專利名稱：用于快速鑒定與特定化學靶點結(jié)合的核酸的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)快速鑒定與生物靶點和化學靶點特異結(jié)合的核酸的裝置和方法。
背景技術(shù)：
SELEX (指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化)過程是一種進化的體外組合化學過程，用于從含多種寡聚核苷酸的核酸池中識別出與某個配體或靶點相結(jié)合的核酸適體。SELEX是用于在特定的可控的結(jié)合條件下從隨機池中分離核酸適體的優(yōu)秀系統(tǒng)。SELEX技術(shù)為產(chǎn)生與指定配體或靶點緊密特異結(jié)合的單鏈DNA或RNA寡聚核苷酸提供了另一途徑(Tuerk et al., Science 249:505-510(1990) ；Ellington A. ,Curr Biol 4:427-429(1994) ；Ellington et al.，Nature346 :818-822 (1990))。目前SELEX實驗已被開發(fā)用于研究核酸的功能與結(jié)構(gòu)， 而識別出的核酸適體已成為分子診斷、分子識別、分子生物學以及分子進化研究的重要工具(Uphoff et al. , Curr Opin Struct Biol 6 :281-288(1996))。
在SELEX過程中，核酸適體的篩選是通過反復進行相繼的靶點結(jié)合、去除未結(jié)合的寡聚核苷酸、洗脫、擴增和純化篩選出的寡聚核苷酸這些步驟而實現(xiàn)富集。SELEX涉及兩個過程的多輪重復(i)使用親和技術(shù)將高親和性的核酸適體從低親和性核酸適體中分離或篩選出來，以及(ii)使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所篩選出的核酸適體。核酸適體一般是在SELEX過程的分離步驟中，使用親和篩選技術(shù)，從大量的隨機DNA或RNA序列池或庫(彡IO15種序列)中篩選得到。被稱為“核酸適體”的單鏈DNA或RNA是人工合成的特定寡聚核苷酸，它們能以高親和力和特異性與非核酸靶點分子結(jié)合(Jenison et al.，Science 263:1425(1994) ；Patel et al.，J Mol Biol 272:645-664(1997) ；Clark et al.，Electrophoresis 23 1335-1340 (2002)) 鑒于核酸適體獨特的性質(zhì)，它們對于推動從親和分離到疾病的診斷與治療，如癌癥和病毒感染的診斷和治療，的自然科學和生命科學的多個領(lǐng)域的革新有良好的前景(Tang et al.，Anal Chem 79 =4900-4907(2007)； Gopinath, S. , Archives of Virology 152:2137-57(2007))。
相對于抗體，核酸適體具有很多優(yōu)勢。它們更小，更穩(wěn)定，能夠化學合成，以及能夠未檢測使用熒光標記同時不影響他們的親和力。與抗體的研發(fā)不同，它們針對毒性靶點(當用于抗體生成)或針對低免疫原性或無免疫原性的靶點的開發(fā)是可行的(Marm et al.，Biochem Biophy Res Comm 338 1928-1934(2005)) 此外，由于它們便捷的制備過程和廣泛的用途，它們能夠作為驗證胞內(nèi)和胞外靶點的有力工具(Gopinath，S.，Anal Bioanal Chem. 387 :171-182 (2007)) 0 一組核酸適體還可以用于選擇性的干擾某個“軸心” 蛋白的部分的連接(Shi et al. , Proc Nat，1 Acad Sci USA 104 :3742-3746 (2007)) 微流體裝置是指使用微米尺度的通道操作非常小量體積( 10_9_10_18升)液體的系統(tǒng)。對小量體積的操作通過減少擴散時間提供了高速的化學反應，并在輸運、交換和安置化學試劑到指定位置這些方面對獲取的樣本本液體提供了精確的控制。通過微加工技術(shù)，微流體裝置還能夠在單個芯片中整合流體元件如微泵、微閥、微加熱器等等，從而使所有化學過程在芯片能自動完成。由于這些因素，微流體裝置被廣泛的應用于化學、生物學、藥學和工程學領(lǐng)域，以實現(xiàn)高速和高通量的樣本分析(Whitesides，G.，Nature 442 368-373(2006))ο 在實際應用中，傳統(tǒng)SELEX系統(tǒng)重復工作多且耗時，不適用于進行高通量篩選。雖然SELEX技術(shù)本身已充分成熟，但其相對低的通量阻礙了需要大量不同核酸適體的研究， 如針對生物標記識別的蛋白質(zhì)組學研究。提高SELEX核酸適體產(chǎn)生速度和篩選能力的一種途徑是過程的自動化和微型化。近來，用于快速和高通量分析的宏觀技術(shù)的微型化方面已取得了進展。小型化的優(yōu)勢包括1)樣本消耗小，2)能進行高通量分析，3)自足體系，4)交叉污染減少，以及 5)多功能整合(Gopinath，S，Anal Bioanal Chem. 387 171-182 (2007)) 用于分離特定RNA核酸適體的SELEX技術(shù)可實現(xiàn)自動化，從而顯著的減少分離和擴增能以高親和力與特定目標靶點分子結(jié)合的寡聚核苷酸序列所需要的時間。近來，一些微流體實驗流程已被用于開發(fā)更快的SELEX過程，顯著地將SELEX產(chǎn)生核酸適體的時間從幾個月/ 周縮短至幾天(Hybarger，et al. ,Anal Bioanal Chem 384 :191-198(2006) ；Windbichler, et al. , Nat. Protoc. 1 :637-640(2006) ；Eulberg, et al. , Nucleic Acids Research 33 e45(2005))。SELEX技術(shù)的大多數(shù)進展，旨在提高篩選的效率(Bunka et al.，Nat Rev Micro 4:588-596(2006)).但是，這些研究并沒有采用微型化的或多路的核酸適體篩選。
SELEX的過程還具有標準化的潛力，如果系統(tǒng)能整合至基于芯片的微流體環(huán)境內(nèi)，將會在快速分析、減少成本和高通量分析這些方面提供顯著的優(yōu)勢。這樣的優(yōu)勢已在基于芯片的酶分析(Hadd et al.，Anal Chem 69:3407-3412(1997) Joseph W., Electrophoresis 23 :713-718(2002))和免疫分析(Wang et al. , Anal Chem 73: 5323-5327(2001) ；Sato et al.，Anal Chem 73 :1213-1218(2001))中得到了證明。
傳統(tǒng)SELEX篩選技術(shù)還存在一些缺陷。傳統(tǒng)篩選過程的一個缺陷是所篩選出的核酸適體對結(jié)合至固定支持物而非溶液中自由的靶點分子具有親和性。進化的SELEX過程所篩選出的核酸適體是結(jié)合至與靶點類似的分子(即，它的膜結(jié)合衍生物)，而不是集中于對期望的靶點有親和力的核酸適體。有報道指出篩選出的結(jié)合至cAMP的核酸適體實際上對 C8位點修飾的cAMP類似物具有更高的親和力，該位點是靶點附著在固定支持物上的位點 (Koizumi et al.，Biochem. 39 :8983-8992 (2000))。這樣，固定支持物的影響在針對更小的配體篩選核酸適體時會被放大，這是由于更小配體只有有限數(shù)量的功能位點能與核酸適體相互作用，并且將配體附著至固定支持物上則進一步減少了這些功能位點的有效性。
固定支持物本身還會引出其他的問題。有報道表明傳統(tǒng)SELEX中以自由靶點溶液把有效序列從柱上去除的清洗步驟可能忽略對靶點有很高親和力的核酸適體(Klug et al.，Mol. Biol. Rep. ,1994 ；20 :97-107 (1994))。主要的問題是動力學偏向，這將使那些具有非常強相互作用的序列幾乎不可能被輕易地從色譜柱上洗脫下來。對靶點具有高親和力的序列無法輕易從親和柱上洗脫下來。當使用自由的未結(jié)合靶點洗脫對結(jié)合的(固定)靶點具有高度特異性的核酸適體時也會出現(xiàn)這樣的情況。因此，將很難從篩選柱上回收那些具有皮摩爾級別或者低解離常數(shù)的序列。
本發(fā)明所針對的是解決本領(lǐng)域中所存在的這些以及其他不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面是有關(guān)一種微流體裝置，它包括具有一個或多個在輸入口和輸出口之間延伸的流體通道的基底，位于一個或多個流體通道中的分子結(jié)合區(qū)，其中，該分子結(jié)合區(qū)含有靶點分子，以及鄰接分子結(jié)合區(qū)的加熱元件。優(yōu)選的，該分子結(jié)合區(qū)包括具有靶點分子的高表面積材料。本發(fā)明也披露了包括這些裝置的試劑盒。
本發(fā)明的第二個方面是有關(guān)篩選與一個或多個靶點分子結(jié)合的核酸適體的方法。 該方法包括提供上述微流體裝置，以及在核酸分子能夠與靶點分子有效且特異地結(jié)合的條件下，向微流體裝置中導入一群核酸分子。本方法進一步包括從該微流體裝置中基本移除所有與靶點分子非特異結(jié)合的核酸分子，對加熱元件加熱以使特異結(jié)合至靶點分子的核酸分子變性，并回收與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子。這些回收得到的核酸分子是篩選出的針對它們所結(jié)合的靶點分子的核酸適體。
本發(fā)明的第三個方面是有關(guān)篩選與一個或多個靶點分子結(jié)合的核酸適體的方法。 該方法包括提供具有一個或者多個兩端具有輸入和輸出口的流體通道的基底，所述一個或者多個流體通道中具有一個或者多個分子結(jié)合區(qū)，其中，這一個或者多個分子結(jié)合區(qū)的每一個都含有靶點分子。該方法進一步包括在能夠使核酸分子與靶點分子特異結(jié)合的條件下將一群核酸分子引入微流體裝置中，從微流體裝置中基本去除所有與靶點分子非特異結(jié)合的核酸分子，使特異結(jié)合至靶點分子的核酸分子變性，以及回收與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子。這些回收的核酸分子是篩選出的針對它們所結(jié)合的靶點分子的核酸適體。
本發(fā)明的第四個方面涉及表1-8中所識別出的一個或多個核酸適體(除序列SEQ ID NOS :24，70，和 81 以外)。
本發(fā)明的第五個方面涉及制作本發(fā)明所述微流體SELEX裝置的方法。該方法包括把包含靶點分子的溶膠-凝膠材料涂在第一主體構(gòu)件的表面上，并使溶劑揮發(fā)，從而形成含有靶點分子的多孔基質(zhì)；然后以第二構(gòu)件把第一構(gòu)件密封，使得第一和第二構(gòu)件一起形成具有輸入口，輸出口，以及至少一個位于輸入輸出口之間的微流體通道的微流體裝置，其中，多孔基質(zhì)與至少一個微流體通道流體連接。
本發(fā)明所描述的微流體SELEX芯片具有許多顯著的優(yōu)勢，對SELEX的結(jié)果有實質(zhì)性的改善。在一優(yōu)選的實施方式中，一個顯著的優(yōu)勢是是用了納米多孔溶膠-凝膠材料， 它在微流體裝置的一個或者多個微流體室中用于固定靶點蛋白，為核酸適體庫與靶點蛋白的競爭性結(jié)合提供了支持。使用了局部熱源以選擇性地洗脫結(jié)合至靶點蛋白的特異高親和力核酸適體。溶膠-凝膠材料能夠固定蛋白質(zhì)的特性使得該材料能夠作為小型化裝置的優(yōu)秀候選材料，因為溶膠-凝膠材料不需要使用親和捕獲標簽或重組蛋白，從而能夠在不需要任何連結(jié)劑存在的條件下捕獲天然狀態(tài)的蛋白(Gill I. ,Chemistry of Materials 13: 3404-3421 (2001)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。這克服了傳統(tǒng)SELEX只能針對結(jié)合的靶點篩選核酸適體的局限性。這也降低了強力結(jié)合的核酸適體序列無法從靶點上被洗脫的動力學陷阱的可能性。由于從將結(jié)合的核酸適體和未結(jié)合的核酸適體區(qū)分或者分離在SELEX過程中是關(guān)鍵而且通常是限速的一個步驟，本法明的微流體系統(tǒng)是更快而且更有效率的替代技術(shù)。
本發(fā)明還能夠進行高通量的，甚至多通路的篩選和表征與靶點特異結(jié)合的核酸適體。該微流體裝置可進行串行的或者平行的分析，在提高通量的同時減少分析時間、樣本本量以及成本。本發(fā)明還披露了優(yōu)化的核酸適體分離方法的實驗步驟。
本發(fā)明所提供的實施例展示了使用本發(fā)明的基于溶膠-凝膠的微流體SELEX系統(tǒng)，即SELEX芯片系統(tǒng)，針對TATA結(jié)合蛋白的核酸適體的篩選(“TBP” ^komori et al.， Genes & Dev. 8 :2313-2323 (1994)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。這些結(jié)果證明了 TBP核酸適體能夠使用SELEX芯片系統(tǒng)有效的分離，證實了該裝置對于支持高通量 SELEX方法的實用價值。本發(fā)明的微流體SELEX系統(tǒng)通過減少用于產(chǎn)生高親和性核酸適體的篩選循環(huán)次數(shù)，極大地提高了篩選效率達50%。使用微流體SELEX系統(tǒng)產(chǎn)生的高親和TBP 核酸適體與之前使用傳統(tǒng)濾膜結(jié)合SELEX方法產(chǎn)生的核酸適體具有一致性或同源性，證明了微流體SELEX系統(tǒng)的高效性和有效性。
最后，利用單芯片和自動化SELEX體系的結(jié)合，本發(fā)明的微流體SELEX系統(tǒng)能用于篩選多個不同靶點分子的核酸適體。這能夠極大的增強識別選擇性的針對一個或者多個目標靶點的新核酸適體分子的能力。


圖IA是SELEX微流體芯片的直觀示意圖，圖IB是展示沉積于芯片電極上的溶膠-凝膠的相對位置的放大的示意圖。所示溶膠-凝膠的直徑約為300 μ m。圖IC是SELEX 微流體芯片(分解的)以及向SELEX微流體芯片輸送液體的系統(tǒng)的示意圖。該微型芯片中的液體流動方向是從陰性對照溶膠-凝膠(N)至點4。收集核酸適體的順序則和流向相反 (從4至3至2，1，然后N)，這樣避免了緩沖液流過其他電極產(chǎn)生不需要的加熱。
