶抑制劑11 [2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)_1Η_吡唑-4-基)-1，5-二氮雜萘]；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1Η-吡唑-4-基)-l，5-二氮雜萘，Wnt3a/BI0(參見(jiàn)， 例如，Dalton，等，W02008/094597，通過(guò)引用結(jié)合于此)，BMP4(參見(jiàn)，Dalton，同前所述)， GW788388(-{4-[3-(吡啶-2-基)_1H_ 吡唑 ~4~ 基]吡啶-2-基}_N_ (四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(參見(jiàn)，例如，Gellibert，等，Journal of Medicinal Chemistry (醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)49 (7) :2210-2221 (2006))，SM16 (參見(jiàn)，例如，Suzuki，等，Cancer Research (癌癥研究)67(5) :2351-2359(2007)), IN-1130 (3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-IH-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(參見(jiàn)，例如，Kim，等，Xenobiotica 38(3) 325-339 (2008))，GW6604 (2-苯基-4- (3-吡啶-2-基-IH-吡唑 _4_ 基)吡啶)(參見(jiàn)， 例如，de Gouville，等，Drug News Perspective (藥物信息觀(guān)點(diǎn))19 O) :85-90 (2006)), SB-505124(2-(5-苯[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯_5_基-2-叔-丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶氫氯化物)(參見(jiàn)，例如，DaCosta，等，Molecular Pharmacology (分子藥理學(xué))65 (3) 744-752(2004))和嘧啶衍生物(參見(jiàn)，例如，在Miefl，等，W02008/006583中列出的那些， 通過(guò)引用結(jié)合于此)。不意欲限制本發(fā)明的范圍，據(jù)信ALK5抑制劑影響間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化 /轉(zhuǎn)變(MET)過(guò)程。TGFii/激活蛋白途徑是上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)的推動(dòng)劑。因此，抑制 TGF β /激活蛋白途徑可以促進(jìn)MET ( S卩，重編程)過(guò)程?？紤]本文中顯示抑制ALK5的作用的數(shù)據(jù)，據(jù)信TGFi3 /激活蛋白途徑的抑制將具有相似的作用。因此，TGFii/激活蛋白途徑的任何抑制劑(例如，上游或下游)可以與本文每段中所述的ALK5抑制劑組合使用或替代ALK5抑制劑使用。示例性的TGFi3 /激活蛋白途徑抑制劑包括，但不限于=TGF β受體抑制劑，SMAD 2/3磷酸化抑制劑，SMAD 2/3和SMAD 4相互作用抑制劑，以及SMAD 6和SMAD 7的激活劑/激動(dòng)劑。此外，下文所述的分類(lèi)僅是為了組織目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知化合物可以影響途徑中的一點(diǎn)或多點(diǎn)，并且因此化合物可以在多于一種所定義的分類(lèi)中起作用。TGF^受體抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向TGFii受體的反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于，STO416 ;2-(5_苯[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基-2-叔-丁基-3Η-咪唑基-4-基)-6-甲基吡啶氫氯化物(SB-505124)；樂(lè)地單抗(Ierdelimumb) (CAT-152)；美替木單抗(metelimumab) (CAT-192) ；GC-1008 ；IDll ； AP-12009 ；AP-11014 ；LY550410 ；LY580276 ；LY364947 ；LY2109761 ；SB-505124 ；SB-431542 ； SD-208 ；SM16 ；NPC-30345 ；Κ 26894 ；SB-203580 ；SD-093 ；格列衛(wèi)(Gleevec) ；3，5，7，2 ‘， 4 ‘-五羥黃酮(3，5，7，2' ,4 ‘ -pentahydroxyflavone)(桑色素(Morin))；激活蛋白-M108A ；P144 ；可溶TBR2_Fc ；和靶向TGFi^受體的反義轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。(參見(jiàn)，例如， Wrzesinski，等，Clinical Cancer Research (臨床癌癥研究)13 (18) :5262-5270(2007)； Kaminska,等，Acta Biochimica Polonica 52(2) :329-337(2005)；禾口Chang,等，F(xiàn)rontiers in Bioscience (生物科學(xué)前沿)12 :4393-4401 (2007))。SMAD 2/3磷酸化的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向SMAD2或SMAD3 的反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括PD169316 ；SB203580 ；SB-431542 ；LY364947 ；A77-01 ； ^P 3,5,7,2 ‘ ,4'-五羥黃酮(桑色素(Morin))。