專利名稱：用于軟組織工程化的方法和工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟組織工程化。更確切地，本發(fā)明涉及非細胞脂肪組織提取物、包含所 述提取物的植入物、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
軟組織包括體內(nèi)的連接和支撐結(jié)構(gòu)，諸如肌肉、結(jié)締組織、脂肪組織和血管。軟組 織工程化目的在于為由例如外傷(燒傷和瘢痕)、手術(shù)切除或先天畸形引起的軟組織缺陷 制造替代部件。另外，美容用途，如填充面部皺紋，是再造軟組織的重要應(yīng)用。在組織工程化中已經(jīng)使用了異體材料，諸如硅和牛膠原蛋白。然而，這些材料可能 導(dǎo)致嚴重的排斥反應(yīng)和過敏反應(yīng)。因此目前優(yōu)選使用天然移植材料。在軟組織工程化中期望使用自體移植物。自體脂肪組織移植是一種老的治療方 法，其中將成熟的脂肪細胞或脂肪組織本身移植到缺陷位置。對于臨床用途而言，脂肪組織 豐富、易于收集并且容易獲得。然而，自體脂肪組織移植物的使用可能仍然導(dǎo)致若干問題， 諸如再吸收、過度的結(jié)締組織(瘢痕)形成、炎癥反應(yīng)以及移植物的硬化和凝固。此外，根 據(jù)所使用的方法和執(zhí)行所述方法的人員的技能，通過脂肪組織移植獲得的長期結(jié)果是不可 預(yù)知的和多變的。脂肪干細胞已經(jīng)被用于軟組織工程化。這些細胞能夠增殖并分化為成熟的脂肪組 織。然而，由于細胞外基質(zhì)在細胞增殖和分化中具有重要作用，因此不太可能僅使用細胞來 修復(fù)大的或深的軟組織缺陷。為了再生為功能性組織，移植的細胞需要人造細胞外基質(zhì)，即 生物材料支架，以幫助細胞附著、增殖和分化。新血管的形成，即新生血管形成，對再生軟組織中的營養(yǎng)供給和廢物清除是至關(guān) 重要的。迄今為止，單一的生長因子(例如FGF-2或VEGF)已經(jīng)為了這種目的被用作生物 活性物質(zhì)，但是結(jié)果并不令人滿意。似乎需要不同生長/分化因子的群，而不僅僅是單一的 因子。然而，分化因子的正確組合是未知的。在單個植入物中使用生物工程化生長因子的 群會造成非常高的成本。迄今為止，還沒有軟組織缺陷再造的合適方法。因此，在本領(lǐng)域中普遍需要開發(fā)植 入物，其誘導(dǎo)快速的體積增加以填充缺陷、使移植組織保持不具有時間依賴性體積損失、并 誘導(dǎo)快速新血管形成。

發(fā)明內(nèi)容
新生脂肪生成是軟組織工程化有希望的方法。本發(fā)明基于嘗試提供適于細胞增殖 和分化的微環(huán)境從而導(dǎo)致在沒有細胞的外源移植的情況下形成脂肪組織的研究。最佳的微 環(huán)境加強脂肪干細胞從周圍組織的遷移并誘導(dǎo)細胞分化為成熟脂肪細胞。在發(fā)育的組織中 需要新血管形成以避免移植組織的壞死、瘢痕形成和再吸收，以及從而分泌若干分化因子。本發(fā)明提供一種元細胞脂肪組織提取物，其包含預(yù)定量的VEGF、FGF-2和IGF-1。 在一些實施方案中，所述提取物包含每Img總蛋白質(zhì)至少Ipg的VEGF、至少70pg的FGF-2和至少50pg的IGF-1。在其他實施方案中，每Img總蛋白質(zhì)的VEGF含量為至少7pg。所述 提取物可以在軟組織修復(fù)或工程化中使用以及在組織工程化中的血管生成誘導(dǎo)中使用，例 如在傷口愈合中、在燒傷治療中和在缺血性病癥治療中使用。本發(fā)明還提供一種植入物，其包含本發(fā)明任一實施方案的無細胞脂肪組織提取物 和生物相容基質(zhì)。所述提取物優(yōu)選是外源的，而所述基質(zhì)優(yōu)選是水凝膠并可以選自透明質(zhì) 酸，殼聚糖，血纖蛋白，膠原蛋白，藻酸鹽，基于聚乳酸、乳酸羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯的聚 酯，及其混合物。在一些實施方案中，所述植入物是可注射的。所述植入物可以在軟組織修 復(fù)或工程化中使用，以及在組織工程化中的血管生成誘導(dǎo)中使用，例如在傷口愈合中、在燒 傷治療中和在缺血性病癥治療中使用。本發(fā)明還進一步提供一種制備本發(fā)明任一實施方案的無細胞脂肪組織提取物的 方法。所述方法包括以下步驟a)提供包括不同細胞的非均勻化的脂肪組織樣品；b)將所 述樣品培養(yǎng)預(yù)定的時間；以及c)收集提取物。還提供根據(jù)所述方法獲得的無細胞脂肪組織 提取物。此外，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明任一實施方案的植入物的方法。所述方法包括 將所述脂肪組織提取物與生物相容材料混合或?qū)⑺鲋窘M織提取物吸收到生物相容材 料中。另外，本發(fā)明提供誘導(dǎo)脂肪生成的方法和誘導(dǎo)血管形成的方法。所述方法包括給 有需要的受試者植入本發(fā)明任一合適實施方案的植入物。


