專利名稱：新的流感病毒免疫表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及包含流感抗原(更特別地，與其他流感毒株具有廣泛交叉反應(yīng)性的經(jīng)修飾流感抗原)之病毒樣顆粒的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
流感是由呼吸系統(tǒng)病毒引起的人類死亡首要原因。常見的癥狀包括發(fā)熱、咽喉疼痛、氣短和肌肉酸痛等。在流感季節(jié)，流感病毒感染全世界10 20 %的人口，每年導(dǎo)致 250 500，000人死亡。流感病毒是從受感染之哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜出芽的包膜病毒。根據(jù)所存在的核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原，流感病毒分為A型、B型或C型。根據(jù)所存在的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面糖蛋白的組合，A型流感病毒可進(jìn)一步分成若干亞型。HA控制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合以及穿入宿主細(xì)胞的能力。NA從宿主細(xì)胞和病毒表面蛋白上的聚糖鏈除去末端唾液酸殘基，這防止病毒凝集并有利于病毒運(yùn)動(dòng)。目前，已鑒定出16種HA(H1-H16)和9種 NA(Nl-NQ)亞型。每種A型流感病毒具有一種HA糖蛋白類型和一種NA糖蛋白類型。一般而言，每種亞型均表現(xiàn)出物種特異性；例如，已知所有HA和NA亞型均感染鳥類，而只有HI、 H2、H3、H5、H7、H9、H10、m、N2、N3 和 N7 顯示感染人類(Horimoto 2006 ；Suzuki 200 。含有H5、H7和H9的流感病毒被認(rèn)為是致病性最強(qiáng)的A型流感病毒形式，并且最有可能引起將來的大流行。流感大流行通常由高傳播性且高致病性的流感病毒引起，并可導(dǎo)致全球性疾病和死亡升級。在20世紀(jì)，新的A型流感亞型的出現(xiàn)導(dǎo)致四次主要的大流行。1918 1919年由Hmi病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年間導(dǎo)致世界范圍內(nèi)超過五千萬人死亡。 當(dāng)前，新亞型出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)或者動(dòng)物中特有的亞型向人傳播的風(fēng)險(xiǎn)總是存在。特別受到關(guān)注的是高致病性形式的禽流感(也稱作“鳥流感”)，據(jù)報(bào)道其已經(jīng)在全世界若干國家爆發(fā)。在許多情形下，該禽流感可在48小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致接近100%的死亡率。據(jù)推測，1997年在香港首次鑒定的禽流感病毒(H5N1)向其它亞洲國家和歐洲的傳播與野生鳥類的遷徙模式有關(guān)。目前對抗人中流感的方法是每年接種疫苗。疫苗通常是預(yù)測為即將到來之“流感季節(jié)”強(qiáng)勢毒株(dominant strain)的幾種毒株的組合。所述預(yù)測由世界衛(wèi)生組織來協(xié)調(diào)完成。一般而言，每年生產(chǎn)的疫苗劑量數(shù)不足以接種全世界的人群。例如，加拿大和美國獲得足以免疫其約三分之一人口的疫苗劑量，而歐盟僅有17%的人口可接種疫苗。很顯然，在世界范圍的流感大流行到來時(shí)，目前全世界的流感疫苗生產(chǎn)不能滿足需求。即使所需的年產(chǎn)量在給定年份中可以某種方式實(shí)現(xiàn)，然而強(qiáng)勢毒株每年都在變化，因此在一年的低需求時(shí)間大量儲備是不切實(shí)際的。經(jīng)濟(jì)地、大規(guī)模地生產(chǎn)有效流感疫苗是政府和私營企業(yè)等非常關(guān)心的。目前，用于疫苗中的最重要來源病毒儲液是在受精的蛋中生產(chǎn)的。收獲病毒顆粒， 為了得到滅活病毒疫苗，通過去污劑破壞使其滅活。減毒活疫苗由適于在低溫下生長的流感病毒制備，這意味著在正常體溫下所述疫苗的毒力減弱。這樣的疫苗在美國被批準(zhǔn)用于5 49歲的個(gè)體。全病毒滅活疫苗是通過化學(xué)試劑滅活而變?yōu)闊o害的，并且其已在胚蛋或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)。所有這些類型的疫苗都顯示出一些特定的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。全病毒來源之疫苗的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種疫苗所引起的免疫類型。通常，裂解型疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體應(yīng)答，而由全病毒制得的疫苗誘導(dǎo)抗體(體液)應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答。盡管功能性抗體應(yīng)答是與疫苗誘導(dǎo)之保護(hù)作用相關(guān)的獲批標(biāo)準(zhǔn)，然而越來越多的證據(jù)表明T細(xì)胞應(yīng)答對流感免疫也很重要，其還可為老年人提供更好的保護(hù)。為了誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，開發(fā)了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5m) 的高致病性，因此在BL3+設(shè)備中生產(chǎn)這些疫苗。對于高致病性流感毒株(例如H5m)來說， 為了降低流感毒株的致病性、使其無毒且更容易在胚蛋或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)，一些制造商對血凝素的基因序列進(jìn)行了修飾。另一些人還使用重排列(reassortant)流感毒株，其中血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白的基因序列被克隆進(jìn)高產(chǎn)量、低致病性的流感供體株(A/ PR/8/34 ；Quan F-S等，2007)中。盡管這些方法可生產(chǎn)有用的疫苗，但是它們?nèi)圆荒芴峁┮詽M足正常年份全球需求的所需規(guī)模來大量、低成本及快速生產(chǎn)疫苗的解決方法，并且當(dāng)大流行到來時(shí)幾乎必然地不能滿足需求。利用該反向遺傳技術(shù)，還可能需要對HA蛋白的基因序列進(jìn)行突變以使其無毒。就高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生產(chǎn)需要防護(hù)(confinement)程序或者所得疫苗不與流行中病毒的基因序列完全匹配。在減毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可與來自宿主的流感病毒重組而產(chǎn)生新流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。盡管該方法保持了抗原表位和翻譯后修飾，但是存在許多缺點(diǎn)，包括由于使用全病毒而引起的污染風(fēng)險(xiǎn)以及取決于病毒株的不確定的產(chǎn)量。亞最佳水平的保護(hù)可由以下原因?qū)е掠捎趯⒉《疽氲爸卸鸬牟《具z傳異質(zhì)性。其它缺點(diǎn)包括為了獲得蛋而進(jìn)行大量計(jì)劃，由于在純化中使用的化學(xué)品引起的污染風(fēng)險(xiǎn)以及生產(chǎn)時(shí)間長。此外，對蛋中蛋白質(zhì)過敏的人可能不適于接種所述疫苗。在大流行的情形中，需要使毒株適于在蛋中生長以及所得產(chǎn)量不確定減緩了裂解型疫苗的生產(chǎn)。盡管此技術(shù)用于生產(chǎn)季節(jié)性疫苗已使用了多年，但是因?yàn)槭澜绶秶纳a(chǎn)能力有限，因此它很難在合理的時(shí)間范圍內(nèi)響應(yīng)于大流行。流感病毒A型Hmi最近在墨西哥的爆發(fā)也顯示出對開發(fā)新出現(xiàn)毒株之疫苗的快速生產(chǎn)方法的迫切需要。為了避免使用蛋，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中(例如在MDCK或PERC. 6細(xì)胞等中)生產(chǎn)流感病毒。另一種方法是反向遺傳方法，其中通過用病毒基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞來生產(chǎn)病毒。然而，這些方法也需要使用全病毒以及復(fù)雜的方法和特定的培養(yǎng)環(huán)境。已開發(fā)了幾種作為候選重組流感疫苗的重組產(chǎn)物。這些方法關(guān)注A型流感病毒HA 和NA蛋白的表達(dá)、制備以及純化，包括利用桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞(Crawford等，1999 ； Johansson, 1999)、病毒載體和DNA疫苗構(gòu)建體(Olsen等，1997)來表達(dá)這些蛋白質(zhì)。流感病毒感染的特異性是公知的。簡言之，感染周期是從病毒體表面HA蛋白與含有唾液酸的細(xì)胞受體(糖蛋白和糖脂)結(jié)合開始的。NA蛋白介導(dǎo)對唾液酸受體的處理，病毒穿入細(xì)胞則取決于HA依賴性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。在含有流感病毒體的內(nèi)化內(nèi)涵體的酸性界限內(nèi)，HA蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，這導(dǎo)致病毒與細(xì)胞膜融合，病毒脫殼以及M2介導(dǎo)的從核衣殼相關(guān)核糖核蛋白(RNP)釋放Ml蛋白，Ml蛋白遷移到細(xì)胞核內(nèi)用于病毒RNA合成。抗HA蛋白的抗體通過中和病毒感染性來預(yù)防病毒感染，而抗NA蛋白的抗體介導(dǎo)其對病毒復(fù)制早期步驟的作用。 Crawford等(1999)公開了流感病毒HA在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。 所表達(dá)的蛋白質(zhì)被描述為能夠預(yù)防由禽類H5和H7流感亞型引起的致命性流感疾病。 Johansson等(1999)教導(dǎo)了桿狀病毒表達(dá)的流感病毒HA和NA蛋白在動(dòng)物中誘導(dǎo)了優(yōu)于常規(guī)疫苗所誘導(dǎo)之應(yīng)答的免疫應(yīng)答。桿狀病毒表達(dá)的馬流感病毒血凝素的免疫原性和效力可與同源DNA候選疫苗相比較(Olsen等，1997)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，使用多種實(shí)驗(yàn)方法以及在不同動(dòng)物模型中，可利用重組HA或NA蛋白誘導(dǎo)針對流感病毒攻擊的高度保護(hù)。由于先前的研究已顯示流感病毒表面糖蛋白HA和NA是用于誘導(dǎo)針對流感病毒之保護(hù)性免疫的主要靶標(biāo)，并且Ml提供了用于流感病毒之細(xì)胞免疫的保守性靶標(biāo)，所以新的候選疫苗可作為蛋白質(zhì)大分子顆粒(例如病毒樣顆粒(VLP))包含這些病毒抗原。作為疫苗產(chǎn)品，VLP提供了如下優(yōu)點(diǎn)比亞基或重組抗原具有更強(qiáng)的免疫原性，能刺激體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有這些流感抗原的顆?？烧故境鰳?gòu)象表位，其誘導(dǎo)針對多種流感病毒株的中和抗體。生產(chǎn)用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免發(fā)生意外感染的一種方法。作為替代，已研究出用作培養(yǎng)病毒之替代物的病毒樣顆粒(VLP)。VLP模擬病毒衣殼的結(jié)構(gòu)，但缺少基因組，因此不能復(fù)制或提供二次感染的機(jī)會。一些研究表明，使用哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒或桿狀病毒載體，重組流感病毒蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)物中自組裝成 VLP (Gomez-Puertas 等，1999 ；Neumann 等，2000 ；Latham 和 Galarza， 2001)。Gomez-Puertas等(1999)公開了流感病毒VLP的有效形成取決于幾種病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Neumann等(2000)建立了基于哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的系統(tǒng)，其用于完全從克隆 cDNA產(chǎn)生感染性流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza(2001)報(bào)道了在用共表達(dá)HA、NA、M1 和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中形成流感病毒VLP。這些研究表明，流感病毒體蛋白質(zhì)可在真核細(xì)胞中共表達(dá)后進(jìn)行自組裝。Gomez-Puertas等(2000)教導(dǎo)，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基質(zhì)蛋白(Ml) 對于VLP從昆蟲細(xì)胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007)教導(dǎo)了 Ml可能不是VLP形成所需的，并觀察到Ml和VLP的有效釋放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割產(chǎn)生VLP之細(xì)胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并將VLP釋放到介質(zhì)中。Quan等(2007)教導(dǎo)了在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的VLP疫苗誘導(dǎo)針對某些流感病毒株(A/PR8/34 (Hmi))的保護(hù)性免疫。經(jīng)觀察，Quan所研究的VLP從質(zhì)膜出芽，并被認(rèn)為具有合適的大小和形態(tài)，與在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)(MDCK細(xì)胞)中得到的相似。包膜病毒可在從感染細(xì)胞“出芽”時(shí)獲得脂質(zhì)包膜，并且從質(zhì)膜獲得膜，或者從內(nèi)部細(xì)胞器的質(zhì)膜獲得膜。流感病毒顆粒和VLP從宿主細(xì)胞的質(zhì)膜出芽。例如，在哺乳動(dòng)物或桿狀病毒細(xì)胞系統(tǒng)中，流感病毒從質(zhì)膜出芽(Quan等，2007)。已知僅有少數(shù)包膜病毒感染植物(例如，番茄斑萎病毒屬(Topovirus)和彈狀病毒屬(Rhabdovirus)的成員)。在已知的植物包膜病毒中，它們的特征在于從宿主細(xì)胞的內(nèi)膜出芽，而不是從質(zhì)膜出芽。雖然已在植物宿主中產(chǎn)生了少數(shù)的重組VLP，但是它們均非源自質(zhì)膜。目前的流感病毒VLP生產(chǎn)技術(shù)依賴于多種病毒蛋白質(zhì)的共表達(dá)，這種依賴性體現(xiàn)出這些技術(shù)的缺點(diǎn)，這是因?yàn)樵谌澜绱罅餍泻兔磕炅餍械那樾沃?，響?yīng)時(shí)間對于疫苗接種來說是至關(guān)重要的。依賴于只表達(dá)一種病毒蛋白的更為簡單的VLP生產(chǎn)系統(tǒng)對加快疫苗的開發(fā)來說是期望的。在基于植物的系統(tǒng)中生產(chǎn)流感病毒HA VLP已描述于W02009/009876中，其主要顯示了在植物宿主細(xì)胞中流感病毒HA能夠自組裝并從質(zhì)膜出芽為病毒樣顆粒。為了保護(hù)全世界人口免于患流感并且擊退將來的大流行，疫苗生產(chǎn)商需要開發(fā)有效的、快速的生產(chǎn)疫苗制劑的方法。目前使用受精的蛋生產(chǎn)疫苗不能滿足需求，并且生產(chǎn)過程長。所用的HA蛋白是每種病毒株特異性的且不與其他病毒株交叉反應(yīng)以提供更廣譜的疫苗，因此一旦鑒定到新的病毒株就必需持續(xù)生產(chǎn)或迅速反應(yīng)?？蓪ιa(chǎn)VLP所用的HA天然蛋白進(jìn)行某些修飾和/或突變，這些修飾得到更廣譜誘導(dǎo)抗體的血凝素蛋白(甚至是在僅僅單次施用后)，所述抗體中和多于一種或數(shù)種流感病毒株。發(fā)明_既述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了改進(jìn)的流感疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了新流感病毒樣顆粒。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了經(jīng)修飾以提供更廣譜之抗體反應(yīng)的血凝素蛋白質(zhì)。