圖2是展示SELEX微流體芯片制作過程的示意圖。
圖3A-B展示了微流體SELEX過程以及微流體芯片。圖3A展示了使用以溶膠-凝膠制作的微流體芯片進行核酸適體篩選的過程。簡要的來說，通過毛細管將隨機的RNA核酸適體池、試劑和緩沖液輸運至芯片。具有特異結(jié)合親和力的核酸適體會被位于微流體裝置微室中溶膠-凝膠微滴中的靶點蛋白所捕獲(也稱為分子結(jié)合區(qū))。五組溶膠-凝膠微滴均勻的點在微流體通道中(N是陰性對照；1具有滯留的酵母TATA結(jié)合蛋白(TBP) ；2具有酵母轉(zhuǎn)錄因子IIA(TFIIA) ；3具有酵母轉(zhuǎn)錄因子IIB (TFIIB) ；4具有人熱休克因子I(HSFl))。 微滴之間的距離保持在1cm，以防止其他加熱電極可能產(chǎn)生的不需要的加熱。結(jié)合至每個靶點的核酸適體通過各自的鋁制微加熱器按照順序加熱洗脫。圖3B展示了微加工制作的溶膠-凝膠芯片。該實施方式包括具有有一組鋁電極和PDMS蓋的玻璃片，蓋和玻璃片共同限定了具有5個獨立微室的微流體通道。壓印在PDMS蓋上的微流體部分包括170 μ m深和 300 μ m寬的微通道，和5個邊長為Imm的六邊形微室。單個溶膠-凝膠微滴的典型體積為 7nl左右，并且每個微滴內(nèi)部的納米多孔結(jié)構(gòu)能夠容納30fmol蛋白。該裝置中設(shè)計了五個六邊形微室，用于孵化和反應。該六邊形微室的容積，以及微室間連接通道的容積分別為 0. 22 μ 1禾Π 0. 41 μ 1。微流體芯片的最終尺寸為75匪X 25匪X 5匪。
圖4展示了溶膠-凝膠掃描電鏡的(SEM)照片?？捎^察到兩種不同類型的微孔。 大孔組的直徑位于大約100至大約200nm之間。小孔組直徑為大約20至大約30nm之間。這些微孔均勻的分布于溶膠凝膠的表面。圖中所示比例尺為1 μ m。
圖5A-D展示了位于鋁電極上的溶膠-凝膠點的熒光強度。溶膠-凝膠點中使用 SYBR-Green I標記的dsDNA(lOObp，InM)通過各自的電極進行加熱變性。繪制了電極在各種功率下熒光強度隨時間的變化以及指數(shù)衰減模型(紅線)。每幅圖配有溶膠-凝膠點每隔20秒的一系列顯微照片。Γ點是根據(jù)每幅圖的熒光強度計算得到，以獲得適宜的時間和功率。圖5Α為100mW，39. 5秒；圖5B為424mW，7. 4秒；圖5C為536mW，3. 3秒，圖5D為 645mff, 1. 8 秒。
圖6A-B圖示了 TATADNA與TBP的結(jié)合。圖6A是強度-時間圖。對于TATA DNA與內(nèi)嵌TBP的溶膠-凝膠的結(jié)合，強度-時間圖符合指數(shù)衰減模型。電極的功率設(shè)置為450mW。 得到的強度衰減半衰期為6. 4秒。相信強度的減弱是由于核酸適體從固定的靶點蛋白上釋放出來。圖6B展示了溶膠-凝膠結(jié)合了以Cy-3標記的TATA DNA以及隨后洗脫的明場顯微照片。
圖7A-D展示了收集到的RNA凝膠電泳條帶照片。為使得RNA在凝膠電泳中可被觀察到，該RNA使用其相應引物進行了逆轉(zhuǎn)錄并以PCR擴增。制備了 4種具有不同RNA濃度的樣本(圖 7A 為 2. 6pmole,圖 7B 為 13pmole，圖 7C 為 77pmole，圖 7D 為 130pmole)。圖中條帶的順序是M(分子標記-梯狀DNA)、N(陰性對照)、1、2、3和4。陰性條帶和其他條帶相比幾乎沒有信號或者信號很弱。分子標記表明凝膠中所表達的條帶大小正確。這意味著核酸適體與靶點如溶膠-凝膠中的蛋白，發(fā)生了特異結(jié)合，而不是與溶膠-凝膠本身發(fā)生了非特異性結(jié)合。
圖8A-B展示了收集到的含有不同RNA濃度的樣本間的條帶強度比較。圖8A展示了標準分子標記(M通道)以及收集到的核酸適體(通道N、50、30、5)的電泳圖譜。通道N 是陰性對照的溶膠-凝膠。核酸適體的起始量為3. 56 μ g(圖中以50表示)、2. 14 μ g(30) 和356ng 。條帶強度使用Matlab程序計算。該強度與篩選中核酸適體的量成正比。陰性對照的條帶強度幾乎和背景相同。圖8B圖形化地展示了條帶強度。
圖9展示了從多通路溶膠-凝膠芯片中收集的RNA的電泳遷移阻滯分析(EMSA) 結(jié)果。測試了收集到的核酸適體對其靶點蛋白的親和性。所有收集到的RNA使用放射性同位素標簽P32標記。然后這些RNA以0nM、50nM靶點蛋白(TBP和TFIIB)孵化。EMSA測試表明RNA核酸適體僅針對靶點蛋白表現(xiàn)出特異親和性#12只與TBP結(jié)合，而#4僅與TFIIB 結(jié)合，反之則不行。
圖10A-C展示了體外篩選循環(huán)效率的提高。圖IOA展示了采用微流體SELEX芯片通過傳統(tǒng)的SELEX循環(huán)4 (G4)、5 (G5)和6 (G6)獲得了 RNA池的三種新產(chǎn)物(G5，、G6，和 G7，)。傳統(tǒng)SELEX篩選TFIIB的起始池為2 X IO15條序列。圖IOB展示了來自微流體SELEX 芯片的嚴標記的RNA池(G6’和G7’)的電泳遷移阻滯實驗(EMSA)。該實驗采用逐步提高的TFIIB濃度(0、2·5、12·5、62·5ηΜ)。圖IOC展示了 EMSA結(jié)果，其中，核酸適體(G7，)不能與TBP或TFIIA結(jié)合，但與TFIIB的結(jié)合具有高親和力。所有使用的蛋白濃度均為200ηΜ。
圖11展示了微流體SELEX過程與傳統(tǒng)SELEX過程的比較。在11輪使用濾膜結(jié)合的傳統(tǒng)SELEX過程后分離出一些TBP的核酸適體。而本發(fā)明的微流體SELEX方法比傳統(tǒng)的 SELEX方法需要更少的循環(huán)數(shù)。微流體SELEX在傳統(tǒng)的濾柱SELEX進行兩輪后進行。濾膜結(jié)合產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化為RNA并注入微流體裝置中。本研究是針對TBP (TATA結(jié)合蛋白)的微流體SELEX。TBP核酸適體(ms3、ms4、ms5和ms6)在每輪SELEX后進行測序，他們的序列列于下文的表1-4中。這些實驗證實了，本發(fā)明的微流體SELEX裝置能夠保持和富集特異結(jié)合至靶點蛋白核酸適體，在該例中是TBP。和傳統(tǒng)的SELEX核酸適體相比，從微流體SELEX中篩選出的核酸適體能分為2組(匹配的，和新篩選出的核酸適體)。
圖12A-B展示了使用溶膠-凝膠陣列芯片進行的核酸適體結(jié)合分析。圖12A展示了分析的設(shè)計，如圖所示，PMMA包被的96孔芯片的每個孔中點有TBP的溶膠-凝膠點以及陽性對照(P)和陰性對照(N)。ms-6輪的核酸適體池使用Cy-3末端標記。圖12B展示了新篩選出的核酸適體各自的結(jié)合活性。結(jié)合活性是利用溶膠-凝膠點的熒光強度計算獲得的。作為陰性對照，在不含核酸適體的情況下進行結(jié)合分析，并且在TBP微滴位置處測得信號強度。ms-6. 4、ms-6. 16和ms-6. 38屬于I組(星號標記的匹配組核酸適體)；所有其他的核酸適體都是新篩選出的。
圖13A-B展示了熒光檢測以及核酸適體與TBP的結(jié)合親和力。單個核酸適體 (ms-6. 12,ms-6. 15,ms-6. 16,ms-6. 18,ms-6. 24 以及 ms_6. 26)與 TBP 的結(jié)合親和力使用溶膠-凝膠芯片分析測量。在一個孔中，點有5種類型的具有不同蛋白濃度(從0至400nM) 的溶膠-凝膠微滴。一個微滴的平均體積為50nl左右。圖13A展示了不同濃度TBP在各微滴位置的分布，以及在這些點觀察到的熒光強度。六種TBP核酸適體被加入每個孔后，經(jīng)分析得到結(jié)果信號。如圖13B所示，結(jié)合親和力(Kd)通過點強度的平均值測量得到。所有的分析重復進行。核酸適體的 Kd 值為ms-6. 12 ^ 2. 7nM ；ms-6. 15 ^ 13. 2nM ；ms-6. 16 ^ 8. 3nM ； ms-6. 18 ^ 4. 5nM ；ms-6. 24 ^ 92. 53nM ；以及 ms-6. 26 ^ 10. 56nM。
圖14A-F展示了核酸適體序列M折疊產(chǎn)生的二級結(jié)構(gòu)。括號中為核酸適體結(jié)構(gòu)的最低自由能。圖14A展示了核酸適體ms-6. 12 (AG =-18. 5) (SEQ ID NO :68)，圖14B展示了核酸適體 ms-6. 15( AG =-13. 9) (SEQ ID NO :69)，圖 14C 展示了核酸適體 ms_6. 16 ( Δ G = -33. 7) (SEQ ID NO :70)，圖 14D 展示了核酸適體 ms_6. 18 ( Δ G =- . 23) (SEQ ID NO: 72)，圖 14E 展示了核酸適體 ms-6.=-20. 80) (SEQ ID NO :74)，圖 14F 展示了核酸適體ms-6. 26(AG = -20. 60) (SEQ ID NO :75)。每個核酸適體由99個核苷酸(nt)構(gòu)成， 它含有中心50個核苷酸的可變區(qū)(大寫字母表示)，兩側(cè)的5’末端和3’末端為49個核苷酸的固定引物結(jié)合區(qū)(小寫字母表示)(SEQ ID NO 82)。
圖15示意性地展示了 96室多通路微流體SELEX芯片示意圖，其包括含有氣動閥控制器和2個泵的PDMS泵-閥系統(tǒng)。
具體實施例方式本發(fā)明的一方面涉及微流體裝置，利用經(jīng)改進的SELEX過程，該微流體裝置可用于對核酸適體池進行高通量的篩選。該微流體裝置優(yōu)選的實施方式還克服了傳統(tǒng)SELEX的一些缺陷，提高了核酸適體篩選的效率，確保了所篩選的核酸適體是結(jié)合至未修飾的靶點分子。
該微流體裝置包括具有在輸入和輸出口之間延伸的一個或多個流體通道的基底， 在這一個或多個流體通道中的分子結(jié)合區(qū)，其中，該分子結(jié)合區(qū)含有靶點分子，以及鄰接分子結(jié)合區(qū)的加熱元件。
該微流體裝置包括一些分散部件的組合，非限定性實例如，流體通道、毛細管、接頭、微室、涂層以及加熱元件，當它們以合適的方式搭配或連接在一起時，就構(gòu)成了本發(fā)明的微流體裝置。該微流體裝置優(yōu)選的，但并非必需的，包含頂部、底部和內(nèi)部，其中的一個或多個部分基本限定了該裝置的的通道和微室。
在一個實施方式中，底部是結(jié)構(gòu)基本平坦的固相基底，其上表面基本是平整的。多種基底材料可用于形成底部。該基底材料應基于它們與已有微加工技術(shù)的兼容性來選用， 這些技術(shù)如，光蝕刻技術(shù)、濕式化學蝕刻技術(shù)、激光燒蝕技術(shù)、空氣磨蝕技術(shù)、注射成型技術(shù)、模壓加工技術(shù)以及其他技術(shù)。該基底材料通常還應兼容微流體裝置可能面臨的所有條件范圍，包括極端的PH值、溫度、鹽濃度和/或電場的施加。
優(yōu)選的基底材料包括但不限于，玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷、高分子材料、半導體材料以及它們的組合。在一些優(yōu)選的方面，該基底材料可包括通常采用微加工技術(shù)的半導體產(chǎn)業(yè)所使用的相關(guān)材料，包括如，硅基基底如玻璃，石英，硅或多晶硅，以及其他基底材料，如砷化鎵等諸如此類材料。如果使用的是半導體材料，通常需要提供絕緣包被或絕緣涂層，例如，二氧化硅或氮化硅，覆蓋于基底材料之上，特別是施加了電場的時候。
高分子材料的實例包括但不限于，塑料，如聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、聚碳酸脂、 聚四氟乙烯(TEFL0NTM)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、以及聚砜。也可以使用其他塑料。采用已知的成型工藝，如注射成型法、模壓加工或沖壓工藝，或通過在模具中使多聚物前體材料發(fā)生聚合，就能夠利用微加工制得的母版制造獲得這樣的基底。這樣的高分子基底材料已被公認具有易于制造、低成本和可拋性的特性，并且通常它們對極端的反應條件通常具有惰性。這些高分子材料可以包括經(jīng)處理的表面，例如，衍生或包被的表面，以增強他們在微流體系統(tǒng)中的效用，或例如，提供增強的流體導向。
理想情況下，用于構(gòu)建內(nèi)部的至少部分界定微流體通道的材料，也應具有生物相容性和抗生物吸附性。因為該裝置的活性表面積只有幾平方微米，用于形成內(nèi)部的材料應當既可以實現(xiàn)具有小橫斷面的通道(在大約寬2-3 μ m，長約1-2 μ m的尺度)的構(gòu)建，也可以實現(xiàn)具有大橫斷面的通道(在大約25至大約500 μ m的寬度和/或高度的尺度，更優(yōu)選的為大約50至大約300 μ m尺度)的構(gòu)建。一些已有的廣泛用于制作流體通道的材料，能夠滿足這些基本的需求。
它們能夠分為兩種類別基于玻璃的類別，如玻璃、硼硅酸玻璃、石英等等(Ymeti et al.，Biosens. Bioelectron. 20 1417-1421 (2005)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)；以及基于高分子聚合物的材料如聚酰亞胺、光刻膠、SU-8負光刻膠、聚二甲硅氧烷 (“PDMS”)，有機硅橡膠 PDMS (McDonald et al. , Electrophoresis 21 :27_4(K2000)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)、液晶聚合物、特氟隆等等。
雖然玻璃材料具有相當好的化學和力學恢復力，它們昂貴的成本以及精細的制作過程使它們在這類應用中很少被用到。而相對的，高分子材料被人們廣泛的用于流體學應用。此外，它們的使用所涉及的構(gòu)建技術(shù)，如粘合、成型、模壓、熔態(tài)加工以及印跡技術(shù)均是成熟的技術(shù)(Mijatovic et al.，Lab on a Chip 5 :492-500 (2005)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)?；诟叻肿硬牧系奈⒘黧w系統(tǒng)的另一項優(yōu)勢是使用相同材料制作的閥和泵能夠容易的進行系統(tǒng)集成(Unger et al.，Science觀8 :113-116 (2000)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。