(參見(jiàn)，例如，Wrzesinski，同前所述；Kaminska,同前所述；Shimanuki，等，Oncogene (癌基因)26 :3311-3320(2007)；和 Kataoka，等，EP1992360，通過(guò)引用結(jié)合于此。)SMAD 2/3和smad4相互作用的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向 SMAD2, SMAD3和/或smad4的反義核酸。SMAD 2/3和SMAD4相互作用抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于，Trx-SARA, Trx_xFoxHlb 和 Trx-Lefl.(參見(jiàn)，例如，Cui，等，Oncogene (癌基因)24 :3864-3874 0005)和 Zhao，等，Molecular Biology of the Cell(分子分子生物學(xué))，17 :3819-3831(2006)) οMEK的抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶標(biāo)MEK的反義核酸。MEK抑制劑的具體實(shí)例包括，但不限于，PD0325901,(參見(jiàn)，例如，Rinehart，等，Journal of Clinical Oncology (臨床腫瘤學(xué)雜志)22 :4456-4462 (2004)), PD98059 (例如，可從 Cell Signaling Technology (細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù))獲得)，U0126 (例如，可從 Cell Signaling Technology (細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù))獲得)，SL 327 (例如，可從Sigma-Aldrich (西格瑪-奧地里奇)獲得)，ARRY-162(例如，可從Array Biopharma獲得)，PD184161(參見(jiàn)， 例如 Klein,等，Neoplasia (瘤形成)8 :1-8(2006)), PD184352 (CI-1040)(參見(jiàn)，例如， Mattingly, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics ( MM^ 和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志)316 :456-465 (2006))，舒尼替尼(sunitinib)(參見(jiàn)，例如，Voss，等， US2008004287，其通過(guò)引用并入本文)，索拉非尼(sorafenib)(參見(jiàn)，Voss同前所述)，凡德他尼(Vandetanib)(參見(jiàn)，Voss同前所述)，帕唑帕尼(pazopanib)(參見(jiàn)，例如，Voss同前所述)，阿昔替尼(Axitinib)(參見(jiàn)，Voss同前所述)和PTK787 (參見(jiàn)，Voss同前所述)。目前，一些MEK抑制劑正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估。CI-1040已經(jīng)在I期和II期癌癥臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估(參見(jiàn)，例如，Rinehart，等，Journal of Clinical Oncology (臨床腫瘤學(xué)雜志)22(22) :4456-4462 (2004))。臨床實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的其它MEK抑制劑包括 PD184352(參見(jiàn)，例如，English，等，Trends in Pharmaceutical Sciences (制藥科學(xué)趨勢(shì))23(1) :40-45(2002)), BAY43-9006 (參見(jiàn)，例如，Chow，等，Cytometry (血細(xì)胞計(jì)數(shù)) (Communications in Clinical Cytometry (臨床血細(xì)胞技術(shù)通訊))46 :72-78 Q001))， PD-325901 (也為 PD0325901)，GSK1120212, ARRY-438162，RDEAl19, AZD6244 (也為 ARRY-142886 或 ARRY-886)，R05126766，XL518 和 AZD8330 (也為 ARRY-704)。(參見(jiàn)，例如，來(lái)自全國(guó)衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health)位于萬(wàn)維網(wǎng) www. clinicaltrials. gov的信息以及來(lái)自全國(guó)癌癥研究所(Nation Cancer hstitute)位于萬(wàn)維網(wǎng)www. cancer, gov/clinicaltrials 的f|f;§、0p38(還已知為CSBP，mHOGl, RK和SAPK2)抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向P38的反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于SB203580 (4- (4-氟苯基)-2- 甲基亞磺酰苯基)-5- (4-吡啶基)IH-咪唑)；SB202190 (4- (4-氟苯基)-2- -羥苯基)-5(4-吡啶基)-1Η-咪唑)；SB 220025 ；N-(3-叔-丁基-1-甲基-5-吡唑基)-N ‘ -(4-(4-吡啶基甲基)苯基)脲；RPR200765A ；UX-745 ；UX-702 ； UX-850 ；SC10-469 ；RWJ-67657(Rff Johnson Pharmaceutical Research Institute(Rff 約翰遜制藥研究所))；RDP-58 (SangStat Medical Corp. (SangStat 醫(yī)藥公司)；由 Genzyme Corp. (Genzyme 公司)獲得)；Scios-323 (SCI0 323 ；Scios Inc. (Scios 公司))； Scios-469(SCI0-469 ；Scios Inc. Gcios 公司))；MKK3/MKK6 抑制劑(Signal Research