本發(fā)明設(shè)想了這樣的多肽，其具有基本上等同于病毒包膜N連接糖蛋白但是部分或完全不含N連接糖(即與原始天然HA序列相比，其一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)被消除)的氨基酸殘基序列，以及生產(chǎn)或應(yīng)用所述多肽的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了這樣的HA蛋白質(zhì)，其中來自HAl結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè) N連接糖基化位點(diǎn)已被修飾/缺失/突變/移除/消除，以產(chǎn)生用于制備廣譜流感疫苗的流感病毒VLP。特別地，HAl結(jié)構(gòu)域包含按照株A/越南/1194/04 (SEQ ID NO 34)所編號的位于 1至331位的氨基酸。更特別地，HAl結(jié)構(gòu)域包含該蛋白質(zhì)的球形頭部分和F' 2結(jié)構(gòu)域 (對應(yīng)于按照株A/越南/1194/04 ；SEQ ID NO 34)所編號的蛋白質(zhì)39至331位之間的氨基酸)。特別地，被消除的糖基化位點(diǎn)最初位于該蛋白質(zhì)的球形頭部分，特別對應(yīng)于SEQ ID NO 34的39至273位之間的氨基酸。更特別地，被消除的糖基化位點(diǎn)最初位于該蛋白質(zhì)的 F' 2結(jié)構(gòu)域，特別對應(yīng)于SEQ ID NO 34的274-331位之間的氨基酸。本發(fā)明提供了可改變HA之抗原性和免疫原性的A型流感病毒血凝素(NA)分子中的氨基酸替換。這些替換可通過改變受體特異性和/或抗體-抗原結(jié)合來改變抗原位點(diǎn)。 在多個(gè)實(shí)施方案中，通過所述替換得到的提高的抗原性可用于生產(chǎn)對流感病毒具有廣泛交叉反應(yīng)性的疫苗。特別地，氨基酸替換產(chǎn)生具有以下氨基酸替換之免疫原性特征的分子，所述替換為在HA蛋白中對應(yīng)于受體結(jié)合位點(diǎn)的位置(特別地對應(yīng)于IM位和/或165位和 /或286位(其中根據(jù)株A/越南/1194/04(SEQ ID NO :34)編號)為非天冬酰胺殘基。在一些具體實(shí)施方案中，所述氨基酸替換使糖基化位點(diǎn)移除/缺失/消除?？乖栽黾拥牧鞲胁《綡A分子可在對應(yīng)于H5HA中巧4和/或165和/或觀6位包括一個(gè)或多個(gè)非糖基化氨基酸，其中移除這些糖基化位點(diǎn)中任一個(gè)導(dǎo)致與抗血清的反應(yīng)性提高，所述抗血清來自暴露于具有野生型HA分子之流感病毒的動(dòng)物。為了破壞糖基化位點(diǎn)，可通過蛋白質(zhì)改造對三聯(lián)信號N-X-S/T (其中N是Asn，X可以是除Pro之外的任何氨基酸，S/T可以是Ser或Thr)進(jìn)行修飾。所用的第一種方法可以將Asn替換為另一種氨基酸。第二種方法是用任何其他氨基酸殘基替換n+2位(相對于進(jìn)行糖基化的天冬酰胺來說)的S/T氨基酸。用于替換天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸的合適氨基酸是丙氨酸，但也可使用其他氨基酸。例如，可用Leu、Ile、Val、Thr、Ser或Ala替換Asn。 另外可用Ala、Val、Ile或Leu替換Ser或Thr。特別地，抗原性增加的流感病毒HA分子可在H5HA中巧4位和/或165位和/或 286位包含非天冬酰胺氨基酸?？乖栽黾拥牧鞲胁《綡A分子可包括這樣的HA蛋白質(zhì)，其中頭部分缺少N-連接糖基化位點(diǎn)，即所有三個(gè)糖基化位點(diǎn)均被消除。抗原性增加的流感病毒HA分子可包含一個(gè)或多個(gè)被移除的糖基化位點(diǎn)，所述位點(diǎn)選自N-154、N-165和N-286 (其中根據(jù)株A/越南/1194/04編號)。本發(fā)明提供了來自不同流感病毒株的經(jīng)修飾血凝素(HA)。本發(fā)明還提供了在非唾液酸化宿主生物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)引入編碼如上定義之流感病毒血凝素(HA)抗原的核酸，其與在非唾液酸化宿主生物或其部分中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接，以及b)將所述宿主或其部分在允許所述核酸表達(dá)的條件下孵育，從而生產(chǎn)VLP。本發(fā)明包括上述方法，其中在引入步驟(步驟a)中，所述核酸可以在宿主中瞬時(shí)表達(dá)，或者在宿主中穩(wěn)定表達(dá)。此外，所述VLP可以使用例如體積排阻色譜進(jìn)行純化。另外，本發(fā)明涉及非唾液酸化宿主生物，其用于生產(chǎn)包含流感病毒HA蛋白的病毒樣顆粒(VLP)。特別地，能夠生產(chǎn)VLP的合適宿主為例如植物或其部分、植物細(xì)胞、昆蟲或其部分或者昆蟲細(xì)胞、或酵母或其部分或者酵母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含如下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列編碼與在非唾液酸化宿主生物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接的、如上定義的經(jīng)修飾流感病毒HA。所述抗原可以是缺少來自分子頭部分的一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)(通常存在于天然序列中的抗原位點(diǎn))的流感病毒血凝素(HA)。本發(fā)明還提供了病毒樣顆粒(VLP)，其包含本文定義的流感病毒HA蛋白以及一種或多種宿主脂質(zhì)。如果宿主是昆蟲，則病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種昆蟲脂質(zhì)；或者如果宿主是酵母，則病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種酵母脂質(zhì)；如果宿主是植物，則病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種植物脂質(zhì)。本發(fā)明還提供了在植物中生產(chǎn)的VLP，其因而含有一種或多種植物來源的脂質(zhì) (一般稱為“植物脂質(zhì)”)。本發(fā)明還提供了在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的VLP，其包含來自昆蟲細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(一般稱為“昆蟲脂質(zhì)”)。本發(fā)明還提供了在酵母中生產(chǎn)的VLP，其包含來自酵母細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(一般稱為“酵母脂質(zhì)”)。本發(fā)明還包括組合物，其包含與可藥用載體混合的有效劑量VLP(其包含流感病毒HA蛋白)以及來自非唾液酸化宿主生產(chǎn)細(xì)胞的一種或多種脂質(zhì)。所述可藥用載體可適于經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。
本發(fā)明中還包括疫苗組合物，其包含與可藥用載體混合的本文定義之免疫有效劑量VLP，其中有或沒有佐劑存在。所述疫苗可以經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。特別地，所述疫苗在不使用佐劑的情況下施用。本發(fā)明還提供了在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯冒鞲胁《綡A蛋白、一種或多種宿主脂質(zhì)的病毒樣顆粒以及可藥用載體。所述病毒樣顆?？梢越?jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。本發(fā)明涉及在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，其包括向?qū)ο笫┯冒疚亩x之一種或多種VLP的有效劑量的疫苗。通過如上所述方法治療的對象可選自包含以下的組人、靈長類、馬、豬、鳥類(禽類)、水禽、候鳥類、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動(dòng)物、狗、貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、靈貓、 貂、石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等。特別地，所述對象可以是人患者或一般意義上的鳥類(包括水禽、候鳥類、家禽例如鵪鶉、鴨、鵝、火雞、雞)，特別是候鳥類或用于人消費(fèi)的家禽(鵪鶉、鴨、鵝、火雞、雞)。本發(fā)明還提供了容器例如注射器以及包含這些容器的藥盒，所有這些均包含本文定義的疫苗組合物。本發(fā)明概述不必然描述本發(fā)明的所有方面。發(fā)明詳述


從引用了附圖的下列說明中，本發(fā)明的上述以及其它特征將更加明顯，其中圖IA示意流感病毒HA H5 A/印度尼西亞/5/05上糖基化位點(diǎn)的位置。標(biāo)出了與 A/越南/1194/04 ；SEQ ID NO. 34 (PDB文件:2IBX)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的氨基酸同一性、位置和定位。通過破壞位于球狀頭部上的N154、附65和N286糖基化位點(diǎn)產(chǎn)生三突變體。Bright 等人Q003)的研究已用于定位潛在的抗原位點(diǎn)。根據(jù)有關(guān)HA之HI、H3和H7的文獻(xiàn)中所述的來確定糖基化類型(Abe Y.等人Q004) ；Vigerust DJ等人Q007)以及Kuroda等人 (1990)；圖IB示意HA單體的亞結(jié)構(gòu)域F' 1 (根據(jù)A/越南/1194/04 ;SEQ ID NO. 34編號的1-38位)、F' 2 074-331位)以及F亞結(jié)構(gòu)域。共同形成球狀頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)和脂酶亞結(jié)構(gòu)域(39-273位)。白色框表示融合肽。在任何HA結(jié)構(gòu)中TmD和細(xì)胞質(zhì)尾均不可見，因?yàn)閮H有HA的可溶性菠蘿蛋白酶產(chǎn)物被結(jié)晶并闡明結(jié)構(gòu)；圖2示意來自不同A亞型的HA單體的結(jié)構(gòu)。還顯示了具有親脂部分以及極性頭的脂雙層。結(jié)構(gòu)獲取自 Ha 等人(Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ,Wiley D(^2002)H5 禽類)；圖3顯示基于苜蓿質(zhì)體藍(lán)素的表達(dá)盒序列，其用于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案表達(dá)Hl (SEQ ID NO 8) 0蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)信號肽以下劃線顯示。用于克隆的 BglII(AGATCT)和&icI (GAGCTC)限制性位點(diǎn)以粗體顯示；圖4示意組裝用于表達(dá)來自A/印度尼西亞/5/05之野生型HA亞型H5的質(zhì)粒660 ；圖5示意組裝用于表達(dá)來自A/印度尼西亞/5/05之非糖基化突變HA亞型H5的質(zhì)粒680 ；圖6顯示第一次和第二次給藥后針對滅活全病毒(whole inactivated virus,WIV)的抗體效價(jià)。在第一次免疫后(第14天)或第二次免疫后(第35天)，評估來自由野生型VLP或三突變體VLP (非糖基化)免疫的大鼠之血清的反應(yīng)性。評估針對幾種H5W 病毒的免疫反應(yīng)性。圖7顯示第一次和第二次給藥之后血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體效價(jià)。在第一次免疫后(第14天)或第二次免疫后(第35天)14天，評估來自由野生型或三突變體VLP (非糖基化)免疫的大鼠的HI效價(jià)。評估針對幾種H5W病毒和一種Hmi病毒的免疫反應(yīng)性。圖8顯示流感病毒HAO的序列；圖9顯示流感病毒HA蛋白亞型H2的序列；圖10顯示流感病毒HA蛋白亞型H3的序列；圖11顯示流感病毒HA蛋白亞型H4的序列；圖12顯示流感病毒HA蛋白亞型H5的序列；圖13顯示流感病毒HA蛋白亞型H6的序列；圖14顯示流感病毒HA蛋白亞型H7的序列；圖15顯示流感病毒HA蛋白亞型H8的序列；圖16顯示流感病毒HA蛋白亞型H9的序列；圖17顯示流感病毒HA蛋白亞型HlO的序列；圖18顯示流感病毒HA蛋白亞型Hll的序列；圖19顯示流感病毒HA蛋白亞型H12的序列；圖20顯示流感病毒HA蛋白亞型Hl3的序列；圖21顯示流感病毒HA蛋白亞型H14的序列；圖22顯示流感病毒HA蛋白亞型Hl5的序列；圖23顯示流感病毒HA蛋白亞型H16的序列；圖M顯示了 660pCAMBIA表達(dá)載體的序列，其含有完整野生型H5序列；圖25A-J顯示了 PCR擴(kuò)增所用引物的序列；圖沈顯示了所產(chǎn)生片段的序列，其含有完整H5編碼區(qū)域(包含天然信號肽)，其側(cè)翼是緊鄰起始ATG上游的HindIII位點(diǎn)和緊鄰終止(TAA)密碼子下游的McI位點(diǎn)；
圖27顯示了所產(chǎn)生片段的序列，其含有經(jīng)修飾除去了全部三個(gè)糖基化位點(diǎn)的完整H5編碼區(qū)域(包含天然信號肽)，其側(cè)翼是緊鄰起始ATG上游的HindIII位點(diǎn)和緊鄰終止(TAA)密碼子下游的Mel位點(diǎn)；圖28A-D顯示了 PCR擴(kuò)增的弓丨物序列。圖四顯示了來自株A/越南/1194/04的成熟H5的氨基酸序列；和圖30A-B分別顯示了來自株B/佛羅里達(dá)/4/2006的成熟HA的核酸和氨基酸序列。
具體實(shí)施方案本發(fā)明涉及病毒樣顆粒(VLP)的生產(chǎn)。更特別地，本發(fā)明涉及包含流感抗原之病毒樣顆粒的生產(chǎn)。以下描述為特定實(shí)施方案。1.HA 蛋白本文使用的“蛋白質(zhì)”通常指由肽鍵相連的氨基酸串，其可折疊為二級、三級或四級結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)特定形態(tài)?；蛘?，術(shù)語多肽、肽或肽片段可用于類似語境。術(shù)語“血凝素結(jié)構(gòu)域”是指包含HAO前體多肽或HAl或HA2結(jié)構(gòu)域的肽。所述血凝素結(jié)構(gòu)域不包含天然蛋白質(zhì)中存在的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞質(zhì)尾部。對于流感病毒，本文使用的術(shù)語“血凝素”或“HA”是指發(fā)現(xiàn)于流感病毒顆粒外部的糖蛋白。HA是同三聚化I型膜糖蛋白，一般包含信號肽、HAl結(jié)構(gòu)域和在C端包含跨膜錨定位點(diǎn)的HA2結(jié)構(gòu)域以及小細(xì)胞質(zhì)尾(圖1B)。編碼HA的核苷酸序列是公知的，可見于， 例如生物防御公共衛(wèi)生數(shù)據(jù)庫(BioDefense Public Health base)(流感病毒；參見URL biohealthbase.org)或者國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)(參見URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其兩者通過引用并入本文。流感病毒HA的結(jié)構(gòu)信息HA單體可分為2個(gè)單獨(dú)的功能結(jié)構(gòu)域球狀頭部結(jié)構(gòu)域和莖結(jié)構(gòu)域。一級序列和 HA結(jié)構(gòu)之間這些結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)在圖IB和2中顯示。莖結(jié)構(gòu)域通過可在酸性pH下進(jìn)行的特別構(gòu)象變化參與病毒的感染和致病性。其還描述為4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，融合肽(在低pH構(gòu)象狀態(tài)下負(fù)責(zé)與宿主膜融合的26個(gè)氨基酸疏水片段)；莖結(jié)構(gòu)域自身(可容納2種極其不同的構(gòu)象)，跨膜結(jié)構(gòu)域(TmD)(決定HA對脂筏的親和性)、細(xì)胞質(zhì)尾(Ctail)(參與HA的分泌)。球狀頭部分為2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，受體結(jié)合(receptor binding, RB)結(jié)構(gòu)域和殘留酯酶結(jié)構(gòu)域(E)。酯酶亞結(jié)構(gòu)域相對埋在蛋白質(zhì)表面之下，因此針對HA產(chǎn)生的大多數(shù)抗體結(jié)合受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(在圖2中由頭的最上部表示)。術(shù)語“同三聚體”或“同三聚化”表示由三個(gè)HA蛋白質(zhì)分子形成的低聚物。HA蛋白質(zhì)合成為75kDa單體前體蛋白質(zhì)(HAO)，其在表面上組裝為延長的三聚化蛋白質(zhì)。對于高致病性禽類株，在細(xì)胞內(nèi)三聚化發(fā)生之前，前體蛋白在保守活化切割位點(diǎn)(也稱為融合肽) 被切割為二硫鍵相連的2條多肽鏈一HAl (328個(gè)氨基酸)和HA2 (221個(gè)氨基酸；包括跨膜區(qū)域)。盡管該步驟對病毒感染力來說是非常重要，但是對于蛋白質(zhì)的三聚化來說不是必要的。對于哺乳動(dòng)物和不致病禽類流感病毒株，前體HAO在細(xì)胞外被宿主呼吸道細(xì)胞或者共感染的細(xì)菌或支原體分泌的蛋白酶所切割。HA插入到宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜中，信號肽切割以及蛋白質(zhì)糖基化是共翻譯事件。