專利名稱：鼻內(nèi)流感病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型流感病毒制劑、其制備方法及其在預(yù)防或治療中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及粘膜給予的疫苗，更具體地說(shuō)是涉及鼻給予的疫苗。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用可以單劑鼻內(nèi)給予的流感疫苗獲得滿足管理要求的合適免疫應(yīng)答。
流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人類，也可感染家畜。流感的經(jīng)濟(jì)影響是顯著的。
流感病毒是RNA包膜病毒，病毒顆粒地直徑大小約為125nm。流感病毒的基本組成為內(nèi)部為與核蛋白結(jié)合的核糖核酸(RNA)核衣殼或核心，外部包繞著脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和外部糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白組成，而外層主要是宿主來(lái)源的脂類物質(zhì)。表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)和血細(xì)胞凝集素(HA)以10-12nm長(zhǎng)的刺突顯露在病毒顆粒表面上。就是用這些表面蛋白、尤其是血細(xì)胞凝集素決定流感亞型的抗原特異性。
典型的流感流行使肺炎和下呼吸道疾病的發(fā)病率增加，其證據(jù)是住院率或死亡率增加。老年人或潛在慢性病的人最有可能發(fā)生這樣的并發(fā)癥，但幼小嬰兒也可能罹患嚴(yán)重疾病。因此，這些人群尤其需要接受保護(hù)。
現(xiàn)時(shí)可用的流感疫苗或者是滅活流感疫苗，或者是減毒流感活疫苗。滅活流感疫苗由三種類型的抗原制品組成滅活完整病毒、其中純化的病毒顆粒用去污劑或其它試劑破壞以溶解脂質(zhì)包膜的亞病毒體(所謂的“片段”疫苗)或純化的HA和NA(亞單位疫苗)。這些滅活疫苗肌內(nèi)(i.m.)給予。
所有種類的流感疫苗通常都是三價(jià)疫苗。它們含有的抗原一般得自兩種甲(A)型流感病毒株和一種乙(B)型流感病毒株。據(jù)單輻射免疫擴(kuò)散(SRD)(J.M.Wood等用于測(cè)定流感血細(xì)胞凝集素抗原的改良單輻射免疫擴(kuò)散技術(shù)適于測(cè)定滅活完整病毒疫苗和亞單位疫苗效價(jià)，J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等用于流感病毒血細(xì)胞凝集素抗原測(cè)定的單輻射擴(kuò)散技術(shù)和免疫電泳技術(shù)的國(guó)際協(xié)作研究，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)0.5ml注射劑量在大多數(shù)情況下含有15μg每種毒株的血細(xì)胞凝集素抗原組分。
每個(gè)季節(jié)加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO和美國(guó)衛(wèi)生管理局以及疫苗生產(chǎn)商共同研究確定。
目前在控制與每年流感流行相關(guān)性發(fā)病率和死亡率方面的努力是基于使用肌內(nèi)給予的滅活流感疫苗。這些疫苗在預(yù)防呼吸疾病和流感并發(fā)癥方面的效力由健康成年人的75％至老年人的低于50％不等。
流感病毒同許多病原體一樣，侵染粘膜表面，首先是上呼吸道粘膜表面。粘膜免疫構(gòu)成了宿主的第一道防線，是鼻道和下呼吸道免疫反應(yīng)的主要組成部分。盡管目前使用的注射流感疫苗在大部分健康個(gè)體中刺激血清HA-特異性IgG，但僅有小部分接種者HA-特異性IgA抗體出現(xiàn)顯著上升。免疫原性和臨床效力更佳的改進(jìn)流感疫苗必須以局部抗體反應(yīng)和系統(tǒng)抗體反應(yīng)這二者為目標(biāo)。
人類實(shí)驗(yàn)性鼻內(nèi)接觸滅活流感疫苗可追溯至20世紀(jì)40年代(參見(jiàn)綜述Eyles等，2000 BioDrugs 13(1)35-59)。盡管在20世紀(jì)60年代和70年代重新燃起了對(duì)使用IN免疫的滅活病毒的興趣，但在鼻內(nèi)領(lǐng)域注意力大部分都集中在活體減毒方式。
鼻內(nèi)給予的減毒流感活疫苗(例如冷適應(yīng)疫苗)改善了粘膜免疫，特別是對(duì)兒童的效果很有前景。然而，迄今為止該方案也不能獲得全世界范圍的認(rèn)同。
因此，大部分市售流感疫苗或者是注射片段疫苗，或者是注射亞單位疫苗。一般通過(guò)用有機(jī)溶劑或去污劑破壞病毒顆粒，并分離或純化病毒蛋白至不同的程度，制備這些疫苗。通過(guò)用增溶濃度的有機(jī)溶劑或去污劑片段化感染性或滅活的完整流感病毒，隨后去除增溶劑以及某些或大部分病毒脂質(zhì)物質(zhì)，制備片段疫苗。片段疫苗通常含有污染性基質(zhì)蛋白和核蛋白以及膜性包膜蛋白，有時(shí)含有脂質(zhì)。片段疫苗通常含有大部分或全部病毒結(jié)構(gòu)性蛋白，盡管不一定與它們?cè)谕暾《局械谋壤嗤?。另一方面，亞單位疫苗基本由高度純化的病毒表面蛋白血?xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶組成，它們是在疫苗接種時(shí)負(fù)責(zé)激發(fā)需要的病毒中和抗體的表面蛋白。
已經(jīng)將更新、更高純度、更好表征的片段流感疫苗與佐劑組合，嘗試改進(jìn)其在成年人和老年人中的免疫原性。盡管在小鼠中的免疫應(yīng)答明顯升高，但還未證明使用新一代佐劑的眾多方案有可能在人類獲得批準(zhǔn)。
國(guó)際上提出了檢測(cè)流感疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)。在下表中給出了有效抗流感疫苗的歐盟官方標(biāo)準(zhǔn)。理論上，為了滿足歐盟要求，對(duì)流感疫苗中包括的所有流感病毒株來(lái)說(shuō)，流感疫苗僅需滿足表中的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。然而實(shí)際上，所有病毒株必須滿足所述標(biāo)準(zhǔn)中的至少兩項(xiàng)或全部三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，特別是對(duì)于新型疫苗(例如新型鼻內(nèi)疫苗)而言。在某些情況下，兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)可能就足夠了。例如，可以接受所有病毒株滿足三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的兩項(xiàng)，而部分但不是全部病毒株滿足第三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)(例如三種病毒株中的兩種)。對(duì)成年人群體(18-60歲)和老年人群體(大于60歲)的要求是不同的。*血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率定義為每種疫苗株接種后血清血細(xì)胞凝集素抑制(HI)滴度增加 至少3倍的接種者的百分率。**轉(zhuǎn)化系數(shù)定義為每種疫苗株接種后血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍 數(shù)。***保護(hù)率定義為(每種疫苗株)接種后血清HI滴度等于或高于1∶40的接
種者的百分率，通常接受所列出的保護(hù)率。
對(duì)于市售用途的鼻內(nèi)流感疫苗而言，不僅僅需要滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，而且實(shí)際上還需要和目前使用的注射疫苗至少等效。此外，需要的抗原量和給予次數(shù)在商業(yè)上必須可行。
在過(guò)去的幾十年中研究的基于滅活病毒的鼻內(nèi)流感疫苗未能滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。
Fulk等1969(J.Immunol.102，1102-5)在老年患者中比較了鼻內(nèi)(滴鼻加噴霧)給予滅活流感病毒和皮下(s.c.)給予。盡管在接受s.c.給予的患者中有56％顯示抗體滴度(HI)增加3倍，但在接受鼻內(nèi)給予的患者中僅有25％觀察到相應(yīng)的增加。兩次鼻內(nèi)給予產(chǎn)生75％的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。
Gluck等1999(J.Virol.73，7780-6)證實(shí)，誘導(dǎo)與肌內(nèi)給予相當(dāng)?shù)难尻?yáng)轉(zhuǎn)(體液抗體應(yīng)答增加3倍)需要以含有效粘膜佐劑(大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素，HLT)的噴霧給予兩次連續(xù)鼻內(nèi)接種。存在佐劑時(shí)鼻內(nèi)單次給予15μg HA(每種病毒株)，乃至不存在佐劑時(shí)給予兩次，都不能達(dá)到相同的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。流感抗原為病毒體形式，病毒體為由使用磷脂酰膽堿產(chǎn)生的脂質(zhì)雙層和提取自卵源流感病毒的病毒表面蛋白重新構(gòu)成。
其他研究者還運(yùn)用了使用兩次或多次鼻內(nèi)給予的構(gòu)思，以便嘗試獲得較高水平的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。Petrescu等(1979.Rev.Rom.Med-Virol.30，109-115)在兩周的時(shí)間內(nèi)兩次鼻內(nèi)給予滅活病毒(1000國(guó)際單位/接種劑量)。Oh等(1992 Vaccine 10，506-11)以一周的間隔給予4次鼻噴霧形式的片段疫苗，每次給予15μg HA(每種病毒株)(每次每個(gè)鼻孔0.25ml)。Kuno-Sakai等(1994 Vaccine 12，1303-1310)間隔一周給予兩次三倍于市售片段流感疫苗強(qiáng)度的氣溶膠滅活疫苗。
最近Muszkat等(2000 Vaccine 18，1696-9)給予老年患者兩次滅活完整流感病毒(每劑20μg A型病毒株和B型病毒株以及40μg另一種A型病毒株)鼻內(nèi)免疫，觀察到鼻內(nèi)給予的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)低于肌內(nèi)注射標(biāo)準(zhǔn)劑量市售滅活片段流感疫苗的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。
因此，1969至2000年間的文獻(xiàn)表明，盡管已廣泛研究了滅活流感疫苗鼻內(nèi)接種，但還沒(méi)有研究小組能夠通過(guò)鼻內(nèi)給予單劑疫苗獲得與肌內(nèi)或皮下注射相等的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。而且，為了獲得多次給予疫苗的超時(shí)效力，使用的抗原劑量已經(jīng)顯著高于每個(gè)接種者15μgHA(每種病毒株)的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)劑量。實(shí)際上，數(shù)據(jù)顯示需要多次給予，最好存在強(qiáng)免疫刺激劑，如大腸桿菌HLT。