下面將通過優(yōu)選實施方案的方式并參照附圖更加詳細地描述本發(fā)明，其中圖1表示本發(fā)明的脂肪組織提取物中總蛋白質(zhì)和生長因子含量。圖IA示出了不 同時間點的20個隨機選擇的人脂肪組織提取物中總蛋白質(zhì)濃度。圖1B、圖IC和圖ID分別 示出了在不同時間點的人脂肪組織提取物(ATE)中IGF-I、FGF-2和VEGF的濃度。在每個 圖中用橫線表示平均值。圖2表示人脂肪干細胞(hASC)的脂肪生成分化。圖2A示出了在對照生長培養(yǎng)基 中生長的hASC。圖2B示出了在含有約350 μ g/ml蛋白質(zhì)的ATE培養(yǎng)基中生長的hASC，圖 2C約700yg/ml蛋白質(zhì)，圖2D約1200 μ g/ml蛋白質(zhì)。ATE處理具有脂肪生成誘導(dǎo)的劑量 依賴性的潛力。圖3示出血管生成實驗中的管形成。圖3A代表陰性對照，其顯示沒有管形成。圖 3B和圖3C分別代表用900 μ g/ml (蛋白質(zhì)含量)或1300 μ g/ml的ATE處理的細胞。圖3D 示出了用已知的血管生成生長因子，10ng/ml的VEGF和lng/ml的FGF-2，處理的陽性對照 細胞。在圖3B、圖3C和圖3D中可以清楚地觀察到管形成。與陽性對照3D的血管生成潛力 相比，兩種ATE處理具有相等但是劑量依賴性的血管生成誘導(dǎo)潛力。圖4表示在植入本發(fā)明實施方案的植入物2周之后在大鼠皮下組織中的體內(nèi)血管 形成和脂肪組織形成。圖4A和圖4B示出在植入物區(qū)域中的大量毛細管形成。圖4C和圖 4D示出大微動脈狀結(jié)構(gòu)以及一些脂肪組織發(fā)育。血管的實例用箭頭表示。圖5表示在植入本發(fā)明實施方案的植入物12周(圖5A和圖5B)和20周(圖5C 和圖5D)之后大量的脂肪組織形成。在圖5B和圖5D中植入物用箭頭表示。
圖6表示在將本發(fā)明實施方案的植入物植入到腿部中的老瘢痕組織之下后顯示 人皮下組織及其脂肪組織形成和血管形成的臨床預(yù)實驗。圖6A表示植入之前的組織。圖 6B表示植入3個月之后的皮下組織。圖6C表示在6個月時上皮下組織血管形成。圖6D表 示在6個月時，剛好在真皮之下的皮下組織中的脂肪組織和血管形成。在6個月時，組織質(zhì) 量至少加倍，并且脂肪組織和大血管已經(jīng)發(fā)育。
具體實施例方式脂肪組織包括各種分化階段的脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、成纖細胞、周細胞以及能夠分 化成若干譜系的細胞的脂肪干細胞和充質(zhì)干細胞。新生脂肪生成，即新脂肪組織的形成，是 軟組織工程化的有希望的方法。本發(fā)明基于嘗試提供適合細胞增殖和分化的微環(huán)境從而導(dǎo) 致在沒有細胞的外源移植的情況下形成血管和脂肪組織的研究。最佳的微環(huán)境加強脂肪干 細胞從周圍組織的遷移并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和脂肪前體細胞分化為成熟脂肪細胞、疏松結(jié)締組 織和肌肉細胞以及血管細胞。發(fā)育組織中的新血管形成始終是必須的以避免壞死和瘢痕形 成，即從而使功能性成熟脂肪組織能夠發(fā)育。本發(fā)明涉及一種無細胞脂肪組織提取物(ATE)，其具有在不施用細胞的情況下在 植入位置誘導(dǎo)脂肪組織和維管結(jié)構(gòu)快速形成的潛力。所述ATE能夠為新生脂肪生成和血管 生成創(chuàng)造最佳的微環(huán)境，并因此可以在軟組織修復(fù)和/或工程化中使用。本文中術(shù)語“脂肪組織提取物”(ATE)是指生物活性物質(zhì)的混合物，所述生物活 性物質(zhì)優(yōu)選為脂肪形成因子和血管形成因子，其由脂肪組織細胞即各種分化階段的脂肪細 胞、內(nèi)皮細胞、成纖細胞、周細胞以及脂肪干細胞分泌。所述提取物是無細胞的或非細胞的。 所述脂肪組織提取物與傳統(tǒng)條件培養(yǎng)基不同，例如，所述提取物采集自小組織塊或活細胞。 制備方法包括無細胞培養(yǎng)，所得提取物比條件培養(yǎng)基濃度要高得多，并且培養(yǎng)時間短，在若 干分鐘到幾天的范圍內(nèi)變化?？梢杂衫缤ㄟ^吸脂術(shù)或外科手術(shù)獲得的脂肪或脂肪組織樣品制備脂肪組織提 取物。根據(jù)需要，將所述組織樣品切成小塊以使細胞基本上保持活力。吸脂術(shù)材料可以直 接使用。換言之，所述組織樣品的加工不涉及勻漿化。