專利名稱：篩選產(chǎn)生生物活性劑的單細(xì)胞的方法
篩選產(chǎn)生生物活性劑的單細(xì)胞的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用于篩選產(chǎn)生一種或多種感興趣的生物活性劑的單細(xì)胞的方法、 裝置和試劑盒，所述生物活性劑諸如蛋白、核酸、或蛋白和編碼其的核酸。引言通常期望篩選產(chǎn)生一種或多種生物活性劑的單細(xì)胞或細(xì)胞小群體。這樣的信息可 用于確定細(xì)胞暴露于生物活性劑后的狀態(tài)或活性以確定這些生物活性劑對細(xì)胞的作用，所 述生物活性劑例如候選藥物諸如小分子、蛋白或siRNA。這樣的信息還可用于鑒定表達(dá)生物 活性劑的特定變體例如SNP或抗體的細(xì)胞。這樣的信息還可用于鑒定編碼感興趣的生物活 性劑例如抗體的核酸序列，以利用核苷酸序列在多個(gè)細(xì)胞中的頻率來預(yù)測或建模其產(chǎn)生的 蛋白的行為或所得的表型。本文的方法、裝置和試劑盒是涉及這些和類似的功用。發(fā)明概要用于篩選產(chǎn)生一種或多種感興趣的生物活性劑的單細(xì)胞的方法、裝置和試劑盒， 所述生物活性劑諸如蛋白、核酸、或蛋白和編碼其的核酸。在實(shí)踐本發(fā)明的方法時(shí)，將產(chǎn)生一種或多種感興趣的生物活性劑的細(xì)胞分離到單 獨(dú)孔中。允許細(xì)胞在孔中產(chǎn)生一種或多種生物活性劑，然后將孔中的一種或多種生物活性 劑與結(jié)合到固體表面的一種或多種結(jié)合劑接觸。結(jié)合劑特異性地結(jié)合孔中的一種或多種感 興趣的生物活性劑，然后基于一種或多種感興趣的生物活性劑與結(jié)合劑或與靶結(jié)合蛋白的 結(jié)合確定關(guān)于孔中細(xì)胞的信息，例如，關(guān)于孔中細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是活性還是失活的信 息。然后將此信息與固體表面的特定尋址區(qū)關(guān)聯(lián)從而鑒定特別感興趣的孔。在本發(fā)明一些 方面中，向孔提供生物活性劑，從而影響孔中細(xì)胞的狀態(tài)和/或活性。在本發(fā)明一些方面中，該方法還包括獲得編碼至少一種感興趣的生物活性劑的核 苷酸序列，并將關(guān)于感興趣的生物活性劑的結(jié)合性質(zhì)的信息與編碼感興趣的生物活性劑核 苷酸序列關(guān)聯(lián)，所述生物活性劑例如構(gòu)成感興趣的蛋白的一種或多種多肽。在本發(fā)明一些方面中，僅獲得編碼至少一種感興趣的生物活性劑的核苷酸序列。 在這些方面，將產(chǎn)生至少一種感興趣的生物活性劑的細(xì)胞分離到單獨(dú)孔中，并獲得編碼一 種或多種生物活性劑的核苷酸序列。然后這種數(shù)據(jù)可用于獲得關(guān)于感興趣的生物活性劑的 元數(shù)據(jù)，例如生物活性劑的結(jié)合性質(zhì)、或感興趣的生物活性劑在被篩選的細(xì)胞群中的出現(xiàn) (represented)步頁率。因此，本發(fā)明提供單獨(dú)地分析大量細(xì)胞的有效方法，而不是分析細(xì)胞群體并報(bào)告 群體的平均測量值。將細(xì)胞分離到小微孔中并在其中加工，其中阻滯或封閉了分子在各微 孔之間擴(kuò)散。另外，由于其小的尺寸，每個(gè)微孔促進(jìn)快速反應(yīng)速率，諸如mRNA雜交或捕獲蛋 白。而且，捕獲到固體基質(zhì)上的蛋白形成基質(zhì)上的陣列，其中可一同分析蛋白對固體基質(zhì)接 觸的動力學(xué)性質(zhì)，或蛋白與所有捕獲的蛋白或復(fù)合體共同的標(biāo)記的親和配體接觸時(shí)的動力 學(xué)性質(zhì)。在閱讀如下更詳細(xì)描述的本發(fā)明方法和實(shí)施方案的細(xì)節(jié)后，本發(fā)明的這些和其它4目標(biāo)、優(yōu)點(diǎn)和特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。附圖簡述結(jié)合附圖閱讀時(shí)，最佳地從以下詳述理解本發(fā)明。重點(diǎn)是，根據(jù)一般實(shí)踐，附圖的 各個(gè)特征不是按比例的。相反，為了清楚，各特征的尺寸是任意放大或縮小的。附圖中包括 以下圖示