Kimura等(1988.Acta Paediatr Jpn.30，601-3)證實(shí)，通過(guò)噴霧器給予兩劑滅活流感病毒和單劑皮下給予等效，但通過(guò)鼻內(nèi)噴霧給予兩劑效力低得多。霧化產(chǎn)生非常細(xì)小的噴霧，直達(dá)肺部。因此在公開(kāi)的臨床實(shí)驗(yàn)中還顯示，鼻噴霧可能無(wú)效，而霧化可能較好。
該文獻(xiàn)進(jìn)一步指出，鼻內(nèi)疫苗需要有效佐劑，更具體地說(shuō)是需要有效的免疫刺激劑。
例如，Gluck等(以上引用)證實(shí)，在沒(méi)有免疫刺激劑時(shí)鼻內(nèi)給予流感疫苗效力遠(yuǎn)低于有免疫刺激劑時(shí)。作者表明，即使兩次鼻內(nèi)給予沒(méi)有免疫刺激劑的疫苗，也不能誘導(dǎo)出與皮下給予獲得的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)相同的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。
Hashigucci等1996(Vaccine 14，113-9)證實(shí)，間隔四周鼻內(nèi)給予兩次以大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素及其B型-亞單位(LTB)為佐劑的片段流感疫苗，獲得50％的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率。在沒(méi)有佐劑時(shí)僅獲得31％的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。通常皮下給予產(chǎn)生75-90％的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。
因此，該文獻(xiàn)明確指出，為了使獲得的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)與常規(guī)流感疫苗相等，需要給予一次以上，另外所述疫苗應(yīng)當(dāng)用毒素作為佐劑。
現(xiàn)在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非活體流感病毒抗原可用于商業(yè)上可行的鼻內(nèi)流感疫苗。具體地說(shuō)，單次給予鼻內(nèi)流感病毒疫苗制品刺激保護(hù)水平的系統(tǒng)免疫。而且，這滿足有效流感疫苗的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。更具體地說(shuō)，鼻內(nèi)給予非活體流感病毒抗原制品產(chǎn)生的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)(抗HA滴度增加3倍)可以等同于皮下給予相同疫苗獲得的系統(tǒng)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。令人驚訝的是，提供給每個(gè)接種者的流感抗原劑量可顯著低于先有技術(shù)中指出的劑量。
以前還沒(méi)有報(bào)道過(guò)單次鼻內(nèi)給予標(biāo)準(zhǔn)劑量滅活流感病毒產(chǎn)生的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)與注射獲得的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)相同。
本發(fā)明首次提供鼻內(nèi)傳遞的單次給予流感疫苗。所述疫苗滿足上文陳述的流感疫苗的部分或全部歐盟標(biāo)準(zhǔn)，使得該疫苗可在歐洲批準(zhǔn)為商業(yè)性單劑疫苗。所述疫苗中提供的所述或全部流感病毒株優(yōu)選滿足三項(xiàng)歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的至少兩項(xiàng)。更優(yōu)選所有的病毒株都滿足至少兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，而所有的病毒株或至少除去其中一種的全部病毒株滿足第三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。最優(yōu)選所有的病毒株滿足全部三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供非活體流感病毒抗原制品在用于單劑鼻內(nèi)抗流感接種的疫苗制劑生產(chǎn)中的用途。該疫苗可以單劑形式或雙劑形式給予(通常為每個(gè)鼻孔一個(gè)亞劑量)。
另一方面，本發(fā)明提供低劑量非活體流感病毒抗原物質(zhì)在用于抗流感免疫的粘膜疫苗生產(chǎn)中的用途。
非活體流感病毒抗原制品優(yōu)選包含至少一種表面活性劑，其具體可為非離子表面活性劑。非離子表面活性劑優(yōu)選為選自以下的至少一種表面活性劑以及它們之中兩種或多種的組合辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如市售的TritonTM系列)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(TweenTM系列)和通式(I)的聚氧乙烯醚或酯
(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n為1-50，A為連接鍵或-C(O)-，R為C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
屬于式(I)的優(yōu)選表面活性劑分子其中的n為4-24，更優(yōu)選為6-12，而最優(yōu)選為9；其中的R部分為C1-50烷基，優(yōu)選為C4-C20烷基，而最優(yōu)選為C12烷基。
辛基苯氧基聚氧乙醇和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯描述于“表面活性劑系統(tǒng)”編輯Attwood和Florence(1983，Chapman和Hall)。辛基苯氧基聚氧乙醇(辛苯聚糖(octoxynol))，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100TM)，還描述于Merck Index Entry 6858(1162頁(yè)，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)。聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，包括聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween 80TM)，描述于Merck Index Entry 7742(1308頁(yè)，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)。這二者都可以使用其中描述的方法制備，或者由商業(yè)渠道(如Sigma Inc.)購(gòu)買。
特別優(yōu)選的非離子表面活性劑包括Triton X-45、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305、Triton N-57、Triton N-101、TritonN-128、Breij 35、聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)和聚氧乙烯-9-硬脂酰醚(steareth 9)。尤其優(yōu)選Triton X-100和laureth 9。還特別優(yōu)選聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween 80TM)。
通式(I)的其它合適的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
在CAS注冊(cè)中公開(kāi)了聚氧乙烯月桂基醚的替代術(shù)語(yǔ)或名稱。聚氧乙烯-9-月桂基醚的CAS注冊(cè)號(hào)為9002-92-0。聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂基醚描述于Merck Index(第12版索引項(xiàng)7717，Merck &Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)。laureth9通過(guò)將環(huán)氧乙烷和十二烷醇反應(yīng)形成，平均具有9個(gè)環(huán)氧乙烷單元。
表面活性劑中聚氧乙烯部分的長(zhǎng)度相對(duì)于烷基鏈長(zhǎng)度的比率(即n∶烷基鏈長(zhǎng)度的比率)影響該類表面活性劑在水性介質(zhì)中的溶解度。因此，本發(fā)明的表面活性劑可以為溶液形式，或者可以形成諸如膠束或小泡的微粒結(jié)構(gòu)。作為溶液，本發(fā)明的表面活性劑安全、易于除菌、給予簡(jiǎn)單，并可以不存在與形成均一顆粒結(jié)構(gòu)相關(guān)的GMP和QC爭(zhēng)議的簡(jiǎn)單方式生產(chǎn)。某些聚氧乙烯醚，如laureth 9，能夠形成無(wú)泡溶液。然而，聚氧乙烯-8棕櫚酰醚(C18E8)能夠形成小泡。因此，本發(fā)明的制劑可使用聚氧乙烯-8棕櫚酰醚小泡與至少一種其它非離子表面活性劑。
用于本發(fā)明的制劑的聚氧乙烯醚最好具有溶血活性?？蓞⒄找韵碌臏y(cè)定體外檢測(cè)聚氧乙烯醚的溶血活性，該活性表示為不能引起紅細(xì)胞裂解的表面活性劑最高濃度
1.用磷酸緩沖鹽水(PBS)以臺(tái)式離心機(jī)清洗豚鼠新鮮血液3次。重懸浮至原始體積后，再用PBS稀釋血液10倍。
2.將50μl的該血液懸浮液加入到含稀釋2倍的去污劑的800μlPBS中。
3. 8小時(shí)后，目測(cè)或通過(guò)檢測(cè)上清液的光密度評(píng)價(jià)溶血。存在于570 nm吸收光的紅色上清液表明存在溶血作用。
4.結(jié)果表示為不再發(fā)生溶血的第一個(gè)去污劑稀釋濃度。
在此生物測(cè)定的固有實(shí)驗(yàn)變異范圍內(nèi)，本發(fā)明的聚氧乙烯醚或通式(I)的表面活性劑具有的溶血活性優(yōu)選約為0.5-0.0001％，更優(yōu)選為0.05-0.0001％，甚至更優(yōu)選為0.005-0.0001％，而最優(yōu)選為0.003-0.0004％。理想的是，所述聚氧乙烯醚或酯應(yīng)當(dāng)具有類似于(即在10倍差異范圍內(nèi))聚氧乙烯-9月桂基醚或聚氧乙烯-8硬脂酰醚的溶血活性。
