專利名稱：用于診斷與治療目的的微小rna(mirna)和下游靶標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷、預(yù)防和/或治療纖維變性和其它疾病的微小 RNA(miRNA)、特別是miR_21及其下游靶標(biāo)的領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及用于治療纖維變性 的組合物、方法和用途。這類方法包括調(diào)節(jié)和抑制患有纖維變性的受治療者的miRNA活 性。
發(fā)明背景
微小RNA是一大類小的非編碼RNA，它控制多種生物過程，包括由調(diào)節(jié)互補(bǔ)的 靶mRNA的表達(dá)而導(dǎo)致主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Ambros，2004)。在各種疾病實(shí)體中微小 RNA的失調(diào)是由基因組改變(Mi等，2007)、差異性表達(dá)或者在某些情況下將微小RNA 功能改變成為腫瘤抑制物或癌基因的病毒感染所引起的。最近在一系列精細(xì)的遺傳學(xué)研 究中，微小RNA涉及不同心臟功能的調(diào)節(jié)(Care等，2007; Yang等，2007)。雖然這些 研究有助于勾畫出微小RNA在心臟生理學(xué)、生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生中的作用，但是對(duì)微小RNA 在體內(nèi)疾病途徑中的詳盡分子機(jī)制的了解不多。研究表明，單鏈寡核苷酸微小RNA拮 抗劑在體外和體內(nèi)使內(nèi)源微小RNA沉默，因而對(duì)靶mRNA和蛋白質(zhì)水平及代謝產(chǎn)生作用 (Kruetzfeldt等，2005 ； :Esau等，2006)。這些研究結(jié)果表明微小RNA拮抗劑的應(yīng)用在體 內(nèi)證實(shí)了微小RNA的功能，或許更重要的是成為新的治療方式。
發(fā)明_既述
本發(fā)明涉及微小RNA的啟動(dòng)子區(qū)(promoter region)、微小RNA、特別是miR-21的用途、以及用于診斷及用于制備治療和/或預(yù)防纖維變性和/或纖維變性相關(guān)疾病的 藥物的相關(guān)成分。另外，本發(fā)明涉及針對(duì)miR-21的靶標(biāo)的各種反義寡核苷酸。還包括 miR-21、啟動(dòng)子區(qū)和miR-21的靶標(biāo)缺陷型細(xì)胞及其敲除生物。最后，本發(fā)明涉及用于 診斷纖維變性和/或纖維變性相關(guān)疾病的方法以及篩選用于治療纖維變性和/或纖維變性 相關(guān)疾病的有藥物活性的化合物的方法。
本文提供用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變 性的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成 并且具有與miRNA互補(bǔ)的核苷堿基(nucleobase)序列。
本文提供的方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者；給予受治療者 包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成，其中修飾寡 核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或其前體互補(bǔ)。
本文提供的方法包括給予有發(fā)生纖維變性風(fēng)險(xiǎn)的受治療者包含修飾寡核苷酸的 化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具有與miRNA或其前體互補(bǔ)的 核苷堿基序列，從而預(yù)防纖維變性。在某些實(shí)施方案中，纖維變性是肝纖維變性。在 某些實(shí)施方案中，纖維變性是肺纖維變性。在某些實(shí)施方案中，纖維變性是皮膚纖維變 性。在某些實(shí)施方案中，纖維變性是年齡相關(guān)性纖維變性。在某些實(shí)施方案中，纖維變 性是心臟纖維變性。在某些實(shí)施方案中，纖維變性是腎纖維變性。在某些實(shí)施方案中， 纖維變性是脾纖維變性。11
本文提供的方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受治療者包含修飾寡核苷 酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具有與miRNA或其前體互 補(bǔ)的核苷堿基序列，其中受治療者患有至少一種心臟疾病或病癥。
本發(fā)明提供的方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中受治療 者患有至少一種心臟疾病或病癥；并且給予受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述 修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或 其前體互補(bǔ)。
在某些實(shí)施方案中，心臟疾病或病癥選自心臟肥大、高血壓性心力衰竭、舒張 性心力衰竭、收縮性心力衰竭、心臟相關(guān)性貯積病、心肌病、縮窄性心包炎、冠狀動(dòng)脈 疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相關(guān)性纖維變性和 心臟瓣膜疾病。
在某些實(shí)施方案中，心肌病選自擴(kuò)張型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、無梗阻 肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
在某些實(shí)施方案中，心臟瓣膜疾病選自二尖瓣狹窄、主動(dòng)脈瓣狹窄、三尖瓣狹 窄和肺動(dòng)脈瓣狹窄。
在某些實(shí)施方案中，心臟瓣膜疾病選自二尖瓣閉鎖不全、主動(dòng)脈瓣閉鎖不全、 三尖瓣閉鎖不全和肺動(dòng)脈瓣閉鎖不全。
在某些實(shí)施方案中，本文提供的方法還包括給予一種或多種另外的藥物。
在某些實(shí)施方案中，給藥改善心臟重量增加、左心室擴(kuò)張或縮短分?jǐn)?shù)的減低 (impairment of fractional shortening) ο
在某些實(shí)施方案中，給藥防止心臟重量增加、左心室擴(kuò)張或縮短分?jǐn)?shù)的減低。
在某些實(shí)施方案中，給藥改善心臟功能。
在某些實(shí)施方案中，給藥包括靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥或心臟內(nèi)給 藥。
本文提供用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變 性的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成 并且具有與miRNA或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中受治療者患有至少一種肝臟疾病 或病癥。