通過在培養(yǎng)基中、在無菌鹽溶液中、 在磷酸鹽緩沖鹽水中或在其他合適的等滲性水緩沖溶液中培養(yǎng)細胞來提取生物活性因子， 其中在培養(yǎng)期間細胞或組織塊將生物活性因子釋放到液相中。然后收集所述ATE，即沒有細 胞的液相。也可以在使用之前將所述ATE過濾以使所述提取物消毒并產(chǎn)生非細胞液體。所 得ATE是細胞因子和其他生物活性物質(zhì)的無細胞蛋白質(zhì)混合物。不僅可以使用同源性脂肪組織，也可以使用異源性脂肪組織作為ATE原料，并為 了上述目的將其加工。這種異源性提取物能夠被吸收到并用于例如冷凍干燥的“成品”軟 組織支架中。這種產(chǎn)品的一個實例由交聯(lián)的透明質(zhì)酸(例如Restylane)和異源性ATE制 成。由于提取物是非細胞的，因此即使在相同的提取物和植入物適合若干患者的異源性使 用中也不太可能發(fā)生免疫反應(yīng)和過敏反應(yīng)。這得到了在實施例5中更詳細描述的動物研究 的支持，其中在大鼠中植入的人ATE(異種移植物)不引起任何炎癥反應(yīng)或其他并發(fā)癥。ATE是通過脂肪組織細胞表達的脂肪形成因子和血管形成因子的最佳的細胞因子 混合物?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)方法(例如ELISA)檢測ATE的生物活性物質(zhì)。本 文中，檢測了在各種ATE中120種細胞因子的表達(參見實施例1)。長培養(yǎng)時間，例如M小時或更長，導(dǎo)致更多的血管生成提取物，而短培養(yǎng)時間和長培養(yǎng)時間都產(chǎn)生脂肪形成混 合物。可以將ATE調(diào)配(tailor)為包含期望量的或預(yù)定量的脂肪形成因子和血管形成 因子，所述脂肪形成因子和血管形成因子包括血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、基本的成纖 細胞生長因子(FGF-2)和類胰島素生長因子(IGF-I)。期望的組成可以取決于預(yù)期的用 途。根據(jù)當(dāng)前的知識和本發(fā)明的支持，VEGF和FGF-2被認為是刺激血管生成的重要因子， 而FGF-2和IGF對刺激脂肪生成是重要的。因此，在一個實施方案中，ATE包含每Img總蛋 白質(zhì)至少Ipg的VEGF、至少70pg的FGF-2和至少50pg的IGF-1。這種ATE特別適用于例 如在軟組織修復(fù)和工程化中刺激脂肪生成。在另一個實施方案中，ATE包含每Img總蛋白 質(zhì)至少7pg的VEGF、至少70pg的FGF-2和至少50pg的IGF-1。這種ATE特別適用于在例 如誘導(dǎo)傷口愈合和治療缺血性病癥和燒傷中刺激血管生成。不同的所調(diào)配的ATE可以進一 步含有不同量的若干其他細胞因子，雖然它們對于特定的應(yīng)用而言可能不總是至關(guān)重要的 (參見表1)。總之，ATE應(yīng)當(dāng)含有約2 1至約1 2的IGF-I和FGF-2，以及約1 100 至約 1 10 的 VEGF 和 FGF-2。可以通過在ATE的制備中使用不同的培養(yǎng)時間和溫度來調(diào)配脂肪組織提取物的 含量。通常，培養(yǎng)時間在若干分鐘至若干小時的范圍內(nèi)，例如過夜。例如，約1小時的培養(yǎng) 時間通常得到約1. 7mg/ml至2. 5mg/ml的總蛋白質(zhì)含量、約200pg/ml至約1300pg/ml的 IGF-I 含量、約 200pg/ml 至約 1400pg/ml 的 FGF-2 含量和約 2pg/ml 至約 25pg/ml 的 VEGF 含量。換言之，1小時的培養(yǎng)時間通常得到每Img總蛋白質(zhì)約150pg至約550pg的IGF-I 含量、每Img總蛋白質(zhì)約IOOpg至約500pg的FGF-2含量以及每Img總蛋白質(zhì)約3pg至約 20pg的VEGF含量。這種類型的提取物是脂肪形成性的和血管形成性的。然而，如果在提 取物中需要特別高濃度的VEGF (約200pg/ml至約1400pg/ml，即每Img蛋白質(zhì)約25pg至 約500pg的VEGF)，例如特別是對于在期望的目標組織中的血管生成誘導(dǎo)而言，則應(yīng)當(dāng)將培 養(yǎng)時間延長至例如約M小時。24小時的培養(yǎng)時間通常得到每Img總蛋白質(zhì)約60pg至約 200pg的IGF-I含量、每Img總蛋白質(zhì)約130pg至約500pg的FGF-2含量以及每Img總蛋 白質(zhì)約25pg至約500pg的VEGF含量。此外，可以使用各種培養(yǎng)溫度來調(diào)整脂肪組織提取 物，所述培養(yǎng)溫度通常在室溫至約37°C的范圍內(nèi)。然而，在一些實施方案中，可以使用較低 的溫度，如4°C。