在本文描述的疫苗制劑中可存在所描述的不同種類表面活性劑中的兩種或多種非離子表面活性劑。具體地說(shuō)，優(yōu)選聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(如聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80TM))和辛苯聚糖(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton)X-100TM)的組合物。另一個(gè)特別優(yōu)選的非離子表面活性劑組合包括laureth 9和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯或辛苯聚糖或者這二者。
在最終疫苗制劑中存在的所述或每種非離子表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.001-20％，更優(yōu)選為0.01-10％，而最優(yōu)選最高約為2％(w/v)。在存在一種或兩種表面活性劑的情況下，它們存在于最終制劑中的濃度一般最高約每種2％，通常最高約每種0.6％?？纱嬖谝环N或多種其它的表面活性劑，濃度一般最高約每種1％，通常痕量最高約每種0.2％或0.1％。本發(fā)明的疫苗制劑中可存在任何表面活性劑混合物。
在最終疫苗組合物中的非離子表面活性劑(如以上論述的表面活性劑)的優(yōu)選濃度如下聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(如Tween 80TM)0.01-1％，最優(yōu)選約0.1％(w/v)；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如TritonX-100TM或其它Triton系列的去污劑)0.001-0.1％，最優(yōu)選0.005-0.02％(w/v)；通式(I)的聚氧乙烯醚(如laureth 9)0.1-20％，優(yōu)選0.1-10％，最優(yōu)選0.1-1％或約0.5％(w/v)。
對(duì)于某些疫苗制劑而言，制劑中可包括其它疫苗組分。因此，本發(fā)明的制劑也可以含有膽汁酸或其衍生物，尤其是其鹽形式。這些衍生物包括膽酸衍生物及其鹽，特別是膽酸或膽酸衍生物的鈉鹽。膽汁酸及其衍生物的實(shí)例包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬脫氧膽酸和衍生物，如上述膽汁酸的甘氨-、?；?、氨丙基-1-丙磺基-、氨丙基-2-羥基-1-丙磺基衍生物或N，N-雙(3D葡糖酸氨丙基)脫氧膽酰胺。特別優(yōu)選的實(shí)例是可存在于最終疫苗劑量中的脫氧膽酸鈉(NaDOC)。
本發(fā)明的制劑優(yōu)選為水溶液形式或無(wú)泡形式的懸浮液。這樣的制劑易于重復(fù)生產(chǎn)，還易于除菌(最后通過(guò)450或220nm孔徑膜過(guò)濾除菌)，并易于以噴霧形式給予鼻粘膜，而不降解所述佐劑的復(fù)合物理結(jié)構(gòu)。
用于本發(fā)明的非活體流感抗原制品可選自片段病毒抗原制品、亞單位疫苗(由完整病毒重組表達(dá)或制備)、可用例如甲醛、β-丙酸內(nèi)酯化學(xué)滅活或其它方式滅活(例如紫外滅活或熱滅活)的滅活完整病毒。所述抗原制品優(yōu)選為片段病毒制品或(特別是利用裂解方法，然后純化表面抗原)由完整病毒制備的亞單位抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗制劑含有與一種或多種非離子表面活性劑組合的片段流感病毒制品。所述一種或多種非離子表面活性劑可以是片段流感抗原制品產(chǎn)生過(guò)程中殘余物和/或之后加入到所述抗原制品中的表面活性劑。據(jù)信，存在非離子表面活性劑可穩(wěn)定片段流感抗原物質(zhì)，但顯然本發(fā)明不依賴于必須是這種情況。
另一方面，本發(fā)明提供非活體流感病毒抗原制品(優(yōu)選片段流感病毒制品)在未添加免疫刺激劑的單劑鼻內(nèi)流感疫苗生產(chǎn)中的用途。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，免疫刺激劑為能夠直接刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞的物質(zhì)，與僅能夠例如通過(guò)起抗原(當(dāng)與載體結(jié)合時(shí)其自身具有刺激作用)載體作用間接刺激免疫系統(tǒng)細(xì)胞的物質(zhì)相反。
在本發(fā)明的一個(gè)替代方面，所述制劑還包含佐劑或免疫刺激劑，包括霍亂毒素及其B型亞單位、任何來(lái)源的解毒脂質(zhì)A、脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物，包括US 4,912,094和GB 2,220,211描述的那些脂質(zhì)A無(wú)毒衍生物(包括單磷酰脂質(zhì)A和雙磷酰脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物，如3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)和3-脫氧-酰化雙磷酰脂質(zhì)A)、皂苷，如Quil A(得自南美Quillaja Saponaria Molina樹(shù)的樹(shù)皮)，以及它們的部分，包括QS21和QS17(US5,057,540；Kensil，C.R.，Crit RevTher Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55；EP 0 362 279 B1；Kensil等(1991，J.Immunology 146卷，431-437；WO 99/10008)和包含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸佐劑系統(tǒng)(如WO 96/02555所述)。
在本發(fā)明此方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑包含選自3D-MPL和雙磷酰脂質(zhì)A無(wú)毒衍生物的無(wú)毒脂質(zhì)A衍生物，尤其是3D-MPL。所述制劑更優(yōu)選包含3D-MPL以及如上定義的通式(I)的聚氧乙烯醚或酯(尤其是laureth 9)。
因此，本發(fā)明還提供包含3D-MPL和laureth 9組合物以及流感病毒抗原制品(特別是片段抗原制品)的疫苗。該疫苗盡管不是唯一的、但特別適于粘膜給予，包括本文描述的鼻內(nèi)給予。
按照本發(fā)明此方面優(yōu)選存在于所述制劑中的其它組分還包括非離子去污劑，諸如本文所述的辛苯聚糖和聚氧乙烯醚，尤其是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)；以及本文所述的膽汁鹽或膽酸衍生物，尤其是脫氧膽酸鈉或鵝脫氧膽酸鈉。因此，特別優(yōu)選的制劑包含可與流感病毒抗原制品組合的3D-MPL、laureth 9、Triton X-100、Tween 80和脫氧膽酸鈉，以提供適于粘膜或鼻內(nèi)應(yīng)用的疫苗。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)含混合的3D-MPL、laureth 9和流感病毒抗原制品的疫苗的方法，其中所述流感病毒抗原制品優(yōu)選為片段抗原制品，例如用于常規(guī)肌內(nèi)流感疫苗的片段抗原制品。
進(jìn)一方面，本發(fā)明提供含鼻內(nèi)噴霧裝置和單劑非活體流感病毒疫苗的藥盒。所述裝置優(yōu)選為用于兩個(gè)亞劑量疫苗的雙劑量傳遞裝置。
本發(fā)明的血細(xì)胞凝集素的低劑量最好為與目前市售流感疫苗的血細(xì)胞凝集素劑量相當(dāng)。因此，優(yōu)選的低劑量最好不超過(guò)約30μg血細(xì)胞凝集素(每種流感病毒株)，更優(yōu)選不超過(guò)約15μg。這通常等于約0.1-2μg/kg體重。本發(fā)明的低劑量疫苗優(yōu)選但不是必須作為單劑疫苗(例如以兩個(gè)亞劑量，每個(gè)鼻孔一個(gè)亞劑量)給予。
最好以小于常規(guī)注射片段流感疫苗(通常為0.5或1ml/劑)的體積提供本發(fā)明的疫苗劑量。本發(fā)明的低體積劑量?jī)?yōu)選低于500μl/劑，更優(yōu)選低于300μl/劑，而最優(yōu)選不超過(guò)約200μl/劑或更低的體積。當(dāng)給予兩個(gè)亞劑量時(shí)，每個(gè)亞劑量的優(yōu)選體積為以上提及的總劑量體積的一半。
因此，按照本發(fā)明的優(yōu)選疫苗劑量為在低體積中低抗原劑量的劑量，例如在約200μl體積中約15μg或約7.5μg HA(每種病毒株)。
本發(fā)明還提供預(yù)防患者流感感染或疾病的方法，所述方法包括經(jīng)粘膜表面給予所述患者單劑非活流感疫苗。
本發(fā)明進(jìn)一步提供預(yù)防患者流感感染或疾病的方法，所述方法包括經(jīng)粘膜表面給予所述患者低劑量的非活流感疫苗。
所述疫苗優(yōu)選鼻內(nèi)給予。
所述疫苗最優(yōu)選局部給予至鼻咽部位，最好不吸入肺中。理想的是使用鼻內(nèi)傳遞裝置，該裝置將疫苗制劑傳遞至鼻咽部位，沒(méi)有或基本沒(méi)有進(jìn)入肺部。
鼻內(nèi)給予本發(fā)明疫苗的優(yōu)選裝置為噴霧裝置。合適的市售鼻噴霧裝置包括AccusprayTM(Becton Dickinson)。霧化器產(chǎn)生非常細(xì)小霧滴，容易吸入到肺中，因此不能有效到達(dá)鼻粘膜。因此不優(yōu)選霧化器。
用于鼻內(nèi)用途的優(yōu)選噴霧裝置的性能與使用者施加的壓力無(wú)關(guān)。這些裝置稱為壓力域裝置。只有施加臨界壓力時(shí)才由噴嘴釋放液體。這些裝置更容易獲得液滴大小規(guī)則的噴霧。適用于本發(fā)明的壓力域裝置在本領(lǐng)域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP 311863 B和EP 516 636，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這樣的裝置可從Pfeiffer GmbH購(gòu)買，也描述于Bommer，R.PharmaceuticalTechnology Europe，1999年9月。
優(yōu)選的鼻內(nèi)裝置產(chǎn)生的液滴(使用水作為液體檢測(cè))范圍為1-200μm，優(yōu)選10-120μm。小于10μm存在吸入風(fēng)險(xiǎn)，因此理想的是10μm以下的液滴不超過(guò)約5％。120μm以上的液滴擴(kuò)散不如較小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超過(guò)約5％。
雙劑量傳遞是用于本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)傳遞系統(tǒng)的更優(yōu)選特征。雙劑量裝置包含單劑疫苗的兩個(gè)亞劑量，每個(gè)鼻孔給予一個(gè)亞劑量。一般來(lái)說(shuō)，兩個(gè)亞劑量存在于一個(gè)容器中，裝置的構(gòu)造允許每次有效傳遞單個(gè)亞劑量。或者，可使用單劑量裝置給予本發(fā)明疫苗。
再一個(gè)方面，本發(fā)明提供含有本文所述的鼻內(nèi)給予裝置的藥盒，所述裝置中裝有本發(fā)明的疫苗制劑。
本發(fā)明不一定限于噴霧傳遞液體制劑。本發(fā)明的疫苗可以其它形式(例如粉末)給予。
本發(fā)明的流感疫苗優(yōu)選為包含兩種或多種流感病毒株的多價(jià)流感疫苗。最優(yōu)選為包含三種病毒株的三價(jià)疫苗。常規(guī)流感疫苗包含三種流感病毒株，兩種A型病毒株和一種B型病毒株。然而，本發(fā)明不排除可能在例如大流行情況下有用的單價(jià)疫苗。單價(jià)大流行流感疫苗最可能含有單個(gè)A型病毒株的流感抗原。