本文提供的方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中受治療者 患有至少一種肝臟疾病或病癥；并且給予受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修 飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或其 前體互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，至少一種肝臟疾病或病癥是慢性肝損傷。在某些實(shí)施方 案中，至少一種肝臟疾病或病癥是肝炎病毒感染。在某些實(shí)施方案中，肝炎感染是丙型 肝炎感染。在某些實(shí)施方案中，至少一種肝臟疾病或病癥是非酒精性脂肪性肝炎。在某 些實(shí)施方案中，給藥包括靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥。在某些實(shí)施方案中，至少一種肝臟疾 病或病癥是肝硬化。在某些實(shí)施方案中，給藥改善肝功能。
本文提供用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變 性的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成 并且具有與miRNA或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中受治療者患有至少一種肺部疾病或病癥。
本文提供的方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中受治療者 患有至少一種肺部疾病或病癥；并且給予受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修 飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或其 前體互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，至少另一種肺部疾病或病癥是慢性阻塞性肺部疾病。在 某些實(shí)施方案中，給藥包括經(jīng)肺給藥。
本文提供用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變 性的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成 并且具有與miRNA或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中受治療者患有至少另一種疾病或 病癥。
本發(fā)明提供的方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中受治療 者患有至少另一種疾病或病癥；并且給予受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修 飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或其 前體互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，至少另一種疾病或病癥是肺動(dòng)脈高壓。在某些實(shí)施方 案中，至少另一種疾病或病癥是血管相關(guān)性疾病。在某些實(shí)施方案中，血管相關(guān)性疾病 選自動(dòng)脈僵硬(arterial stiffoess)、mediasclerosis和動(dòng)脈硬化。在某些實(shí)施方案中，至少 另一種疾病或病癥是腸硬化。在某些實(shí)施方案中，至少另一種疾病或病癥是全身性硬皮 病。在某些實(shí)施方案中，至少另一種疾病或病癥選自腹膜后纖維變性、增生性纖維變性 (proliferative fibrosis) >增殖性纖維變性(neoplastic fibrosis)、腎源性系統(tǒng)性纖維變性、充 血性纖維變性(injection fibrosis)、縱隔纖維變性、骨髓纖維變性、輸精管切除術(shù)后疼痛 綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在某些實(shí)施方案中，給藥改善纖維變性。在某些實(shí)施方案中，給藥減緩纖維變 性進(jìn)一步發(fā)展。在某些實(shí)施方案中，給藥終止纖維變性進(jìn)一步進(jìn)展。在某些實(shí)施方案 中，給藥減輕纖維變性。在某些實(shí)施方案中，給藥減少膠原含量。
本文提供用于治療纖維增生性疾病的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有 纖維增生性疾病的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè) 連接核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miRNA或其前體互補(bǔ)，從而治療纖 維增生性疾病。
在某些實(shí)施方案中，給藥包括靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、經(jīng)肺給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥 或心臟內(nèi)給藥。
本文提供用于抑制成纖維細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使成纖維細(xì)胞與包含 由12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基 序列與miRNA或其前體互補(bǔ)，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖。
本文提供用于刺激成纖維細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括使成纖維細(xì)胞與包含 由12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基 序列與miR-21或其前體互補(bǔ)，從而刺激成纖維細(xì)胞凋亡。
本文提供增加成纖維細(xì)胞中的Spmuty 1蛋白的方法，所述方法包括使成纖維細(xì) 胞與包含由12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中修飾寡核苷酸的 核苷堿基序列與miRNA或其前體互補(bǔ)，從而刺激Sprcmty 1蛋白表達(dá)。
本文提供用于抑制微小RNA的組合物。在某些實(shí)施方案中，miRNA是 miR-21。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸具有與同miR-21或其前體有至少80%同 一性的核苷堿基序列互補(bǔ)的核苷堿基序列。在某些實(shí)施方案中，miR-21具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷堿基序列。在某些實(shí)施方案中，miR-21前體具有如SEQ ID NO: 11 所示的核苷堿基序列。