在再其他實施方案中，只要蛋白質(zhì)未發(fā)生變性，可以使用更高的溫度。更普遍地，所述提取物中VEGF的濃度可以在約lpg/ml和約1400pg/ml之間，優(yōu)選 在約10pg/ml和約1000pg/ml之間，更優(yōu)選在約7pg/ml和約700pg/ml之間，并且最優(yōu)選 在約10pg/ml和約100pg/ml之間變化。所述提取物中FGF-2的濃度可以在約20pg/ml和 約1500pg/ml之間，優(yōu)選在約100pg/ml和約1300pg/ml之間，更優(yōu)選在約150pg/ml和約 1000pg/ml之間，并且最優(yōu)選在約200pg/ml和約800pg/ml之間變化。IGF-I的濃度可以在 約100pg/ml和約1500pg/ml之間，并優(yōu)選在約150pg/ml和約800pg/ml之間，并且最優(yōu)選 在約200pg/ml和約500pg/ml之間變化。另一方面，所述提取物的總蛋白質(zhì)濃度可以在約 0. 75mg/ml和約3. 5mg/ml之間變化。優(yōu)選地，總蛋白質(zhì)濃度為約1. 4mg/ml至約2. 7mg/ml, 更優(yōu)選為約1. 8mg/ml至約2. 7mg/ml，再更優(yōu)選為約ang/ml至約2. 7mg/ml，并且最優(yōu)選為 約 2. lmg/ml 至約 2. 5mg/ml。還可以以與總蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系定義提取物中生物活性物質(zhì)的濃度。因此，含有
6Img總蛋白質(zhì)的提取物中VEGF的量(每Img蛋白質(zhì)的生長因子含量)可以在約Ipg和約 800pg之間，并優(yōu)選在約3. 5pg至約500pg之間，更優(yōu)選在約7pg至約300pg之間，并且最優(yōu) 選在約20pg至約IOOpg之間變化。含有約Img總蛋白質(zhì)的提取物中FGF-2的量(每Img 蛋白質(zhì)的生長因子含量)可以在約Ipg和約1200pg之間，優(yōu)選在約Ipg至約600pg之間， 更優(yōu)選在約70pg至約500pg之間，再更優(yōu)選在約IlOpg至約450pg之間，并且最優(yōu)選在約 250pg至約350pg之間變化。IGF-I的量(每Img蛋白質(zhì)的生長因子含量)可以在約50pg 和約700pg之間，并優(yōu)選在約IOOpg至約500pg之間，再更優(yōu)選在約IOOpg至約300pg之間， 并且最優(yōu)選在約IlOpg至約230pg之間變化。ATE還可以天然地包含或為了進一步調(diào)配ATE而向其中添加若干其他脂肪形成和 血管形成因子(表1所示)，如生長因子、白細胞介素、補體系統(tǒng)產(chǎn)品、糖皮質(zhì)素、前列腺素、 脂蛋白和游離脂肪酸以及細胞外基質(zhì)成分，例如膠原蛋白I、膠原蛋白IV和膠原蛋白VI、蛋 白聚糖、彈性蛋白和乙酰透明質(zhì)酸。另外，在使用之前，例如可以用任何期望的藥物或藥劑 補充所述ATE。另一方面，在使用之前，可以通過去除諸如單一生長因子或細胞因子的物質(zhì)來進 一步調(diào)配ATE。例如，如果所述ATE要被用于例如在治療缺血性病癥中誘導(dǎo)初級血管生成， 則可以去除血管生成抑制劑如TIMP-I和TIMP-2以及初級脂肪形成因子如IGF-1、脂連蛋白 和/或瘦蛋白。去除或分離期望的物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域容易得到的，包括通過免疫吸附分 離生長因子。調(diào)配ATE可以進一步包括濃縮(例如通過離心分離)或稀釋(例如用培養(yǎng)基、無 菌生理鹽溶液或任何其他緩沖等滲性溶液)，從而獲得適合特別用途的ATE。在細胞培養(yǎng)研究中測試脂肪組織提取物的脂肪形成潛力，其中在存在或不存在本 實施方案的提取物的情況下培養(yǎng)人脂肪源性干細胞(hASC)。如圖2所示和在實施例2中更 詳細地描述，如通過增加的油-紅-0顏色富集(甘油三酯(triglyseride)形成)的判斷， 所述提取物清楚地誘導(dǎo)多數(shù)干細胞的脂肪形成分化。此外，在體外管形成實驗中評價本實施方案提取物的血管形成潛力。在存在或不 存在脂肪組織提取物或VEGF和FGF-2的情況下在成纖細胞培養(yǎng)物之上培養(yǎng)人內(nèi)皮細胞。在 所有情況下，清楚地觀察到血管生成，即管形成，如圖3所示和在實施例3中更詳細地描述。 然而，ATE的血管形成潛力明顯是劑量依賴性的。在一些實施方案中，本發(fā)明的ATE可以用作細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)基補充物以在 體外研究脂肪生成或血管生成。