可由常規(guī)胚胎化卵法產(chǎn)生非活體流感病毒制品，或者可由任何使用組織培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)病毒的新生代方法產(chǎn)生。適于培養(yǎng)病毒的細(xì)胞支持物包括例如犬腎細(xì)胞(如MDCK或MDCK克隆細(xì)胞、MDCK樣細(xì)胞)、猴腎細(xì)胞(諸如AGMK細(xì)胞，包括非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞)，或任何其它適于產(chǎn)生流感疫苗病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。合適的細(xì)胞培養(yǎng)支持物還包括人細(xì)胞，例如MRC-5細(xì)胞。合適的細(xì)胞培養(yǎng)支持物不限于細(xì)胞系；例如還包括原代細(xì)胞，如雞胚成纖維細(xì)胞。
可通過(guò)眾多商業(yè)上適用的方法中的任一種產(chǎn)生流感病毒抗原制品，所述方法例如專利號(hào)DD 300 833和DD 211 444(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述的片段流感法。使用溶劑/去污劑處理產(chǎn)生傳統(tǒng)的片段流感抗原制品，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚組合TweenTM(稱作“Tween-醚”裂解)，該方法仍在某些生產(chǎn)廠家中使用。目前使用的其它裂解劑包括去污劑或蛋白水解酶或膽汁鹽，例如專利號(hào)DD 155875(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述的脫氧膽酸鈉。可用作裂解劑的去污劑包括陽(yáng)離子去污劑，例如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；其它離子去污劑，例如十二烷基硫酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽；或非離子去污劑，如上述非離子去污劑，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的工藝中)和Triton N-101；或者任何兩種或多種去污劑的組合物。
其它可用于產(chǎn)生片段流感病毒制品的合適裂解劑包括
1.膽汁酸及其衍生物包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬脫氧膽酸和衍生物，如上述膽汁酸的甘氨-、?；?、氨丙基-1-丙磺基-、氨丙基-2-羥基-1-丙磺基-衍生物或N，N-雙(3D葡糖酸氨丙基)脫氧膽酰胺。具體的實(shí)例是可以痕量存在于最終疫苗劑量中的脫氧膽酸鈉(NaDOC)。
2.烷基糖苷或烷基硫糖苷，其中烷基鏈為C6-C18，通常為C8-C14，糖部分為任何戊糖或己糖或其具有不同連接的組合，如1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。烷基鏈可為飽和、不飽和和/或支鏈。
3.以上2的衍生物，其中一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選6個(gè))羥基被修飾，例如酯、乙氧基化物、硫酸鹽、醚、碳酸鹽、磺基琥珀酸鹽、羥乙基磺酸鹽、醚羧酸鹽、季銨化合物。
4.酰糖，其中?；湠镃6-C18，通常為C8-C12，糖部分為任何戊糖或己糖或其具有不同連接的組合，如1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。?；溈蔀轱柡突虿伙柡秃?或支鏈、環(huán)鏈或非環(huán)鏈，具有或不具有一個(gè)或多個(gè)雜原子，例如N、S、P或O。
5.結(jié)構(gòu)為R-N，N-(R1，R2)-3-氨基-1-丙磺酸鹽的磺基甜菜堿，其中R為C6-C18的任意烷基鏈或芳烷基鏈，通常為C8-C16。烷基鏈R可為飽和、不飽和和/或支鏈。R1和R2優(yōu)選為C1-C4的烷基鏈，通常為C1，或者R1、R2可與氮一起形成雜環(huán)。
6.結(jié)構(gòu)為R-N，N-(R1，R2)-甘氨酸的甜菜堿，其中R為C6-C18的任意烷基鏈，通常為C8-C16。烷基鏈可為飽和、不飽和和/或支鏈。R1和R2優(yōu)選為C1-C4的烷基鏈，通常為C1，或者R1、R2可與氮一起形成雜環(huán)。
7.結(jié)構(gòu)為R-(N-R1)-葡糖酰胺的N，N-雙烷基-葡糖酰胺，其中R為C6-C18的任意烷基鏈，通常為C8-C12。烷基鏈可為飽和、不飽和和/或支鏈或環(huán)鏈。R1和R2為C1-C6的烷基鏈，通常為C1。糖部分可修飾為戊糖或己糖。
8.結(jié)構(gòu)為R，-N+(-R1，-R2，-R3)的季銨鹽化合物，其中R為C6-C20的任意烷基鏈，通常為C20。烷基鏈可為飽和、不飽和和/或支鏈。R1、R2和R3優(yōu)選為C1-C4的烷基鏈，通常為C1，或者R1、R2可與氮一起形成雜環(huán)。具體的實(shí)例為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。
片段疫苗的制備方法包括許多不同的過(guò)濾和/或其它分離步驟，如各種組合的超離心、超濾、區(qū)帶離心和層析(例如離子交換)步驟，以及任選滅活步驟，例如可在裂解前或后用甲醛或β-丙酸內(nèi)酯或紫外線滅活。裂解過(guò)程可以分批、連續(xù)或半連續(xù)形式進(jìn)行。
諸如脫氧膽酸鈉的膽汁酸鹽，優(yōu)選以痕量存在于本發(fā)明的片段疫苗制劑中，存在的濃度優(yōu)選不超過(guò)0.05％，或不超過(guò)約0.01％，更優(yōu)選約為0.0045％(w/v)。
盡管可在制備片段抗原之后加入Tween 80和/或Triton X-100或者調(diào)節(jié)它們的濃度，但本發(fā)明的片段流感疫苗抗原制品優(yōu)選包含生產(chǎn)過(guò)程中剩余的殘量Tween 80和/或Triton X-100。Tween 80和TritonX-100最好都存在。這些非離子表面活性劑在疫苗劑量中的優(yōu)選最終濃度范圍為
Tween 800.01-1％，更優(yōu)選約0.1％(w/v)。
Triton X-1000.001-0.1％(w/v)，更優(yōu)選0.005-0.02％(w/v)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這兩種表面活性劑以低濃度組合存在促進(jìn)所述抗原在溶液中的穩(wěn)定性。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性可能使得所述抗原的鼻內(nèi)免疫原性比以前的制劑更強(qiáng)。這種增強(qiáng)作用可能由普遍存在的小抗原凝集或抗原天然構(gòu)型增強(qiáng)引起。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明與這種理論上正確的解釋無(wú)關(guān)。
還有證據(jù)顯示，對(duì)于片段流感病毒制品，存在結(jié)合或包含病毒蛋白(特別是HA)的完整片段流感病毒可維持抗原提呈和有助于誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。因此，片段流感病毒是精選用于本發(fā)明各個(gè)方面的抗原。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，優(yōu)選的片段病毒制品還含有l(wèi)aureth 9，優(yōu)選濃度范圍為0.1-20％，更優(yōu)選為0.1-10％，而最優(yōu)選為0.1-1％(w/v)。
本發(fā)明的疫苗一般含有不超過(guò)25％(w/v)的去污劑或表面活性劑，優(yōu)選少于15％，最優(yōu)選不超過(guò)約2％。
另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)鼻內(nèi)應(yīng)用的流感疫苗的方法，該方法包括
(i)提供基本如常規(guī)注射(例如肌肉)流感疫苗一樣產(chǎn)生的片段流感病毒制品，其含有至少一種非離子表面活性劑；
(ii)任選調(diào)節(jié)所述制品中血細(xì)胞凝集素的濃度和/或非離子表面活性劑的濃度；
(iii)用疫苗劑量的片段流感病毒制品裝填鼻內(nèi)傳遞裝置，所述劑量的體積適于鼻內(nèi)給予，可選為雙劑量形式。
按照本發(fā)明此方面的方法中的進(jìn)一步任選步驟包括加入吸附增強(qiáng)型表面活性劑，如laureth 9；和/或加入佐劑，如無(wú)毒脂質(zhì)A衍生物，特別是3D-MPL。
生產(chǎn)常規(guī)注射滅活流感疫苗的方法是眾所周知的，并已在文獻(xiàn)中描述。可對(duì)這些方法進(jìn)行改良，例如通過(guò)在疫苗最后除菌過(guò)濾之前加入濃縮步驟，以產(chǎn)生用于本發(fā)明的單劑粘膜疫苗，因?yàn)楸莾?nèi)疫苗使用的疫苗制劑體積最好比注射疫苗小?；蛘?，可通過(guò)加入將其它組分(例如非離子表面活性劑)濃度調(diào)節(jié)至對(duì)本發(fā)明的鼻內(nèi)疫苗合適的百分比(w/v)的步驟，改良所述方法。然而，疫苗的活性成分，即流感抗原，可與常規(guī)肌內(nèi)疫苗和本發(fā)明的單劑鼻內(nèi)疫苗基本相同。
本發(fā)明的疫苗制劑當(dāng)以單劑疫苗給予時(shí)，優(yōu)選不包括所有病毒株未滿足歐盟標(biāo)準(zhǔn)中至少兩項(xiàng)的制劑。
現(xiàn)在以下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1-制備片段流感疫苗
按照以下步驟制備單價(jià)片段疫苗。制備病毒接種物
在接種胚胎化卵當(dāng)天，通過(guò)混合工作批種子(working seed lot)與含0.5mg/ml硫酸慶大霉素和25μg/ml氫化可的松(取決于病毒株)的磷酸緩沖鹽水，制備新鮮接種物。將病毒接種物保持在2-8℃。接種胚胎化卵
使用9-11天齡的胚胎化卵進(jìn)行病毒復(fù)制。對(duì)蛋殼消毒。用0.2ml所述病毒接種物接種雞胚。于合適的溫度(取決于病毒株)培養(yǎng)接種雞胚48-96小時(shí)。在培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，通過(guò)冷凍處死雞胚，并將雞胚儲(chǔ)存于2-8℃12-60小時(shí)。收獲
收獲冷凍胚胎化卵中的尿囊液。通常，每個(gè)雞胚收集8-10ml粗品尿囊液?？蛇x地向粗品單價(jià)病毒原液中加入0.100mg/ml硫柳汞。由尿囊液濃縮和純化完整病毒1.澄清
通過(guò)中速離心(范圍4000-14000g)澄清收獲的尿囊液。2.吸附步驟
為了獲得澄清的病毒合并液的CaHPO4膠體，加入0.5mol/L的Na2HPO4和0.5mol/L的CaCl2溶液，以使CaHPO4的終濃度達(dá)到1.5g-3.5g CaHPO4/L(取決于病毒株)。
沉降至少8小時(shí)后，去除上清液，根據(jù)使用的CaHPO4量通過(guò)加入0.26mol/L EDTA-Na2溶液，重溶解含流感病毒的沉淀。3.過(guò)濾