圖1是微孔中捕獲的B細(xì)胞或漿細(xì)胞的示意圖。圖2是可連同本發(fā)明的多孔系統(tǒng)使用的方法的流程圖。圖3是mRNA捕獲和隨后轉(zhuǎn)化為標(biāo)簽cDNA的示意圖。圖4描繪用于從抗體-產(chǎn)生細(xì)胞捕獲mRNA的2種寡核苷酸探針的特征，一種探針 是針對小鼠重鏈(上圖)(SEQ ID NO :1)，一種探針是針對小鼠輕鏈(下圖)(SEQ ID NO 2)。401和406是用于被核酸內(nèi)切酶BioI從微陣列裂解下合成的cDNA的識別位點(diǎn)。402 和406是將用于PCR擴(kuò)增的引物序列。403和408是增強(qiáng)PCR引物與包含由多個(gè)N表示的 糾錯(cuò)漢明碼的獨(dú)特14-核苷酸標(biāo)簽G04和409)之間的區(qū)分的界標(biāo)二核苷酸。405是與包 括同種型1、加和2b的小鼠重鏈mRNA恒定區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸(oIigo)。此外，410是與小 鼠κ輕鏈mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸。為了更好的捕獲效率，有間隔子和6個(gè)脫氧腺苷殘基使 得捕獲寡核苷酸遠(yuǎn)離微陣列表面。圖5是可與本發(fā)明系統(tǒng)一起使用的多孔托盤部件(1)的一種實(shí)施方案的圖解視 圖?？装ㄑ刂械乃饕虻刂?-12(2)和沿著列的索引或地址A-H(3)，形成常規(guī)96孔托ο圖6是可與本發(fā)明一起使用的多孔托盤蓋(top)部件的圖解視圖。蓋4包括基本 框架5，并包括蓋上的多個(gè)區(qū)域6。如同圖5的多孔托盤1，每個(gè)區(qū)域6標(biāo)以索引。如同圖5 的托盤，各區(qū)域沿著行編號為1-12，沿著列編號為A-H。切去部分14-17以提供與例如圖7 中蓋部件的準(zhǔn)確對齊。圖7是可與圖6的蓋部件一起使用的多孔托盤部件的第二實(shí)施方案的圖解視圖。 托盤包括框架8，框架8包括多個(gè)孔9。托盤包括在每個(gè)拐角處向上延伸的槽口 10、11、12 和13。槽口 10-13與圖6所示蓋的切去部分14、15、16和17配合。以這種方式，蓋與托盤 可以準(zhǔn)確地彼此對齊。圖8是顯示在圖6的蓋的第二實(shí)施方案的圖解視圖，其中蓋在每個(gè)區(qū)域上包含一 個(gè)突起。托盤蓋20包含框架21和在對應(yīng)圖5的孔3的每個(gè)區(qū)域上包含突起22。在該圖所 示的實(shí)施方案中，每個(gè)區(qū)域包含單個(gè)突起。然而，該區(qū)域可包含2、3、4或任何更大數(shù)目的突 起。圖9是本發(fā)明系統(tǒng)的分解圖解視圖，顯示用于將托盤與托盤蓋對齊的具體部件。圖10是具有不同設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)的微孔601-608的圖解視圖，當(dāng)視野不包括所有微孔 時(shí)其可提供局部可尋址性。定義本文所用的生物活性劑是在生物系統(tǒng)中具備活性的任何劑。生物活性劑的實(shí)例包 括小分子化合物；多肽，如蛋白；siRNA ；和寡核苷酸。多種這樣的生物活性劑將包括，例如， 2種或更多種這樣的劑；在一些情況，3種或更多種劑；5種或更多種劑；10種或更多種劑； 20種或更多種劑；50種或更多種劑；100種或更多種劑；500種或更多種劑；1000種或更多種劑；5000種或更多種劑；10，000種或更多種劑；30，000種或更多種劑；100，000種或更多 種劑；或1，000，000種或更多種這樣的劑。本文所用的術(shù)語“標(biāo)簽”是指標(biāo)明其來源的物理位置的部分。在一些實(shí)施方案中， 標(biāo)簽可以是寡核苷酸標(biāo)簽，其中寡核苷酸的序列作為標(biāo)簽來標(biāo)明其來源的物理位置。本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”包括具有天然或修飾的單體或鍵合的線性寡聚物， 包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其端基異構(gòu)形式、肽核酸(PNA)和類似物，所述寡核苷酸能 夠經(jīng)由單體間相互作用的規(guī)則模式特異性地結(jié)合靶多核苷酸，所述單體間相互作用諸如 Watson-Crick型堿基配對、堿基堆積、Hoogsteen或反向Hoogsteen型堿基配對、或類似相 互作用。通常單體以磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從數(shù)個(gè)單體單位如3-4到數(shù)十 個(gè)單體單位如40-60變化的寡核苷酸。無論何時(shí)寡核苷酸以字母序列諸如“ATGCCTG”表示 時(shí)，應(yīng)理解的是，除非另外指明，否則核苷酸是從左到右以5' .