所述ATE導(dǎo)致分化的脂肪細胞在細胞培養(yǎng)物中均勻的分 布，并因此提供用于反映人體內(nèi)條件的脂肪生成的優(yōu)異的細胞模型。迄今為止，還沒有用于 脂肪形成分化的合適的細胞模型。在細胞培養(yǎng)中，特別是在臨床應(yīng)用中存在代替異種血清的總目標。人血清是及其 昂貴的，因此不是最佳的溶液。在本發(fā)明的一些實施方案中，ATE可以用作細胞培養(yǎng)物成分 或者在細胞培養(yǎng)基中用作血清替代物。這不僅節(jié)省成本，而且對于產(chǎn)生組織工程化的人構(gòu) 造是有用的，特別是在動物源性成分不合適的情況下。本發(fā)明還涉及包含同源性或異源性無細胞脂肪組織提取物和生物相容性基質(zhì)的 植入物。僅使用脂肪組織提取物修復(fù)大的或深的軟組織缺陷是困難的，但是所提供的植入 物適于填充軟組織缺陷，承受機械負載，并且還使新組織再生。此外，所述植入物提供穩(wěn)定的長期結(jié)果，感覺上并看起來與自然組織相似，易于使用，無毒并且是惰性的，但是另一方 面，允許營養(yǎng)物和代謝物適當(dāng)?shù)臄U散。所述生物相容基質(zhì)必須是對人體無毒的、在組織中相 當(dāng)惰性的、能夠結(jié)合和釋放小分子(例如生長因子)，并且在組織中可降解。在本發(fā)明的植入物中使用的生物相容基質(zhì)優(yōu)選為水凝膠。本文中所用術(shù)語“水凝 膠”是指含有親水性聚合物鏈、能夠?qū)⑺盏狡浣Y(jié)構(gòu)中、溶脹成其原始體積的百分之?dāng)?shù)百 或數(shù)千并仍然保持其結(jié)構(gòu)的高度含水的材料。天然聚合物水凝膠具有若干有希望的性質(zhì)。 它們可降解，它們能夠在溫和條件下加工，并且它們是細胞外基質(zhì)(ECM)的成分或具有與 其相似的結(jié)構(gòu)。天然聚合物通常是無毒的并且在體內(nèi)與周圍的組織良好地相互作用。根據(jù) 特定植入物的要求，可以修改水凝膠的硬度或剛度、降解速率和生物活性物質(zhì)結(jié)合速率或 物質(zhì)釋放速率。這些修改的方法易于在現(xiàn)有技術(shù)中獲得的。一種合適的水凝膠材料是透明質(zhì)酸或乙酰透明質(zhì)酸，其是廣泛分布的形成結(jié)締組 織細胞外基質(zhì)的天然多糖。其包含與N-乙酰葡萄糖胺鏈連接的D-葡萄糖醛酸。透明質(zhì)酸 是通常使用的天然生物材料，因為其是完全無免疫原性的并且在本領(lǐng)域已經(jīng)被安全使用了 幾十年。交聯(lián)的透明質(zhì)酸是市售的，例如商品名Restylane ^Hfed，瑞典)、E丨evess (Anika Therapeutics, USA) Juvederm (l. ε. a. Derm,法國)> Reyoungel (Bioha laboratories,中國)、Puragen (Genzyme, USA)、Prevelle Silk (Genzyme, USA)、 Teosyal (Teoxane laboratories,瑞士)、Bolotero (Merz Aesthetik,德國)、 Revanesse (Auragenix Biopharma,荷蘭)禾口 Rofilan Hylan QgJ (Cairo Tech,埃 及)。這些交聯(lián)的透明質(zhì)酸中的一些(例如Restylane)已經(jīng)被FDA批準為在臨床應(yīng)用中的 軟組織填充物質(zhì)。適用于本發(fā)明的另一水凝膠是殼聚糖，其是含有葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺的 聚合物的天然多糖。由于是緩慢生物可降解的生物材料并且對人體無毒，因此在工業(yè)和研 究中殼聚糖已經(jīng)被廣泛地用作制藥試劑。在此之前，改性殼聚糖已經(jīng)被用作激素、藥物或蛋 白質(zhì)的控釋遞送系統(tǒng)，其中通過擴散和生物材料的降解發(fā)生釋放。適用于本發(fā)明的其他天然水凝膠形成材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的，包括例 如膠原蛋白、藻酸鹽、明膠、血纖蛋白和瓊脂糖。合成水凝膠如基于聚乳酸(PLA)、乳酸羥基乙酸共聚物PLGA、聚己內(nèi)酯(PCL)的聚 酯也可以在本發(fā)明實施方案的植入物中用作水凝膠。根據(jù)材料，有可能實現(xiàn)更多的脂肪生成或血管生成。通過選擇不同的支架材料或 通過材料改性(例如乙酰透明質(zhì)酸交聯(lián))，有可能提高植入物的脂肪形成或血管形成效果， 并使所述效果集中于更多的血管形成或更多的脂肪形成潛力。本發(fā)明實施方案的植入物還可以包含水凝膠的混合物，如殼聚糖和透明質(zhì)酸的混 合物。還可以通過共混、共聚或功能化組合水凝膠。在一些實施方案中，所述生物相容基質(zhì)可以包含納米或微米顆粒。例如，可以例 如通過離子凝膠化法由殼聚糖制成微米顆粒，或者可以通過水包油包水法制備合成的PLA、 PLGA或PCL微米顆粒，并可以在內(nèi)部混合第二水凝膠材料，例如透明質(zhì)酸。因此，在植入物 中可以以納米或微米顆粒和包圍所述顆粒的水凝膠的形式提供脂肪組織提取物?？傊珹TE 可以與任何可降解的藥物釋放裝置組合。