HA的正確重折疊需要蛋白的糖基化以及6個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的形成。HA三聚體在順面和反面高爾基復(fù)合體中組裝，跨膜結(jié)構(gòu)域在三聚化過程中起作用。在流感病毒株中，菠蘿蛋白酶處理的缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的HA蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)顯示高度保守的結(jié)構(gòu)。也已發(fā)現(xiàn)，HA在感染過程中經(jīng)歷重大構(gòu)象變化，其需要前體HAO被切割為 2個(gè)多肽鏈HAl和HA2。HA蛋白可以是加工的(即包含HAl和HA2結(jié)構(gòu)域)或者未加工的 (即包含HAO結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明涉及使用包含跨膜結(jié)構(gòu)域的HA蛋白質(zhì)，包括HAl和HA2結(jié)構(gòu)域，例如HA蛋白質(zhì)可以是HA0，或者經(jīng)加工的包含HAl和HA2的HA。本發(fā)明的HA可獲得自任何亞型。例如，擬可以是亞型!11、!12、!13、!14、!15、!16、!17、 H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16。本發(fā)明包括包含具有經(jīng)修飾N-聚糖之HA的VLP。本發(fā)明的重組HA還可包含基于本領(lǐng)域中已知的任何血凝素序列的氨基酸序列，參見例如生物防御公共衛(wèi)生數(shù)據(jù)庫(流感病毒；參見URL :biohealthbase. org)或者國立生物技術(shù)信息中心(參見URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其中天然N-連接糖基化位點(diǎn)已移除/突變/缺失/修飾從而除去了掩蓋肽抗原位點(diǎn)的糖殘基。此外，HA可基于分離自一種或多種出現(xiàn)的或新鑒定出的流感病毒的血凝素序列。此外，可產(chǎn)生包含HA亞型組合的VLP。例如，VLP可包含來自下列亞型的一種或多種 HA :H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或其組合?？捎蓮腣LP制備的疫苗的預(yù)定用途來確定HA組合的選擇。例如，用于接種禽類的疫苗可包含HA 亞型的任何組合，而用于接種人的VLP可包含來自下列一種或多種亞型的亞型H1、H2、H3 或H5。但是，根據(jù)VLP的用途可制備其他HA亞型組合。為產(chǎn)生包含HA亞型組合的VLP，所需HA亞型可在相同細(xì)胞中共表達(dá)，例如植物細(xì)胞中。特別地，根據(jù)本文生產(chǎn)的VLP不包含神經(jīng)氨酸酶(NA)。但是，如果需要包含HA和 NA的VLP，NA可與HA共表達(dá)。2.流感亞型本發(fā)明包括所有類型的人流感病毒，包括例如但不限于非常流行的A亞型，以及較不常見的B型，和C型，以及從其他流感亞型獲得的HA。本發(fā)明還包括包含獲得自一種或多種流感亞型之HA的VLP。例如，VLP可包含來自下列亞型的一種或多種HA :H1 (由SEQ ID NO 1編碼)、H2(由SEQ ID NO 2編碼)、H3(由 SEQ ID NO 3 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 4 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 5 編碼)、H6 (由 SEQ ID NO 6 編碼)、H7 (由 SEQ ID NO 7 編碼)、H8 (由 SEQ ID NO 8 編碼)、H9 (由 SEQ ID NO 9 編碼)、H10 (由 SEQ ID NO :10 編碼)、H11 (由 SEQ ID NO :11 編碼)、H12 (由 SEQ ID NO 12 編碼)、H13 (由 SEQ ID NO 13 編碼)、H14 (由 SEQ ID NO 14 編碼)、H15 (由 SEQ ID NO 15編碼)、H16(由SEQ ID NO 16編碼)或其組合。來自一種或多種流感亞型的一種或多種HA可在植物或昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)，以確保一種或多種HA的合成導(dǎo)致形成包含獲得自一種或多種流感亞型之HA組合的VLP?？捎蓮腣LP制備的疫苗的預(yù)定用途來確定HA組合的選擇。例如，用于接種人的疫苗可包含HA亞型的任何組合，特別是HI、H2、H3、H5、H7、H9、 H10、N1、N2、N3*N7中的一種或多種亞型。特別是HI、H2、H3、H5。但是，可根據(jù)接種物的用途制備其他HA亞型組合。3-生產(chǎn)方法此外，本發(fā)明提供了在宿主中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法。因此，本發(fā)明提供了來自單個(gè)包膜蛋白質(zhì)表達(dá)的VLP，以及在宿主表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)病毒VLP的方法。所述方法包括引入與在宿主或其部分中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接的編碼抗原的核酸，以及將所述宿主或其部分在允許所述核酸表達(dá)的條件下孵育，從而生產(chǎn)VLP。本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件還可與適于轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)表達(dá)的一系列宿主生物(例如特別是植物、昆蟲或酵母)中表達(dá)的目的編碼區(qū)域結(jié)合。特別地，這些生物是植物，單子葉植物和雙子葉植物，例如但不限于玉米、谷物、小麥、大麥、燕麥、煙草屬物種(Nicotiana spp.)、蕓苔屬物種(Brassica spp.)、大豆、菜豆、 豌豆、苜蓿、馬鈴薯、番茄、人參和擬南芥(Arabidopsis)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以及這些生物再生的方法是本領(lǐng)域中已建立的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。獲得轉(zhuǎn)化和再生植物的方法也是本領(lǐng)域中公知的?！稗D(zhuǎn)化”表示基因型上、表型上或兩者上顯現(xiàn)的遺傳信息(核苷酸序列)的穩(wěn)定種間轉(zhuǎn)移。來自嵌合構(gòu)建物的遺傳信息向宿主的種間轉(zhuǎn)移可以是可遺傳的，該遺傳信息的轉(zhuǎn)移認(rèn)為是穩(wěn)定的，或者該轉(zhuǎn)移可以是瞬時(shí)的并且遺傳信息的轉(zhuǎn)移是不可遺傳的?？墒褂盟矔r(shí)表達(dá)方法表達(dá)本發(fā)明構(gòu)建物(參見Liu和Lomonossorf，2002，Journal of Virological Methods，105 :343_348，其通過引用并入本文)?；蛘?，可使用基于真空的瞬時(shí)表達(dá)方法，如Kapila等人1997所述(通過引用并入本文)。這些方法可包括，例如但不限于，農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入方法，但是，如上文所述也可使用其他瞬時(shí)方法。使用農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入，包含所需核酸的農(nóng)桿菌混合物進(jìn)入組織的細(xì)胞間隙，例如葉、植物氣生部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、花)或整株植物。在穿過表皮之后， 農(nóng)桿菌將t-DNA拷貝感染并轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。t-DNA以附加體形式轉(zhuǎn)錄，mRNA被翻譯，導(dǎo)致在受感染細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，但是t-DNA進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)是瞬時(shí)的。4.宿主生物本發(fā)明的VLP可在特征為缺乏唾液酸化蛋白質(zhì)能力(例如缺乏唾液酸酶)的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述細(xì)胞例如植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌和其他生物，包括海綿、腔腸動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、線形動(dòng)物、擔(dān)輪動(dòng)物、扁形動(dòng)物、毛顎動(dòng)物、具觸手動(dòng)物、衣原體、螺旋體、革蘭氏陽性細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古細(xì)菌，如glycoforum中所鑒定地(參見例如，URL glycoforum. gr. jp/science/word/evolution/ES-A03E. html)。根據(jù)本文所述生產(chǎn)的VLP通常不包含神經(jīng)氨酸酶(NA)。但是，如果需要包含HA和 NA的VLP，NA可與HA共表達(dá)。特別地，本發(fā)明的VLP可在植物細(xì)胞、整株植物或其部分(例如葉、種子或任何其他植物物質(zhì))中生產(chǎn)。術(shù)語“植物物質(zhì)”表示來源于植物的任何物質(zhì)。植物物質(zhì)可包括整株植物、組織、 細(xì)胞或其任何部分。另外，植物物質(zhì)可包括細(xì)胞內(nèi)植物組分、細(xì)胞外植物組分、植物的液體或固體提取物、或者其組合。另外，植物物質(zhì)可包括來自植物葉、莖、花、果實(shí)、根或其組合的植物、植物細(xì)胞、組織、液體提取物或其組合。植物物質(zhì)可包括未接受任何處理步驟的植物或其部分。但是，也考慮植物物質(zhì)可接受最少的如下文定義的處理步驟，或者更嚴(yán)格的處理，包括部分的或很大程度的蛋白質(zhì)純化，其使用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)(包括但不限于色譜、電泳等)。術(shù)語“最少的處理”表示包含目的蛋白質(zhì)的植物物質(zhì)(例如，植物或其部分)經(jīng)部分純化而產(chǎn)生植物提取物、勻漿物、植物勻漿級分等(即最少處理)。部分純化可包括但不限于破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生包含可溶性植物組分和不可溶植物組分的組合物，所述組分可通過例如但不限于離心、過濾或其組合來分離。就這點(diǎn)而言，可使用真空或離心提取容易地獲得葉或其他組織的細(xì)胞間隙內(nèi)分泌的蛋白質(zhì)，或者可在壓力下通過碾或粉碎等提取組織從而從細(xì)胞間隙中榨出或釋放游離蛋白質(zhì)。最少處理也可包括制備可溶性蛋白質(zhì)的粗提物，因?yàn)檫@些制備物具有可忽略的來自次要植物產(chǎn)物的污染。另外，最少處理可包括用水溶液從葉提取可溶性蛋白質(zhì)，然后用任何合適的鹽進(jìn)行沉淀。其他方法可包括大規(guī)模離析和汁液提取，從而允許直接使用提取物。植物材料或組織形式的植物物質(zhì)可以經(jīng)口遞送給對象。植物物質(zhì)可以作為食物補(bǔ)充劑的一部分與其他食物一起施用或者封裝。根據(jù)需要，植物物質(zhì)或組織也可濃縮以改善或增加可口性，或者與其他材料、成分或藥物賦形劑一起提供。本發(fā)明的一部分還考慮了含有本發(fā)明嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或種子。從植物細(xì)胞再生整個(gè)植物的方法也是本領(lǐng)域中已知的。一般說來，將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基可含有選擇劑例如抗生素，其中使用選擇標(biāo)記來利于鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一旦愈傷組織形成，可根據(jù)已知方法通過使用合適的植物激素促使幼苗形成，將幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基用以再生植物。然后，所述植物可用于建立重復(fù)代，從種子產(chǎn)生或者使用營養(yǎng)繁殖方法產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因植物也可在不使用組織培養(yǎng)的情況下產(chǎn)生。本發(fā)明的一部分還考慮了根據(jù)本發(fā)明用于VLP生產(chǎn)的含有嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物、樹、酵母、細(xì)菌、真菌、昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞，所述基因構(gòu)建物包含編碼重組HAO的核酸。考慮了可根據(jù)需要和情況用多種方法將包含目的蛋白或者表達(dá)包含目的蛋白之 VLP的植物施用給對象或靶生物。例如，可在以粗制、部分純化或純化形式使用之前提取獲得自植物的目的蛋白。如果蛋白質(zhì)是待純化的，則其可產(chǎn)生自食用或非食用植物。此外，如果蛋白質(zhì)經(jīng)口施用，則可收獲植物組織并直接喂給對象，或者可在喂食之前將收獲的組織干燥，或者可允許動(dòng)物在不事先收獲的情況下取食所述植物。本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮將收獲的植物組織以動(dòng)物飼料內(nèi)食品添加劑的形式提供。如果植物組織在很少或沒有進(jìn)一步處理的情況下喂食給動(dòng)物，則優(yōu)選所施用的植物組織是可食用的。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)可涉及植物中轉(zhuǎn)基因的有限表達(dá)，來自馬鈴薯病毒Y(HcPro)的沉默抑制子的共表達(dá)可用于抵消轉(zhuǎn)基因mRNA的特異性降解(Brigneti等人，1998)。替代性的沉默抑制子是本領(lǐng)域公知的，可如本文所述使用(Chiba等人，2006，Virology 346 :7_14 ；其通過引用并入本文)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro(煙草蝕刻病毒-pl/HC-Pro)、BYV_p21、番茄黑環(huán)病毒的pl9(TBSV P 19)、番茄皺紋病毒的衣殼蛋白(TCV-CP)、黃瓜花葉病毒的2b (CMV-2b)、馬鈴薯病毒X 的p25(PVX-p25)、馬鈴薯病毒M的pll (PVM-pll)、馬鈴薯病毒S的pll (PVS-pll)、藍(lán)莓枯黃病毒的P16 (BScV-pl6)、柑橘衰退病毒的p23 (CTV_p23)、葡萄卷葉相關(guān)病毒_2的 p24(GLRaV-2p24)、葡萄病毒A的plO(GVA-plO)、葡萄病毒B的pl4(GVB_pl4)、白芷潛伏病毒的PlO (HLV-plO)或者大蒜普通潛伏病毒的pl6(GCLV-pl6)。因此，沉默抑制子(例如但不限于 HcPro、TEV-p 1/HC-Pro、BYV_p21、TBSV pl9、TCV-CP, CMV_2b、PVX_p25、PVM-pll、 PVS-pll, BScV-p 16, CTV_p23、GLRaV_2p24、GBV_pl4、HLV-plO、GCLV-pl6 或 GVA-plO)可與編碼目的蛋白的核酸序列共表達(dá)，從而進(jìn)一步確保植物內(nèi)產(chǎn)生高水平蛋白質(zhì)。包膜病毒的VLP通常從它們出芽所通過的膜獲得其包膜。植物質(zhì)膜具有植物固醇補(bǔ)體，其可具有免疫激活作用。為了研究此可能性，將植物制備的H5VLP在存在佐劑的情況下施用給動(dòng)物，測定HAI (血細(xì)胞凝集抑制抗體應(yīng)答)(圖7)。在植物中生產(chǎn)VLP相比在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)這些顆粒具有幾種優(yōu)點(diǎn)。植物脂質(zhì)可激活特異性免疫細(xì)胞并增強(qiáng)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。植物膜由脂質(zhì)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)形成，還含有鞘糖脂(其是植物和一些細(xì)菌和原生動(dòng)物所特有的)。鞘脂類是不常見的，因?yàn)樗鼈儾皇穷愃芇C或PE的甘油酯，而是由長鏈氨基醇組成，所述氨基醇與含有超過18個(gè)碳的脂肪酸鏈形成酰胺鍵。PC和PE以及鞘糖脂可結(jié)合哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞(例如抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及其他細(xì)胞(包括胸腺和肝臟中的B和T淋巴細(xì)胞))表達(dá)的⑶1分子(Tsuji M，2006)。此外，除了存在植物脂質(zhì)的潛在佐劑作用之外，植物N-聚糖利于抗原呈遞細(xì)胞捕獲糖蛋白抗原的能力(Saint-Jore-Dupas，2007)可以是在植物中生產(chǎn)VLP的優(yōu)點(diǎn)。