在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案 中，修飾寡核苷酸由12個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由13個(gè)連 接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由14個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方 案中，修飾寡核苷酸由15-M個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由15 個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由16個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí) 施方案中，修飾寡核苷酸由17個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由 18個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由19個(gè)連接核苷組成。在某些 實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由20個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由 21個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由22個(gè)連接核苷組成。在某些 實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由23個(gè)連接核苷組成。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸由 24個(gè)連接核苷組成。
在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體的核苷堿 基序列的錯(cuò)配不多于2個(gè)。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 或其前體的核苷堿基序列的錯(cuò)配不多于1個(gè)。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷 堿基序列與miR-21或其前體的核苷堿基序列無錯(cuò)配。
在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQ IDNO : 12的核苷 堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷堿基。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列 包含SEQ ID NO: 12的核苷堿基序列的至少16個(gè)連續(xù)核苷堿基。在某些實(shí)施方案中， 修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少17個(gè)連續(xù)核苷 堿基。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQID NO: 12的核苷堿 基序列的至少18個(gè)連續(xù)核苷堿基。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包 含SEQ ID NO: 12的核苷堿基序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷堿基。在某些實(shí)施方案中，修 飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷堿 基。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQ ID NO: 12的核苷堿基 序列的至少21個(gè)連續(xù)核苷堿基。在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少22個(gè)連續(xù)核苷堿基。
在某些實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸的核苷堿基序列由SEQ ID NO: 12的核苷堿 基序列組成。
在某些實(shí)施方案中，化合物包含與配體綴合的修飾寡核苷酸。在某些實(shí)施方案 中具有以下結(jié)構(gòu)(III)
(5，)QxQz1 (Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L (3，)
(III)
其中
每個(gè)Q獨(dú)立地為2’ -O-甲基修飾核苷；
權(quán)利要求
1.一種用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受 治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具 有與miR-21或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列。
2.—種方法，所述方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者；和給予所述受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接 核苷組成，其中修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)。
3.一種預(yù)防纖維變性的方法，所述方法包括給予有發(fā)生纖維變性風(fēng)險(xiǎn)的受治療者 包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具有與 miR-21或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述纖維變性是肝纖維變性、心臟纖維變性、腎 纖維變性、肺纖維變性、皮膚纖維變性、年齡相關(guān)性纖維變性或脾纖維變性。
5.一種方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受治療者包含修飾寡核 苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具有與miR-21或其前體 互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中所述受治療者患有至少一種心臟疾病或病癥。
6.—種方法，所述方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中所述受治療者患有至少一種心臟疾 病或病癥；和給予所述受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接 核苷組成，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述心臟疾病或病癥選自心臟肥大、高血壓性心力衰 竭、舒張性心力衰竭、收縮性心力衰竭、心臟相關(guān)性貯積病、心肌病、縮窄性心包炎、 冠狀動(dòng)脈疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相關(guān)性纖 維變性和心臟瓣膜疾病。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述心肌病選自擴(kuò)張型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、無 梗阻肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述心臟瓣膜疾病選自二尖瓣狹窄、主動(dòng)脈瓣狹窄、三尖 瓣狹窄和肺動(dòng)脈瓣狹窄。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述心臟瓣膜疾病選自二尖瓣閉鎖不全、主動(dòng)脈瓣閉鎖 不全、三尖瓣閉鎖不全和肺動(dòng)脈瓣閉鎖不全。
11.權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括給予一種或多種另外的藥物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中一種或多種另外的藥物選自利尿藥、inotropes、地 高辛、血管擴(kuò)張藥、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻滯藥 (ARB)、鈣通道阻滯藥、硝酸異山梨酯、胼屈嗪、硝酸鹽、胼屈嗪、β-阻滯藥和利尿納 肽。