PDMS和SU-8光刻膠作為構(gòu)建微流體系統(tǒng)的原材料已有豐富的研究支持。它們兩者都是光透明的，它們的力學和化學性質(zhì)相當不同。SU-8比PDMS更硬(Blanco et al., J Micromechanics Microengineering 16 :1006-1016 Q006)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)，因此這兩種材料的構(gòu)建技術(shù)是不同的。PDMS還易受到壁變形的影響，這取決于通道的長寬比(Delamarche et al.，Adv. Materials 9 :741-746 (1997)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。根據(jù)所要進行的應用，他們的化學性質(zhì)是一個重要的考慮方面。它們在聚合之后都擁有疏水的表面，這能夠使得蛋白質(zhì)被吸附到PDMS壁上，以及在小橫斷面的情況下能夠填充通道。PDMS和SU-8 二者的表面都可以表面活性劑或等離子處理，變得具有親水個生(Nordstrom et al. , J Micromechanics Microengineering 14: 1614-1617 (2004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。SU-8的成分還可以在其聚
(Chen and Lee, J Micromechanics Microengineering 17 1978-1984 (2007)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。非特異性的結(jié)合對通道表面的污染是任何一種微流體應用顯然要考慮的一個問題。據(jù)說SU-8不易受到這個問題的影響，但需要指明的是已有的化學處理方法能夠提高PDMS性能(Lee andVoros5Langmuir 21 11957-11962(2004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。
基底材料還可以是玻璃或硼硅酸玻璃底，以及高分子蓋的組合，它們共同限定了一條或者多條流體通道。微流體裝置的通道和/或微室通常是通過上述微加工技術(shù)在基底的上表面或者高分子蓋的下表面形成微米級的小槽或凹入來制作。接著，微流體裝置頂部的下表面覆蓋并粘合至底部基底的表面，該頂部通常包括另一平整的基底，在這兩個部件的界面位置密封裝置的通道和/或微室(內(nèi)部)。頂部與底部的粘合可根據(jù)基底材料的天然性質(zhì)，使用多種已知方法進行。例如，在使用玻璃基底時，可使用熱粘合技術(shù)，該技術(shù)通過提高溫度和壓力以使得裝置的頂部與底部粘合。高分子基底可使用類似的技術(shù)粘合，但所使用的溫度通常較低以防止基底材料發(fā)生過度的熔化。其它方法也可以用于粘合裝置的高分子材料部分，包括聲波焊接技術(shù)或使用粘合劑，例如，紫外線固化的粘合劑。
加熱元件可使用任意熱和電的良導體來制作。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，該加熱元件是由能夠經(jīng)受嚴厲的或者持續(xù)的化學和流體環(huán)境改變的金屬制成，這樣的環(huán)境如極端的PH值、溫度、鹽濃度以及電場的施加。用于制作加熱元件的材料的膨脹和收縮性質(zhì)應與基底材料的相應性質(zhì)兼容，這樣膨脹使其從基底脫離或者導致其他微流體裝置中復雜情況。這樣金屬的非限定性實例實例包括鋁、銀、金、鉬、銅以及合金。
在一些實施方式中，本發(fā)明的微流體裝置還包括包裹加熱元件的導熱涂層，這樣， 在液體通過流體通道時不會直接與加熱元件接觸。這種做法能夠防止加熱元件的金屬部分被暴露于嚴厲的化學環(huán)境而遭到腐蝕。優(yōu)選的涂層材料包括但不限于玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷以及高分子材料。用于此目的的一種優(yōu)選的高分子涂層是聚(甲基)丙烯酸酯或者聚氨酯丙烯酸酯涂層材料。
本發(fā)明的微流體芯片在其物理尺寸上并不受限制，它們可以具有適用于任意特定應用的尺寸。為了與當前實驗室的裝置兼容，外部尺寸為標準的顯微鏡玻片尺寸更小的尺寸的微流體芯片比較容易制作。其他的微流體芯片尺寸也可定制為適應儀器使用的標準尺寸，例如質(zhì)譜儀的樣本室，或者培養(yǎng)箱的樣本室。本發(fā)明的微流體芯片的微室可以是任意形狀，如矩形、正方形、橢圓形、圓形或者多邊形。微流體芯片中的微室或者通道的底部可以是方形、圓形、V型或者U型。微室底部的形狀在特定芯片中并不需要一致，它們可以根據(jù)芯片上進行的特定SELEX的需要而變化。本發(fā)明的微流體芯片的微室可以是任意的寬度與深度比。本發(fā)明的微流體芯片中的微室(孔)以及通道可以具有與所需要使用的樣本容積所兼容的任意容積或直徑。該微室(孔)或者通道可以用作儲液室、混合室、或者化學或生物反應進行的地方。
本發(fā)明的微流體裝置優(yōu)選的包括至少一個微室，位于輸入口和輸出口之間，并與一條或者多條流體通道流體連接。優(yōu)選的，分子結(jié)合區(qū)被包含于至少一個微室中。
在一個實施方式中，該微流體裝置的每條通道含有2個或多個微室。這2個或多個微室的每一個可含有相同的靶點分子，或者這2個或者多個微室可含有不同的靶點分子。 因此，加載了多個靶點的裝置能夠用于對多個靶點進行并行的SELEX。該實施方式提供含有 2個或者多個緊密分布的微室，其中具有含靶點的溶膠-凝膠材料，從而對核酸適體的篩選能夠并行進行，這克服了 SELEX篩選一次針對一個靶點的局限性。這使得能夠同時篩選多個靶點的核酸適體。
如其相應的實例所證明的，該實施方式的一種形式是在單個通道中含有5個微室，能夠平行的針對四種不同的分子靶點進行4個并行的SELEX篩選，其中一個微室作為對照組。其他的多通道形式也可以進行，包括但不限于，M通道、96通道、120通道、240通道以及更高通道數(shù)量。這些更高的SELEX多通道篩選方案可使用單個流體通道或者多個流體通道進行。當使用多個流體通道時，不同的通道可用在，例如，利用本發(fā)明的微流體SELEX 程序的不同篩選輪次。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，分子結(jié)合區(qū)具有含靶點分子的高表面積材料。這種高表面積材料用于容納或捕獲靶點分子，從而使靶點分子能夠在保持天然狀態(tài)的條件下有效地與核酸適體結(jié)合。即是，該靶點分子優(yōu)選的不經(jīng)任何可能影響到其表面結(jié)合位點可用性的化學修飾。分子結(jié)合區(qū)優(yōu)選地包含于微流體芯片的一個或者多個微室內(nèi)。對于高表面積材料，該材料應具有豐富的多孔結(jié)構(gòu)能夠使核酸分子擴散至材料的微孔中，與其中所含有的靶點分子進行接觸以及進行可能的特異性結(jié)合。
該高表面積材料可以是溶膠-凝膠衍生產(chǎn)物(Reetz et al.，Biotech Bioeng 49 527-534(1996) ；Frenkel-Mullerad, et al.，J Amer Chem Soc 127 :8077-8081(2005)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?，水凝膠衍生產(chǎn)物，如那些使用聚丙烯酰胺或聚乙二醇形成的產(chǎn)物(Xu et al. ,Polymer Bulletin 58(1) :53-63(2007) ；Gurevitch et al. ,JALA 6(4) 87-91(2001) ；Lueking et al. ,Molecular & Cellular Proteomics 2 :1342-1349(2003), 這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?，聚合物刷衍生產(chǎn)物(Wittemarm et al. , Analytical Chem. 76 (10) :2813-2819 (2004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)，硝化纖維素膜包產(chǎn)物，或基于樹狀高分子的產(chǎn)物(Pathak et al.，Langmuir 20(15) :6075-6079(2004), 該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。在這些材料當中，優(yōu)選使用溶膠-凝膠衍生材料。
使用溶膠-凝膠材料捕獲靶點分子的一個優(yōu)勢是不需要使用聯(lián)接物或標簽來固定靶點分子。在溶膠-凝膠中封裝靶點分子是十分有利的，因為溶膠-凝膠材料能夠很容易實現(xiàn)微型化。相比其他可用的捕獲方法，如膜封裝法，該方法要可靠得多，并且更加簡易。此外，在玻璃溶膠-凝膠材料中進行捕獲還能夠使用簡單的測光方法對很多酶反應進行光學監(jiān)測。獲得這樣的溶膠-凝膠材料的方法在以下參考文獻中有詳述，Wright etal.，“Sol-Gel Materials Chemistry and Applications，，，CRC Press (2000) ；Pierre， Α.，“Introduction to Sol-Gel Processing (The International Series in Sol-Gel Processing-Technology & Applications), "Springer(1998) ；Brinker et al. ,"Sol-Gel Science :The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing，"Academic Press (1990)， 這些文獻在此被全文并入?yún)⒖肌?br> 溶膠-凝膠過程是一種濕化學過程，可用于制作陶瓷或者玻璃材料。一般來說， 溶膠-凝膠過程涉及體系從液體“溶膠”(主要是膠體)到固體“凝膠”相態(tài)的轉(zhuǎn)化。通過應用溶膠-凝膠過程，可以制作各種形式的陶瓷或者玻璃材料超細或者球形粉末，薄膜涂層，陶瓷纖維，微孔無機膜，單片陶瓷和玻璃，或者超多孔氣凝膠材料。本發(fā)明所需要的是溶膠-凝膠與加熱元件保持鄰接，即在一個或者多個微室中，涂層和單片結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的。
用于制備“溶膠”的起始材料通常是無機金屬鹽或者金屬有機化合物如金屬烷基氧化物，包括但不限于，含有硅、鋁、鈦及其組合的金屬烷基氧化物。也可以使用其他金屬氧化物。在典型的溶膠-凝膠過程中，前體經(jīng)過一系列的水解反應和聚合反應以形成膠質(zhì)懸浮液，或稱為“溶膠”。進一步對該“溶膠”進行操作以去除溶劑，從而能夠制做出上述類型的不同形式的陶瓷材料。
溶膠-凝膠過程提供了相對溫和的途徑以固定生物分子如蛋白質(zhì)，其被限制于不斷生長的共價凝膠網(wǎng)絡(luò)中，而不是通過化學修飾粘附到無機材料上(Gill，et al., Annals of the New York Academy of Sciences 799 :697-700(1996), Gill et al., Trends in Biotechnology 18 :282-296 Q000)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。很多研究詳述了使用各式各樣的溶膠-凝膠衍生納米復合材料封裝多種生物制品，包括酶、抗體、調(diào)控蛋白、膜結(jié)合受體、核酸適體、甚至整個細胞(Reetz et al.，Biotech Bioeng 49 527-534(1996)，F(xiàn)renkel-Mullerad, et al.，J Amer Chem Soc 127 :8077-8081 (2005)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。
關(guān)于穩(wěn)定性，溶膠-凝膠捕獲的蛋白質(zhì)通常展示出提高了的對熱變性和化學變性的抗性，并且其儲存和操作的穩(wěn)定性可以超過幾個月甚至更長(Kim，et al. ,J Biomat Sci 16:1521-1535(2005), Pastor et al. , JPhy Chem 111 11603-1161(^2007)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。此外，Kim等人研發(fā)的溶膠凝膠基質(zhì)的雙納米多孔材料(Analytical Chem78(21) :7392-7396 (2006)，在此被全文并入?yún)⒖?可使得分子如核酸適體能夠進行擴散，而保持靶點分子(蛋白質(zhì)或化學品)仍然被固定在孔洞中。這是溶膠-凝膠材料最大的優(yōu)勢之一，其使得溶膠-凝膠材料能夠應用于SELEX方法。
在一個實施方式中，分子結(jié)合區(qū)(例如，內(nèi)嵌靶點的溶膠-凝膠)在高分子涂層上形成。該高分子涂層可以是聚(甲基)丙烯酸酯或PMMA(Kwon et al. ,Clinical Chemistry 54(2) :^4-4 0008)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。該分子涂層物理隔離了溶膠-凝膠材料(及嵌于其內(nèi)的靶點分子)與鄰接的加熱電極，從而避免了直接對靶點分子進行加熱。
在本發(fā)明的另一實施方式中，分子結(jié)合區(qū)可包括一個或多個流體通道或者一個或多個微室的表面，其中，通過聯(lián)接分子以結(jié)合至該表面的一種或多種靶點分子修飾了該表面。微流體陣列可以形成于，例如，表面平坦的玻璃或者硼硅酸玻璃片上。靶點蛋白或者其他靶點分子共價或者非共價的結(jié)合在這種固相載體的平整表面上。所述靶點能夠直接與固相載體的平整表面結(jié)合，或者通過聯(lián)接分子或化合物附著至該平整表面。所述聯(lián)接物可以是任何衍生于固相載體表面的分子或化合物，以便于靶點附著至固相載體的表面。該聯(lián)接物可以共價或非共價的將靶點結(jié)合至固相載體的表面。此外，該聯(lián)接物可以是無機的或者有機的分子。該聯(lián)接分子可以進行標準的玻璃耦合化學反應。優(yōu)選的聯(lián)接物的一個實例是含自由氨基的化合物。