-.3'順序，“A”表示脫氧腺 苷，“C”表示脫氧胞苷，“G”表示脫氧鳥苷，且“T”表示胸苷。通常本發(fā)明的寡核苷酸包括四 種天然核苷酸；然而，還可包括非天然核苷酸類似物。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，當(dāng)可 能采用具有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸，如當(dāng)需要被酶加工時(shí)，通常需要由天然核苷 酸組成的寡核苷酸。提及雙鏈體時(shí)的“完全匹配”是指構(gòu)成雙鏈體的多核苷酸或寡核苷酸鏈彼此形成 雙鏈結(jié)構(gòu)以使每條鏈中的每一個(gè)核苷酸與另一條鏈中的核苷酸進(jìn)行Watson-Crick堿基配 對。該術(shù)語還包括可能采用的核苷類似物諸如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷和類 似物的配對。提及三鏈體時(shí)，該術(shù)語是指三鏈體由完全匹配的雙鏈體和第三鏈構(gòu)成，第三鏈 中的每一個(gè)核苷酸與完全匹配的雙鏈體的堿基對進(jìn)行Hoogsteen或反向Hoogsteen締合。 相反，雙鏈體中標(biāo)簽與寡核苷酸“錯(cuò)配”是指雙鏈體或三鏈體中的一對核苷酸或三聯(lián)體不能 進(jìn)行 Watson-Crick 禾口 / 或 Hoogsteen 禾口 / 或反向 Hoogsteen 成鍵。本文所用的“核苷”包括天然核苷，包括2’ -脫氧和2’ -羥基形式，如由Kornberg 和 Baker，DNA 1 印1化&^011(0離復(fù)制)，第2版(Freeman, SanFrancisco, 1992)所述。提 及核苷時(shí)的“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成的核苷，如由 Scheit, Nucleotide Analogs (核苷酸類似物)(John Wiley, New York, 1980) ；UhIman 和 Peyman, ChemicalReviews 90 =543-584(1990)或類似文獻(xiàn)所述，唯一的前提是其能夠特異 性雜交。這樣的類似物包括設(shè)計(jì)為增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)、減少復(fù)雜性、增加特異性等等的合成的核 苷。術(shù)語“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文可互換使用，描述多核苷酸例如多肽的基 因的序列。類似地，術(shù)語“序列確定”、“確定核苷酸序列，，和“確定核酸序列，，可互換使用， 描述構(gòu)成多核苷酸的核酸或核苷酸的序列的確定，包括確定多核苷酸的部分以及完整序列 信息。即，該術(shù)語包括序列比較、指紋分析、和關(guān)于靶多核苷酸的類似水平的信息，以及靶多 核苷酸中核苷、通常是每種核苷的明確鑒定和順序。該術(shù)語還包括確定靶多核苷酸中四種 核苷酸的一種、兩種或三種的鑒定、順序和位置。本文所用的“表位”是被免疫系統(tǒng)識別，尤其是被抗體、B細(xì)胞或T細(xì)胞識別的大分 子部分。盡管通常認(rèn)為表位來源于非自身蛋白，來源于宿主的可被識別的序列也分類為表 位。被抗體或B細(xì)胞識別的大多數(shù)表位可認(rèn)為是抗原分子的三維表面特征；這些特征與抗 體精確地配合，因此結(jié)合抗體。
本文所用的“雜交”是指其中細(xì)胞RNA或單鏈DNA與具有大致序列互補(bǔ)性的寡核 苷酸相互作用的過程，其中在具有序列互補(bǔ)性的所述區(qū)域形成雙鏈體。本文所用的“微孔”是指亞毫米結(jié)構(gòu)，容積在1皮升和500納升之間。微孔通常 構(gòu)造為允許在平面基質(zhì)上緊密堆積的形狀，即形狀是三角形、矩形或六邊形。微孔可通過 移去通常在蓋上的一個(gè)表面而打開，或通過將所述蓋放置在接觸其它表面而關(guān)閉。微孔可 以是均質(zhì)的，或由相異的材料構(gòu)造，所述材料包括但不限于玻璃、光刻膠或聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。本文所用的“互補(bǔ)位”是指抗體識別抗原表位的部分。本文所用的“phOX”是指4- {[⑵-(5-氧-2-苯基_1，3_亞噁唑_4 (5H)-基)甲基]氨基} 丁酸，以化學(xué)式C14H12N2O4表示。