生物相容基質(zhì)的量相對于植入物中脂肪組織提取物的量通常為約37%至約50% 生物相容基質(zhì)和約50%至約63%提取物。在生物相容基質(zhì)為水凝膠如透明質(zhì)酸的情況下， 植入物中水凝膠含量的降低導(dǎo)致較弱的凝膠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在體內(nèi)較快的降解速率。在一個具 體的實施方案中，所述植入物包含約45. 5%透明質(zhì)酸、和約54. 5%脂肪組織提取物。這種 植入物具有足夠弱的凝膠強度以允許直接注射到受體組織中。所述水凝膠或其組合還可以通過交聯(lián)、冷凍干燥、共混和/或共聚進行改性，并且 可以使用不同濃度的水凝膠組合。植入物的大小也可以在非常小(幾微升)至幾十微升的 范圍內(nèi)變化。通常，例如為了面部重建的目的，使用1至5微升的植入物。植入物中的脂肪組織提取物含量可以變化。通常，植入物包含約300μ g/ml至約 Lang/ml的蛋白質(zhì)，優(yōu)選在600 μ g/ml和lmg/ml之間，再更優(yōu)選接近800至900 μ g/ml。本發(fā)明的植入物可以通過任何合適的方式植入。注射提供可行的植入方法。植入 的替代形式是本領(lǐng)域中熟知的，如支架、薄膜或膜。在動物實驗中證實了本發(fā)明的植入物的脂肪形成和血管形成潛力。將植入物植入 到大鼠體內(nèi)皮膚之下，在植入位置處監(jiān)測脂肪組織和血管形成(實施例4，圖4和圖幻。已 經(jīng)經(jīng)過2周之后，觀察到脂肪組織積累和血管形成。在4至6周時，在與植入物緊密接觸的 位置中觀察到大量的血管形成和動脈狀結(jié)構(gòu)以及一些脂肪組織形成。在12至20周時，在 與植入物緊密接觸的位置處檢測到成熟脂肪組織的高度血管化的、厚的、密集的層。在40 周時，植入物已經(jīng)降解；然而，發(fā)育的成熟脂肪組織仍然存在，證明通過本發(fā)明實施方案的 植入物可以獲得長效的結(jié)果。因此，這些結(jié)果證明本發(fā)明實施方案的植入物的確能夠用于 體內(nèi)軟組織工程化和修復(fù)。因此，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)新生脂肪組織形成和血管生成的植入物，以及提供一 種已經(jīng)被捕集并固定到水凝膠結(jié)構(gòu)中的脂肪形成和/或血管形成因子的長期遞送系統(tǒng)。本 發(fā)明的生物活性植入物有助于誘導(dǎo)宿主細胞滲透并且使組織再生更加有效率。所述植入 物的效果是局部的且位置特定的，降低了某種效果需要的脂肪形成和血管形成因子的總劑 量。這不僅節(jié)省成本還是避免有害全身效應(yīng)的方法。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明植入物的方法。所述方法包括將脂肪組織提取物與生物 相容基質(zhì)混合或?qū)⑵湮盏缴锵嗳菪曰|(zhì)中。所述混合通常在室溫下在無菌注射器中小 心地進行直到ATE和水凝膠材料完全地混合，避免氣泡形成。所述提取物立即被捕集并吸 收到所述水凝膠材料中并準備用于植入。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的脂肪組織提取物和植入物在軟組織修復(fù)或工程化中的 用途。因此，所述提取物和所述植入物可以在修復(fù)或工程化軟組織的方法中使用以實現(xiàn)成 熟脂肪組織和足夠血管形成的發(fā)展。在一個具體實施方案中，所述植入物通過注射施用。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的脂肪組織提取物和植入物在血管生成誘導(dǎo)和/或缺血 組織修復(fù)中的用途。因此，所述提取物和所述植入物可以在修復(fù)或工程化毛細血管的方法 中使用以實現(xiàn)足夠血管形成的發(fā)展。在一個具體實施方案中，所述植入物通過注射施用。與 本發(fā)明相關(guān)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于脂肪生成而言，在組織中存在生存脂肪細胞或脂肪組織干細胞 通常是有利的。