不希望受理論的限制，預(yù)計(jì)由植物制備的VLP會誘導(dǎo)出比其他生產(chǎn)/制造體系生產(chǎn)之VLP更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并且這些植物制備的VLP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)會比由活的或減毒全病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強(qiáng)。與全病毒制備的疫苗不同的是，VLP提供了以下優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兪欠歉腥拘缘?，因此限制性生物防范不像操作感染性全病毒時(shí)那樣重要并且不是生產(chǎn)所必需的。植物制備的 VLP提供了另外的優(yōu)點(diǎn)，即允許表達(dá)體系在溫室或田地(field)中生長，因此明顯更經(jīng)濟(jì)且適于擴(kuò)大規(guī)模。另外，植物不包含參與合成和添加唾液酸殘基到蛋白質(zhì)上的酶?？稍跊]有神經(jīng)氨酸酶(NA)的情況下生產(chǎn)VLP，且不需要共表達(dá)NA，也不需要用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)處理所產(chǎn)生的細(xì)胞或提取，以確保植物中的VLP生產(chǎn)。特別地，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP不包含已知結(jié)合RNA的Ml蛋白質(zhì)。RNA是VLP制備物中的雜質(zhì)，其在獲得VLP產(chǎn)品用作人疫苗的監(jiān)管批準(zhǔn)時(shí)是不想要的。5.核酸本發(fā)明提供了包含編碼流感病毒血凝素(HA)抗原之核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與在非唾液酸化宿主生物中具有活性的調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接。本發(fā)明描述了但不限于將編碼HA (例如但不限于人A型流感病毒HA)之核酸的克隆進(jìn)宿主表達(dá)載體，以及從宿主生產(chǎn)適于疫苗生產(chǎn)的流感VLP。所述VLP也可用于生產(chǎn)含重組流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白的試劑，所述結(jié)構(gòu)蛋白在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)中自組裝成有功能的免疫原性同型大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括亞病毒流感顆粒和流感 VLP)。本發(fā)明還包括核苷酸序列Hl (由SEQ ID NO 1編碼)、H2 (由SEQ ID而2編碼)、 H3 (由 SEQ ID NO 3 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 4 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 5 編碼)、H6 (由 SEQ ID NO 6 編碼)、H7 (由 SEQ ID NO 7 編碼)、H8 (由 SEQ ID NO 8 編碼)、H9 (由 SEQ ID NO :9 編碼)、H10(由 SEQ ID NO 10 編碼)、H11(由 SEQ ID NO 11 編碼)、H12(由 SEQ ID NO :12編碼)、!113(由 SEQ ID NO :13 編碼)、H14(由 SEQ ID NO :14 編碼)、H15(由 SEQ ID NO 15 編碼)禾口 H16(由 SEQ ID NO 16 編碼)。特別地，本發(fā)明包括核苷酸序列SEQ ID NO =USEQ ID NO :5、SEQ ID N0:7，其分別編碼來自 HI、H5 或 H7 的 HA ；核苷酸序列 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7，其在嚴(yán)格雜交條件下分別與編碼來自H1、H5或H7的HA的核酸雜交；或核苷酸序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7，其在嚴(yán)格雜交條件下分別與編碼來自HI、H5或H7的HA的核酸的互補(bǔ)序列雜交；其中編碼血凝素蛋白的核苷酸序列在表達(dá)時(shí)形成VLP，以及所述VLP 誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。例如，該核苷酸序列在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形成VLP，所述VLP可用于產(chǎn)生能夠結(jié)合HA (包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗體。在施用給對象時(shí)，VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在嚴(yán)格雜交條件下的雜交是本領(lǐng)域已知的(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等人編，1995 及其增刊；Maniatis 等人，Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ；Sambrook 禾口 Russell， Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 3 版，2001 ；其各自通過引用并入本文)。一種此類嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例可以是在65°C下在4XSSC中雜交約16-20小時(shí)，然后在65°C下在0. IXSSC中清洗1小時(shí)或者在65 °C下在0. IXSSC中清洗兩次(每次20或30分鐘)?；蛘?，一種此類嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例可以是在42 °C下在50 %甲酰胺、4 X SSC中過夜 (16-20小時(shí))，然后在65°C下在0. 1 X SSC中清洗1小時(shí)或者在65°C下在0. 1 X SSC中清洗兩次(每次20或30分鐘)，或者過夜(16-20小時(shí))，或者在65°C下在Church磷酸鹽緩沖水溶液(7% SDS ；0. 5M NaP04 緩沖液 pH 7. 2 ；IOmM EDTA)中雜交，在 50°C下在 0. IX SSC, 0. 1 % SDS中清洗兩次(每次20或30分鐘)，或者在65°C下在2 X SSC、0. 1 % SDS中清洗兩次(每次20或30分鐘)。此外，本發(fā)明包括具有如下特征的核苷酸序列，所述序列與編碼來自Hl (SEQ ID N0:1)、H5(SEQ ID N0:5)或 H7(SEQ ID NO :7)的 HA 的核苷酸序列具有約 70、75、80、85、 87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或其間任意值的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列編碼血凝素蛋白(其在表達(dá)時(shí)形成VLP)，并且所述VLP誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。 例如，核苷酸序列在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形成VLP，所述VLP可用于產(chǎn)生能夠結(jié)合HA(包括成熟HA、HAO、HAl或H/^)的抗體。當(dāng)施用給對象時(shí)，VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。可使用核苷酸序列比較程序確定序列同一性或序列相似性，例如DNASIS(例如但不限于使用以下參數(shù)GAP罰分5，#of top diagonals 5，固定GAP罰分10，k-tuple 2，浮動(dòng)空位10和窗口大小5)所提供的。但是，其他用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域公知的， 例如 Smith&Waterman(1981，Adv. App 1. Math. 2 :482)、Needleman&ffunsch (J. Mol. Biol. 48 443，1970)、Pearson&Lipman (1988，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA85 :2444)的算法，以及利用這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)，或者通過手動(dòng)比對和肉眼觀察。因此，本發(fā)明還包括合適的載體，其包含適用于穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的嵌合構(gòu)建物?？稍谝粋€(gè)或多個(gè)構(gòu)建物中提供遺傳信息。例如，可在一個(gè)構(gòu)建物中引入編碼目的蛋白的核苷酸序列，可使用另外的構(gòu)建物引入編碼修飾目的蛋白糖基化之蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列。然后，可在宿主中共表達(dá)這些核苷酸序列。但是，也可使用同時(shí)包含編碼目的蛋白和修飾目的蛋白糖基化特征之蛋白的核苷酸序列的構(gòu)建物。在這種情況下，核苷酸序列包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含與啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接的編碼目的蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含編碼修飾目的蛋白糖基化特征之蛋白質(zhì)的第二核酸序列，所述第二序列與啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接?！肮脖磉_(dá)”表示兩種或更多核苷酸序列大約同時(shí)在宿主中表達(dá)，并且在宿主相同組織中。但是，所述核苷酸序列不必需剛好同時(shí)表達(dá)。而是，所述兩種或更多核苷酸序列以使得所編碼產(chǎn)物有機(jī)會相互作用的方式表達(dá)。例如，修飾目的蛋白糖基化的蛋白質(zhì)可在目的蛋白表達(dá)之前或期間表達(dá)，使得發(fā)生對目的蛋白的糖基化修飾?？墒褂盟矔r(shí)表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)所述兩種或更多核苷酸序列，其中在允許兩種序列表達(dá)的條件下將所述兩種或更多序列在大約同時(shí)引入宿主中。或者，可將包含所述核苷酸序列之一(例如編碼修飾目的蛋白糖基化特征之蛋白質(zhì)的序列)的平臺宿主以瞬時(shí)或以穩(wěn)定形式用編碼目的蛋白的其他序列轉(zhuǎn)化。在這種情況下，編碼修飾目的蛋白糖基化特征之蛋白質(zhì)的序列可在期望發(fā)育階段的期望組織中表達(dá)，或者可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)其表達(dá)，所述編碼目的蛋白的另外序列可在類似條件下在相同組織中表達(dá)，以確保核苷酸序列共表達(dá)?？墒褂肨i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本發(fā)明的構(gòu)建物引入植物細(xì)胞。這些技術(shù)的綜述參見，例如Weissbach和Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII,421-463 頁 (1988) ；Geierson 和 Corey，Plant Molecular Biology，第 2 版(1988)以及 Miki 和 Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism,第二版，DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebvre, DB Layzell (編),Addison ffesly, Langmans Ltd. London, 561-579頁(1997)。其他方法包括直接DNA攝取、使用脂質(zhì)體、電穿孔，例如使用原生質(zhì)體、 顯微注射、顯微發(fā)射或須(whisker)，以及真空滲入。參見例如Bilang等人(Gene 100 247-250(1991)，Scheid 等人(Mol. Gen. Genet. 228:104-112,1991)，Guerche 等人(Plant Science 52 :111_116，1987)，Neuhause 等人(Theor. Appl Genet. 75 :30_36，1987)，Klein 等人，Nature 327 70-73(1987) ；Howe 11 等人(Science 208 1265，1980)，Horsch 等人 (Science 227 :1229_1231，1985)，DeBlock 等人(Plant Physiology 91 :694_701，1989)， Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach 禾口 Weissbach 編，Academic Press Inc.,1988), Methods in Plant Molecular Biology(Schuler 禾口 Zielinski 編，Academic Press Inc.，1989)，Liu 和 Lomonossoff (J. Virol Meth, 105 :343_348，2002，)，美國專利 No. 4, 945, 050 ；5，036，006 ；和5，100，792，1995年5月10日提交的美國專利申請序列號 No. 08/438, 666以及1992年9月25日提交的07/951，715 (其全部通過引用并入本文)。“調(diào)節(jié)區(qū)域” “調(diào)節(jié)元件”或“啟動(dòng)子”表示核酸的一部分，其通常但不總是在基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的上游，可由DNA或RNA或者由DNA和RNA 二者構(gòu)成。當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)域是活性的并與目的基因有效結(jié)合或有效連接時(shí)，可導(dǎo)致目的基因表達(dá)。調(diào)節(jié)元件能夠介導(dǎo)器官特異性或者控制發(fā)育或時(shí)序基因活化?！罢{(diào)節(jié)區(qū)域”包括啟動(dòng)子元件、表現(xiàn)啟動(dòng)子基本活性的核心啟動(dòng)子元件、響應(yīng)于外部刺激而誘導(dǎo)的元件、介導(dǎo)啟動(dòng)子活性的元件(例如負(fù)調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。本文使用的“調(diào)節(jié)區(qū)域”還包括在轉(zhuǎn)錄后具有活性的元件，例如調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件例如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄抑制子、上游活化序列以及mRNA不穩(wěn)定性決定簇。后面所述元件中的一些可位于編碼區(qū)域附近。在本公開內(nèi)容中，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”或“調(diào)節(jié)區(qū)域”通常表示這樣的DNA序列，其通常但不總是位于結(jié)構(gòu)基因編碼序列的上游(5')，其通過提供與RNA聚合酶和/或轉(zhuǎn)錄從特定位點(diǎn)起始所需之其他因子的識別來控制編碼區(qū)域的表達(dá)。但是，應(yīng)理解，位于內(nèi)含子中或序列3'的其他核苷酸序列也可有助于目的編碼區(qū)域表達(dá)的調(diào)節(jié)。提供與RNA聚合酶或確保在特定位點(diǎn)起始之其他轉(zhuǎn)錄因子的識別的調(diào)節(jié)元件的實(shí)例有啟動(dòng)子元件。大多數(shù)(但不是全部)真核啟動(dòng)子元件含有TATA盒(由腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸堿基對構(gòu)成的保守核酸序列)，其通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25個(gè)堿基對處。啟動(dòng)子元件包含負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的基本啟動(dòng)子元件，以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)元件(如上文所列)。有幾種類型的調(diào)節(jié)區(qū)域，包括受發(fā)育調(diào)節(jié)的、誘導(dǎo)型的或組成型的調(diào)節(jié)區(qū)域。某些器官或器官組織中受發(fā)育調(diào)節(jié)或者在其控制下控制基因差異表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域在器官或組織發(fā)育過程中特定的時(shí)間被活化。