用6μm濾膜過(guò)濾重懸浮的沉淀。4.蔗糖梯度離心
以含100μg/ml硫柳汞的線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))通過(guò)等密度離心濃縮流感病毒。流速為8-15L/小時(shí)。
在離心結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)子內(nèi)容物回收為四種不同的組分(用折光儀檢測(cè)蔗糖)
- 組分155-52％蔗糖
- 組分2約52-38％蔗糖
- 組分338-20％蔗糖*
- 組分420-0％蔗糖
*取決于病毒株組分3可降低至15％蔗糖。
為進(jìn)一步制備疫苗，只使用組分2和3。
用磷酸鹽緩沖液經(jīng)透析清洗組分3，以便將蔗糖含量降低至約6％以下。沉淀存在于該稀釋組分中的流感病毒，以去除可溶性雜質(zhì)。
重懸浮沉淀，并徹底混合，以獲得均一懸浮液。合并組分2和組分3的重懸浮沉淀，加入磷酸鹽緩沖液，得到約40L的體積。該產(chǎn)物為單價(jià)完整病毒濃縮液。5.用脫氧膽酸鈉進(jìn)行蔗糖梯度離心
對(duì)單價(jià)完整流感病毒濃縮液進(jìn)行ENI-Mark II超離心。K3轉(zhuǎn)子含有線性蔗糖梯度(0.55％(w/v))，在該梯度中另外覆蓋脫氧膽酸鈉梯度。在裂解期間存在的Tween 80最高為0.1％(w/v)。最大脫氧膽酸鈉濃度為0.7-1.5％(w/v)，并取決于病毒株。流速為8-15L/小時(shí)。
在離心結(jié)束時(shí)，以三種不同組分(用折光儀險(xiǎn)測(cè)蔗糖)回收轉(zhuǎn)子內(nèi)容物。組分2用于進(jìn)一步加工。組分的蔗糖含量根據(jù)病毒株有限度(47-18％)變化，在評(píng)價(jià)后固定6.除菌過(guò)濾
最后以0.2μm濾膜過(guò)濾片段病毒組分。使用含0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋。過(guò)濾的組分2的終體積為原始組分體積的5倍。7.滅活
于22±2℃溫育過(guò)濾的單價(jià)物質(zhì)至多84小時(shí)(取決于病毒株，該溫育過(guò)程可縮短)。然后加入含0.025％Tween 80的磷酸鹽緩沖液，以便將總蛋白含量降低至最高250μg/ml。加入甲醛至終濃度為50μg/ml，于20±2℃滅活至少72小時(shí)。8.超濾
用裝備20kDa截流分子量(MWCO)醋酸纖維素膜的超濾裝置將滅活的片段病毒物質(zhì)濃縮至少2倍。隨后用含0.025％(w/v)Tween 80的磷酸鹽緩沖液清洗所述物質(zhì)，此后用含0.01％(w/v)Tween的磷酸緩沖鹽溶液清洗。9.最終除菌過(guò)濾
將超濾后的物質(zhì)在具有0.2μm膜的過(guò)濾膜終端上過(guò)濾。經(jīng)SRD(WHO推薦方法)檢測(cè)的血細(xì)胞凝集素終濃度應(yīng)當(dāng)超過(guò)450μg/ml。10.儲(chǔ)存
將單價(jià)終原液儲(chǔ)存于2-8℃，最多18個(gè)月。純度
通過(guò)考馬斯染色的聚丙烯酰胺凝膠的O.D.掃描測(cè)定純度。人工測(cè)定峰值。樣品結(jié)果示于表1
表1
1＝100％減去所有未鑒定的峰值實(shí)施例2-由疫苗原液制備疫苗劑量
通過(guò)由單價(jià)原液配制三價(jià)疫苗，制備最終的疫苗，去污劑濃度根據(jù)需要調(diào)節(jié)。
混合注射用水、濃縮10倍的PBS pH7.4、Tween 80和Triton X-100，以獲得需要的最終濃度(PBS濃縮1倍，Tween 80 0.15％和TritonX-100 0.02％)。加入以下的三種滅活片段病毒體，每次加入之間攪拌10分鐘
30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)
30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)
30μg HA B/Harbin/7/94
攪拌15分鐘后調(diào)節(jié)pH至7.2+/-0.2。
劑量體積為200μl。
在用laureth 9配制的疫苗中，加入laureth 9，然后調(diào)節(jié)pH獲得0.5％(w/v)的終濃度。實(shí)施例3-用于檢測(cè)抗體應(yīng)答的方法1.通過(guò)ELISA檢測(cè)人鼻分泌物中的特異性抗流感IgA和總IgA人鼻分泌物的收集方法
將兩條棉拭子涂抹志愿者的下鼻甲(每個(gè)鼻孔一個(gè))。棉拭子在鼻中保留1分鐘之后，放入2ml的0.9％NaCl、1％BSA和0.1％疊氮化鈉(防腐緩沖液)中。所有的樣品都在冰上保持2小時(shí)。然后擠壓棉拭子回收抗體。離心(10分鐘，2000g，4℃)后，收集所有的流體樣品，等分并于-20℃冷凍，直至測(cè)試日。在400μl生理鹽水中懸浮沉淀，顯微鏡觀察血細(xì)胞污染。使用鼻棉拭子收集人鼻分泌物并進(jìn)行處理，然后用兩種不同的ELISA對(duì)總IgA和特異性抗流感IgA進(jìn)行檢測(cè)檢測(cè)總IgA的捕獲ELISA
用固定在微量滴定板上的抗人IgA多克隆抗體親和純化Ig捕獲總IgA，隨后使用偶合過(guò)氧化物酶的不同多克隆抗人IgA親和純化Ig進(jìn)行檢測(cè)。
將純化的人sIgA用作標(biāo)準(zhǔn)，以便可以定量分析收集的鼻分泌物中的sIgA。
3個(gè)純化的人sIgA的參比在該測(cè)定中用作低、中和高參比。檢測(cè)特異性抗流感IgA的直接ELISA
進(jìn)行三個(gè)不同的ELISA，所述疫苗制劑中存在的每種流感病毒株都對(duì)應(yīng)一個(gè)ELISA。
用包被在微量滴定板上的片段滅活流感抗原捕獲特異性抗流感IgA，隨后使用偶合過(guò)氧化物酶的不同多克隆抗人IgA親和純化Ig進(jìn)行檢測(cè)，該Ig與用于總IgA ELISA的Ig相同。試劑生物試劑
- 山羊抗人IgA親和純化Ig(Sigma I-0884)
- 純化的人分泌性IgA(ICN-Cappel 55905)(總IgA定量分析標(biāo)
準(zhǔn))
- 人分泌性IgA(Colostrum)(Biogenesis 5111-5504)(總IgA參
比，Bio)，稀釋獲得低、中和高參比
- 純化的人IgA(Sigma I-1010)(總IgA參比，Sig)
- 特異性抗流感ELISA的陰性參比(合并針對(duì)3種病毒株的應(yīng)
答為不可檢測(cè)水平的鼻分泌物；取舍值＝0.6 OD450nm)
- 特異性抗流感ELISA的陽(yáng)性低參比(合并針對(duì)3種病毒株的
應(yīng)答為低檢測(cè)水平的鼻分泌物)
- 特異性抗流感ELISA的陽(yáng)性中參比(合并針對(duì)3種病毒株的
應(yīng)答為中等檢測(cè)水平的鼻分泌物；取舍值＝0.6 OD)
- 山羊抗人IgA血清親和純化HRP綴合(ICN 674221)
- 得自片段失活雞胚的抗原A/Beijing/262/95 H1N1
- 得自片段失活雞胚的抗原A/Sydney/5/97 H3N2
- 得自片段失活雞胚的抗原B/Harbin/7/94試劑配制
- 飽和緩沖液(PBS，Tween 20 0.1％，BSA 1％，NCS 4％)
- NaCl T20(NaCl 9g/l，Tween 20 0.05％)方法總?cè)薎gA檢測(cè)
- 以100μl孔加入山羊多克隆抗人IgA的DPBS溶液(1μg/ml)，
并于4℃溫育過(guò)夜。
- 以200μl/孔加入飽和緩沖液，并于37℃溫育1小時(shí)。
- 在第一行加入標(biāo)準(zhǔn)IgA在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液，由
250ng/ml下降至0.12ng/ml，100μl/孔。
- 在其它行加入樣品(鼻液)在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液，
由1/100下降至1/102400，100μl/孔，在第十二列加入100μl
飽和緩沖液，并于22℃溫育2小時(shí)。
- 用NaCl T20清洗所述板4次。
- 加入在飽和緩沖液中稀釋10000倍的綴合過(guò)氧化物酶的山羊
抗人IgA，100μl/孔，并于22℃溫育1.5小時(shí)。
- 用NaCl T20清洗所述板4次。
- 加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)，100μl/孔，并于室溫在黑暗中溫
育10分鐘。
- 以100μl/孔加入0.4 N H2SO4終止反應(yīng)。
- 使用分光光度計(jì)檢測(cè)每塊板于450nm的吸光度(OD)，參比
檢測(cè)波長(zhǎng)為630nm。特異性抗流感IgA檢測(cè)
- 加入每種流感病毒株的DPBS溶液(1μg/ml)，100μl/孔，并
于4℃過(guò)夜溫育。
- 每孔加入200μl的飽和緩沖液，并于37℃溫育1小時(shí)。
- 加入所述樣品在飽和緩沖液中的兩倍稀釋液，由1/5下降至
1/640，100μl/孔，并于22℃溫育2小時(shí)。
- 用NaCl T20清洗所述板4次。
- 加入在飽和緩沖液中稀釋10000倍的綴合過(guò)氧化物酶的山羊
抗人IgA，100μl/孔，并于22℃溫育1.5小時(shí)。
- 用NaCl T20中清洗所述板4次。
- 加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)，100μl/孔，并于室溫在黑暗中溫
育10分鐘。
- 以100μl/孔加入0.4 N H2SO4終止反應(yīng)。
- 使用分光光度計(jì)檢測(cè)每塊板于450nm的吸光度(OD)，參比
檢測(cè)波長(zhǎng)為630nm。結(jié)果-表達(dá)與計(jì)算總IgA表達(dá)
使用Softmaxpro程序，將結(jié)果表示為1ml鼻液中的總IgA的μg數(shù)。特異性抗流感IgA表達(dá)
結(jié)果表示為終點(diǎn)單位滴度，以產(chǎn)生高于取舍值(OD450nm＝0.6)的OD450nm的最高稀釋度的倒數(shù)計(jì)算。
取舍值定義為1/5稀釋度的陰性對(duì)照(參見(jiàn)驗(yàn)證方案)的最高光密度。因此，可以5終點(diǎn)單位作為對(duì)應(yīng)于取舍值的終點(diǎn)單位滴度的檢測(cè)界限。滴度≤5終點(diǎn)單位的樣品判為陰性，而滴度＞5終點(diǎn)單位的樣品判為陽(yáng)性。
樣品的最終結(jié)果如下表示
通過(guò)計(jì)算特異性應(yīng)答和總IgA濃度的比率終點(diǎn)單位/μg總IgA(文獻(xiàn)中最常使用的計(jì)算方法)，歸一化特異性應(yīng)答。2.流感特異性血清抗體的血細(xì)胞凝集抑制(HAI)活性
用200μl RDE(受體破壞酶)于37℃處理血清(50μl)16小時(shí)。用150μl 2.5％檸檬酸鈉終止反應(yīng)，并于56℃、30分鐘使血清滅活。通過(guò)加入100μl PBS配制1∶10稀釋液。然后，在96孔板(V底)中通過(guò)用25μl PBS稀釋25μl血清(1∶10)配制2倍稀釋系列。向每孔中加入25μl參比抗原，濃度為4血細(xì)胞凝集單位/25μl。使用微量滴定板震蕩器混合抗原和抗血清稀釋液，并于室溫溫育60分鐘。然后加入50μl雞紅細(xì)胞(RBC)(0.5％)，讓RBC于室溫沉降1小時(shí)。HAI效價(jià)相當(dāng)于完全抑制病毒誘導(dǎo)型血細(xì)胞凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)。實(shí)施例4-鼻內(nèi)片段流感疫苗與獲準(zhǔn)的常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)在健康成年受試者中的免疫原性比較用于研究的制劑