Division(信號(hào)研究部門(mén)))；p38/MEK 調(diào)節(jié)劑(Signal Research Division(信號(hào)研究部門(mén)))；SB-210313 類(lèi)似物；SB-238039 ；HEP-689(SB 235699) ；SB-239063 ；SB-239065 ； SB-242235 (SmithKline Beecham Pharmaceuticals (SmithKline Beecham )) ；VX-702 禾口 VX-745(Vertex Pharmaceuticals Inc. (Vertex 制藥公司))；AMG—548(Amgen Inc. (Amgen 公司))；Astex p38 激酶抑制劑(Astex Technology Ltd. (Astex 技術(shù)有限公司))； RPR-200765 類(lèi)似物(Aventis SA) ；Bayer p38 激酶抑制劑(Bayer Corp. (Bayer 公司))；BIRB-796(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. (Boehringer Ingelheim fpy 藥公司))；Celltech p38MAP 激酶抑制劑(Celltech Group pic. (Celltech 集團(tuán)股票上市公司))；FR-167653 (Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd. (Fujisawa 制藥有限公司))； SB-681323 和 SB-281832 (GlaxoSmithKlineplc (GlaxoSmithKline 股票上市公司))； LEO制藥MAP激酶抑制劑(LEOPharma A/S) ；Merck Co.(默克公司)p38MAP激酶抑制劑 (Merck research Laboratories (默克研究實(shí)驗(yàn)室))；SC-040 和 SC-XX906 (Monsanto Co. (Monsanto 公司))；腺苷 A3 拮抗劑(Novartis AG) ；p38MAP 激酶抑制劑(Novartis Pharma AG) ；CNI-1493 (Picower Institute for Medical Research (Picower 醫(yī)藥石if 究所))；RPR-200765A(Rhone-Poulenc Rorer Ltd. (Rhone—Poulenc Rorer 有限公司))；禾口 Roche P38MAP 激酶抑制劑(例如，RO32Oll95 和 R04402257 ;Roche Bioscience (羅氏生物科學(xué)))。參見(jiàn)，例如，Roux，等，Microbiology and Molecular Biology Reviews(微生物和分子生物學(xué)綜述)68 ) :320-344(2004) ；Engelman，等，Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)273(48) :32111-32120(1998) Jackson,等，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (藥理學(xué)禾口實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志)284 (2): 687-692(1998) ；Kramer，等，Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)271 04) 27723-27729(1996)；和 Menko,等，US20080193504。另外的p38抑制劑包括但不限于，1,5- 二芳基-取代的吡唑和取代的吡唑化合物(US6509361和US6335336)；取代的吡啶基化合物(US20030139462)；喹唑啉衍生物 (US6M1477，US61842^，US6509363 和 US6635644)；芳基脲和雜芳基類(lèi)似物(US6;344476)； 雜環(huán)脲(W01999/32110)；其它脲化合物(W01999/32463, W01998/52558, W01999/00357 和 W01999/58502)；以及取代的咪唑化合物和取代的三唑化合物(US6560871和US6599910)。Erk抑制劑可以包括抗體，其顯性陰性變體和靶向Erk的反義核酸。Erk抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于PD98059 (參見(jiàn)，例如，^iu，等，Oncogene (癌基因)23 4984-4992(2004)), U0U6(參見(jiàn)，Zhu,同前所述)，F(xiàn)R180204 (參見(jiàn)，例如，Ohori, Drug News Perspective (藥物信息觀(guān)點(diǎn))21 (5) :245_25(K2008))，舒尼替尼(參見(jiàn)，例如，Ma， 等，US2008004^7，其通過(guò)引用結(jié)合于此)，索拉非尼(參見(jiàn)，Ma，同前所述)，凡德他尼(參見(jiàn)，Ma,同前所述)，帕唑帕尼(參見(jiàn)，Ma,同前所述)，阿昔替尼(參見(jiàn)，Ma,同前所述)和 PTK787 (參見(jiàn)，Ma,同前所述)。Erk抑制劑可以包括僅抑制Erk的分子或還抑制第二靶標(biāo)的分子。例如，在一些實(shí)施方案中，所述Erk抑制劑是其中
權(quán)利要求
1.通過(guò)至少一次細(xì)胞分裂培養(yǎng)多能細(xì)胞的方法，所述方法包括在充足量的a.ALK5抑制劑，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；和c.充分的營(yíng)養(yǎng)足夠的時(shí)間，存在時(shí)培養(yǎng)多能動(dòng)物細(xì)胞，以允許至少一次細(xì)胞分裂同時(shí)保持細(xì)胞的多能性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟還包括在存在一定量的GSK3β抑制劑時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述GSK3β抑制劑是CHIR99021。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟還包括在存在一定量的白血病抑制因子 (LIF)時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二化合物是MEK抑制劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二化合物是Erk抑制劑。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)步驟在還存在LIF時(shí)進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述多能細(xì)胞通過(guò)至少5次細(xì)胞分裂進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)保持細(xì)胞多能性。