如果所述植入物例如被施用到?jīng)]有脂肪細胞的組織中，則所述植入物的效 果可能更多地或主要地是血管形成性的而不是脂肪形成性的。由于短培養(yǎng)時間和短混合時間的原因，本發(fā)明的一個優(yōu)點在于ATE的制備容易并且其調(diào)配快速。因此，獲得脂肪組織、將其加工成ATE并進一步加工成植入物的整個過程以 及植入可以在一次手術(shù)中完成。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，隨著技術(shù)進步，本發(fā)明的概念可以以不同的方式 實施。本發(fā)明及其實施方案不限于下述的實施例，而是可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)變化。實施例1.用于細胞培養(yǎng)和動物研究的脂肪組織提取物的制備根據(jù)需要，將從吸脂術(shù)中獲得的并且作為得自外科手術(shù)的皮下組織的人脂肪組織 樣本以及得自被處死的大鼠的大鼠脂肪組織樣本切成小塊。將組織塊或吸脂術(shù)材料移至 50ml試管(Nunc)中。向試管中加入沒有任何補充物的無菌鹽溶(用于動物研究)或DMEM/ F12培養(yǎng)基(用于細胞培養(yǎng)研究)，并培養(yǎng)至少45分鐘。在培養(yǎng)期間輕柔震蕩試管若干分 鐘。在不同時間點收集脂肪組織提取物(ATE)的樣品(在每個收集點，將培養(yǎng)基或鹽溶液 完全移除并用新鮮液體替換)，以12000rpm離心5分鐘，并且在細胞培養(yǎng)物或動物實驗中使 用之前無菌過濾。在ATE制備的M小時之后，通過分離細胞并將其進一步培養(yǎng)來檢測細胞 的生存力?；|(zhì)血管部分細胞是形態(tài)正常的，并且保持生物活性且正常增殖。通過BCA 蛋白質(zhì)測定法(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)分析源自不 同患者和/或在不同時間點(lhr、2hr或Mhr)收集的80個人ATE樣品的總蛋白質(zhì)濃度。 總蛋白質(zhì)濃度總是在時間點lhr(l等分試樣)和2hH2等分試樣)處于最高值，并且蛋白質(zhì) 濃度在該時間內(nèi)降低(圖1A)。通常，總蛋白質(zhì)濃度在第一等分試樣(Ihr)中為約1.8mg/ ml至約2. 5mg/ml，在第二等分試樣(》ir)中為約1. 5mg/ml,以及在第三等分試樣Q4hr)中 為約lmg/ml。在無菌鹽溶液或在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的提取物具有相當(dāng)?shù)目偟鞍踪|(zhì)含量。在 將相等體積的培養(yǎng)溶液(培養(yǎng)基或無菌鹽溶液)和切碎的脂肪組織用于提取的情況下，實 現(xiàn)最佳蛋白質(zhì)制備。這種條件導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度接近2mg/ml，對于細胞培養(yǎng)物研究而言其在 合適的范圍。然而，可以并且通常不得不將較高的濃度稀釋到合適的范圍。任何過多的培 養(yǎng)溶液導(dǎo)致過低的蛋白質(zhì)濃度，這需要通過在離心柱中濃縮來進一步調(diào)整。此外，在不同時間點(lhr、2hr和24hr)收集的31至40個人脂肪組織提取物樣 品中每個都通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA，分別為Quantikine人VEGF免疫測定法、 Quantikine人FGF基本免疫測定法或者Quantikine人IGF-I免疫測定法，R&D Systems, Abingdon,UK)檢測血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、基本成纖細胞生長因子(FGF-幻或類胰 島素生長因子(IGF-I)的濃度。根據(jù)制造商的說明進行ELISA。所有標樣和樣品都雙份檢 測。根據(jù)結(jié)果，在1小時培養(yǎng)之后IGF-I濃度處于最高水平(圖1B)，而FGF-2濃度在 培養(yǎng)過程中都非常高(圖ic)。VEGF似乎在培養(yǎng)M小時之后急劇增加(圖1D)。雖然根據(jù) 測試，在1小時和2小時處的VEGF濃度對于脂肪生成或血管生成誘導(dǎo)是合適的，但是僅在 24小時培養(yǎng)之后VEGF才達到非常高的水平。此外，使用RayBio 人細胞因子抗體陣列儀C系列1000 (Human Cytokine Antibody Array C Series 1000， RayBioTech, Inc. ， Norcross, GA, USA) /A^M^^^W 間點(Ihi^PMhr)的2個不同提取物樣品中檢測出全部120種生長因子和細胞因子。根 據(jù)制造商的說明操作所述陣列儀。所有樣品均以雙份檢測，并以半定量獲得結(jié)果。表1中 表示為(_)的因子是未被表達的，或其表達很低從而在陣列儀中檢測不到。根據(jù)細胞因子檢測，在陣列儀的檢測限內(nèi)的ATE的細胞因子圖案如下=IhrATE樣