評(píng)價(jià)兩個(gè)得自雞胚的片段流感抗原制劑(A、B)。A是鼻內(nèi)制劑，而B(niǎo)是肌內(nèi)給予的FluarixTM/α-Rix。所述制劑含有三種由WHO推薦的1998/1999流感季節(jié)病毒株制備的滅活片段病毒體抗原。
用于給予所述疫苗的裝置為Becton Dickson的AccusprayTM鼻內(nèi)噴射器。該裝置的工作原理同常規(guī)噴射器相似，但其具有一個(gè)帶螺旋通道的專用噴嘴，該噴嘴甚至在壓力施加于活塞上時(shí)也產(chǎn)生噴霧。該裝置裝填200μl疫苗制劑，每個(gè)鼻孔噴入100μl A制劑。制劑組成
鼻內(nèi)制劑(A)含有以下的滅活片段病毒體
1. 30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)
2. 30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)
3. 30μg HA B/Harbin/7/94以及磷酸緩沖鹽水pH7.4±0.1、0.1％的Tween 80、0.015％的TritonX-100、0.0045％的脫氧膽酸鈉和小于35μg/ml的硫柳汞。
一劑的體積為200μl(每個(gè)鼻孔100μl亞劑量)。
對(duì)比的FluarixTM/α-Rix為SmithKline Beecham Biological銷售的滅活三價(jià)片段流感疫苗。肌內(nèi)給予500μl的劑量。
該劑量包含
15μg上述三種病毒株HA、500-1000μg/ml的Tween 80(0.05％-0.1％)、50-170μg/ml的Triton X-100(0.005％-0.017％)、最大100μg/ml的脫氧膽酸鈉、100μg/ml的硫柳汞和磷酸緩沖鹽水pH6.8-7.5。免疫原性研究
一個(gè)開(kāi)放性對(duì)照隨機(jī)化研究評(píng)價(jià)了用Tween 80和Triton X-100配制的鼻內(nèi)片段流感疫苗相比于常規(guī)胃腸外疫苗(即FluarixTM)的免疫原性。20個(gè)健康成年受試者(年齡18-40歲)接受一劑FluarixTM，而10個(gè)受試者接受一劑鼻內(nèi)流感疫苗。鼻內(nèi)制劑(200μl)含以下的滅活病毒體30μg A/Beijing/262/95(H1N1)血細(xì)胞凝集素、30μgA/Sydney/5/97(H3N2)血細(xì)胞凝集素、30μg B/Harbin/7/94血細(xì)胞凝集素以及磷酸緩沖鹽水(pH7.4±0.1)、Tween 80(0.1％)、Triton X-100(0.015％)、脫氧膽酸鈉(0.0045％)和硫柳汞(＜35μg/ml)。
對(duì)要求的局部和全身癥狀隨訪8天，兩種疫苗在安全性和反應(yīng)性方面都良好耐受。沒(méi)有與接種相關(guān)的嚴(yán)重副反應(yīng)事件的報(bào)告。
通過(guò)評(píng)價(jià)血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)滴度檢測(cè)所述疫苗的免疫原性，以測(cè)定血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率(定義為第21天相比于第0天每種疫苗株的血清HI滴度增加至少3倍的接種者百分率)、轉(zhuǎn)化系數(shù)(定義為第21天相比于第0天每種疫苗株的血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍數(shù))和血清保護(hù)率(定義為在公認(rèn)保護(hù)的(每種疫苗株)接種后血清HI滴度≥40的接種者百分率)。另外，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)評(píng)價(jià)粘膜IgA抗體反應(yīng)。
由表2可知一劑FluarixTM或所述鼻內(nèi)制劑接種后21天的HI血清陽(yáng)性率、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和血清保護(hù)率。由表2a可知轉(zhuǎn)化系數(shù)。
表2
1劑接種后21天的HI血清陽(yáng)性率、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和血清保護(hù)率
血清陽(yáng)性(n，％)滴度≥10的受試者的數(shù)目和百分率
血清保護(hù)(n，％)滴度≥40的受試者的數(shù)目和百分率
血清陽(yáng)轉(zhuǎn)(n，％)由第0天至第21天滴度增加至少3倍的受試者的數(shù)目和百分率
在所有情況下，轉(zhuǎn)化系數(shù)(接種后血清HI GMT的增加倍數(shù))都大于2.5(成功流感疫苗必須的水平)。
由表3可知第21天與第0天(1劑)的特異性/總粘膜IgA抗體比率增加1倍或3倍的受試者百分率。
表3
第21天與第0天(1劑)的特異性/總IgA比率增加1倍或3倍的受試者百分率總結(jié)
以上表格列出的免疫原性結(jié)果顯示，一劑接種后21天鼻內(nèi)制劑產(chǎn)生的血清陽(yáng)性、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)和血清保護(hù)水平與常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)相似。一劑接種后鼻內(nèi)制劑產(chǎn)生的粘膜IgA應(yīng)答好于常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)。實(shí)施例5-用laureth 9、Triton X-100和Tween 80配制的鼻內(nèi)片段流感疫苗與獲準(zhǔn)的常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)在健康成年受試者中的免疫原性比較。
評(píng)價(jià)并比較用laureth 9、Triton X-100和Tween 80配制的得自雞胚的片段流感抗原鼻內(nèi)制劑(A)和FluarixTM/α-Rix(B)。所述制劑含有三種由WHO推薦的1998/1999流感季節(jié)病毒株制備的滅活片段病毒體抗原。用于給予所述疫苗的裝置為Becton Dickson的AccusprayTM鼻內(nèi)噴射器。該裝置的工作原理同常規(guī)噴射器相似，但其具有一個(gè)帶螺旋通道的專用噴嘴，該噴嘴甚至在壓力施加于活塞上時(shí)也產(chǎn)生噴霧。每個(gè)鼻孔噴入100μl所述制劑。制劑組成
鼻內(nèi)制劑(A)含有以下的滅活片段病毒體
1. 30μg A/Beijing/262/95(H1N1)HA
2. 30μg A/Sydney/5/97(H3N2)HA
3. 30μg B/Harbin/7/94 HA以及磷酸緩沖鹽水pH7.4±0.1、0.1％的Tween 80、0.015％的TritonX-100、0.0045％的脫氧膽酸鈉和小于35μg/ml的硫柳汞。
一劑的體積為200μl(每個(gè)鼻孔100μl亞劑量)。制劑A用laureth配制，以獲得0.5％(w/v)的終濃度。
對(duì)比的FluarixTM/α-Rix(B)為SmithKline Beecham Biological銷售的滅活三價(jià)片段流感疫苗，其以500μl的劑量肌內(nèi)給予。免疫原性研究
一個(gè)開(kāi)放性對(duì)照隨機(jī)研究評(píng)價(jià)了用laureth 9補(bǔ)加Tween 80和Triton X-100配制的鼻內(nèi)片段流感疫苗相比于常規(guī)胃腸外疫苗(即FluarixTM)的免疫原性。20個(gè)健康成年受試者(年齡18-40歲)接受一劑FluarixTM，而10個(gè)受試者接受一劑(兩個(gè)亞劑量，每個(gè)鼻孔一個(gè)亞劑量)鼻內(nèi)流感疫苗。
對(duì)要求的局部和全身癥狀隨訪8天，兩種疫苗在安全性和反應(yīng)性方面都良好耐受。沒(méi)有與接種相關(guān)的嚴(yán)重副反應(yīng)事件的報(bào)告。
通過(guò)評(píng)價(jià)血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)滴度檢測(cè)所述疫苗的免疫原性，以測(cè)定血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率(定義為第21天相比于第0天每種疫苗株的血清HI滴度增加至少3倍的接種者百分率)、轉(zhuǎn)化系數(shù)(定義為第21天相比于第0天每種疫苗株的血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍數(shù))和血清保護(hù)率(定義為在公認(rèn)保護(hù)的(每種疫苗株)接種后血清HI滴度≥40的接種者百分率)。另外，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)評(píng)價(jià)粘膜IgA抗體反應(yīng)。
由表4可知一劑FluarixTM或所述鼻內(nèi)制劑接種后21天的HI血清陽(yáng)性率、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和血清保護(hù)率。
表41劑接種后21天的HI血清陽(yáng)性率、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和血清保護(hù)率
血清陽(yáng)性(n，％)滴度≥10的受試者的數(shù)目和百分率
血清保護(hù)(n，％)滴度≥40的受試者的數(shù)目和百分率
血清陽(yáng)轉(zhuǎn)(n，％)由第0天至第21天滴度增加至少3倍的受試者的數(shù)目和百分率
在所有情況下，轉(zhuǎn)化系數(shù)(疫苗接種后血清HI GMT的增加倍數(shù))都大于2.5(成功流感疫苗必須的水平)。
由表5可知第21天與第0天(1劑)的特異性/總粘膜IgA抗體比率增加1倍或3倍的受試者百分率。表5第21天與第0天(1劑)的特異性/總IgA比率增加1倍或3倍的受試者百分率。總結(jié)
以上表格列出的免疫原性結(jié)果顯示，一劑接種后21天鼻內(nèi)制劑產(chǎn)生的血清陽(yáng)性、血清陽(yáng)轉(zhuǎn)和血清保護(hù)水平與常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)相似。一劑接種后鼻內(nèi)制劑產(chǎn)生的粘膜IgA應(yīng)答一般好于常規(guī)胃腸外疫苗(FluarixTM)。實(shí)施例6-用接觸過(guò)抗原的小鼠評(píng)價(jià)有和沒(méi)有l(wèi)aureth 9+3D-MPL的鼻內(nèi)流感疫苗6.1.在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用侯選制劑接種小鼠，所述侯選制劑含有與用于小鼠初免的抗原相同的流感病毒株。實(shí)驗(yàn)步驟