但是，受發(fā)育調(diào)節(jié)的一些調(diào)節(jié)區(qū)域可優(yōu)選在特定發(fā)育階段的某些器官或組織中具有活性，在植物的其他器官或組織中它們也可以受發(fā)育調(diào)節(jié)的形式而具有活性或者維持在基本水平。組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)域的實(shí)例(例如參見特異性調(diào)節(jié)區(qū)域)包括 nap in 啟動(dòng)子和 cruciferin 啟動(dòng)子(Rask 等人，1998，J. Plant Physiol. 152 595-599 ;Bilodeau等人1994，Plant Cell 14:125-130)。葉特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(圖3;US 7，125，978，其通過引用并入本文)。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)域是能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物而直接或間接活化一個(gè)或多個(gè)DNA序列或基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。在誘導(dǎo)物不存在時(shí)，DNA序列或基因不轉(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié)合活化轉(zhuǎn)錄之誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)域的蛋白質(zhì)因子可以無活性形式存在，其隨后被誘導(dǎo)物直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。但是，也可以不存在蛋白質(zhì)因子。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物或者由熱、冷、鹽或毒性元素直接施加或者通過病原體或致病物質(zhì)(例如病毒)的作用間接施加的生理應(yīng)激。可通過外部施加誘導(dǎo)物到細(xì)胞或植物(例如通過噴霧、澆水、加熱或類似方法)將含有誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)區(qū)域的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件可來自于植物或非植物基因(例如feitz，C.和Lenk，I. R. P.， 1998, Trends Plant Sci. 3，352-358 ；其通過引用并入本文)。潛在的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz, C, 1997，Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48，89-108 ；其通過引用并入本文)、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Aoyama, T.和Chua，N. H.， 1997，Plant J. 2，397-404 ；其通過引用并入本文)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Salter, Μ. G.， 等人，1998，Plant Journal 16，127-132 ；Caddick, Μ. X.，等人，1998，Nature Biotech. 16， 177-180，其通過引用并入本文)、細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)型IB6和CKIl基因(Brandstatter，I.和 Kieber,J. J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019 ；Kakimoto,Τ.，1996，Science274,982-985 ； 其通過引用并入本文)和植物生長素誘導(dǎo)型元件DR5(UlmaS0V，T.，等人，1997，Plant Cell 9，1963-1971 ；其通過引用并入本文)。組成型調(diào)節(jié)區(qū)域在植物的多個(gè)部分中以及在植物整個(gè)發(fā)育過程中持續(xù)指導(dǎo)基因的表達(dá)。已知的組成型調(diào)節(jié)元件實(shí)例包括與下列相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物(Odell 等人，1985，Nature, 313 :810-812)、水稻肌動(dòng)蛋白 1 (Zhang 等人，1991，Plant Cell, 3 1155-1165)、肌動(dòng)蛋白 2 (An 等人，1996，Plant J.，10 :107-121)或 tms 2 (U. S. 5，428，147， 其通過引用并入本文)以及磷酸丙糖異構(gòu)酶l(Xu等人，1994，Plant Physiol. 106 459-467)基因、玉米泛素 1 基因(Cornejo 等人，1993,Plant Mol. Biol. 29 :637-646)、擬南芥泛素1和6基因(Holtorf等人，1995，Plant Mol. Biol. 29 :637-646)和煙草翻譯起始因子4A基因(Mandel等人，1995Plant Mol. Biol. 29 :995-1004)。本文使用的術(shù)語“組成型” 不必然表示在組成型調(diào)節(jié)區(qū)域控制下的基因在所有細(xì)胞類型中都以相同水平表達(dá)，而是指該基因在眾多細(xì)胞類型中表達(dá)，即使常常觀察到豐度的差異。“有效連接”表示特定序列(例如調(diào)節(jié)元件和目的編碼區(qū)域)直接或間接相互作用使得行使預(yù)定功能，例如介導(dǎo)或調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有效連接序列的相互作用可例如由與有效連接序列相互作用的蛋白質(zhì)介導(dǎo)。本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可在轉(zhuǎn)化了本發(fā)明核苷酸序列或構(gòu)建物或載體的任何合適植物宿主中表達(dá)。合適宿主的實(shí)例包括但不限于農(nóng)作物，包括苜蓿、油菜、蕓苔屬物種、玉米、煙草屬物種、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日葵、 棉花等。本發(fā)明的一種或多種嵌合遺傳構(gòu)建物還可包含3 ’非翻譯區(qū)。3 ’非翻譯區(qū)是指包含含有多腺苷酸化信號和任何其他能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)之調(diào)節(jié)信號的DNA區(qū)段的基因部分。多腺苷酸化信號通常的特征為引起一系列多聚腺苷酸加至mRNA前體的3' 端。多腺苷酸化信號通常識記為存在典型形式5' AATAAA-3'的同源形式，但也常見變型形式。根據(jù)可能需要地，本發(fā)明的一種或多種嵌合遺傳構(gòu)建物還可包含其他增強(qiáng)子(翻譯或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。這些增強(qiáng)子區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其可包括ATG起始密碼子和相鄰序列。起始密碼子必須與編碼序列的讀碼框同框，以確保完整序列的翻譯。合適3'區(qū)域的非限制性實(shí)例有3'轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，其含有農(nóng)桿菌瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(例如胭脂堿合酶(Nos基因))和植物基因(例如大豆貯藏蛋白基因、核酮糖-1， 5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO ；US4, 962, 028 ；其通過引用并入本文)基因)的多聚腺苷酸化信號、調(diào)節(jié)質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)所用的啟動(dòng)子(Pwee和Gray 1993 ；其通過引用并入本文)。 質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子的實(shí)例描述于US 7，125，978 (其通過引用并入本文)。如本文所述，已發(fā)現(xiàn)包含具有已證明在葉表達(dá)中有效力之增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子在瞬時(shí)表達(dá)中是有效的。不希望受理論的限制，光合基因上游調(diào)節(jié)元件與核基質(zhì)的結(jié)合可介導(dǎo)強(qiáng)表達(dá)。例如，從豌豆質(zhì)體藍(lán)素基因翻譯起始位點(diǎn)起算的-784位可用于介導(dǎo)強(qiáng)的報(bào)告基因表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明可使用來自光合基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，例如但不限于質(zhì)體藍(lán)素調(diào)節(jié)區(qū)(US 7，125，978;通過引用并入本文)或獲得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO ； US 4，962，028 ；其通過引用并入本文)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB ；Leutwiler等人；1986 ； 其通過引用并入本文)、ST-LSl (其與光系統(tǒng)II的放氧復(fù)合體相關(guān)，Stockhaus等人，1989 ； 其通過引用并入本文)的調(diào)節(jié)區(qū)。為幫助鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可進(jìn)一步操縱本發(fā)明的構(gòu)建物使其包含植物選擇標(biāo)記?？捎玫倪x擇標(biāo)記包括提供對化學(xué)品例如抗生素(如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素)或除草劑(例如草胺膦、草甘膦、氯磺隆等)具有抗性的酶。類似地，可使用產(chǎn)生可通過顏色變化鑒定之化合物的酶(例如GUS ( β -葡糖醛酸酶))，或使用產(chǎn)生可通過發(fā)光來鑒定之化合物的酶(例如螢光素酶)或GFP。所得的這些基因的cDNA拷貝可根據(jù)宿主表達(dá)系統(tǒng)的需要克隆到合適表達(dá)載體中?？蛇x擇地，植物的合適表達(dá)載體實(shí)例如下所述，可使用桿狀病毒表達(dá)載體(例如 pFastBacl (InVitrogen))，利用已知方法以及制造商說明提供的信息得到基于pFastBacl 的質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及上述包含編碼HA之核酸的基因構(gòu)建物，其中所述核酸與在植物中可操作的調(diào)節(jié)元件有效連接。植物細(xì)胞中可操作的并且可用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件實(shí)例包括但不限于質(zhì)體藍(lán)素調(diào)節(jié)區(qū)(US 7，125，978 ；其通過引用并入本文)，或者獲得自1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO ；US 4，962，028 ；其通過引用并入本文)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB ；Leutwiler等人；1986 ；其通過引用并入本文)、ST-LSl (其與光系統(tǒng)II的放氧復(fù)合體相關(guān)，Stocldiaus等人1989 ；其通過引用并入本文)的調(diào)節(jié)區(qū)。如果所述構(gòu)建物在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，則昆蟲細(xì)胞中可操作的調(diào)節(jié)元件實(shí)例包括但不限于多面體啟動(dòng)子、gp64 啟動(dòng)子等。本發(fā)明還提供了將編碼HA(例如但不限于人流感A/印度尼西亞/5/05病毒 HA(H5N1))之核酸克隆進(jìn)植物、酵母或昆蟲表達(dá)載體(例如桿狀病毒表達(dá)載體)以及在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)含重組流感結(jié)構(gòu)蛋白的候選流感疫苗或試劑，所述結(jié)構(gòu)蛋白自組裝成有功能的免疫原性同型大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括亞病毒流感顆粒和流感 VLP)。
可使用例如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在合適細(xì)胞系中表達(dá)編碼HA(例如但不限于人流感A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)病毒HA，或者人流感A/印度尼西亞/5/05病毒HA基因) 的核酸，所述細(xì)胞系例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞(例如Sf_9細(xì)胞系； ATCC PTA-4047)。也可使用其他昆蟲細(xì)胞系。或者，可在植物細(xì)胞或植物中表達(dá)編碼HA的核酸?？墒褂肏A RNA通過逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成編碼HA的核酸。例如，可從人流感A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl) 病毒或人流感A/印度尼西亞/5/05 (H5W)病毒或者從感染流感病毒的細(xì)胞分離RNA。對于逆轉(zhuǎn)錄和PCR，特異性針對HA RNA的寡核苷酸引物可使用例如但不限于人流感A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)病毒HA基因或人流感A/印度尼西亞/5/05 (H5m)病毒HAO基因。另外，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成編碼HA的核酸。6-蛋白質(zhì)本發(fā)明還包括由以下核苷酸序列編碼的一種或多種HA蛋白核苷酸序列SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :7 (分別編碼來自HI、H5或H7的HA)，在嚴(yán)格雜交條件下分別與編碼來自HI、H5或H7之HA的核酸雜交的核苷酸序列SEQ ID NO =USEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :7，或者在嚴(yán)格雜交條件下分別與編碼來自H1、H5或H7之HA的核酸的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列SEQ ID NO =USEQ ID N0:5、SEQ ID NO :7，其中所述核苷酸序列編碼血凝素蛋白，其在表達(dá)時(shí)形成VLP，并且VLP誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。類似地，本發(fā)明包括與下列亞型相關(guān)的HA :H1 (由SEQ ID NO :1編碼)、H2(由SEQ ID NO 2 編碼)、H3 (由 SEQ ID NO 3 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 4 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 5 編碼)、H6 (由 SEQ ID NO 6 編碼)、H7 (由 SEQ ID NO 7 編碼)、H8 (由 SEQ ID NO 8 編碼)、H9(由 SEQ ID NO :9 編碼)、H10(由 SEQ ID NO 10 編碼)、H11(由 SEQ ID NO 11 編碼)、H12(由 SEQ ID NO :12 編碼)、H13(由 SEQ ID NO 13 編碼)、H14 (由 SEQ ID N0:14 編碼)、H15(由SEQ ID NO :15編碼)、H16(由SEQ ID N0:16編碼)；以及具有以下特征的核苷酸序列與 Hl (SEQ ID N0:1)、H2(SEQ ID N0:2)、H3(SEQ ID N0:3)、H4(SEQ ID NO :4)、 H5 (SEQ ID N0:5)、H6(SEQ ID N0:6)、H7(SEQ ID N0:7)、H8(SEQ ID N0:8)、H9(SEQ ID NO: 9)、HlO (SEQ ID NO : 10)、Hll (SEQ ID NO :11)、H12 (SEQ ID NO : 12)、H13 (SEQ ID NO: 13)、 H14(SEQ ID NO :14)、H15(SEQ ID NO : 15)、H16 (SEQ ID NO 16)具有約 60 至 100%或其間任何值的序列同一性，特別地具有約70至100%或其間任何值的同源性，約80至100%或其間任何值、約90至100%或其間任何值、約95至100%或其間任何值的序列同一性，其中所述核苷酸序列編碼血凝素蛋白，其在表達(dá)時(shí)形成VLP，并且VLP誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。