12.權(quán)利要求1的方法，其還包括向所述多能細(xì)胞中引入異源核酸，并且培養(yǎng)所得到的細(xì)胞，以允許至少一次另外的細(xì)胞分裂，同時(shí)保持多能性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將異源核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞中，然后誘導(dǎo)多能性，再然后進(jìn)行培養(yǎng)步驟。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞或人細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)、羊、牛、貓、狗、或豬的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述多能細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述多能細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是非人動(dòng)物細(xì)胞，并且所述方法還包括將所述多能細(xì)胞引入到胚泡中，其中所述胚泡與所述細(xì)胞來(lái)自相同的動(dòng)物物種，并且將所述胚泡引入到相同物種動(dòng)物的子宮內(nèi)。
19.權(quán)利要求18的方法，基于來(lái)自所述多能細(xì)胞的核酸的存在選擇所述動(dòng)物的嵌合體后代。
20.多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物，其包括充足量的a.ALK5抑制劑，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；以允許至少一次細(xì)胞分裂，同時(shí)保持細(xì)胞多能性。
21.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其還包括白血病抑制因子(LIF)。
22.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其還包括一定量的GSK3β抑制劑。
23.權(quán)利要求22的培養(yǎng)物，其中所述GSK3β抑制劑是QHR99021。
24.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述第二化合物是MEK抑制劑。
25.權(quán)利要求對(duì)的培養(yǎng)物，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
26.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述第二化合物是Erk抑制劑。
27.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
28.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
29.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。
30.權(quán)利要求20的培養(yǎng)物，其中所述多能細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
31.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括充足量的下述a.ALK5抑制劑，和b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、和FGF受體抑制劑中的一種或多種；從而在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞時(shí)，允許至少一次細(xì)胞分裂，同時(shí)保持細(xì)胞多能性。
32.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其還包括白血病抑制因子(LIF)。
33.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其還包括一定量的GSK3β抑制劑。
34.權(quán)利要求33的培養(yǎng)基，其中所述GSK3β抑制劑是QHR99021。
35.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其中所述第二化合物是MEK抑制劑。
36.權(quán)利要求35的培養(yǎng)基，其中所述MEK抑制劑是PD0325901。
37.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其中所述第二化合物是Erk抑制劑。
38.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其中所述ALK5抑制劑是Α-83-01。
39.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其中所述ALK5抑制劑是SB431542。
40.權(quán)利要求31的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基在預(yù)先包裝的、密封容器中。