本發(fā)明的靶點蛋白以及其他靶點分子也可以結(jié)合至位于并被保持在一個或者多個微室中的基底(例如，微珠)上。基底的實例包括但不限于，硝化纖維素顆粒、玻璃珠、塑料珠、磁性顆粒以及乳膠顆粒。優(yōu)選的，靶點分子通過公知的操作流程共價地附著至基底。
本發(fā)明的微流體SELEX流程可用于篩選對各種靶點表現(xiàn)出所期望的親和力的核酸適體。例如，可識別與大分子靶點結(jié)合的核酸適體，如蛋白質(zhì)的核酸適體。大分子靶點的實例包括但不限于，IgE、Lrp大腸桿菌metj蛋白、彈性蛋白酶、人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (HIV-RT)、凝血酶、T4DNA聚合酶、以及L-選擇素。還可以識別與小分子靶點結(jié)合的核酸適體，例如，針對多肽，氨基酸或其他生物小分子靶點的核酸適體。小分子靶點的實例包括但不限于，ATP、L-精氨酸、卡那霉素、青紫霉素、新霉素、煙酰胺(NAD)、N-甲基中卟啉(NMM)、 茶堿、妥布霉素、D-色氨酸、L-纈氨酸、維生素B12、D-絲氨酸、L-絲氨酸、Y -氨基丁酸 (y-ABA)以及有機染料。也可識別與高分子結(jié)合的核酸適體，這些高分子的非限定性實例有，病毒，如人細胞巨化病毒(HCMV)，細菌，真核細胞，細胞器以及納米顆粒。廣義上來講，適宜作為靶點的生物材料包括但不限于蛋白質(zhì)或多肽、糖類、脂類、制藥劑、有機非制藥劑或者高分子復合物。糖類、多糖、底物、代謝產(chǎn)物、過渡態(tài)類似物、輔助因子、藥物分子、染料、養(yǎng)分、脂質(zhì)體也可用作靶點分子，只要它們能夠被固定于微流體裝置中，優(yōu)選的為固定于多孔的溶膠-凝膠基質(zhì)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易使用可作為本發(fā)明的靶點的生物材料增補該靶點清單。此外，可以根據(jù)需要，以能夠檢測到的取代基，如離子、配體、有光學活性的化合物或通常被用于標記生物學或化學化合物的成分，來標記或修飾該生物材料。
圖IA-B和圖2展示了微流體裝置10的一個優(yōu)選的實施方式。該微流體裝置10 在玻璃基底12上形成，其上方固定有PDMS蓋14?；?2和蓋14共同限定了在輸入口 18 和輸出口 20之間形成的微流體通道16。該通道的特征在于在沿長度方向上間隔地分布有 5個微室22。每一微室22均位于加熱電極M之上，電極M位于裝置兩邊的電接點沈之間。在該實施方式中，加熱電極M通過聚甲基丙烯酸脂涂層觀(參見圖幻與微室物理隔離。在把PDMS蓋14固定至基底12以前，含有目的靶點分子的溶膠-凝膠材料30被沉積于一個或者多個微室22中，優(yōu)選的位置為直接位于加熱電極M之上或者與其鄰接(參見圖1B)。如以上所述，以對應的微室22可以有效地限制靶點分子。
根據(jù)圖2所示，裝置10的制作可以通過如下過程進行，首先將一個或多個電極 M(以及它們的接點26)圖案化至基底12清潔后的表面。然后，在整個表面上旋涂聚甲基丙烯酸脂高分子材料，用硅遮掩(在高分子涂布的電極之上)，然后包被的基底通過蝕刻以去除遮掩處以外的高分子材料。該高分子涂層觀有效的隔離了加熱電極M和微流體裝置中將形成微室22的位置。蝕刻完成之后，可以進行含目的靶點分子的溶膠-凝膠的生成， 并將溶膠-凝膠懸浮液沉積于高分子層觀之上。在溶膠-凝膠材料沉積完成之后，使溶劑揮發(fā)或?qū)⒀b置放于合適的條件下使其干燥，從而形成溶膠-凝膠點30。之后，基底12掩蓋上圖案化的PDMS蓋14以形成微流體裝置10。
該微流體裝置10將與微流體SELEX系統(tǒng)40組合使用，它的一個實施方式如圖IC 所示。所述系統(tǒng)40包括核酸適體群體42 (其可以是前幾輪SELEX篩選出的核酸適體的富集的池或者尚未通過SELEX篩選的核酸分子隨機群體)、洗滌緩沖液44、封阻緩沖液46以及結(jié)合緩沖液48的儲液池。儲液池可以通過多端口偶聯(lián)裝置與50和液體管線52實現(xiàn)連接，通過裝置10的輸入口按序?qū)⒉牧蠈?。與輸出口連接的是液體管線M，根據(jù)需要其可通過閥和多端口偶聯(lián)裝置與一個或者多個收集容器56連接。優(yōu)選的，每個容器是用于接收裝置中單個微室所洗脫下來的核酸適體群體，即是，特異的針對某個特定靶點分子的核酸適體。如圖IC所示，例如，陰性對照室和1-4室都對應有收集容器。對閥門進行適當?shù)拈_與關(guān)操作能夠引導洗脫的核酸適體群體從特定的微室流入相應的容器中。
可以泵手動地控制各種液體在裝置10中的流入和流出，可通過對相應電極通電手動地控制加熱元件的操作?；蛘撸梢岳镁幊痰牟僮飨到y(tǒng)來自動控制裝置10中液體的流入和流出，以及加熱元件的操作，該操作系統(tǒng)可控制一個或者多個泵以及一個或者多個閥的時序，這些泵和閥分別調(diào)控核酸適體池、洗滌緩沖液、封阻緩沖液和/或結(jié)合緩沖液輸入裝置，該操作系統(tǒng)也可控制加熱元件為洗脫結(jié)合的核酸適體以及隨后將它們收集至對應的收集容器而進行的加熱操作的時序。
由于SELEX過程具有高度的連續(xù)性，優(yōu)選的，各種與微流體芯片相關(guān)的系統(tǒng)為自動化系統(tǒng)，并且有易于編程和修改的配套的計算機軟件。本發(fā)明的微流體系統(tǒng)的計算機可控制系統(tǒng)的進程，并接收信號進行解釋。例如，該計算機能夠控制從儲存容器中獲取SELEX 循環(huán)所需的樣本或分析物的機器人子系統(tǒng)。該計算機能夠控制樣本站以指定的吸取配方中的樣本和試劑至微流體裝置中的順序?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的計算機接口通過計算機在微流體裝置上施加壓力差和電勢，從而控制泵和閥裝置以調(diào)控試劑流入和流出系統(tǒng)。該計算機可以是獨立的子系統(tǒng)，其可以是作為多功能分析儀器的整合部分，或者是模塊化的子系統(tǒng)中獨立的計算機。
控制過程和解釋探測器探測信號的計算機系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域所知的任意計算機系統(tǒng)。該計算機還包含軟件程序，例如，可用于關(guān)聯(lián)、分析和評估一個或者多個核酸適體是否存在的探測器探測信號，評估探測器探測信號以定量核酸適體，檢測和評估功率水平以計算加熱元件散發(fā)的熱量和加熱元件處的溫度，分析熔解性，計算核酸適體紫外吸收從而進行核酸適體的設(shè)計和篩選。該計算機可與一個或者多個控制液體流入和流出的閥門，各種微流體芯片中的加熱元件控制器，流速控制器，進行功能通信，以控制芯片或者探測器中流體的流速和方向。該計算機還可以控制電源電路，控制機械驅(qū)動器，通過通信線路接受信息，儲存信息，解釋探測器探測信號，計算相關(guān)性等等。
本發(fā)明中的系統(tǒng)可包括，例如，數(shù)字計算機，其含有錄入了數(shù)據(jù)集和指令集的軟件系統(tǒng)，以實施本文所述的多種分析方法。該計算機可以是含合適操作系統(tǒng)和控制軟件的個人電腦，或整合在系統(tǒng)中的簡單的邏輯裝置，如集成電路或具有存儲裝置的處理器。解釋探測器探測信號的軟件是現(xiàn)有的，或者可以由掌握標準編程語言如Visualbasiclortran、 Basic、Java等等的技術(shù)人員容易構(gòu)建。
雖然圖IC中所示系統(tǒng)40僅包括具有單個核酸適體庫源的單個芯片庫，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應該知道本發(fā)明的系統(tǒng)可修改以適用于多通路SELEX程序，在一個或者多個芯片中篩選一個或者多個靶點的2個或者多個核酸適體庫。這能夠提供多種核酸適體-靶點組合的結(jié)果。多通路SELEX系統(tǒng)可包括，例如，具有含一個或者多個靶點的一個或者多個反應室的微流體裝置，兩個或者多個庫流至這一個或者多個反應室中以接觸靶點，以及一個或者多個探測器、測序儀或分析儀器，用于探測由靶點和核酸適體庫接觸所產(chǎn)生的信號。所獲得的信號可被評估，以確定樣本本中是否存在核酸適體及其序列，或?qū)颖局械暮怂徇m體進行定量。該系統(tǒng)對于分析靶點/核酸適體組合的陣列是很有幫助的。
本發(fā)明的微流體芯片可與各種樣本操作站進行液體接觸。這些樣本操作站可以是，例如，自動取樣儀，如在環(huán)形托盤上載有多個核酸適體庫的旋轉(zhuǎn)樣本架，通過按序或隨機旋轉(zhuǎn)使一個或者多個移液器對齊庫容器。該移液器能裝于驅(qū)動臂上，通過驅(qū)動臂將移液管伸入樣本中取樣或輸運。微流體芯片也可以與洗脫收集器連接，洗脫收集器可以是，例如，自動收集器。這些收集器在SELEX過程中可收集來自各微室中洗脫的液體。樣本站也可以保持裝載有一個或者多個樣本或洗脫液的微孔板。該樣本站能夠以X-Y平面移動方式平移微孔板使得板中任一樣本孔對齊移液管。
在該系統(tǒng)的很多實施方式中，樣本或者試劑的容積非常小，例如，很多分子庫的典型容積。從這樣的庫或者洗脫的核酸適體中取樣，例如，在微孔板或者微陣列載片上取樣， 通常是由機器人系統(tǒng)完成，它能夠精確地把移液器槍頭定位在微量樣本中。在庫成員是脫水形式的實施方式中，能夠很方便的以移液器中注入少量的溶劑以溶解樣本并輸入至本發(fā)明中的微流體裝置中。
本發(fā)明的方法是有關(guān)使用微流體芯片的改進的SELEX方法。SELEX是組合化學的 “演化”的方法，它通過體外篩選以鑒定與特定靶點具有高親和力的RNA或DNA序列(Joyce， Gene，82 :83-87(1989) ；Ellington et al. , Nature 346 :818-822(1990) ；Tuerk et al., Science, 1990 ；249 :505-510 (1990)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。一些文獻描述了 SELEX 過程(Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol.，4 :331-336(1994) ；Lorsch et al.，Acc. Chem. Res. ,29 :103-110(1996) ；Forst, J. Biotech. ,64 :101-118(1998) ；Klug et al., Mol. Biol. Rep.，20 :97-107 (1994)；美國專利案 5，270，163，5，475，096 和 5，707，796to Gold et al.，這些文獻和專利在此被全文并入?yún)⒖?。該過程使用能區(qū)分高親和力結(jié)合物和低親和力結(jié)合物的技術(shù)將功能性的高親和力分子從隨機的DNA或RNA池中分離出來。這些對靶點具有高親和力的功能序列已用作為針對特定生物受體的藥物，或者用作生物醫(yī)學分析或成像的診斷試劑。
傳統(tǒng)SELEX的一般過程涉及隨機DNA序列池(大約彡IO14-IO15不同的序列)的篩選。通常DNA被轉(zhuǎn)錄為比DNA更有功效的RNA。RNA池隨后通過含有結(jié)合至固相的靶點分子的微室。對固定的靶點分子具有親和力的RNA被保留在固相上。對靶點分子沒有親和力或具有弱親和力的RNA被洗脫。結(jié)合的RNA隨后通過使用含有自由配體的溶液從固相上洗脫，或通過改變結(jié)合條件洗脫。洗脫的RNA分子然后進行逆轉(zhuǎn)錄，所得到的DNA進行PCR 擴增。重復多次以后，這樣的篩選循環(huán)去除了池中非活性的RNA，僅保留了對靶點分子具有特異性和高親和力的序列。這種SELEX技術(shù)已被成功的應用于針對各種靶點分子篩選具有親和力的分子(Wiegand et al.，J. Immun.，1996 ；157 :221-230(1996) ；Huizenga et al.， Biochem.，1995 ；34 :656-665 (1995)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。
本發(fā)明的微流體SELEX篩選過程通過使用微流體芯片，從候選核酸混合物中識別靶點分子的核酸配體。這樣的候選核酸混合物也可稱為“庫”、“組合庫”、“隨機組合庫”、“組合池”、“隨機池，，或“隨機DNA池”。例如，在一個要進行篩選的候選核酸混合物中，每個核酸序列可以具有隨機區(qū)，以及其兩邊的引物特異區(qū)。隨機核苷酸的數(shù)量可以是任意長度，但通常其長度是10至80個核苷酸，更優(yōu)選的為20-60個核苷酸。引物特異區(qū)也可以是使其發(fā)揮引物作用的任意尺寸，但通常其長度為10-40個核苷酸，優(yōu)選地為約15-30個核苷酸。 無論如何，隨機區(qū)的核苷酸長度可以容易的按照需要增減。類似的，兩端的引物序列可以根據(jù)PCR所需條件進行修飾。此外，可挑選庫中所用的引物序列以減小PCR反應中引物-引物相互作用或引物二聚體的形成。設(shè)計的引物可以是各種熔解溫度；設(shè)計引物的方法為本領(lǐng)域所公知。
這樣的池含有對靶點分子具親和力的核酸分子以及對靶點分子不具親和力的核酸分子。候選核酸分子混合物可是單鏈DNA或單鏈RNA的隨機池。用于微流體SELEX的庫也可與傳統(tǒng) SELEX所用的 DNA 或 RNA 隨機池相似(He et al.，J Mol Biol 255:55-66(1996)； Bock et al.，Nature 355 :564-566 (1992)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。另外，微流體SELEX過程所使用的的池可以是通過傳統(tǒng)SELEX過程篩選過一輪或者多輪的部分篩選的池。