例如，核苷酸序列在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形成VLP，所述VLP可用于產(chǎn)生能夠結(jié)合HA (包括成熟ΗΑ、ΗΑ0、 HAl或HA2)的抗體。當(dāng)施用給對象時(shí)，所述VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。7-VLP因此，本發(fā)明涉及包含一種或多種HA類型或亞型的VLP。術(shù)語“病毒樣顆?！?VLP)或“VLP”是指自組裝且包含結(jié)構(gòu)蛋白(如流感病毒HA 蛋白)的結(jié)構(gòu)。VLP通常在形態(tài)上和抗原性上類似于感染中產(chǎn)生的病毒顆粒，但是缺乏足以用于復(fù)制的遺傳信息，因此是非感染性的。在某些實(shí)例中，VLP可包含單一蛋白質(zhì)種類，或者多種蛋白質(zhì)種類。對于包含多種蛋白質(zhì)種類的VLP來說，蛋白質(zhì)種類可以來自同一病毒物種，或者可包含來自不同病毒物種、屬、亞科或科(根據(jù)ICTV命名法所命名)的蛋白質(zhì)。在另一些實(shí)例中，VLP所包含的一種或多種蛋白質(zhì)種類可來自對天然序列的修飾。VLP可在合適宿主細(xì)胞(包括植物和昆蟲宿主細(xì)胞)中生產(chǎn)。從宿主細(xì)胞中提取之后，經(jīng)過分離以及在合適條件下進(jìn)一步純化，可將VLP純化為完整結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還包括但不限于這樣的源自流感病毒之VLP，其獲得來自表達(dá)該VLP蛋白之細(xì)胞的質(zhì)膜的脂質(zhì)包膜。例如，如果VLP在基于植物的系統(tǒng)中表達(dá)，則VLP可獲得來自細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)包膜。通常，術(shù)語“脂質(zhì)”是指脂溶性的(親脂性)天然分子。更具體地說，該術(shù)語也用于表示脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油單酯，以及磷脂)以及其他含脂溶性固醇的代謝物或固醇。磷脂以及糖脂、固醇和蛋白質(zhì)是所有生物膜的主要組分。磷脂的實(shí)例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸等。固醇的實(shí)例包括動(dòng)物固醇(例如膽固醇)和植物固醇。已經(jīng)在多種植物物種中鑒定出超過200種植物固醇， 最常見的是菜油固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子固醇、δ-7-豆固醇、δ-7-燕麥固醇、胡蘿卜苷(daimosterol)、谷固醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-谷固醇。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解地，細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)組成可隨著細(xì)胞或從中獲得細(xì)胞之生物的培養(yǎng)或生長條件而變化。細(xì)胞膜通常包含脂雙層以及用于多種功能的蛋白質(zhì)。可在脂雙層中發(fā)現(xiàn)局部富集的特定脂質(zhì)，稱為“脂筏”。不希望受理論的限制，脂筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染原的進(jìn)入或釋出、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細(xì)胞或生物其他結(jié)構(gòu)組分(例如胞內(nèi)和胞外基質(zhì)) 的相互作用中具有重要作用。根據(jù)本發(fā)明，由流感病毒來源之蛋白質(zhì)產(chǎn)生的VLP不包含Ml蛋白。已知Ml蛋白結(jié)合對于VLP制備物來說屬于雜質(zhì)的RNA (Wakefield和Brownlee，1989)。在獲得VLP產(chǎn)品的監(jiān)管批準(zhǔn)時(shí)，不期望存在RNA，因此不含RNA的VLP制備物是有優(yōu)勢的。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，在植物中生產(chǎn)的VLP可與植物來源的脂質(zhì)相復(fù)合。VLP可包含HA0、HA1或HA2肽或其組合。植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層的形式，還可包含圍繞VLP 的包膜。植物來源的脂質(zhì)可包含生產(chǎn)VLP之植物的質(zhì)膜的脂質(zhì)組分，其包括一種或多種植物來源脂質(zhì)(例如但不限于磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、鞘糖脂、植物固醇或其組合)?；蛘?，植物來源的脂質(zhì)可稱為“植物脂質(zhì)”。在植物中，流感VLP從質(zhì)膜出芽，因此VLP的脂質(zhì)組分反映其來源。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP包含與植物來源脂質(zhì)相復(fù)合的HA。植物脂質(zhì)可激活特異性免疫細(xì)胞并增強(qiáng)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。植物膜由脂質(zhì)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)構(gòu)成，還含有鞘糖脂、 皂苷和植物固醇。另外，植物質(zhì)膜中也發(fā)現(xiàn)了脂筏，這些微區(qū)域富含鞘脂類和固醇類。在植物中，已知存在多種植物固醇，包括豆固醇、谷固醇、24-甲基膽固醇和膽固醇(Mongrand等人，2004)。PC和PE以及鞘糖脂可結(jié)合哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞(APC)(如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)以及其他細(xì)胞(包括胸腺和肝臟中的B和T淋巴細(xì)胞)表達(dá)的CDl分子(Tsuji M，2006)。⑶1分子在結(jié)構(gòu)上類似于I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，其作用是將糖脂抗原呈遞給NKT細(xì)胞(自然殺傷T細(xì)胞)。一經(jīng)活化，NKT細(xì)胞激活固有免疫細(xì)胞(例如NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)，并激活獲得性免疫細(xì)胞(如產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞和T細(xì)胞)。質(zhì)膜中可發(fā)現(xiàn)多種植物固醇，其具體組分可根據(jù)物種、生長條件、營養(yǎng)資源或病原體狀態(tài)等因素而不同。一般來說，谷固醇是豐度最高的植物固醇。流感VLP中存在的與脂雙層相復(fù)合的植物固醇(例如質(zhì)膜來源的包膜)可提供有利的疫苗組合物。不希望受理論的限制，與脂雙層(例如質(zhì)膜來源的包膜)相復(fù)合的植物制備之VLP可誘導(dǎo)比其他表達(dá)系統(tǒng)中所制備之VLP更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且其可類似于活病毒或減毒全病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與植物來源之脂雙層相復(fù)合的VLP。在一些實(shí)施方案中，植物來源的脂雙層可包含VLP的包膜。8-組合物因此，本發(fā)明提供了包含有效劑量VLP和可藥用載體的組合物，所述VLP包含流感病毒HA蛋白、一種或多種植物脂質(zhì)。所述流感病毒HA蛋白可以是Η5(印度尼西亞)。還提供了在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法。所述方法包括施用包含流感病毒HA 蛋白、一種或多種植物脂質(zhì)的病毒樣顆粒和可藥用載體。所述病毒樣顆?？梢越?jīng)口、皮內(nèi)、 鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。9-治療方法本發(fā)明提供了在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力或“激發(fā)免疫應(yīng)答”的方法，所述方法包括施用本文定義的組合物?！懊庖邞?yīng)答”一般是指獲得性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。獲得性免疫系統(tǒng)通常包括體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。體液應(yīng)答是由分泌抗體(其在B淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞(B細(xì)胞)中產(chǎn)生)所介導(dǎo)的免疫力方面。分泌的抗體與侵入微生物(例如病毒或細(xì)菌)表面上的抗原結(jié)合，所述抗原對它們進(jìn)行了標(biāo)記以供破壞。體液免疫通常用于表示抗體產(chǎn)生和伴隨其的過程，以及抗體的效應(yīng)物功能(包括Th2細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生、記憶細(xì)胞產(chǎn)生、調(diào)理素促進(jìn)的噬菌作用、病原體清除等)。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答是不涉及抗體而涉及應(yīng)答于抗原之巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞 (NK)、抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的活化以及多種細(xì)胞因子釋放的免疫應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力通常用于表示某些Th細(xì)胞活化、Tc細(xì)胞活化和T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力對于病毒感染的應(yīng)答來說特別重要。本發(fā)明的重組HA VLP可與現(xiàn)有流感疫苗聯(lián)用，以補(bǔ)充所述疫苗，使得它們更加有效，并減少所需的施用劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知地，所述疫苗可針對一種或多種流感病毒。合適疫苗的實(shí)例包括但不限于可購自Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、 Sinovac> Chiron、Roche、MedImmune> GlaxoSmithKline、Novartis> Sanofi-Aventis> Serono> Shire Pharmaceuticals 的Ιβ^。如果需要，本發(fā)明的VLP可與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適佐劑混合。此外，所述 VLP可用于疫苗組合物中，所述疫苗組合物包含如上定義用于治療靶標(biāo)生物的效劑量的 VLP。此外，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP可與使用不同流感病毒蛋白質(zhì)(例如神經(jīng)氨酸酶(NA)) 獲得的VLP相組合。因此，本發(fā)明提供了在動(dòng)物或靶標(biāo)生物中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用包含一種或多種VLP的有效劑量的疫苗。所述疫苗可以經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。如圖6和7所示，體外測定顯示針對突變的A/印度尼西亞/5/05H5VLP和其他流感毒株(例如A/越南/1203/04 ；A/安徽/1/05和A/ 土耳其/582/06 (均為H5N1株))產(chǎn)生之抗體的交叉反應(yīng)性，而其對于唯一測試的Hmi顯示較低的血細(xì)胞凝集反應(yīng)性(圖7)。顯著地，與針對野生型H5產(chǎn)生的抗體相比，在突變H5W (非糖基化H5蛋白)單次給藥后產(chǎn)生的抗體在14天后誘導(dǎo)出針對所測試的全部H5株的更高應(yīng)答，這表明該非糖基化免疫原可提供比野生型更快速的應(yīng)答。因此，這些數(shù)據(jù)證明，植物制得的包含缺少N連接糖之突變H5血凝素病毒蛋白的流感VLP誘導(dǎo)特異性針對致病流感株的免疫應(yīng)答，并且該應(yīng)答是交叉反應(yīng)性，且可以在單次給藥后快速產(chǎn)生。10-對象可向其施用本發(fā)明VLP的對象或靶標(biāo)生物的實(shí)例包括但不限于人、靈長類、禽類、水禽、候鳥類、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、火雞、雞、豬、綿羊、馬科動(dòng)物、馬、駱駝、犬科動(dòng)物、狗、 貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、靈貓、貂、石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其他嚙齒動(dòng)物、海豹、鯨等。這些靶標(biāo)生物是示例性的，不視為限制本發(fā)明的應(yīng)用和用途。本發(fā)明還涉及感染其他哺乳動(dòng)物或宿主動(dòng)物(例如人、靈長類、馬、豬、鳥類、水禽、候鳥類、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、火雞、雞、駱駝、犬科動(dòng)物、狗、貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、靈貓、貂、 石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等)的流感病毒。特別地，通過如上定義之方法治療的對象可選自包含以下的組人、靈長類、馬、 豬、禽類(鳥類)、水禽、候鳥類、鵪鶉、鴨、鵝、雞、狗、貓、雪貂、家畜等。特別地，所述對象通?？梢允侨嘶颊呋蛞话阋饬x的鳥類(包括水禽、候鳥類、家禽，例如鵪鶉、鴨、鵝、火雞、雞)， 特別是候鳥類或用于人類消費(fèi)的家禽(鵪鶉、鴨、鵝、火雞、雞)。更特別地，所述對象是人。11-容器、注射器和藥盒等本發(fā)明還提供了包含本文所定義組合物的容器。特別地，所述容器包含含有防腐劑的單個(gè)單位劑量或多劑量形式。更特別地，所述容器是“即用型”注射器，其預(yù)先裝入本文定義的組合物或疫苗。更特別地，本發(fā)明還提供了包含含有本文定義之疫苗或組合物的容器以及如何使用/施用所述組合物/疫苗的說明的藥盒。下面僅通過參考如下非限制性實(shí)施例的方式詳細(xì)描述本發(fā)明。實(shí)施例1材料和方法1.對來自A/印度尼西亞/5/05的野生型H5 (SEO ID NO. 17)進(jìn)行突變以獲得突變的非糖基化H5。通過去除位于野生型HA球狀頭部的糖基化位點(diǎn)N154、N165和N286產(chǎn)生三突變體，更具體地，通過用Ala殘基替換糖基化序列模式N-X-T/S中的Thr或Ser來實(shí)現(xiàn)。因此，三突變體含有下列三處氨基酸替換T156A、T167A和S288A (根據(jù)起始SEQ ID NO. 17編碼)。通過Darveau等人(19%)給出的基于PCR的連接方法，使用野生型HA表達(dá)載體(660 構(gòu)建體，圖4)作為模板進(jìn)行三處氨基酸替換。簡言之，使用3對不同引物，對作為模板的660pCAMBIA表達(dá)載體平行進(jìn)行三個(gè)PCR 擴(kuò)增，所述引物對為l)Plato-443c(SEQ ID NO :18)和 HA5-T156A. r(SEQ ID NO 19)；