本文所用的“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體”是指低能側(cè)鏈構(gòu)象。利用旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的建成庫允許任 何人確定或建模結(jié)構(gòu)以嘗試最可能的側(cè)鏈構(gòu)象，省時(shí)并產(chǎn)生最可能正確的結(jié)構(gòu)。即，當(dāng)然， 僅當(dāng)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體真正地是正確的低能構(gòu)象的情況。庫以多種方式解決這一質(zhì)量問題僅使 用非常高分辨率的結(jié)構(gòu)(1.8 A或更好)，利用多個(gè)濾器去除其位置可能存疑的側(cè)鏈，利用觀 察到的構(gòu)象的模式而不是平均值(這具有許多益處)，并努力去除系統(tǒng)地不吻合的構(gòu)象。本文所用的“突變”是生物體遺傳物質(zhì)的核苷酸序列的改變。突變可由以下導(dǎo)致 遺傳物質(zhì)在細(xì)胞分裂期間的復(fù)制錯(cuò)誤，暴露于紫外線或電離輻射、化學(xué)誘變劑或病毒，或可 在諸如高突變等過程期間在細(xì)胞控制下故意地發(fā)生。在多細(xì)胞生物體中，突變可細(xì)分為種 系突變和本文所用的“體細(xì)胞突變”，種系突變可傳遞給后代，體細(xì)胞突變不能傳遞給動物 后代。B細(xì)胞在親和性成熟過程中經(jīng)歷體細(xì)胞突變。為了能夠進(jìn)行其生物功能，蛋白折疊為一種或多種具體空間構(gòu)象，這是由多種非 共價(jià)相互作用諸如氫鍵、離子相互作用、范德華力和疏水堆積驅(qū)動的。本文所用的“結(jié)構(gòu)”是 指蛋白結(jié)構(gòu)的四種不同方面a) —級結(jié)構(gòu)是肽鏈的氨基酸序列，b) 二級結(jié)構(gòu)是高度規(guī)則的 亞結(jié)構(gòu)(α螺旋和β折疊鏈)，這是局部界定的，表示在單個(gè)蛋白分子中可存在許多不同二 級基序，c)三級結(jié)構(gòu)是單個(gè)蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)的空間排列，和d)四級結(jié)構(gòu)是 多種在本文通常稱為蛋白亞基的蛋白分子或多肽鏈的復(fù)合體，蛋白亞基的功能是作為更大 的裝配體或蛋白復(fù)合體的部分。本文所用的蛋白是氨基酸以線性鏈排列而構(gòu)成的有機(jī)化合物，并由相鄰氨基酸殘 基的羧基和氨基之間的肽鍵連接在一起。蛋白可包括氨基酸的單個(gè)多肽鏈或氨基酸的多 個(gè)多肽鏈，例如，由二硫鍵結(jié)合在一起的多個(gè)多肽，如抗體。本文所用的“蛋白復(fù)合體”是由 蛋白-蛋白相互作用形成的一組兩個(gè)或多個(gè)締合的蛋白。蛋白復(fù)合體是一種形式的四級結(jié) 構(gòu)。隨著時(shí)間穩(wěn)定的蛋白復(fù)合體在本文稱為“順式蛋白復(fù)合體”。瞬時(shí)的蛋白復(fù)合體在本文 稱為“反式蛋白復(fù)合體”。本發(fā)明涉及順式和反式蛋白復(fù)合體二者。本文所用的“動力學(xué)特征”是指在順式和/或反式蛋白復(fù)合體之間的反應(yīng)速率 k。ff、k。n*其比例KD。對于雙元蛋白復(fù)合體，解離常數(shù)Kd與GilDbs自由能單調(diào)相關(guān)，Gibbs 自由能描述從等溫、等壓過程、與活系統(tǒng)緊密接近的條件可獲得的結(jié)果。本文所用的“靶結(jié)合蛋白，，或“靶蛋白，，是感興趣的生物活性劑結(jié)合的蛋白。靶結(jié) 合蛋白可以是通常結(jié)合感興趣的生物活性劑的蛋白；例如細(xì)胞因子，其中感興趣的生物活 性劑是受體；或抗原，其中感興趣的生物活性劑是抗體。可選地，靶結(jié)合蛋白可以是通常不結(jié)合感興趣的生物活性劑的蛋白；例如，對照細(xì)胞因子。本文所用的“結(jié)合劑”或“捕獲劑”是用于固定生物活性劑的分子。捕獲劑可以是 寡核苷酸、DNA、RNA、蛋白、小分子、肽、適體等等，其對各自的天然或人工配體具有親和性。本文所用的固體表面或固體表面是任何種類的表面或支持物。其可以由玻璃、塑 料、硝化纖維素、聚偏氟乙烯或其它高度非反應(yīng)性材料制成?？赡芨郊咏Y(jié)合/捕獲劑，在這 種情況下，結(jié)合/捕獲劑可以包被固體表面，或結(jié)合/捕獲劑可被包含在固體表面上離散位 置，例如布為點(diǎn)，或局限在墊中，或成形為線。術(shù)語“單克隆抗體”是指選自不同抗體混合物的抗體。