41.一種分離的多能動(dòng)物細(xì)胞，其(1)在存在白血病抑制因子(LIF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)時(shí)，或(2)在抑制TGFii和激活蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制MAH(信號(hào)傳導(dǎo)途徑，和任選地抑制 FGF途徑時(shí)；復(fù)制并且保持多能性，條件是所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞不是鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)。
42.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
44.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
45.權(quán)利要求44的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大鼠胚胎干細(xì)胞。
46.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在抑制ALK5和MEK時(shí)保持多能性。
47.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，其中與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、上胚層干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)更高水平的E-鈣粘著蛋白。
48.權(quán)利要求47的分離的細(xì)胞，其中與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、EpiSCs和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)2-倍更高水平的E-鈣粘著蛋白。
49.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，與常規(guī)培養(yǎng)的hESCs、上胚層干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞相比，所述分離的多能動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)更高水平標(biāo)記，其中所述標(biāo)記包括(Λχ2，Dppa3, Klf4，和 Rexl。
50.權(quán)利要求41的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在a.ALK5抑制劑，b.第二化合物，其選自MEK抑制劑、Erk抑制劑、p38抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體抑制劑中的一種或多種，存在時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。
51.增加部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多能性至更加完全多能的細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)使所述部分多能細(xì)胞與外遺傳修飾劑接觸，所述外遺傳修飾劑選自組蛋白脫乙酰酶抑制劑、組蛋白H3K4去甲基化抑制劑或H3K4甲基化激活劑；(b)在步驟(a)后，用(i)ALK5抑制劑，(ii)MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和 (iii)FGF受體抑制劑中的兩種或多種在不存在所述外遺傳修飾劑時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞，由此產(chǎn)生比所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞更加完全多能的細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的方法，其還包括(c)在步驟(b)后用(i)ALK5抑制劑，(ii)MEK抑制劑，Erk抑制劑，或p38抑制劑，和 (iii)FGF受體抑制劑和(iv)GSK3抑制劑培養(yǎng)所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
53.權(quán)利要求51或52任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)步驟(a)和/或(b)和/或(c)還包括在存在白血病抑制因子(LIF)時(shí)培養(yǎng)所述部分多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述部分多能細(xì)胞是上胚層干細(xì)胞。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所述部分多能細(xì)胞不表達(dá)至少一種下述標(biāo)記，所述標(biāo)記選自由0ct4，Nanogjn REX-I組成的組，并且所述更加完全多能的細(xì)胞表達(dá)所述標(biāo)記的一種或多種或所有。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述部分多能細(xì)胞不表達(dá)ALP-1，并且所述更加完全多能的細(xì)胞表達(dá)ALP-I。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述外遺傳修飾劑是丙戊酸或硫酸反苯環(huán)丙胺。
全文摘要
本發(fā)明提供通過(guò)在存在A(yíng)LK5抑制劑時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞而產(chǎn)生并且保持多能細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102317442SQ200980156917
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者丁生, 周宏彥, 李文林 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究所