在第0天用β-丙酸內(nèi)酯滅活的得自雞胚的三價(jià)完整流感病毒A/Beijing/262/95、A/Sydney/5/97和B/Harbin/7/94(5μg HA/病毒株)鼻內(nèi)“初免”雌性Balb/c小鼠(8周齡)，以便模擬在人類發(fā)生的天然初免。
28天后，用以下的三價(jià)疫苗制劑鼻內(nèi)接種小鼠(每組10只小鼠)，所述三價(jià)疫苗制劑含有與用于初免的抗原相同的病毒株
給予小鼠的鼻內(nèi)疫苗制劑類似于實(shí)施例7中給予人的制劑，只是給予小鼠的劑量相當(dāng)于給予人的劑量的1/10。
在第42天收集血清樣品，并測(cè)試其血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體。處死后(第42天)，進(jìn)行鼻部清洗，并通過(guò)ELISA測(cè)試IgA抗體滴度。以終點(diǎn)滴度(EPT)檢測(cè)特異性IgA抗體，結(jié)果表示為特異性IgA EPT/μg總IgA，以便排除任何由取樣方法造成的差異。結(jié)果
研究的第一個(gè)目的是證實(shí)鼻內(nèi)疫苗制劑能夠使激發(fā)的血清HI滴度與胃腸外給予產(chǎn)生的血清HI滴度無(wú)顯著差異。

圖1顯示了在第42天(即接種后第14天)于血清中觀測(cè)到的各種疫苗的HI滴度。
對(duì)觀測(cè)的HI滴度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Tukey-HSD統(tǒng)計(jì)比較分析)，以便比較所述鼻內(nèi)疫苗和胃腸外疫苗。對(duì)于三種流感病毒株中的兩種(A/H1N1和B型病毒株)而言，由普通疫苗1和2組觀測(cè)到的HI滴度顯著不同于(p＜0.05)由胃腸外疫苗誘導(dǎo)的HI滴度?？?A/H3N2病毒株滴度無(wú)顯著差異。對(duì)三種病毒株中的兩種(A/H3N2和B型病毒株)而言，L9制劑的免疫原性與胃腸外疫苗相同。相反，L9+MPL配制的疫苗激發(fā)的抗三種流感病毒株的HI抗體的滴度與用胃腸外疫苗觀測(cè)到的HI抗體滴度無(wú)顯著差異。
第二個(gè)目的是確定鼻內(nèi)接種的鼻部IgA應(yīng)答是否優(yōu)于在肌內(nèi)加強(qiáng)免疫動(dòng)物中觀測(cè)到的IgA應(yīng)答。圖2圖示加強(qiáng)接種后第14天(第42天)記錄到的鼻部IgA應(yīng)答。
任一種鼻內(nèi)制劑誘導(dǎo)的應(yīng)答之間不存在顯著差異。鼻內(nèi)給予激發(fā)的應(yīng)答比胃腸外途徑高1-3倍。最后，用L9+MPL配制的疫苗能夠維持與其它鼻內(nèi)疫苗相同的應(yīng)答水平，但抗原劑量較低。結(jié)論
依據(jù)HI抗體應(yīng)答的結(jié)果，用L9+MPL配制的三價(jià)片段流感抗原(0.75μg HA+0.5％Laureth 9+5μg MPL)是免疫原性最強(qiáng)的鼻內(nèi)疫苗制劑。
所有測(cè)試的鼻部傳遞疫苗在誘導(dǎo)局部IgA抗體方面都比胃腸外給予的疫苗更有效。L9+MPL制劑誘導(dǎo)的應(yīng)答與其它制劑類似，但抗原含量減少。6.2.在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用與用于小鼠初免的病毒株不同的病毒株鼻內(nèi)免疫小鼠。
抗原性漂移是一年一度的流感流行的原因。每年流感疫苗中包含的病毒株是那些最經(jīng)常出現(xiàn)的病毒株；但在疫苗中也可以存在或多或少涉及到的其它病毒株。因而，最佳的侯選流感疫苗必須誘導(dǎo)有效的抗廣譜病毒株的保護(hù)。因此，饒有趣味的是研究在用與所述疫苗中包含的病毒株異種的病毒株“初免”之后，給定的鼻內(nèi)制劑能夠激發(fā)何種程度的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)步驟
在第0天用β-丙酸內(nèi)酯滅活的得自雞胚的三價(jià)完整流感病毒(A/Johannesburg/82/96 H1N1、A/Johannesburg/33/94 H3N2和B/Panama/45/90；5μg HA/病毒株)鼻內(nèi)“初免”雌性Balb/c小鼠(8周齡)，以模擬在人類發(fā)生的天然初免。
28天后，用以下的三價(jià)疫苗制劑(含有A/Beijing/262/95 H1N1、A/Sydney/5/97 H3N2和B/Harbin/7/94作為異種病毒株)鼻內(nèi)接種小鼠(每組10只小鼠)。
再對(duì)小鼠測(cè)試的各種鼻內(nèi)疫苗制劑中包含的三價(jià)片段病毒體的量相當(dāng)于實(shí)施例7中給予人類自愿接種者的劑量的1/10。
在第42天收集血清樣品，并測(cè)試其血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體。處死后(第42天)，進(jìn)行鼻部清洗，并通過(guò)ELISA測(cè)試IgA抗體滴度。以終點(diǎn)滴度(EPT)檢測(cè)特異性IgA抗體，結(jié)果表示為特異性IgA EPT/μg總IgA，以便排除任何由取樣方法造成的差異。結(jié)果
研究的第一個(gè)目的是當(dāng)使用異種亞型病毒株進(jìn)行初免時(shí)，確定鼻內(nèi)疫苗制劑是否能夠激發(fā)出抗疫苗抗原的血清HI應(yīng)答。圖3顯示了在接種后第14天(第42天)于血清中觀測(cè)到的各種疫苗制劑的HI滴度。
所有的具有L9或L9+MPL的鼻內(nèi)制劑都能夠誘導(dǎo)針對(duì)所述三種流感病毒株的免疫應(yīng)答，其與通過(guò)胃腸外給予普通疫苗激發(fā)的免疫應(yīng)答相當(dāng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Tukey-HSD統(tǒng)計(jì)比較分析)證實(shí)，所有的鼻內(nèi)制劑激發(fā)的應(yīng)答與胃腸外給予的應(yīng)答無(wú)顯著(p＞0.05)差異。在鼻內(nèi)制劑中，未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但一般來(lái)說(shuō)，L9+MPL和L9制劑免疫原性更強(qiáng)，前者含有的抗原含量是后者的一半(0.75μg與1.5μgHA)。
第二個(gè)目的是確定(1)在鼻內(nèi)接種后是否可檢測(cè)到針對(duì)異種病毒株的鼻部特異性IgA應(yīng)答，和(2)這種應(yīng)答是否優(yōu)于在肌內(nèi)接種動(dòng)物中觀測(cè)到的免疫應(yīng)答。圖4圖示接種后第14天(第42天)記錄到的鼻部特異性抗異種IgA應(yīng)答。
第二個(gè)目標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)都得到了滿足。所有的鼻內(nèi)制劑都誘導(dǎo)針對(duì)所述三種異種病毒株的IgA應(yīng)答，其比肌內(nèi)注射普通疫苗時(shí)觀察到的IgA應(yīng)答高2-7倍。在鼻內(nèi)制劑中，IgA應(yīng)答的強(qiáng)度無(wú)顯著差異。
異源接種觀測(cè)到的應(yīng)答程度所達(dá)到的范圍與同源接種相同(參見(jiàn)圖2)。同樣，用L9+MPL配制的疫苗能夠維持與普通制劑或L9制劑(3和1.5μg HA)相同的應(yīng)答強(qiáng)度，但抗原劑量較低(0.75μg HA)。結(jié)論
依據(jù)流感疫苗株特異性的血清HI抗體和鼻內(nèi)IgA這二者的結(jié)果，鼻內(nèi)給予有或沒(méi)有吸附增強(qiáng)型表面活性劑或輔助劑的三價(jià)片段流感疫苗能夠誘導(dǎo)異種亞型應(yīng)答。
盡管組別之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不明顯，但一般來(lái)說(shuō)，其中的三價(jià)片段病毒體用L9或L9+MPL配制的疫苗誘導(dǎo)的系統(tǒng)以及局部免疫應(yīng)答更有效。另外，與含L9的疫苗相比，用L9+MPL配制的疫苗誘導(dǎo)相同水平的免疫，但抗原劑量較低。實(shí)施例7-與肌內(nèi)給予三價(jià)片段病毒體流感疫苗相比，以18-40歲的健康成年人評(píng)價(jià)按照單劑免疫計(jì)劃鼻內(nèi)給予的得自雞胚的有或沒(méi)有l(wèi)aureth 9或laureth 9+3D-MPL的三價(jià)片段病毒體流感疫苗。
在此研究中，以約120個(gè)健康男性和女性受試者評(píng)價(jià)針對(duì)所述疫苗的局部粘膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。侯選疫苗組合物
在此研究中評(píng)價(jià)5種得自雞胚的片段流感抗原制劑。鼻內(nèi)給予侯選疫苗。另外，SmithKline Beecham Biologicals的FluarixTM用作對(duì)照，F(xiàn)luarixTM是肌內(nèi)給予的滅活片段病毒體流感疫苗。
侯選鼻內(nèi)疫苗含有FluarixTM制劑使用的三種滅活片段病毒體抗原。病毒株為WHO推薦的2000年度南半球流感季節(jié)病毒株。表6列出了對(duì)各種制劑的一般性描述。
表6疫苗的一般性描述無(wú)L9或MPL的鼻內(nèi)三價(jià)片段流感疫苗(30μg劑量和15μg劑量)
一劑的體積為0.2 ml。
表7*每個(gè)鼻內(nèi)制劑小瓶裝量體積超過(guò)20％用L9配制的鼻內(nèi)三價(jià)片段流感疫苗(15μg劑量和7.5μg劑量)
一劑的體積為0.2ml。所述制劑如表7所示，該制劑還包括1mglaureth 9/劑，以及15或7.5μg劑量的HA/病毒株。Laureth 9得自德國(guó)Kreussler。用L9+3D-MPL配制的鼻內(nèi)三價(jià)片段流感疫苗(7.5μg劑量)
一劑的體積為0.2ml。所述制劑如表7所示，該制劑還包括1mglaureth 9/劑和50μg 3D-MPL/劑以及7.5μg HA/病毒株。FluarixTM市售滅活三價(jià)片段流感疫苗用作對(duì)照
FluarixTM 2000(南半球)用作對(duì)照。肌內(nèi)給予此0.5ml劑量疫苗。
一劑含有15μg每種流感疫苗病毒株(A/New Caledonia/20/99(H1N1)-A/Sydney/5/97(H3N2)-B/Yamanashi/166/98)的血細(xì)胞凝集素以及作為防腐劑的50μg硫柳汞/劑。三價(jià)片段流感侯選疫苗制劑1.濃縮三種滅活片段病毒體
在配制最終的侯選疫苗之前，通過(guò)切向流過(guò)濾將三種滅活片段病毒體分別濃縮至最高1000-1500μg HA/ml。使用配有10kDa截流的三乙酸纖維素膜的卡型膜盒。2.配制三價(jià)片段流感疫苗
以下提供了配制流程圖
注射用水
+
磷酸緩沖鹽水
+
Tween 80至0.15％
+Triton X100至0.02％
+ →于室溫?cái)嚢?分鐘病毒株A/New Caledonia/20/99150或75或37.5μg HA/ml
+ →于室溫?cái)嚢?0分鐘病毒株A/Sydney/5/97150或75μg HA/ml
+ →于室溫?cái)嚢?0分鐘病毒株B/Yamanashi/166/98150或75μg HA/ml