請參圖3A，微流體SELEX過程是有關(guān)篩選與一種或者多種靶點分子結(jié)合的核酸適體。該方法包括在允許核酸分子與靶點分子有效地特異地結(jié)合的條件下將核酸群體導入至微流體裝置中。該方法進一步包括從該微流體裝置中基本去除所有不與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子，然后對加熱元件加熱以使與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子(即，核酸適體)變性，然后回收與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子。這些回收的核酸分子是篩選出的針對它們所結(jié)合的靶點分子的核酸適體。
該過程可重復任意次數(shù)。例如，所產(chǎn)生的與靶點結(jié)合的核酸分子的富集群體可逆轉(zhuǎn)錄(根據(jù)需要)，擴增，然后(i)進行克隆和測序，或者(ii)轉(zhuǎn)錄形成與靶點結(jié)合的核酸的富集的池，其可再通過加載了相同靶點分子的微流體SELEX裝置；或者兩種操作都實施。
本發(fā)明的微流體SELEX過程產(chǎn)生了一類稱為核酸適體的產(chǎn)物，每一個核酸適體都具有獨一無二的序列。本文中所使用的“核酸適體”是能夠與靶點化合物或分子特異結(jié)合的核酸配體。但“核酸適體”這個術(shù)語并不能衡量核酸與靶點的親和力。本發(fā)明的目的是將對靶點具有高親和力的核酸適體從低親和力核酸適體池中篩選出來。這樣，核酸適體針對靶點具有高結(jié)合親和力，并具有分子識別的特性。篩選出的核酸適體可以進行克隆和測序，從而能夠大量生產(chǎn)單個分離的和純化的核酸適體。
在本發(fā)明的一個實施方式中，核酸適體由RNA形成，該方法進一步包括對篩選出的核酸適體群體進行逆轉(zhuǎn)錄擴增。通過微流體SELEX過程獲得的篩選出的RNA核酸適體可使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄成為DNA。逆轉(zhuǎn)錄是將單鏈RNA序列轉(zhuǎn)化為單鏈DNA 序列的酶學方法。用于逆轉(zhuǎn)錄的酶被稱為RNA依賴型DNA聚合酶(Gelfand的美國專利第 5，322，770號以及第5，641，864號，Hayashizaki的美國專利第6，013，488號，這些專利在此被全文并入?yún)⒖?。
在本發(fā)明的另一實施方式中，核酸適體由DNA形成，在這種情況下，核酸適體的富集池可根據(jù)需要直接進行擴增、克隆和測序，并重新導入通過載有相同靶點分子的微流體 SELEX裝置中。
該方法可進一步包括對經(jīng)擴增的核酸適體群體進行純化和測序。通過微流體SELEX過程所得到核酸適體進行擴增后仍是對靶點分子具有類似的結(jié)合親和力的核酸適體序列的混合物。這些不同可能很小(例如，核酸適體的不同位置具有相似的序列)或展示完全不同的結(jié)合機制(結(jié)合至靶點分子的不同位點)?？寺『蜏y序可用于表征單個核酸適體，以及鑒定結(jié)合基序。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種克隆和測序的流程都可用于表征單個核酸適體。
該微流體裝置可設(shè)計為具有微室以及與含有靶點分子的微室流體接觸的通道，這樣，核酸適體和試劑進行混合后能夠進入微室與靶點分子接觸以形成反應混合物，其可產(chǎn)生或者不產(chǎn)生特定信號。含靶點的微室可與微流體裝置中的其他含有試劑的微室流體接觸，或者優(yōu)選的與試劑或者核酸適體庫池流體接觸，或者與液體操作站流體接觸，該操作站能夠串行地或并行地接收或輸運多個試劑、反應物或產(chǎn)物。
試劑可以是任意SELEX過程中有用的組分，例如，能夠與核酸適體或靶點分子相互作用的化學試劑或生物分子，能夠控制反應條件的化學試劑或生物分子，或者能夠產(chǎn)生可探測信號的化學試劑或生物分子。試劑通常是溶液中的一種或者多種分子，或者固定于微流體芯片上的一種或多種分子，它們能夠流動以與微室中的靶點接觸，或者與核酸適體或者核酸適體池接觸。例如，試劑可以是洗滌緩沖液、結(jié)合緩沖液或者封阻緩沖液。其他試劑包括發(fā)色團，它能與靶點反應提供改變的光學信號。系統(tǒng)中的試劑還可包括附著至介質(zhì) (如，凝膠或固相載體)的分子，它們能夠與靶點或核酸適體相互作用。例如，該試劑可以是固相載體上的親和分子。不止一種試劑能參與可探測信號的生成。本發(fā)明系統(tǒng)中所用的典型試劑包括，例如，位點特異試劑、PCR引物、標記的配體、發(fā)色團、抗體、熒光基團、酶、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針、分子信標、放射性核素和/或類似的試劑。
微流體裝置中靶點分子與特定試劑和核酸適體是在微室內(nèi)進行接觸的。這些微室也可被配置成提供為提供由靶點和核酸適體接觸而產(chǎn)生的可探測信號所必需的條件，或提供將特異的或更高親和力的核酸適體和非特異的或更低親和力的核酸適體區(qū)分開的條件。 核酸適體對靶點分子的親和力取決于各個靶點的特性、反應條件以及所用的核酸適體池。 例如，反應室能夠受到力的作用以引導液體流動，具有可控的溫度以進行結(jié)合和洗脫，具有足夠的長度以在流動中提供充分的孵育時間，具有固相載體以保持或者捕獲反應成分，保持篩選介質(zhì)和/或類似功能。該裝置可具有單個反應室或者多個反應室。
反應室還可以是，例如，溫控循環(huán)儀擴增室，能夠在微室中存在反應混合物時按照可編程的溫度控制方案使得微室溫度進行多次循環(huán)。溫控循環(huán)室中的擴增反應是典型的聚合酶鏈式反應(PCR)，以擴增樣本中稀有的或者稀釋的核酸序列，從而使它們能夠被檢測或測序。目前已有很多高通量的進行PCR和其他擴增反應的方法，例如，在微流體裝置中進行擴增反應的方法，以及在裝置中探測和分析擴增的核酸的方法(Knapp等的美國專利第 6，444，461 號、第 6，406，893 號、第 6，391，622 號，Kopf-Sill 等的美國專利第 6，303，343 號， Nagle等的美國專利第6，171，850號，Loewy等的美國專利第5，939，291號，Wilding等的美國專利第 5,955,0 號，Chow 等的美國專利第 5,965,410 號，Zhang et al. Anal Chem. 71 1138-1145 (1999)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。
在一些情況下，反應室也可以作為各種試劑的孵育室和/或混和器，例如，供化學試劑或生物分子特定地與靶點反應以產(chǎn)生結(jié)合構(gòu)象。在其他情況下，反應室可含有選擇性介質(zhì)形式的試劑。選擇性介質(zhì)可是本領(lǐng)域所公知的介質(zhì)，如，尺寸選擇性介質(zhì)(例如，尺寸排除介質(zhì)或電泳凝膠)，等電聚焦(IEF)技術(shù)所使用的兩性電解質(zhì)緩沖液，離子交換介質(zhì)， 親和介質(zhì)(例如，凝集素樹脂、附著至固相載體的抗體、金屬離子樹脂等等)，疏水作用樹脂，螯合樹脂和/或類似介質(zhì)。例如，使樣本與尺寸排除介質(zhì)試劑接觸能夠?qū)⒛繕撕怂徇m體同其他成分分開，從而在預定的保留時間后的吸收信號可被解讀，以確定樣本中是否存在核酸，或者確定核酸的量。
微流體裝置還可包括可被探測器監(jiān)測的探測區(qū)，探測器探測器探測信號，這些信號如，靶點與核酸適體接觸產(chǎn)生的信號，與樣本分析物反應后的試劑所產(chǎn)生的信號，可探測信號的消失(例如，樣本分析物的量不足以產(chǎn)生探測器敏感度能識別的信號，從而認為該分析物不存在)，與樣本分析物的量相關(guān)的信號幅度和/或類似的信號。探測區(qū)可以是與傳感器功能性接觸的一個或者多個通道、微室區(qū)域或者微室。例如，探測區(qū)可以包括傳感器， 如PH電極、電導儀電極。探測區(qū)可包括一個或者多個對特定波長的光具有通透性的微室， 使得光信號，例如，吸收、熒光發(fā)射、化學發(fā)光等能夠被探測到。探測器可以位于微流體裝置中，或者與該裝置相近，處于接收樣本與試劑接觸后產(chǎn)生信號的方向。探測器可包括，例如， 核酸測序儀、熒光計、電荷耦合裝置、激光器、光電倍增管、分光光度計、掃描探測器、顯微鏡或者(ialvo掃描儀。從試劑與樣本相互作用探測到的信號可以是，例如，光波長的吸收、光發(fā)射、放射性、導電率、光的折射等等。信號的特征，如幅度、頻率、持續(xù)時間、計數(shù)等等可以被探測到。
探測器可以從探測區(qū)探測信號，該區(qū)域以物理尺寸描述，如發(fā)出信號的探測點、 線、面或容積。在很多實施方式中，探測器監(jiān)視的探測區(qū)基本上是從反應通道流出的反應混合物流經(jīng)的通道上的點。在其他的實施方式中，該探測器可以在反應混合物流動時或者停止時，沿著通道的長度方向掃描探測區(qū)。在又一些實施方式中，該探測器可掃描表面或容積的圖像以獲得試劑和樣本相互作用所產(chǎn)生的信號。例如，探測器可以同時成像多個并行的通道，這些通道含有來自多個分析的反應混合物，從而能夠同時探測多個不同分析的結(jié)果。
該探測器能夠發(fā)送表達接收到的結(jié)果信號特征的探測器信號。例如，探測器可以與輸出裝置進行通信，如模擬的或數(shù)字的計量器，其顯示與結(jié)果信號強度成比例的值。該探測器可以通過數(shù)據(jù)傳輸線與計算機通信，以傳輸模擬的或者數(shù)字的探測器信號，對信號進行顯示、儲存、評估、關(guān)聯(lián)等操作。
雖然在以上展示的實施例中是使用加熱元件來變性與靶點分子結(jié)合的核酸。在本發(fā)明的另一替換實施方式中，該微流體裝置可以加以改造以去除加熱元件，而是使用含有高度嚴格的洗滌試劑的儲液池代替，這些洗滌試劑能夠有效的使核酸適體發(fā)生化學變性。 變性是通過使用一些外在的壓力或者化學試劑，如強堿性試劑或者離液劑如甲酰胺、胍鹽或者尿素，使核酸失去三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的過程。核酸如DNA或RNA的變性通常在高溫下也會發(fā)生。在二級結(jié)構(gòu)層面上，變性是雙鏈分解為兩條單鏈。當兩條鏈之間的氫鍵破裂時就會發(fā)生。在三級結(jié)構(gòu)層面上，RNA各個位點間的相互作用，如氫鍵結(jié)合，可以被變性劑干擾。
本發(fā)明的方法可以使得在一個或者多個獨立的流體裝置上進行回收、逆轉(zhuǎn)錄、擴增、純化和/或測序，這些流體裝置與本發(fā)明的微流體裝置通過流體連接。這些裝置可以是，例如，溫控循環(huán)儀擴增室、色譜分析室、溫育室、親和捕獲室、序列探測室或者進行類似任務的裝置。這些微室還可包括探測區(qū)或連接至探測區(qū)以探測例如，測序反應所產(chǎn)生的信號。所產(chǎn)生的信號可以使用任何合適的探測器探測。探測器可以串行的或并行的方式分別探測來自兩個或者多個反應室的信號。所產(chǎn)生的提供關(guān)于核酸適體或者靶點或者其他分析物的信息的信號可以是，例如，由與樣本核酸適體反應的試劑所產(chǎn)生的可探測信號，或者由核酸適體與靶點結(jié)合所產(chǎn)生的信號，可探測信號的缺失，和/或與結(jié)合至靶點的核酸適體的量相關(guān)的信號幅度。探測器可以是，例如，熒光計、電荷耦合裝置、激光器、酶、酶底物、光電倍增管、分光光度計、掃描探測器、顯微鏡、Galvo掃描儀、質(zhì)譜儀、液相色譜-質(zhì)譜儀、高壓液相色譜(HPLC)或者其他色譜檢測方法，和/或類似的探測器。
本發(fā)明的核酸適體是分析化學的有力工具，對于各種診斷分析均有幫助，并且能對很多研究領(lǐng)域提供直接的幫助，包括生物醫(yī)學和健康研究。例如，提高了的結(jié)合效率和 /或提高了的結(jié)合選擇性對于開發(fā)作用于特定生物受體的核酸適體的藥物非常有利。提高了結(jié)合效率和選擇性的核酸適體能夠提高藥物學活性，并具有更少的副作用。改良的核酸適體還能夠為開發(fā)診斷分析提供幫助，這些分析的探測往往受限于結(jié)合親和力。改良的核酸適體還能夠作為診斷標志物用于許多領(lǐng)域，例如，用于醫(yī)學分析，體內(nèi)成像和生物傳感器。選擇性的提高也有益于定量復雜基質(zhì)中存在的靶點。核酸適體可開發(fā)用于其他基于核酸適體的分析，如對分析物的分析。已有技術(shù)已經(jīng)描述了各種核酸適體的用途，本發(fā)明所披露的方法能夠擴展到這樣的應用中(German et al. Anal. Chem. , 70 :4540-4545 (1998)； Jhaveri et al. , J. Amer. Chem. Soc. , 122 :2469-2473 (2000) ；Lee et al. ,Anal. Biochem., 282 :142-146(2000) ；Bruno et al. , Biosens. Bioelec. ,14 :457-464(1999) ；Blank et al.，J. Biol. Chem.，279 :16464-16468(2001) ；Stojanovic et al.，J. Am. Chem. Soc.，123 4928-4931 (2001)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。
本發(fā)明的微流體SELEX過程還可用于開發(fā)診斷分析用于神經(jīng)方向的化合物一如神經(jīng)肽或小分子神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸鹽和鋅離子?；诤怂徇m體的診斷分析還可實現(xiàn)神經(jīng)肽分析，其通常在體內(nèi)以皮摩爾濃度存在。核酸適體可作為藥物使用，可以通過篩選對特定生物受體具有親和力的分子而設(shè)計(Osborne et al.，Chem. Rev. ,97 :349-370(1997)； Brody et al.，Rev. Mol. Biotech. ,74 :5-13(2000) ；White et al.，J. Clin. Invest.，106 929-934(2000)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。這樣的核酸適體藥物可用于修飾生物學信號通路或清除靶點病原，如病毒或癌變細胞。例如，結(jié)合至IgE的核酸適體能抑制免疫反應，對治療過敏反應和哮喘有用(Wiegand et al.，J. Immun.，1996 ；157 :221-230 (1996)， 該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。本發(fā)明的SELEX方法也可用于篩選那些不僅結(jié)合至靶點分子，還具有催化劑功能的RNA或DNA(Lorsch et al.，Acc. Chem. Res. ,29 103-110(1996)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。本發(fā)明的核酸適體包括含經(jīng)修飾的核苷酸，該核苷酸賦予了該核酸配體改良的特性，如提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性或提高了輸運的特性。這種修飾的實例包括但不限于，核糖和/或磷酸鹽和/或堿基位點所進行的化學取代。