13.權(quán)利要求5-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥包括靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、動(dòng)脈 內(nèi)給藥或心臟內(nèi)給藥。
14.權(quán)利要求5-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥改善心臟重量增加、左心室擴(kuò)張或 縮短分?jǐn)?shù)的減低。
15.權(quán)利要求5-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥防止心臟重量增加、左心室擴(kuò)張或 縮短分?jǐn)?shù)的減低。
16.權(quán)利要求5-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥改善心臟功能。
17.一種用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受 治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具 有與miR-21或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中所述受治療者患有至少一種肝臟疾病或 病癥。
18.—種方法，所述方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中所述受治療者患有至少一種肝臟疾 病或病癥；和給予所述受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接 核苷組成，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中至少一種肝臟疾病或病癥是慢性肝損傷。
20.權(quán)利要求17或18的方法，其中至少一種肝臟疾病或病癥是肝炎病毒感染。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述肝炎感染是丙型肝炎感染。
22.權(quán)利要求17或18的方法，其中至少一種肝臟疾病或病癥是非酒精性脂肪性肝炎。
23.權(quán)利要求17或18的方法，其中至少一種肝臟疾病或病癥是肝硬化。
24.權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥包括靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥。
25.權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥改善肝功能。
26.一種用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受 治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具 有與miR-21或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中所述受治療者患有至少一種肺部疾病或 病癥。
27.—種方法，所述方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中所述受治療者患有至少一種肺部疾 病或病癥；和給予所述受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接 核苷組成，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中至少另一種肺部疾病或病癥是慢性阻塞性肺部疾病。
29.權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥包括經(jīng)肺給藥。
30.一種用于治療纖維變性的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維變性的受 治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成并且具 有與miR-21或其前體互補(bǔ)的核苷堿基序列，其中所述受治療者患有至少另一種疾病或病癥。
31.—種方法，所述方法包括鑒定患有或疑似患有纖維變性的受治療者，其中所述受治療者患有至少其它的疾病 或病癥；和給予所述受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接 核苷組成，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)。
32.權(quán)利要求30或31的方法，其中至少另一種疾病或病癥是肺動(dòng)脈高壓。
33.權(quán)利要求30或31的方法，其中至少另一種疾病或病癥是血管相關(guān)性疾病。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述血管相關(guān)性疾病選自動(dòng)脈僵硬、mediasclerosis和動(dòng) 脈硬化。
35.權(quán)利要求30或31的方法，其中至少另一種疾病或病癥是腸硬化。
36.權(quán)利要求30或31的方法，其中至少另一種疾病或病癥是全身性硬皮病。
37.權(quán)利要求30或31的方法，其中至少另一種疾病或病癥選自腹膜后纖維變性、增 生性纖維變性、增殖性纖維變性、腎源性系統(tǒng)性纖維變性、充血性纖維變性、縱隔纖維 變性、骨髓纖維變性、輸精管切除術(shù)后疼痛綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
38.權(quán)利要求33-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥包括靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、動(dòng) 脈內(nèi)給藥、心臟內(nèi)給藥或經(jīng)肺給藥。
39.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥改善纖維變性。
40.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥減緩纖維變性進(jìn)一步發(fā)展。
41.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥終止纖維變性進(jìn)一步發(fā)展。
42.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥減輕纖維變性。
43.一種用于治療纖維增生性疾病的方法，所述方法包括給予患有或疑似患有纖維增 生性疾病的受治療者包含修飾寡核苷酸的化合物，所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核 苷組成，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)，從而治療纖維 增生性疾病。
44.一種用于抑制成纖維細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使成纖維細(xì)胞與包含由 12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基 序列與miR-21或其前體互補(bǔ)，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖。