10品表達大量的血管生成素、脂肪生成素、TIMP-I和TIMP-2、MIF、IGFBP-6、NAP-2、瘦蛋白、 PDGF-BB, GRO和少量的若干其他因子，如表1中所示。Mhr ATE樣品表達大量的血管生成 素、11^-6、嫩 -2、103-1、脂肪生成素、61 0、111^-1、111^-2和少量的若干其他因子，如表1中 所示。在M小時，總體上比在1小時表達更多的細胞因子(參見表1)。瘦蛋白、PDGF-BB、 MIF和IGFBP-6的表達在1小時處很高，而在M小時處很低。在M小時，MCP_1、IL_6、CCL5 和VEGF表達很高，但在1小時處僅檢測到很低的量。因此，通過改變培養(yǎng)時間和調(diào)整生長因子濃度，有可能制備和調(diào)配用于不同用途 的 ATE。表1.各種細胞因子的表達
權(quán)利要求
1.一種無細胞脂肪組織提取物，包含預(yù)定量的VEGF、FGF-2和IGF-I。
2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其中每Img總蛋白質(zhì)的生長因子含量為至少Ipg的 VEGF、至少 70pg 的 FGF-2 和至少 50pg 的 IGF-I。
3.如權(quán)利要求2所述的提取物，其中每Img總蛋白質(zhì)的VEGF含量為至少7pg。
4.如權(quán)利要求2所述的提取物，還包含血管生成素、脂肪生成素、TIMP-I和TIMP-2、 MIF、IGFBP-6、NAP-2、瘦蛋白、PDGF-BB 和 GR0。
5.如權(quán)利要求2或3所述的提取物，還包含血管生成素、IL-5、IL-6、lL-8、CCL5、NAP-2、 MCP-I、脂肪生成素、GRO、TIMP-I、TIMP-2。
6.用于軟組織修復(fù)或工程化、傷口愈合、治療燒傷或治療缺血性病癥的如權(quán)利要求1 至5中任一項所述的提取物。
7.包含權(quán)利要求1至5中任一項所述的無細胞脂肪組織提取物和生物相容基質(zhì)的植入物。
8.如權(quán)利要求7所述的植入物，其中所述生物相容基質(zhì)為水凝膠。
9.如權(quán)利要求8所述的植入物，其中所述水凝膠選自透明質(zhì)酸，殼聚糖，血纖蛋白，膠 原蛋白，藻酸鹽，基于聚乳酸、乳酸羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯的聚酯，及其混合物。
10.如權(quán)利要求7至9中任一項所述的植入物，所述植入物是可注射的。
11.如權(quán)利要求7至10中任一項所述的植入物，其中所述提取物是異源性的。
12.用于軟組織修復(fù)或工程化、傷口愈合、治療燒傷或治療缺血性病癥的如權(quán)利要求7 至11中任一項所述的植入物。
13.制備包含預(yù)定量VEGF、FGF-2、和IGF-I的無細胞脂肪組織提取物的方法，所述方法 包括以下步驟a)提供包含活細胞的非勻漿的脂肪組織樣品，b)培養(yǎng)所述樣品預(yù)定時間，以及c)收集提取物。
14.通過如權(quán)利要求13所述的方法獲得的無細胞脂肪組織提取物。
15.制備如權(quán)利要求7至11中任一項的植入物的方法，包括將所述脂肪組織提取物與 所述生物相容材料混合，或?qū)⑺鲋窘M織提取物吸收到所述生物相容材料中。
16.一種誘導(dǎo)脂肪生成的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求7至11中任一項的植入物 植入到有需要的受試者中。
17.一種誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求7至11中任一項的植入物 植入到有需要的受試者中。
全文摘要
本發(fā)明涉及無細胞脂肪組織提取物、包含它的植入物及其制備方法。所述提取物和植入物能夠誘導(dǎo)脂肪生成和血管生成，并因此在包括軟組織修復(fù)和工程化以及血管生成誘導(dǎo)的應(yīng)用中，例如在傷口愈合、燒傷和缺血性病癥的治療中是有用的。
文檔編號C12N5/077GK102143755SQ200980134877
公開日2011年8月3日 申請日期2009年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者杰爾特-里納·薩爾卡寧, 蒂莫·伊利科米 申請人:杰爾特-里納·薩爾卡寧, 蒂莫·伊利科米