本發(fā)明的另一方面涉及試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的微流體裝置或芯片，以及可選地包括一個或多個隨機核酸分子池、洗脫緩沖液、結(jié)合緩沖液、封阻緩沖液，進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR和/或轉(zhuǎn)錄的試劑，以及實施本發(fā)明的微流體SELEX過程的說明。本發(fā)明的微流體裝置或芯片可在試劑盒中以完全組裝好的形式提供，這種情況下，該裝置的不同微室中預裝了一種或者多種靶點分子。作為替換方案，該微流體裝置或芯片還可以以未組裝的形式提供，在這種情況下，試劑盒還可包含固定靶點分子的試劑，優(yōu)選用于形成高表面積的材料的試劑(例如，溶膠-凝膠試劑)，和實施固定靶點分子和組裝該裝置或芯片的說明。
實施例 本發(fā)明將通過下述實施例進一步闡明，這些實施例旨在作為本發(fā)明的示例。
實施例1-8的材料和方法 化學試劑和材料。SU-82075 和 PMMA All 購于 Microchem(Newton，MA)。載玻片購于VWR(Batavia，IL)。用于多芯片制作的直徑為4英尺的硼硅酸晶圓購于Corning (Corning, NY)。重組酵母TATA結(jié)合蛋白(TBP)和酵母TFIIB (轉(zhuǎn)錄因子IIB)蛋白根據(jù)文獻制備(Fan et al.，Proc Nat，1 Acad Sci USA 101 :6934-6939 Q004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。SDS-PAGE凝膠電泳被用于確證這些蛋白的表達情況。為了制備SDS-PAGE凝膠，把2ml 30%的丙烯酰胺混合物、1. 25ml的1. 5M Tris緩沖液(ρΗ8· 8)、 1. 7ml的去離子水、100 μ 1的10% SDS和100 μ 1的10% APS進行混合，從而使丙烯酰胺凝膠的最終濃度為12%。用于PDMS制作的硅樹脂184硅氧烷橡膠試劑盒購于Dow Corning 公司(Midland，MI)。所有的毛細管用品，包括留爾洛克(lure lock)、毛細管和連接器購于 Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA)。用于注入 RNA 核酸適體的 50 μ 1 和 25 μ 1 注射器購于Hamilton (Reno，NV)。推送緩沖液至微流體裝置的注射器(Iml和:3ml)購于Aria Medical(San Antonio, TX)。
蛋白質(zhì)制備根據(jù)標準的Hi S-標記蛋白純化方法，從BL21-DE3細胞中純化 His-標記的全長酵母TBP(TATA結(jié)合蛋白)、TFIIB (轉(zhuǎn)錄因子II)以及hHSFl (人熱休克轉(zhuǎn)錄因子 1)使用(Fan et al. ,Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 101 :6934-6939(2004) ；Sevilimedu et al. ,Nucleic Acids Res. 36 :3118-3127(2008) ；Zhao et al. ,Nucleic Acids Res. 34 3755-3761 (2006)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。對于酵母TFIIA (轉(zhuǎn)錄因子IIA)，重組蛋白的純化使用了 S. Hahn 的方法(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle), 其中，亞基Toal和Toa2分別在大腸桿菌中表達，在8M尿素中變性，通過透析去除尿素后組合和復性(Hahn et al. ,Cell, 58 :1173-1181 (1989)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。透析膜(MW 10, 000)根據(jù)生產(chǎn)商說明制備。經(jīng)純化的靶點蛋白部分在4°C下，IL透析緩沖液OOmM Tris-HCl, 50mM KC1，和10%甘油，pH8. 0)中透析過夜。這些蛋白的表達和純化使用SDS-PAGE確證。
實施例1用于芯片上SELEX的微流體裝置的制作 如圖IA-B所展示類型的微流體芯片包括具有微流體通道或微室的PDMS(聚二甲硅氧烷，Dow Corning, MI)蓋；以及具有一組鋁電極的玻璃或硼硅酸玻璃載片。硅樹脂 184試劑盒提供了用于制作PDMS蓋的固化劑和硅橡膠本體。固化劑和橡膠本體的比率 (1 10w/w)能得到具有優(yōu)良性能和彈性的PDMS蓋?；旌瞎袒瘎┖拖鹉z本體，并對混合物除氣處理后，將該混合物澆灌至預制的SU-8(SU-8 2075,Microchem)母模上。該SU-8母模是在Imm厚的硅晶圓上使用常用的光刻技術(shù)獲得。壓印在PDMS蓋上的微流體部分為170 μ m 深和300 μ m寬的微通道和五個邊長為Imm的六邊形微室或微孔。PDMS蓋的厚度為大約 5mm(見圖;3B)。
選用鋁做為加熱器金屬，因為其延展性使得可以沉積獲得無應力的微米級厚的層。雖然采用了普通載玻片和4英尺硼酸玻璃晶圓都曾被可用作沉積鋁的基底材料(大量的電極組件可以導入至硼硅酸晶片上)，在此，用于芯片上SELEX的裝置使用了圖案化有5 個電極組件的普通載玻片。該玻璃載片使用RCA清潔方法清洗。該RCA清潔方法包括第一步，使用1 1 5的冊40!1、!1202和!120溶液于751下進行清洗；第二步，使用1 :1:6 的HCl、H2O2和H2O溶液在75°C下清洗。該方法清除了玻璃載片表面的有機物污染。該玻璃載片隨后使用光刻膠覆蓋。使用標準的光蝕刻技術(shù)圖案化光刻膠層。隨后，鋁被沉積至光刻膠層的表面。使用電子束蒸發(fā)器，(Evaporator-CHA MARK 50)獲得了總厚度為1. 2μπι 的鋁層。沉積之后，光刻膠使用掀離溶劑(Microposit 1165，Microchem)N-甲基吡咯烷酮處理超過M小時逐漸去除。獲得的電極可作為局部的熱源，用以從蛋白結(jié)合陣列中被選中的元件上釋放結(jié)合的核酸適體。如圖2所示。
將鋁電極沉積至玻璃載片表面之后，使用標準的光蝕刻技術(shù)以及利用Plasm Therm 72(Qualtx Technology Inc. , TX)的反應離子蝕刻工藝把1. 4 μ m厚的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)層圖案化。同樣參見圖2所示。
粘合PDMS蓋之前，含靶點蛋白的溶膠-凝膠混合物被沉積于圖案化的PMMA表面的鋁電極之上(圖IB和幻。溶膠-凝膠材料參照已有文獻中的方法制備(Kim，et al.， J. Biomat. Sci. 16 :1521-1535 (2005)，該文獻在此全部引用以作參考)，僅對其進行了細微的修改。
對于以下實施例2-4中的裝置，溶膠-凝膠中僅載入TBP。對于下文實施例5中的裝置，溶膠-凝膠中僅載入TFIIB。
對于實施例6中的裝置，使用針型點樣器(Stealth Solid pin,SNS6)把含有蛋白 yTBP、yTFIIA、yTFIIB和hHSFl的溶膠-凝膠微滴分別點在單個鋁電極加熱器的中心。載有這四種蛋白的溶膠-凝膠位于微室1-4，如圖3A中所示。第五個微室N作為陰性對照，并未載入蛋白。凝膠過程中，該芯片置于潮濕的腔中( 80%濕度)超過12小時。圖案化的 PMMA層增強了溶膠凝膠網(wǎng)絡(luò)與表面的附著力；此外，它保護了鋁層在電接觸時不會受到電化學的腐蝕。硅酸溶膠-凝膠網(wǎng)絡(luò)的點直徑為大約300 μ m，所產(chǎn)生的典型容積為大約7nl。
凝膠過程完成以后，利用掀離沉積工藝在溶膠凝膠點的表面沉積導電的金層 (20nm左右)。該過程使用了電子束蒸發(fā)器(Evaporator-CHA MARK 50)。然后對溶膠-凝膠點的表面使用掃描電鏡(Zeiss Ultra, Carl Zeiss, Germany)進行觀察。
可觀察到兩種不同類型的孔。小尺寸的孔直徑為大約20-30nm，大尺寸的孔洞直徑大小為100-200nm(圖4)。這些均勻分布于整個溶膠-凝膠表面的孔，作為通向固定在內(nèi)部的蛋白的分子通道。五組溶膠-凝膠均勻地沿著微流體通道點樣。
溶膠-凝膠間的距離，根據(jù)微室和電極的位置，保持在1cm，以防止其他電極對緩沖液進行不需要的加熱。為進行孵育和反應，溶膠-凝膠附近布置了六邊形的微室。該六邊形微室以及微室間連接通道的容積分別為0. 22 μ 1和0. 41 μ 1。
當溶膠-凝膠處于凝膠過程中時，PDMS被澆鑄至SU-8母模上。在進行粘合之前， 使用PDMS細胞培養(yǎng)孔及其塑料蓋(Culture well, Grace Bio-Lab)覆蓋溶膠-凝膠點，以防止其受到氧等離子體的損傷。玻璃基底和PDMS蓋在氧等離子處理下進行粘合。圖2展示了詳細的微型芯片制作步驟的示意圖。完成的微流體裝置以及實驗系統(tǒng)如圖IA-C和;3B 所示。微流體芯片的最終尺寸為75mmX25mmX5mm。
實施例2加熱電極的設(shè)計和表征 如上所述，所述微流體芯片內(nèi)集成有五組加熱電極。這些電極包括兩個電極區(qū)供探針臺使用，以及一個窄電阻區(qū)用于產(chǎn)生熱量。電極的總電阻根據(jù)其厚度為大約2 < 5Ω。 為表征加熱電極，在變化的條件下對含有TBP和TATA DNA并且熔解溫度為81. 5°C的溶膠-凝膠進行加熱。酵母TATA結(jié)合蛋白(TBP)和TATADNA區(qū)被用作蛋白-核酸適體對，因為TBP是一個已知的測試系統(tǒng)。TBP識別大多數(shù)重要的真核生物核心啟動子基序，即TATA元素。TBP是所有酵母中RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所必不可少的。在制備溶膠-凝膠時，向混合物中摻入了 TBP，以及嵌入 SYBR Green I (Invitrogen,Molecular Probes)染料標記的 TATADNA。 TATA DNA的熔解溫度通過使用定量PCR儀進行測定。完全凝膠之后，利用KeithleyMOO 電源電表(Cleveland，OH)對電極通電，從而對其中結(jié)合緩沖液流速為90 μ L/min的微流體室內(nèi)的溶膠-凝膠進行加熱，其中，該電表可產(chǎn)生的最大功率為22W。加熱的效果在熒光顯微鏡下同步觀測。IP-Lab軟件用于在5分鐘的時間內(nèi)連續(xù)拍攝30張熒光照片。每個溶膠-凝膠點的熒光強度使用Matlab設(shè)計的程序進行分析。
如圖5A-D所示，對電極施加了各種電壓。相應的溶膠-凝膠的熒光照片附在每幅圖上。單獨地確定了電極能夠在2分鐘內(nèi)使PBS緩沖液微滴(< 10μ1)沸騰。基于此， 100mW、424mW、536mW、645mW的電源功率被分別加載于單個溶膠-凝膠。在電源輸運相應功率的時候，進行連續(xù)的熒光拍照(照片間間隔20秒)，并對每個照片的強度和時間做圖。這些熒光強度的趨勢表現(xiàn)出遵循指數(shù)衰減模型。因此，這些數(shù)據(jù)被擬合至如下模型 I = IB+I0e-t/T 其中I是溶膠凝膠的強度，^是非特異性結(jié)合至溶膠-凝膠的熒光分子的強度，Itl 是溶膠-凝膠初始的強度，τ表示強度的半衰期。所有四幅圖片表明獲得的數(shù)據(jù)之間具有很好的一致性，并且以很高的相關(guān)性擬合至以上方程所表示的模型(R2 < 0. 9853,0. 9905、 0. 9969,0. 9976，對應功率 100、424、536、645mW)。對于功率 100mW、424mW、536mW 以及 645mW， 強度衰減的半衰期為分別為39. 4秒左右、7. 4秒左右、3. 4秒左右和1. 8秒左右。這些結(jié)果表明當電極上的功率超過400mW時，鋁電極把溶膠-凝膠加熱到高于TATADNA的熔解溫度 (81. 5 0C )。
實施例3固定蛋白和核酸間的相互作用的可視化 使用PDMS蓋封閉含TBP的溶膠-凝膠。封裝之后，通過連接主通道的一端與注射泵(泵11，Harvard Apparatus, Holliston, ΜΑ)，以PBS緩沖液(結(jié)合緩沖液)充分清洗通道。預清洗步驟完成后，以含 25mM Tris-Cl(pH 8) UOOmM NaCl、25mM KCl 和 10mMMgC12 以及5%脫脂牛奶的IX結(jié)合緩沖液封阻硅酸凝膠點1小時。封阻緩沖液作為反應混合物中的非特異性競爭結(jié)合物，有助于具有高親和力的分子的篩選。然后合成的TATA DNA互補鏈，其核酸序列為 5，-Cy3-GGGAA TTCGG GCTAT AAAAG GGGGA TCCGG-3，(SEQ ID NO 1)和 5，-CCGGA TCCCC CTTTT ATAGC CCGAA TTCCC-3，(200pmole) (SEQ ID NO :2)，在退火緩沖液 (20mM Tris-Cl(pH 7. 5), IOmM MgC12，和 50mM NaCl)中混合，使終容積為 50 μ 1，在 95°C下孵育5分鐘，然后緩慢降溫至室溫。Cy-3，一種青色素染料，常用于測量雙鏈DNA的熔解溫度。該Cy-3標記的TATADNA被導入微流體室中，然后使DNA孵育2小時。然后使用洗滌緩沖液進行清洗步驟。結(jié)合之后，固定的TBP蛋白與Cy-3標記的TATA DNA的相互作用通過熒光顯微鏡監(jiān)測。