+ →于室溫?cái)嚢?5分鐘調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2
↓
儲(chǔ)存于+2℃至+8℃
對(duì)于含laureth 9的制劑，加入laureth 9至0.5％，然后馬上調(diào)節(jié)pH，并于室溫持續(xù)攪拌15分鐘。
對(duì)于含laureth 9+3D-MPL的制劑，加入250μg/ml的3D-MPL，然后立即加入laureth 9，攪拌所述制劑15分鐘然后加入laureth 9。裝填三價(jià)片段流感侯選疫苗
最終的原液無(wú)菌裝填在Pfeiffer(德國(guó))的1型(Ph.Eur.)玻璃小瓶中。裝填后馬上用橡膠塞子密封小瓶。所有的操作都在無(wú)菌室(層流系統(tǒng))中進(jìn)行。
裝填和封閉以后，將塞住的小瓶插入到塑料活塞中，并安裝入產(chǎn)生噴霧的噴嘴裝置中。該裝置可給予100μl的兩次噴霧。結(jié)果
對(duì)所有的受試者進(jìn)行以下的分析
1.第0、21和42天分別測(cè)試針對(duì)所述疫苗中的三種流感病毒株的每一種病毒株的粘膜IgA(局部免疫應(yīng)答)ELISA滴度。
2.第0、21和42天分別測(cè)試針對(duì)三種流感病毒株中的每一種病毒株的血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體滴度。
由此獲得
1.所有時(shí)間點(diǎn)的血清HI抗體GMT(95％的置信區(qū)間)。
2.HI第21天的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率。
3.HI第21天的轉(zhuǎn)化系數(shù)。
4.HI第21天和第42天的保護(hù)率。
5.僅針對(duì)IgA由第0天至第21天和第0天至第42天的IgA滴度增加1倍和3倍的受試者百分率。
權(quán)利要求
1.非活體流感病毒抗原制品在生產(chǎn)用于單劑鼻內(nèi)抗流感接種的疫苗制劑中的應(yīng)用，其中所述單劑接種產(chǎn)生的免疫應(yīng)答符合國(guó)際流感疫苗管理要求。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述單劑接種達(dá)到了對(duì)所述疫苗提供的所述或全部流感病毒株的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率、血清保護(hù)率和血清轉(zhuǎn)化系數(shù)的三項(xiàng)歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的至少兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述疫苗中提供的所述或全部流感病毒株滿足全部三項(xiàng)歐盟標(biāo)準(zhǔn)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中所述流感病毒抗原制品選自片段病毒抗原制品、亞單位抗原、化學(xué)或其它方式滅活的完整病毒。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述流感抗原制品為片段病毒抗原制品。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中所述制劑含有至少一種表面活性劑。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述表面活性劑為至少一種選自以下的非離子表面活性劑或其中兩種或多種的組合辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(例如市售的TritonTM系列)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(TweenTM系列)和通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯
(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n為1-50，A為連接鍵或-C(O)-，R為C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述非離子表面活性劑為至少一種選自以下的非離子表面活性劑或其中兩種或多種的組合叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)和laureth 9。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述疫苗包含所述三種非離子表面活性劑中兩種的組合，即聚氧乙烯山梨糖醇酐一油酸酯(Tween 80)和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述疫苗包含所有三種非離子表面活性劑的組合。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗進(jìn)一步包含膽汁酸或膽酸或其衍生物，例如脫氧膽酸鈉。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的用途，其中每劑所述疫苗制劑都含有低劑量的血細(xì)胞凝集素。
13.權(quán)利要求12的用途，其中每個(gè)流感病毒株的血細(xì)胞凝集素含量為約30μg/劑或更少。
14.權(quán)利要求13的用途，其中每個(gè)流感病毒株的血細(xì)胞凝集素含量為約15μg/劑或更少。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述血細(xì)胞凝集素含量為每劑疫苗約7.5μg血細(xì)胞凝集素/病毒株或更少。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗制劑的每劑體積較小。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述每劑體積少于500μl，或少于300μl或每劑不多于約200μl。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗以兩個(gè)亞劑量的雙劑量形式傳遞。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗不含有添加的免疫刺激劑。
20.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗還含有脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物，該無(wú)毒衍生物優(yōu)選選自單磷酰脂質(zhì)A和雙磷酰脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述疫苗含有3D-MPL。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述疫苗含有3D-MPL和laureth 9。
23.一種預(yù)防患者流感感染或疾病的方法，該方法包括經(jīng)粘膜表面給予所述患者單劑非活體流感病毒疫苗，以使誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答滿足針對(duì)所述疫苗中提供的全部流感病毒株的以下標(biāo)準(zhǔn)中的至少兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)
(i)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率大于或等于40％；
(ii)血清保護(hù)率大于或等于70％；和
(iii)轉(zhuǎn)化系數(shù)大于或等于2.5。
24.一種預(yù)防患者流感感染或疾病的方法，該方法包括經(jīng)粘膜表面給予所述患者單劑低HA的非活體流感病毒疫苗，以使誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答滿足針對(duì)所述疫苗中提供的全部流感病毒株的以下標(biāo)準(zhǔn)中的至少兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)
(i)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率大于或等于40％；
(ii)血清保護(hù)率大于或等于70％；和
(iii)轉(zhuǎn)化系數(shù)大于或等于2.5。
25.權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的方法，其中提供的全部流感病毒株滿足全部三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。
26.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述疫苗鼻內(nèi)傳遞。
27.一種包含鼻內(nèi)傳遞裝置和單劑疫苗的藥盒，所述單劑疫苗含有未添加免疫刺激劑的非活體流感病毒抗原制品。
28.一種包含鼻內(nèi)傳遞裝置和單劑流感疫苗的藥盒，所述單劑流感疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答符合國(guó)際流感疫苗管理要求。
29.一種包含鼻內(nèi)傳遞裝置和單劑疫苗的藥盒，所述單劑疫苗含低HA劑量的非活體流感病毒抗原制品。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的藥盒，其中所述裝置為雙劑量傳遞裝置，用于在單次給予中傳遞兩個(gè)亞劑量。
31.權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)的藥盒，其中所述裝置為鼻內(nèi)噴霧裝置。
32.一種生產(chǎn)鼻用流感疫苗的方法，該方法包括
(i)提供基本如同常規(guī)注射流感疫苗制備的片段流感病毒制品，其含有至少一種非離子表面活性劑；
(ii)任選調(diào)節(jié)所述制品中的血細(xì)胞凝集素濃度和/或非離子表面活性劑濃度；
(iii)將疫苗劑量的所述片段流感病毒制品裝填在鼻內(nèi)傳遞裝置內(nèi)，所述疫苗劑量體積適合鼻內(nèi)給予，任選為雙劑量形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用非活體流感病毒抗原制品、尤其是片段流感病毒制品生產(chǎn)用于單劑鼻內(nèi)抗流感接種的疫苗制劑，其中所述單劑接種符合國(guó)際流感疫苗管理要求。本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)所述疫苗的方法以及包括鼻內(nèi)給予裝置和所述單劑疫苗的藥盒。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1391463SQ0081594
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月24日
發(fā)明者M·弗里德, V·亨德里克斯, P·赫爾曼德, M·M·斯勞伊, S·G·J·特倫 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司