相同特異性的所有單克隆 抗體是相同的，除了其天然突變體。本文所用的術(shù)語“抗體”理解為表示免疫球蛋白的完整 分子以及其片段(Fab、F(ab，)、Fv、SCFv)。本文所用的“配體”是能夠結(jié)合生物分子并與其形成復(fù)合體以起到生物目的的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語“B細(xì)胞”是指在骨髓中發(fā)育并高度特異化以產(chǎn)生免疫球蛋白和抗 體的免疫細(xì)胞。B細(xì)胞是來源于骨髓的淋巴細(xì)胞，并提供體液免疫。B細(xì)胞識別溶液中的抗 原分子并成熟為漿細(xì)胞。因此，當(dāng)本文使用術(shù)語“B細(xì)胞”時(shí)，意為包括從B細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞 諸如漿細(xì)胞。術(shù)語“漿細(xì)胞”意為指反應(yīng)于特定抗原從B淋巴細(xì)胞發(fā)育來的細(xì)胞。漿細(xì)胞見于 骨髓和血液中。漿細(xì)胞還可稱為漿B細(xì)胞或漿細(xì)胞(plasmocyte)，是免疫系統(tǒng)中分泌大量 抗體的細(xì)胞。在被CD4+淋巴細(xì)胞刺激時(shí)從B細(xì)胞分化漿細(xì)胞。漿細(xì)胞是一種類型的白血 細(xì)胞，其產(chǎn)生抗體并來源于抗原特異性B細(xì)胞。在本申請中，術(shù)語“B細(xì)胞”意為涵蓋“漿細(xì) 胞”且反之亦然。總之這兩者都意為涵蓋是指產(chǎn)生感興趣的抗體的細(xì)胞的術(shù)語。生物活性劑的特征為其對指定靶生物活性劑例如蛋白的“結(jié)合親和性”。例如，抗 體的特征為其對結(jié)合位點(diǎn)或表位的親和性。每一種抗體包含特定3維結(jié)構(gòu)的氨基酸，其結(jié) 合稱為表位或抗原的另一結(jié)構(gòu)?？贵w對其抗原的結(jié)合是簡單的雙分子、可逆反應(yīng)。如果抗體以Ab表示，抗原以Ag 表示，可由標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)理論分析反應(yīng)。假設(shè)單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，反應(yīng)以以下等式I表示
權(quán)利要求
1.一種從感興趣的分離細(xì)胞獲得信息的方法，包括以下步驟將多個(gè)單獨(dú)細(xì)胞放置在多個(gè)單獨(dú)孔中，其中每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生至少一種感興趣的生物活性劑；將所述孔中的所述至少一種感興趣的生物活性劑與附加至少一種結(jié)合劑的固體表面 接觸，其中所述至少一種結(jié)合劑選擇性地結(jié)合所述至少一種感興趣的生物活性劑，且所述 固體表面包含可與所述單獨(dú)孔關(guān)聯(lián)的可尋址區(qū)；確定關(guān)于所述一種或多種感興趣的生物活性劑與靶結(jié)合蛋白結(jié)合的結(jié)合信息；并將所述結(jié)合信息與所述固體表面的特定尋址區(qū)關(guān)聯(lián)，從而鑒定特別感興趣的孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞為在所述多個(gè)單獨(dú)孔的每個(gè)單獨(dú)孔中大 體上相同的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞選自以下組成的組原代細(xì)胞、來自細(xì)胞 系的細(xì)胞和工程化細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞為在所述多個(gè)單獨(dú)孔的每個(gè)單獨(dú)孔中不 同的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞選自以下組成的組漿細(xì)胞、來自同一人 類受治療者的不同細(xì)胞類型、和來自不同人類受治療者的相同細(xì)胞種類。