2)HA5-T167A. C(SEQ ID NO :20)和 HA5-S288A· r(SEQ ID NO :21)；禾口3) HA5-S288A. c (SEQ ID NO. 22)和 HA (Ind)-SacI. r (SEQ ID NO :23)。將從三個(gè)反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起，并利用該混合物作為模板進(jìn)行第四個(gè)反應(yīng)(組裝反應(yīng))，其使用 Plato-443c(SEQ ID NO :18)和 HA (Ind)-Sac. r (SEQ ID NO :23) 作為引物。用BamHI (位于質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子中)和SacI (在片段的3'端)消化所得片段，將其克隆進(jìn)預(yù)先用相同酶消化的pCAMBIAPlasto中。所得質(zhì)粒(稱為680)示于圖5中(SEQ ID NO 29)。2.表汰盒的組裝所有操作均使用Sambrook和Russell (2001 ；其通過引用并入本文)的一般分子生物學(xué)方案來進(jìn)行。第一個(gè)克隆步驟包括組裝含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因的上游和下游調(diào)節(jié)元件的受體質(zhì)粒。使用寡核苷酸引物Xmal-pPlas. c(SEQ ID NO :24)和McI-ATG-pPlas. r(SEQ ID NO :25)從苜?；蚪MDNA擴(kuò)增質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5' UTR序列。用XmaI和 SacI消化所得擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接進(jìn)預(yù)先用相同酶消化的pCAMBIA2300(Cambia，Canberra, Australia)中，得到 pCAMBIApromo Plasto。類似地，使用引物 &tcI_PlasTer· c (SEQ ID NO: 26)和EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO :27)從苜蓿基因組DNA擴(kuò)增質(zhì)體藍(lán)素基因的3' UTR序列和終止子，用Mel和EcoRI消化產(chǎn)物，然后插入到pCAMBIApromoPlasto的相同位點(diǎn)中， 得到 pCAMBIAPlasto。3. H5表汰盒的組裝由Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, USA)合成編碼來自流感毒株A/印度尼西亞 /5/05 (H5N1 ；登記號LANL ISDN 125873)之血凝素的片段。SEQ ID NO :28 (以及對于突變H5 來說的SEQ ID NO 29)示出所產(chǎn)生的含有完整H5編碼區(qū)(SEQ ID N0. 17)的片段，其包含天然信號肽(其側(cè)翼是緊鄰起始ATG上游的HindIII位點(diǎn)以及緊鄰終止密碼子(TAA)下游的 McI位點(diǎn)。通過Darveau等人(1995)給出的基于PCR的連接方法將H5編碼區(qū)克隆進(jìn)基于質(zhì)體藍(lán)素的表達(dá)盒中。簡言之，使用引物Plato-443c(SEQ ID NO :30) ^P SpHA(Ind) -Plasto. r(SEQ ID NO :31)以及使用pCAMBIA promoPlasto作為模板獲得第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。平行地，使用引物 Plasto-SpHA(Ind). c (SEQ ID NO 6)和 HA (Ind)-Sac. r (SEQ ID NO :32)以及使用H5編碼片段作為模板進(jìn)行第二擴(kuò)增。將從兩個(gè)反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起， 并利用該混合物作為第三反應(yīng)(組裝反應(yīng))的模板，其使用Plato-443c(SEQ ID NO 4)和 HA(Ind) -Sac. r (SEQ ID NO :33)作為引物。用BamHI (在質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子中)和&icl (在片段3’端)消化所得片段，并將其克隆進(jìn)預(yù)先用相同酶消化的pCAMBIAPlasto中。所得質(zhì)粒(稱為660)示于圖5中，而得自“突變” H5蛋白的質(zhì)粒稱為680。如Hamilton等人Q002)所述制備HcPro構(gòu)建物(35Hcftx))。對所有克隆進(jìn)行測序，以確認(rèn)構(gòu)建物的完整性。所述質(zhì)粒用于通過電穿孔(Mattanovich等人，1989)轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) (AGL1 ；ATCC, Manassas, VA 20108, USA)。通過限制性酶切確認(rèn)所有根瘤農(nóng)桿菌菌株的完整性。4.勿勿質(zhì)、接種體的泡丨備,農(nóng)桿菌滲入以及IBr獲在裝有市售泥炭蘚基質(zhì)的平面中從種子開始培養(yǎng)煙草本塞姆氏(Mcotiana benthamiana)植株。使植株在溫室中在16/8光周期以及白天25°C /夜晚20°C的溫度條件下生長。播種三周后，挑出單株的幼苗，移植到盆中，使之在同樣環(huán)境條件下在溫室中再培養(yǎng)3周。轉(zhuǎn)化前，在下文所示的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過從植物掐去芽或者通過對植物進(jìn)行化學(xué)處理去除頂芽和腋芽。在添加了 IOmM 2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)、20 μ M乙酰丁香酮、50 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml羧芐西林的YEB培養(yǎng)基(pH 5. 6)中培養(yǎng)用質(zhì)粒660或680轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至它們的0D600達(dá)到0. 6至1. 6。使用前對農(nóng)桿菌懸液進(jìn)行離心，用滲入介質(zhì)(IOmM MgCl2 ^P IOmM MESpH 5.6)重懸。如 Liu 和 LomonossofT(2002，Journal of Virological Methods, 105 :343-348)所述進(jìn)行注射器滲入。對于真空滲入而言，對根瘤農(nóng)桿菌懸液進(jìn)行離心，用滲入介質(zhì)進(jìn)行重懸，并在4攝氏度下保存過夜。在滲入當(dāng)天，用2. 5倍培養(yǎng)體積對培養(yǎng)物批次進(jìn)行稀釋，并在使用前使之變溫暖。在20-40ΤΟΠ·真空下的氣密不銹鋼罐中，將煙草本塞姆氏的整個(gè)植株倒置于細(xì)菌懸液中2分鐘。注射器滲入或真空滲入之后，將植物放回溫室，孵育4-5天直至收獲。5.葉取樣和總蛋白質(zhì)提取孵育后，收獲植株的氣生部分，在零下80攝氏度下冷凍，切成小塊。通過在3倍體積的冷50mM Tris (pH7. 4)、0. 15M NaCl和ImM苯甲基磺酰氟中對冷凍-切碎植物材料的每個(gè)樣品進(jìn)行勻漿(Polytron)來提取總可溶性蛋白。勻漿之后，在4攝氏度下以20，OOOg 將漿液離心20分鐘，將澄清的粗提物(上清)留作分析。通過Bradford測定(Bio-Rad， Hercules, CA)使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)品測定澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量。6.蛋白質(zhì)分析和免疫印跡通過BCA蛋白質(zhì)測定(Pierce Biochemicals, Rockport IL)測定蛋白質(zhì)濃度。通過在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE以及用考馬斯藍(lán)進(jìn)行染色來分離蛋白質(zhì)。掃描經(jīng)染色的凝膠，用ImageJ軟件(OTH)進(jìn)行光密度測定分析。使用丙酮沉淀來自SEC洗脫級分的蛋白質(zhì)(Bollag等人，1996)，用1/5體積的平衡/洗脫緩沖液進(jìn)行重懸，在還原條件下通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯 (PVDF) II (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)口跡之前，在4攝氏度下用Tris緩沖鹽溶液中5%脫脂乳和0. 吐溫20 (TBS-T)將膜封閉 16-18h0通過與下述抗體一起孵育進(jìn)行免疫印跡為檢測H1，小鼠抗A型流感病毒單克隆抗體(Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA,貨號 10-150)(在含有2%脫脂乳的TBS-吐溫20(0. )中為2μ g/ml)；為檢測H5，兔抗H5 (越南)抗體(Immune Technology, Woodside，NY, USA,貨號 IT-003-005V)(用含有 2 % 脫脂乳的 TBS-吐溫20 (0.1%)以1/4000進(jìn)行稀釋)。過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG (H+L)抗體 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA,貨號 115-035-146)(用含有2%脫脂乳的TBS-吐溫20(0. 1%)以1/12000稀釋)用作第二抗體。通過化學(xué)發(fā)光法使用魯米諾作為底物(Roche Diagnostics Corporation)檢測免疫反應(yīng)復(fù)合物。通過使用 EZ-Link Plus 活化過氧化物酶綴合試劑盒(Pierce，Rockford，IL)將人IgG抗體與辣根過氧化物酶進(jìn)行綴合。H5的血液凝集測定基于Nayak.和Reichl (2004)所述的方法。簡言之，在含有 100 μ L PBS的V形底96孔微量滴定板中制備測試樣品的連續(xù)二倍稀釋物(100 μ L)，每孔留下IOOyL的稀釋樣品。將一百微升0.25%馬紅細(xì)胞懸液(Bio Link Inc. , Syracuse,NY)加至每個(gè)孔，將平板在室溫下孵育2小時(shí)。顯示完全血液凝集的最高稀釋度的倒數(shù)記為 HA活性。平行地，用PBS稀釋重組HA標(biāo)準(zhǔn)品(A/越南/1203/2004H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT)，在每個(gè)平板上用作對照。7. H5VLP 純化使用市售攪拌器在1. 5倍體積的50mM Tris (pH8)、NaCl 50mM和0. 04%焦亞硫酸鈉中對冷凍的經(jīng)660-或680-滲入的煙草本塞姆氏葉進(jìn)行勻漿。向所得提取物添加ImM PMSF，用IM乙酸調(diào)節(jié)到pH6，然后在42攝氏度下加熱5分鐘。向經(jīng)熱處理的提取物添加硅藻土(DE)，以吸收由pH變化和熱處理而沉淀下來的雜質(zhì)，通過Whatman濾紙過濾漿液。在室溫下將所得澄清提取物以10，000 Xg離心10分鐘，除去殘余DE，通過0. 8/0. 2 μ m Acropack 20濾器，并加樣至胎球蛋白-瓊脂糖親和柱(Sigma-Aldrich, St-Loui s, MO, USA)。使用 400mM NaCl、25mM Tris (pH 6)的清洗步驟之后，用 1. 5M NaCl、50mM MES(pH6)洗脫所結(jié)合的蛋白。向洗脫的VLP添加吐溫-80至終濃度0. 0005% (體積/體積)。利用IOOkDa MWCO Amicon膜濃縮VLP，在4攝氏度下以IOOOOXg離心30分鐘，并用含有0. 01 %吐溫-80和 0.01%硫柳汞的PBS (pH7. 4)進(jìn)行重懸。在使用前，將懸浮的VLP進(jìn)行過濾除菌。8.動(dòng)物研究使用6-8 周齡雌性Wistar 大鼠(Charles River Laboratories)進(jìn)行針對流感VLP 施用之免疫應(yīng)答的研究。將13只大鼠隨機(jī)分到3組中，其中對照組3只，植物制備VLP H5 野生型疫苗(660)和突變體(680)疫苗組各5只。8組用于肌內(nèi)免疫，6組用于測試鼻內(nèi)施用途徑。所有組均使用兩劑方案進(jìn)行免疫，加強(qiáng)免疫在初次免疫后14天進(jìn)行。對于在后腿內(nèi)的肌內(nèi)施用，用植物制備的VLP H5疫苗(15 μ g)、植物制備的VLP H5突變體形式疫苗或PBS免疫未麻醉大鼠。在免疫前，以1 1的體積比將所有抗原制劑與Alhydrogel (明礬；Accurate Chemical and Scientific Corporation, ffesbury, NY, US)混合至終濃度 1%。血液收集和脾臟收集在初次免疫后14天和二次免疫后14天對麻醉動(dòng)物進(jìn)行頸靜脈血收集。通過SOOOg 離心10分鐘收集血清。二次免疫后三周，用C02氣體麻醉動(dòng)物，停止后立刻使用心臟穿刺收集血液。對大鼠進(jìn)行脾臟收集。將收集的脾臟置于添加慶大霉素的RPMI中，在50ml圓錐試管中用IOml注射器的推桿將其搗碎。將搗碎的脾臟清洗兩遍，以2000rpm離心5分鐘， 重懸于ACK裂解緩沖液中室溫保持5分鐘。將脾細(xì)胞在PBS-慶大霉素中清洗，重懸于5% RPMI中并計(jì)數(shù)。將脾細(xì)胞用于增殖測定?？贵w效價(jià)A/越南/1203/2004 (H5N1) ；A/安徽/1/05 (H5m) ；A/土雞 / 土耳其/1/05 (H5m)； A/新喀里多尼亞Λ0/99 (H1N2)在第一次免疫后14天和第二次免疫后21天(處死時(shí))測定血清的抗流感病毒抗體效價(jià)。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)使用滅活病毒A/印度尼西亞/5/05作為包被抗原測定效價(jià)。終點(diǎn)效價(jià)表示為達(dá)到比陰性對照樣品的OD值高出至少0. 1的OD值時(shí)最高稀釋度的倒數(shù)值。對于抗體分類測定(IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM)，通過如上所述的ELISA評估最終放血的效價(jià)。血液凝集抑制(HI)效價(jià)在第二次免疫后14和35天測定血清的血液凝集抑制(HI)效價(jià)，如前所述(WHO 2002 ；Kendal 1982)。使用來自毒株A/印度尼西亞/5/05、A/安徽/1/05 (H5m)、A/火雞/ 土耳其/l/05(H5m)或A/越南/1203/2004的滅活病毒制劑測試大鼠血清樣品的HI活性。用從霍舌L弧菌(Vibrio cholerae)制備的受體破壞醇 II (receptor—destroying enzyme II， RDE II) (Denka Seiken Co.，Tokyo, Japan)對血清進(jìn)行預(yù)處理(Kendal 1982)。用 0· 5% 馬紅細(xì)胞進(jìn)行HI測定。HI抗體效價(jià)定義為造成完全凝集抑制的最高稀釋度的倒數(shù)。結(jié)果在第一次免疫后14天(第14天)或第二次免疫后14天(第35天)評估來自用野生型VLP或突變VLP免疫的大鼠的血清反應(yīng)性。用與明礬一起配制的15yg抗原免疫所有大鼠。評估針對下列H5W病毒的免疫反應(yīng)性進(jìn)化枝1 (A/越南/1203/04)、進(jìn)化枝2. 1 (A/印度尼西亞/5/05)、進(jìn)化枝2. 2 (A/火雞/ 土耳其/1/05)和進(jìn)化枝2. 3 (A/安徽 /1/05)。第一次給藥后，對于所有檢測的H5W株，突變的VLP誘導(dǎo)比野生型更高的抗體反應(yīng)(圖6)。在第一次給藥后，針對禽類毒株A/火雞/ 土耳其/1/05的免疫反應(yīng)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P < 0. 05)。還評估了針對Hmi病毒(A/新喀里多尼亞/20/99)的免疫反應(yīng)性，其顯示在加強(qiáng)注射后的免疫反應(yīng)性。GMT:效價(jià)幾何平均值。值為每組五只大鼠倒數(shù)終點(diǎn)效價(jià)的GMT(In)。短棒表示平均偏差。*相比于野生型VLP，ρ < 0. 05。在第一次免疫后14天(第14天)或第二次免疫后14天(第35天)評估用野生型或突變VLP免疫的大鼠的HI效價(jià)。使用滅活全H5W病毒測定HI抗體應(yīng)答。第一次免疫后，針對所測的全部H5W病毒，突變VLP誘導(dǎo)出比野生型VLP更高的HI抗體應(yīng)答(圖 7)。對于A/印度尼西亞/5/05和A/火雞/ 土耳其/1/05流感毒株，達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。 GMT:效價(jià)幾何平均值。值為每組五只大鼠倒數(shù)終點(diǎn)效價(jià)的GMT(In)。短棒表示平均偏差。 *相比于野生型VLP, ρ < 0. 05。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，對于生產(chǎn)作為廣譜快速作用流感疫苗的VLP而言，“突變的”非糖基化H5蛋白是天然H5蛋白的非常具有吸引力的替代物。所有弓I文通過參考并入本文。本發(fā)明通過一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方案進(jìn)行描述。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，在不脫離權(quán)利要求所限定的發(fā)明范圍的前提下，可進(jìn)行多種變化和修改。參考文獻(xiàn)■ Abe Y. et al. 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權(quán)利要求