24 Cy-3標記的TATA DNA對TBP具有高親和力，類似于傳統(tǒng)方法篩選出的核酸適體。 TATA DNA與TBP的結(jié)合分析在溶膠-凝膠微流體芯片中進行。在該實驗中，凝膠過程僅在溶膠-凝膠中固定了 ΤΒΡ。25μ 1反應容積內(nèi)的200pmole TATA DNA被導入至微流體微室中。測得的TATA DNA的熔解溫度為72°C。經(jīng)過2小時溫育，整個微流體通道和微室使用此前使用的洗滌緩沖液充分清洗，在流速15μ Ι/min條件下清洗30分鐘。除陰性對照溶膠-凝膠以外的溶膠-凝膠熒光強度使用熒光顯微鏡檢測(圖6)。結(jié)果表明TATA DNA確實與溶膠凝膠中固定的蛋白質(zhì)發(fā)生了結(jié)合。如圖5A-D所示，溶膠-凝膠的強度隨時間推移指數(shù)級衰減。因此，可認為當通入電源時，TATADNA從其靶點蛋白，TBP上釋放出來。因為獲得的數(shù)據(jù)同樣符合實施例2中的方程，強度衰減的半衰期可在功率450mW，6. 4士 1. 55秒時被提取獲得，雖然和前一實驗相比，使用了不同的成分(TATADNA-Cy3+TBP)，但該值仍然是可以接受的。該結(jié)果表明核酸適體能夠被微流體裝置中溶膠凝膠網(wǎng)絡(luò)中的靶點蛋白所捕獲，然后當環(huán)境溫度超過核酸適體的熔解溫度時，被自由釋放出來。此外，核酸適體的捕獲與釋放可以通過使用微流體裝置精確控制。
實施例4驗證選擇性洗脫中的RNA核酸適體 根據(jù)實施例2和3的結(jié)果，可預計到當以足夠高的功率把溶膠-凝膠基質(zhì)加熱到高于嵌入的生物分子的變形溫度時，結(jié)合至固定蛋白的RNA核酸適體將被洗脫。為驗證RNA 核酸適體與靶點蛋白結(jié)合，而不是非特異性的結(jié)合至溶膠-凝膠基質(zhì)，四個固定有TBP的溶膠-凝膠和一個空白陰性對照組溶膠-凝膠被點在微流體裝置中。干擾TBP與TATA DNA結(jié)合的1型RNA核酸適體被選用作為反應樣本，因為它們對TBP具有高親和力。圖7A-D中， 電泳圖證實了 1)結(jié)合的核酸適體成功的從溶膠-凝膠中釋放出來。標準梯狀DNA標記表明每個溶膠-凝膠的條帶對應了 RNA核酸適體條帶的大小(< IOObp) ；2)由于在空白溶膠-凝膠(陰性對照)中并未檢測到條帶信號或信號相當弱，說明RNA核酸適體主要不是結(jié)合于溶膠-凝膠基質(zhì)而是結(jié)合至TBP ；3)在指定PCR循環(huán)中能夠檢測出核酸適體的濃度極限是大約2. 6pmole至13pmole。圖8A-B比較了同一塊瓊脂糖凝膠中來自每個樣本的條帶強度。條帶的強度與注入的RNA核酸適體成正比。這是證明RNA結(jié)合至溶膠-凝膠網(wǎng)絡(luò)中的靶點蛋白的有力證據(jù)。
實施例5SELEX循環(huán)效率測試 為研究微流體SELEX芯片篩選時的循環(huán)效率，對它在不同階段從RNA池中篩選核酸適體的能力進行了測試。以往的經(jīng)驗表明，TFIIB和篩選出的核酸適體池之間的主要結(jié)合親和性在第8輪(G8) SELEX過程中首次展現(xiàn)。作為比較，微流體SELEX過程從針對TFIIB的已知的G4、G5和G6輪RNA核酸適體池開始。這些RNA池是用傳統(tǒng)的SELEX濾膜結(jié)合分析從起始池(< 2X IO15個序列)得來。體外篩選實驗的一個循環(huán)使用TFIIB蛋白作為靶點進行，該蛋白固定在微流體裝置中的四個溶膠-凝膠中。在反應微室經(jīng)過1小時溫育后，加熱洗脫，并進行轉(zhuǎn)錄，每輪(G4、G5和G6)的產(chǎn)物標記為G5’、G6’和G7’。這些產(chǎn)物對TFIIB 的親和力使用EMSA測試。實驗結(jié)果如圖9-10所示。圖中顯示，在G6’和G7’而不是G5’產(chǎn)物中，RNA池與TFIIB表現(xiàn)出了親和力(圖10B)。G7，RNA池比G6，表現(xiàn)出更高的親和力。 因此，微流體SELEX芯片與傳統(tǒng)的濾膜結(jié)合分析相比具有更好的篩選效率(提前了 2個循環(huán))。該產(chǎn)物確實結(jié)合至TFIIB而不是其他蛋白的現(xiàn)象是來自以三種不同蛋白進行的EMSA 測試(圖10C)。選用TFIIA和TBP是因為TFIIB是聚合酶II轉(zhuǎn)錄機的組件，它與DNA、TBP和TFIIA形成四聯(lián)復合物。雖然這三種蛋白相互間聯(lián)系非常緊密，G7’產(chǎn)物僅表現(xiàn)出針對 TFIIB的親和力。這說明這一次循環(huán)的微流體SELEX產(chǎn)物特異性結(jié)合至TFIIB。
實施例6使用微流體片上SELEX裝置針對體外篩選多個靶點蛋白的核酸適體 整體的實驗設(shè)計如圖2的示意圖所示。使用四種不同核酸適體濃度進行四個獨立的實驗(四種靶點蛋白)。如實施例1所述，五個溶膠-凝膠微滴均勻地沿著微流體通道點樣。每個溶膠-凝膠微滴能夠捕獲大約30fmole蛋白，從而一個微流體裝置中固定了總共 120fmole蛋白(四種蛋白)。
起始池中含有 IO15個不同的RNA分子。該核酸池中的成員的結(jié)構(gòu)包括中心50bp長的隨機區(qū)，兩側(cè)具有兩個含5’ -T7啟動子的恒定區(qū)，便于PCR擴增(參見圖 14A-F)。前兩個循環(huán)的篩選和擴增使用傳統(tǒng)的硝化纖維素濾膜結(jié)合分析，按照之前所描述的進行(Yokomori et al.，Genes & Dev 8 :2313-2323(1994) ；Fan et al.，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 101 :6934-6939(2004) ；Sevilimedu et al. , Nucleic Acids Res 36 3118-3127(2008)，這些文獻在此被全文并入?yún)⒖?。每個RNA-蛋白混合物在IX結(jié)合緩沖液(12mM HEPES pH 7. 9、150_200mM NaClU-IOmM Mg C12、lmM DTT)中溫育，使用硝化纖維素濾膜分離，結(jié)合的RNA通過使用苯酚抽提回收，并進行擴增以得到下輪循環(huán)所使用的富集的池。如圖11所示。
第二輪循環(huán)完成以后，使用實施例1中的微流體SELEX平臺進行了四輪循環(huán)體外篩選和擴增。在注射反應樣本至微流體裝置以前，微通道和反應室使用結(jié)合緩沖液浸潤并封阻1小時以防止核酸適體與溶膠-凝膠或微流體裝置可能的非特異性結(jié)合。然后， 25 μ 1的反應樣本被注入該裝置中，在室溫下溫育2小時。3. 46 μ 1的反應容積內(nèi)的大約 1. 2pmoIeRNA被導入至微流體微室中。
在這些芯片中，所有的反應和洗滌步驟使用注射泵進行。溫育和洗滌完成后，使用 Keithley 2400電源電表(Cleveland，OH)對電極通電，以加熱結(jié)合緩沖液流速90 μ 1/min 的微流體室中的溶膠-凝膠微滴。最佳的電源功率(1. 5V,450mff)被加載于鋁電極作用2分鐘以進行加熱洗脫，從hHSFl液滴開始(微室4，接近輸出口)到TBP液滴(微室1)再到陰性對照(微室N，接近輸入口)。含有這些溶膠-凝膠點的微室的相對位置關(guān)系如圖3A所示。按照這個順序進行加熱能夠避免不希望的熱效應作用于隨后的微室中。
每個洗脫的RNA核酸適體如傳統(tǒng)SELEX —樣進行回收，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增，然后轉(zhuǎn)錄為RNA核酸適體(圖3A)。逆轉(zhuǎn)錄反應使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitroger^CA)進行。得到的cDNA直接進行PCR反應(15個循環(huán))。正向引物和反向引物的序列是 Forward(SEQ ID NO 3) 5’ -GTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCAACTGCCATCTA-3’ Reverse (SEQ ID NO :4) 5’ -ACCGAGTCCAGAAGCTTGTAGT-3， PCR產(chǎn)物的條帶大小( IOObp)使用含8M尿素的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。每種PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR Purif ication試劑盒Oliagen，Germany)進行純化，然后使用 MEGAshortscript 試劑盒(Ambion，USA)轉(zhuǎn)化為 RNA 核酸適體。針對 TBP、TFIIA、TFIIB 和hHSFl的等摩爾RNA核酸適體被導入微流體芯片中進行下一篩選步驟(圖3A)。
前面的實例已證實核酸適體能夠特異性結(jié)合至它們相應的蛋白靶點，并且能夠通過微加熱選擇性的洗脫?；谶@樣的片上SELEX方法，利用酵母TBP實施第一個蛋白SELEX， 其之前已使用傳統(tǒng)的濾膜結(jié)合SELEX方法篩選過核酸適體。如圖3A所示，TBP蛋白以及其他3個蛋白(TFIIA、TFIIB JPhHSFl)還有一個陰性對照(不含蛋白)被固定，以在沒有負SELEX步驟的條件下獲得高度特異性的核酸適體。相對于傳統(tǒng)的SELEX(Jenison et al.，Science (New York, N. Y.) 263 1425-1429 (1994)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)，這還減少了所需要的循環(huán)的數(shù)量。
為獲得高親和力和特異性的核酸適體，在傳統(tǒng)的宏觀規(guī)模SELEX中，加入了全套核酸適體池(大約IO15個序列， 1.7nM)。與蛋白相比，這使用了更多的量的池，因為競爭能夠提高池中核酸適體的選擇性。因此，用于SELEX的微流體裝置應能夠容納至少1. 7pM 的靶點蛋白(比池小1000倍)。然而，SELEX微流體裝置在每個7nl的溶膠-凝膠液滴中僅能夠容納30fmol (0. 6ng)的TBP蛋白，因此，可固定總量為120fmol的蛋白，如圖所示。在微流體裝置或基于芯片的微型分析中，固定的靶點蛋白量少(大約小14倍)會造成問題，因為它失去了池的復雜性。因此，在微流體SELEX的起始輪，使用了濾膜結(jié)合的SELEX 方法，在得到核酸適體的富集的池以后，再使用微流體SELEX獲取特異的以及各種的核酸適體。應知道，當使用更大的多通路裝置時，能夠直接篩選隨機核酸池，而不需要先進行傳統(tǒng)的SELEX。
如圖11所示，TBP核酸適體篩選使用微流體SELEX進行，其結(jié)果與傳統(tǒng)的濾膜結(jié)合SELEX (Fan et al. , Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 101 :6934-6939 Q004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)進行了比較。在進行了初始的兩輪濾膜結(jié)合SELEX后，進行了四輪連續(xù)的微流體SELEX。在酵母TBP的傳統(tǒng)SELEX中，TBP的核酸適體可以在11個SELEX 循環(huán)后獲得，還需要進行幾輪額外的負篩選循環(huán)。這些實例中，僅經(jīng)過三個微流體SELEX循環(huán)就得到了高特異性和強親和力的核酸適體，甚至不用進行負SELEX篩選。所得到的核酸適體群體與上述實施例5中的報道的相當。由于TBP靶點蛋白被固定于第一位置，以含有 TFIIA(位置2)、TFIIB(位置3)和hHSFl (位置4)的溶膠-凝膠液滴作為競爭結(jié)合物以及不含蛋白的溶膠-凝膠液滴(N)，所以沒有必要添加額外的負篩選SELDC步驟。這進一步減少了微流體SELEX的循環(huán)數(shù)，并提高了所篩選的核酸適體的特異性(圖3A)。
利用第6輪(ms-6)最后篩選出的池，獲得了 38個核酸適體，并對其進行了測序。 這些序列屬于20個克隆，這些克隆的序列在下文表5中列出。基于利用序列對比，從微流體SELEX分離獲得的核酸適體序列之間的比較，其中，該微流體SELEX是利用此前以傳統(tǒng)濾膜結(jié)合篩選獲得的序列(Fan et al.，Proc. Nat，1. Acad. Sci. 101 :69；34_6939 Q004)，在此被全文并入?yún)⒖?，結(jié)果表明它們具有100%同源性(aptTBP-#17/ms-6. 16和aptTBP_#l/ ms-6. 38)以及98%同源性(aptTBP#13/ms-6. 4)，分別列入組I中，而新分離出的核酸適體列入組II中。除了 ms-6. 7，這些克隆間并沒有共同的保守序列。微流體SELEX中豐度最高的序列(38個中有8個)ms6-#4是此前研究中分離出的高親和力的核酸適體(僅一個堿基對不匹配)(Fan et al. , Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 101 :6934-6939 Q004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。這些結(jié)果表明使用微流體SELEX能夠成功的分離核酸適體。
實施例7使用基于溶膠-凝膠的陣列芯片進行蛋白質(zhì)-核酸適體結(jié)合分析 進一步研究了微流體SELEX實驗中TBP核酸適體的富集步驟。針對TBP，對每輪的核酸適體池(mS-3、mS-4和ms-5)進行了收集，然后克隆和測序。序列在下文表1_4中列出。意外的是，核酸適體(TBP apt#l)在第三個循環(huán)(微流體SELEX第一輪)之后就能被篩選出。此外，在第一輪片上微流體SELEX中觀察到的三種核酸適體類型，mS-3(mS-3. Ums-3. 2 以及ms-3. 25)，擁有超過60%的共同序列(50中的31nt)。對于克隆ms_3. 1，它在分離出的 23 條序列中出現(xiàn)了 4 次。此外，克隆 ms-3. 3 與 ms_4. 20、ms_5. 4、ms_6. 38 和 aptTBP_#l 完全重疊。一段ms-3. 15和ms-3. 23所共有的七核苷酸長度的片段具有高度的保守性，在測序數(shù)據(jù)中被廣泛觀察到。因此，使用微流體SELEX，甚至在第一輪循環(huán)后就能夠獲得高親和力的核酸適體。