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中結(jié)合到固體表面的所述至少一種結(jié)合劑選自以下 組成的組蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、抗IgG Fcy亞類特異性抗體、和由所述細(xì)胞產(chǎn) 生的所述至少一種生物活性劑的靶結(jié)合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括向所述孔中的所述細(xì)胞加入生物活性劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中向所述細(xì)胞加入不同生物活性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中向所述細(xì)胞加入相同生物活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中加入所述細(xì)胞的所述生物活性劑選自以下組成 的組小分子化合物、siRNA、蛋白和寡核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括獲得編碼來自所述特別感興趣的孔的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種感興趣的生物活性劑的核 苷酸序列；并將關(guān)于細(xì)胞產(chǎn)生的所述感興趣的生物活性劑的結(jié)合性質(zhì)的信息與編碼所述感興趣的 生物活性劑的核苷酸序列關(guān)聯(lián)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中獲得所述核苷酸序列的步驟包括從所述細(xì)胞獲得mRNA ；從所述mRNA合成cDNA并在所述cDNA中摻入獨(dú)特的孔特異性標(biāo)簽；并將所述cDNA測序。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，還包括匯集包含所述標(biāo)簽的所述cDNA序列并同時(shí)將所述匯集的cDNA序列測序。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將10，000或更多單獨(dú)細(xì)胞放置在相應(yīng)數(shù)目的單 獨(dú)孔中，且所述固體表面中有相應(yīng)數(shù)目的尋址區(qū)；且其中所述孔是以大于100微孔/cm2的密度互連的微孔，并且其中所述孔是微孔且每個(gè)微孔具有1皮升和500納升之間的容積。
15.一種方法，包括以下步驟將來自細(xì)胞群的多個(gè)單獨(dú)細(xì)胞放置在多個(gè)單獨(dú)孔中，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生至少一種感興 趣的生物活性劑；分離感興趣的生物活性劑；并從特別感興趣的孔獲得編碼所述感興趣的生物活性劑的核苷酸序列；并 將感興趣的所述序列與感興趣的所述劑關(guān)聯(lián)，其中將5，000或更多細(xì)胞放置在包括 5,000或更多孔的孔托盤的孔中，并且其中篩選所述孔中劑的感興趣的特征。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中細(xì)胞產(chǎn)生的所述感興趣的生物活性劑是抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中獲得所述核苷酸序列包括獲得所述抗體的重鏈 和輕鏈的核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，還包括采用所述核苷酸序列來產(chǎn)生關(guān)于所述感興趣的生物活性劑的元數(shù)據(jù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述元數(shù)據(jù)包括基于所述核苷酸序列，所述感 興趣的生物活性劑的結(jié)合性質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述元數(shù)據(jù)包括基于所述細(xì)胞群中所述核苷酸 序列的出現(xiàn)頻率，所述細(xì)胞群中所述感興趣的生物活性劑的出現(xiàn)頻率。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及用于篩選產(chǎn)生一種或多種感興趣的生物活性劑的單細(xì)胞的方法、裝置和試劑盒，所述生物活性劑諸如蛋白、核酸、或蛋白和編碼其的核酸。
文檔編號C12Q1/68GK102046809SQ200980119401
公開日2011年5月4日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月5日
發(fā)明者春-楠·陳, 理查德·亞歷克·約根森, 詹姆斯·O·鮑爾比 申請人:單細(xì)胞科技公司