1.具有HAl結(jié)構(gòu)域的流感病毒血凝素(HA)分子，其中所述HAl結(jié)構(gòu)域完全或部分不含 N-連接糖基化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒血凝素(HA)分子，其中HAl結(jié)構(gòu)域中一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)被消除，所消除的糖基化位點(diǎn)最初存在于該蛋白質(zhì)的免疫原性球狀頭部分上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的流感病毒血凝素(HA)分子，其中所述被消除的糖基化位點(diǎn)在所述免疫原性球狀頭部的受體結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)或附近或者在所述HAl結(jié)構(gòu)域的F' 2亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)或附近。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的HA分子，其中所述糖基化位點(diǎn)由糖基化識別三聯(lián)體N-X-S/T組成，其中N是天冬酰胺，X是除脯氨酸外的任意氨基酸，S是絲氨酸以及T是蘇氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的HA分子，其中糖基化識別三聯(lián)體N-X-S/T中所包含的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基被非天冬酰胺氨基酸所替換。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的HA分子，其中所述天冬酰胺殘基由選自下列的氨基酸所替換 Leuλ lie、Val、Thr、Ser 禾口 Ala。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的HA分子，其中所述天冬酰胺殘基被丙氨酸所替換。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5的HA分子，其中糖基化識別三聯(lián)體N-X-S/T中所包含的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基被非絲氨酸和非蘇氨酸氨基酸所替換。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的HA分子，其中糖基化識別三聯(lián)體N-X-S/T中所包含的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基被選自下列的氨基酸所替換Ala、Val、IIe和Leu。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的HA分子，其中所述絲氨酸或蘇氨酸殘基被丙氨酸所替換。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的HA分子，其中所述糖基化位點(diǎn)在與位于39至331 位氨基酸之間任何三聯(lián)體對應(yīng)的位置，其中根據(jù)毒株A/越南/1194/04進(jìn)行編碼，其中所述被消除的N-糖基化位點(diǎn)使得HA分子對于特異性針對天然HA分子的抗體更具有抗原性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中任一項(xiàng)的HA分子，其中所述糖基化位點(diǎn)在選自巧4、165和觀6 的位置。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的HA分子，其具有一個(gè)被消除的糖基化位點(diǎn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的HA分子，其具有兩個(gè)被消除的糖基化位點(diǎn)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的HA分子，其具有三個(gè)被消除的糖基化位點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的流感血凝素(HA)，其中所述流感是A型和B型。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述流感是B型。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述HA來自選自下列的一種或多種A 亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的流感血凝素(HA)，其中所述HA亞型是選自下列的一種或多種亞型H1、H2、H3、H5、H7、H9 和 H10。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的流感血凝素(HA)，其中所述HA亞型是選自下列的一種或多種亞型H1、H3、H5 和 H7。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述流感血凝素是B型或A型H3亞型。
22.包含編碼權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)之流感HA分子的核苷酸序列的核酸。
23.根據(jù)SEQID NO. 17定義的核酸，其中編碼選自巧4、165和286位的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基編碼非天冬酰胺。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的核酸，其中編碼選自1M、165和286位的氨基酸的所述一個(gè)或多個(gè)殘基編碼丙氨酸。
25.根據(jù)SEQID NO. 17定義的核酸，其中編碼選自154+2,165+2和286+2位的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)殘基編碼非絲氨酸和非蘇氨酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的核酸，其中編碼選自1M+2、165+2和286+2位的氨基酸的所述一個(gè)或多個(gè)殘基編碼丙氨酸。
27.與權(quán)利要求23、24、25或沈的核酸具有90%同一性的核酸。
28.根據(jù)SEQID NO 29定義的核酸。
29.與SEQID NO 29具有90%同一性的核酸。
30.包含權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)的核酸的表達(dá)盒，所述核酸與在非唾液酸化宿主生物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)域有效連接。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的表達(dá)盒，其中所述調(diào)節(jié)區(qū)域選自質(zhì)體藍(lán)素調(diào)節(jié)區(qū)；napin啟動(dòng)子、cruciferin啟動(dòng)子，或獲得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO)、葉綠素a/ b結(jié)合蛋白、ST-LS的調(diào)節(jié)區(qū)，多面體啟動(dòng)子和gp64啟動(dòng)子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的表達(dá)盒，其中所述質(zhì)體藍(lán)素調(diào)節(jié)區(qū)來自苜蓿(Medicago sativa)0
33.在非唾液酸化宿主生物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，所述方法包括a)引入權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)的核酸，所述核酸與在非唾液酸化宿主生物或其部分中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，以及b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下孵育該宿主或其部分，從而生產(chǎn)所述VLP。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中在引入步驟(步驟a)中，所述核酸可以在所述宿主中瞬時(shí)表達(dá)或者在所述宿主中穩(wěn)定表達(dá)。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中所述非唾液酸化宿主生物選自植物、昆蟲和酵母。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述植物選自植物細(xì)胞、整株植物或其部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的核酸，其中所述植物細(xì)胞來自煙草本塞姆氏(N.benthiamina)。
38.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其還包括步驟c)收獲所述宿主并純化所述VLP。
39.包含具有HAl結(jié)構(gòu)域之流感血凝素分子的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述HAl亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)已被消除。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的VLP，其中所述VLP是免疫原性的。
41.由權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)的核酸編碼的病毒樣顆粒(VLP)。
42.病毒樣顆粒(VLP)，其包含權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的流感病毒HA蛋白質(zhì)以及一種或多種宿主脂質(zhì)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的病毒樣顆粒，其中所述宿主脂質(zhì)是植物脂質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求41、42或43的病毒樣顆粒(VLP)，其包含帶有植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖的流感病毒HA。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述流感HA蛋白質(zhì)是H5印度尼西亞。
46.權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的VLP在制備用于預(yù)防或治療對象中病毒感染之疫苗中的用途。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的用途，其中所述對象選自人或鳥類。
48.權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的VLP用于預(yù)防或治療對象中流感病毒感染的用途。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的用途，其中所述對象選自人或鳥類。
50.包含有效劑量的權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)之VLP的組合物，其與可藥用載體相混合。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所述可藥用載體適于經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。
52.用于對具有患流感病毒病之風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體進(jìn)行免疫的組合物，所述組合物包含與可藥用載體混合的權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的VLP。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的組合物，其中所述組合物采用液體、混懸液、固體或粉末形式。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的組合物，其中所述組合物適于經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、 靜脈內(nèi)或皮下施用。
55.包含免疫有效劑量的權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的VLP的疫苗組合物，其與含有或不含佐劑的可藥用載體相混合。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的疫苗，其中所述可藥用載體適于經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的疫苗，其不含所述佐劑。
58.病毒疫苗，其包含與生理可接受之賦形劑或佐劑相混合的權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的VLP。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的疫苗，其為人或禽類疫苗。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的疫苗，其適于在癥狀出現(xiàn)之前用于預(yù)防；或者適于在癥狀出現(xiàn)之后治療感染。
61.在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，所述方法包括施用病毒樣顆粒以及可藥用載體，所述病毒樣顆粒包含權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的流感病毒HA蛋白或者由權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)的核酸所編碼的流感病毒HA蛋白、一種或多種宿主脂質(zhì)。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述病毒樣顆粒經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。
63.在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用有效劑量的權(quán)利要求50的組合物或權(quán)利要求55的疫苗。
64.在對象中誘導(dǎo)針對流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)的病毒樣顆粒。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述病毒樣顆粒經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。
66.根據(jù)權(quán)利要求61至65中任一項(xiàng)的方法，其中所述對象選自包含以下的組人、靈長類、馬、豬、鳥類(禽類)、水禽、候鳥類、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動(dòng)物、狗、貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、靈貓、貂、石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述對象選自人和鳥類。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述對象是人。
69.包含權(quán)利要求55之疫苗的容器。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的容器，所述容器含有單次單位劑量。
71.根據(jù)權(quán)利要求69的容器，所述容器采用多劑量形式。
72.根據(jù)權(quán)利要求69、70或71的容器，所述容器是注射器。
73.預(yù)裝有權(quán)利要求55之疫苗的注射器。
74.包含權(quán)利要求69至73中任一項(xiàng)之容器以及如何使用/施用所述疫苗之說明的藥
75.用權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)之核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的植物細(xì)胞，其是被瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。
77.用權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)之核酸轉(zhuǎn)化的植物部分。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的植物部分，其是被瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。
79.用權(quán)利要求22至四中任一項(xiàng)之核酸轉(zhuǎn)化的植物。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的植物，其是被瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。
81.用權(quán)利要求30、31或32的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)胞。
全文摘要
提供了在植物或其部分中合成流感病毒樣顆粒(VLP)的方法。該方法包括在植物中表達(dá)新流感HA蛋白及其純化。本發(fā)明還涉及包含流感HA蛋白和植物脂質(zhì)的VLP。本發(fā)明還涉及編碼經(jīng)改進(jìn)之流感HA的核酸以及載體。該VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于豐富現(xiàn)有疫苗。
文檔編號C12N7/01GK102165062SQ200980136376
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者納薩莉·蘭德里, 路易斯-菲利普·韋齊納, 馬農(nóng)·科圖雷 申請人:麥迪卡格公司