為進一步研究微流體SELEX新分離出的核酸適體的結(jié)合活性，核酸適體分別使用 Cy-3標記。針對TBP篩選出的核酸適體個體首先使用MEGAshortscript試劑盒(Ambion， USA)進行轉(zhuǎn)錄。簡單地說，在PCR擴增構(gòu)建核酸適體的DNA后，Iyg擴增的模板根據(jù)制造商的使用說明進行體外轉(zhuǎn)錄。之后，核酸適體使用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TdT)標記上 Cy3-dUTP0 RNA 核酸適體(Inmol)在含有 2nmol Cy3_dUTP (E-biogen，Korea)、20 單位 TdT(Fermentas)、200mM 二甲胂酸鉀、25mM Tris/HCl(pH 6. 6)、0. 25mg/ml 牛血清白蛋白、 5mM CoC12和0. 5mM三磷酸脫氧核苷酸，終體積為20 μ 1的反應液中，在37°C下溫育4小時。 其中加入了 10單位RNA酶抑制劑(Boehringer Mannheim)。反應通過添加EDTA終止。標記的RNA使用苯酚/氯仿/異戊醇處理抽提，并在0. 3M醋酸鈉的濃度下利用乙醇沉淀進行回收。
RNA池與TBP的結(jié)合使用溶膠-凝膠芯片分析測試。在96孔板(SPL，韓國)的 8個孔中，點入六個重復的樣本以及陰性對照組(無蛋白)和陽性對照組(Cy-3標記的蛋白)。溶膠-凝膠蛋白芯片點樣方法參照已有文獻中的方法(Kim et al.，Anal Chem 78 7392-7396 (2006)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。小孔使用100 μ 1 PBS溶液浸潤并使用封阻緩沖液(含有20 μ g/ml tRNA的結(jié)合緩沖液)溫育2小時。洗滌之后，每個小孔中的Cy-3標記的核酸適體(使用TdT酶標記)溫育2小時，然后進行3次15分鐘的洗滌。使用96孔熒光掃描儀和對應的軟件程序(FLA-5100 and Multi-gauge,Fuji Japan) 對完成的點樣板芯片孔進行掃描和分析。從每個點的信號強度(LAU/mm2)中減去背景信號強度后進行分析。
通過溶膠-凝膠微滴(圖12A)的熒光強度計算出單個序列的結(jié)合活性。結(jié)果如圖12B所示。一些ms-6核酸適體相比之前使用傳統(tǒng)濾膜結(jié)合篩選出的核酸適體在與TBP蛋白特異性結(jié)合方面表現(xiàn)更好(圖12B)。有意思的是，核酸適體ms-6. 16比核酸適體ms-6. 4 表現(xiàn)出更高的結(jié)合活性。當比較TBap-t#7和TBPapt-#13的解離常數(shù)，這個結(jié)果是合理的 (Fan et al.，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 101 :6934-6939 Q004)，該文獻作為參考并且其全文被并入本文)。這些結(jié)果共同證實了微流體裝置能夠富集核酸適體，甚至是在第一輪篩選之后。

權(quán)利要求
1.一種微流體裝置，包括包括在輸入口和輸出口之間延伸的一條或者多條流體通道的基底，位于所述一條或者多條流體通道中的分子結(jié)合區(qū)，其中，分子結(jié)合區(qū)包括靶點分子；以及鄰近分子結(jié)合區(qū)的加熱元件。
2.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述加熱元件包括位于基底表面的電極。
3.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述基底包括玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷以及高分子材料的一種或多種。
4.如權(quán)利要求3所述的微流體裝置，其中，所述基底是玻璃或硼硅酸玻璃底座和高分子材料蓋的組合，它們共同限定了所述一條或者多條流體通道。
5.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其還包括包裹所述加熱元件的高分子材料涂層， 從而使液體流過流體通道時不會直接與所述加熱元件接觸。
6.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述分子結(jié)合區(qū)是在所述高分子材料涂層上形成。
7.如權(quán)利要求6所述的微流體裝置，其中，所述高分子材料涂層為聚(甲基)丙烯酸
8.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述分子結(jié)合區(qū)包括具有所述靶點分子的高表面積材料。
9.如權(quán)利要求8所述的微流體裝置，其中，所述高表面積材料為溶膠-凝膠衍生產(chǎn)物， 水凝膠衍生產(chǎn)物，高分子刷衍生產(chǎn)物，硝化纖維素膜包裹產(chǎn)物，或者基于樹狀聚合物的產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述分子結(jié)合區(qū)包括所述一條或者多條流體通道的表面，這些流體通道包括一種或者多種聯(lián)接分子，能夠使所述靶點分子附著至所述區(qū)域內(nèi)的表面。
11.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述靶點分子是蛋白質(zhì)或多肽，糖類，脂類，制藥劑，有機非制藥試劑，或者高分子復合物。
12.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其還包括至少一個位于所述輸入口和輸出口之間并且與所述一條或者多條流體通道流體連接的微室，以及基本位于與所述加熱元件鄰近的所述微室內(nèi)的溶膠-凝膠材料。
13.如權(quán)利要求12所述的微流體裝置，其中，所述至少一個微室包括兩個或者更多微室。
14.如權(quán)利要求13所述的微流體裝置，其中，所述兩個或者多個微室包括相同的靶點分子。
15.如權(quán)利要求13所述的微流體裝置，其中，所述兩個或者多個微室包括不同的靶點分子。
16.如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其還包括與輸入口連通的多端口耦合裝置。
17.如權(quán)利要求16所述的微流體裝置，其還包括一個或者多個和所述多端口耦合裝置連通的儲液池，所述一個或者多個儲液池各自含有洗滌緩沖液、封阻緩沖液、結(jié)合緩沖液或含有核酸分子群體的溶液。
18.—種篩選與一個或者多個靶點分子結(jié)合的核酸適體的方法，包括 提供如權(quán)利要求1-17任一所述的微流體裝置；以及在核酸分子與靶點分子能夠有效特異結(jié)合的條件下，將核酸分子群體導入至微流體裝置中；從微流體裝置中基本去除所有不與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子； 使所述加熱元件加熱，致使與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子變性；以及回收與靶點分子特異結(jié)合的核酸分子，這些回收獲得的核酸分子即是篩選出的特異結(jié)合至靶點分子的核酸適體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述核酸適體包括RNA核酸適體，所述方法還包括對篩選出的核酸適體群體進行逆轉(zhuǎn)錄擴增。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括 對經(jīng)擴增的核酸適體群體進行純化和測序。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述回收，所述逆轉(zhuǎn)錄擴增，所述純化，和/或所述測序是在一個或多個與所述微流體裝置流體聯(lián)通的獨立的流體裝置中進行的。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述的導入、去除、加熱以及回收均是自動化進行的。
23.表1-8中所識別出的核酸適體，除SEQID NOS : ，70，和81這幾個核酸適體以外。
24.一種篩選與一種或者多種靶點分子結(jié)合的核酸適體的方法，包括 提供微流體裝置，其包括包括在輸入口和輸出口之間延伸的一條或者多條流體通道的基底，以及位于所述一條或者多條流體通道中的一個或者多個分子結(jié)合區(qū)，其中，所述一個或者多個分子結(jié)合區(qū)每個含有一種靶點分子；在核酸分子能夠有效特異結(jié)合至所述一種或者多種靶點分子的條件下，將核酸分子群體導入所述微流體裝置中；從微流體裝置中基本去除所有不與所述靶點分子特異結(jié)合的核酸分子； 使特異結(jié)合至所述靶點分子的核酸分子變性；以及回收與所述靶點分子特異結(jié)合的核酸分子，這些回收獲得的核酸分子是篩選出的能夠結(jié)合至所述靶點分子的核酸適體。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述一個或者多個分子結(jié)合區(qū)包括兩個或者更多個分子結(jié)合區(qū)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述兩個或者多個分子結(jié)合區(qū)被安置于不同的位置。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述兩個或者多個分子結(jié)合區(qū)含有相同的靶點分子。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述兩個或者多個分子結(jié)合區(qū)含有不同的靶點分子。
29.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述一個或者多個分子結(jié)合區(qū)含有分子復合物， 該分子復合物包括兩種或者更多靶點分子。
30.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述變性過通過化學方法實現(xiàn)。
31.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述變性是通過對特異結(jié)合至靶點分子的核酸分子進行局部加熱實現(xiàn)。
32.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，對所述一個或者多個分子結(jié)合區(qū)每一個的所述變性和回收是分別進行的。
33.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述核酸適體包括RNA核酸適體，該方法還包括對篩選出的核酸適體群體進行逆轉(zhuǎn)錄擴增。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，還包括 對所述經(jīng)擴增的核酸適體群體進行純化和測序。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述回收，所述逆轉(zhuǎn)錄擴增，所述純化，和/或所述測序是在一個或多個與所述微流體裝置流體聯(lián)通的單獨流體裝置中進行的。
36.如權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述導入、去除、加熱以及回收均是自動化進行的。
37.一種制作微流體SELEX裝置的方法，包括把一種包含靶點分子的溶膠-凝膠材料涂在第一構(gòu)件的表面上，并使溶劑揮發(fā)，從而形成含有所述靶點分子的多孔基質(zhì)；以及將第二構(gòu)件封在所述第一構(gòu)件上，使得該第一和第二構(gòu)件一起形成具有輸入口、輸出口以及該輸入口和輸出口之間的至少一個微流體通道的微流體裝置，其中，所述多孔基質(zhì)與所述至少一個微流體通道流體連通。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，還包括，在所述涂溶膠-凝膠材料之前在所述第一構(gòu)件上設(shè)置電極，并使用高分子涂層包被該電極，從而形成涂溶膠-凝膠材料的表面。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述電極是金屬電極。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述設(shè)置電極包括 在所述第一構(gòu)件上涂一層圖案化的光刻膠層；在所述光刻膠層上沉積金屬；將所述第一構(gòu)件暴露于電子束蒸發(fā)器中，以在第一構(gòu)件上沒有光刻膠層的區(qū)域形成金屬層；以及去除所述光刻膠層。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述高分子材料是聚(甲基)丙烯酸酯。
42.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述第一構(gòu)件由玻璃、硼硅酸玻璃、玻璃陶瓷或者高分子材料形成，所述第二構(gòu)件由高分子材料形成。
43.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述第二構(gòu)件包括浮雕圖案，使得在所述封合時形成所述輸入口、輸出口以及至少一條微流體通道。
44.一種包括如權(quán)利要求1所述的微流體裝置的試劑盒。
45.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其還包括一個或者多個核酸分子隨機池，洗滌緩沖液，結(jié)合緩沖液，封阻緩沖液，進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR和/或轉(zhuǎn)錄所需的試劑，以及實施所述的微流體SELEX過程的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及微流體芯片以及它們在SELEX中的使用。所述微流體芯片優(yōu)選的包括具有含靶點的高表面積材料的反應室。一種優(yōu)選的高表面積材料是溶膠-凝膠衍生材料。本發(fā)明還描述了制作微流體芯片的方法，以及使用這些裝置針對靶點篩選核酸適體的方法。
文檔編號C12M1/38GK102186992SQ200980140755
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者H·G·克萊格海德, J·T·麗斯, 金粟勇, 樸相民 申請人:康奈爾大學