45.—種用于刺激成纖維細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括使成纖維細(xì)胞與包含由 12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基 序列與miR-21或其前體互補(bǔ)，從而刺激成纖維細(xì)胞凋亡。
46.一種用于在成纖維細(xì)胞中增加Spmutyl蛋白的方法，所述方法包括使成纖維細(xì)胞 與包含由12-30個(gè)連接核苷組成的修飾寡核苷酸的化合物接觸，其中所述修飾寡核苷酸 的核苷堿基序列與miR-21或其前體互補(bǔ)，從而刺激Spmutyl蛋白表達(dá)。
47.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸由12-30個(gè)連接核苷組成。
48.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸由12、13或14個(gè)連接核 苷組成。
49.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸由15-24個(gè)連接核苷組成。
50.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸由15、16、17、18、19、 20、21、22、23或24個(gè)連接核苷組成。
51.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21或其前體的核苷堿基序列的錯(cuò)配不多于2個(gè)。
52.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 或其前體的核苷堿基序列的錯(cuò)配不多于1個(gè)。
53.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與miR-21 或其前體的核苷堿基序列無錯(cuò)配。
54.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19 個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)或至少22個(gè)連續(xù)核苷堿基。
55.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物包含與配體綴合的修飾寡核苷酸。
56.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體是膽固醇。
57.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)核苷間鍵合是修飾核苷間鍵合。
58.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)核苷間鍵合都是修飾核苷間鍵合。
59.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)核苷間鍵合為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
60.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)核苷間鍵合都是硫代磷酸酯核苷間鍵合。
61.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)核苷包含修飾糖。
62.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中眾多核苷的每一個(gè)都包含修飾糖。
63.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)核苷都包含修飾糖。
64.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。
65.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中眾多核苷的每一個(gè)都包含2’-O-甲氧基乙 基糖，且眾多核苷的每一個(gè)都包含2’ -氟糖。
66.權(quán)利要求61-63中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)修飾糖獨(dú)立選自2’-O-甲氧基乙基 糖、2’ -氟糖、2’ -O-甲基糖或二環(huán)糖部分。
67.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)核苷包含修飾核苷堿基。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述修飾核苷堿基是5-甲基胞嘧啶。
69.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶 是5-甲基胞嘧啶。
70.權(quán)利要求69的方法，其中每個(gè)胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
71.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與SEQID NO 1的核苷堿基序列有至少90%互補(bǔ)性或至少95%互補(bǔ)性。
72.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與SEQID NO 1的核苷堿基序列有100%互補(bǔ)性。
73.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與SEQID NO 1的核苷堿基序列具有全長(zhǎng)互補(bǔ)性。
74.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與SEQID NO 11的核苷堿基序列有至少90%互補(bǔ)性或至少95%互補(bǔ)性。
75.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與SEQIDNO 11的核苷堿基序列有100%互補(bǔ)性。
76.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-21核苷堿基序列由SEQID NO 1 的核苷堿基序列組成。
77.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述前體核苷堿基序列由SEQID NO: 11的 核苷堿基序列組成。
78.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中把包含修飾寡核苷酸的化合物制成藥物組合物。
79.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物由修飾寡核苷酸組成。
80.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸是單鏈修飾寡核苷酸。
81.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述給藥減少膠原含量。
82.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述修飾寡核苷酸是反義寡核苷酸。
83.與miR-21互補(bǔ)的反義寡核苷酸在制備用于治療和/或預(yù)防纖維變性的藥物中的用途。
84.一種用于治療和/或預(yù)防纖維變性的與miR-21互補(bǔ)的反義寡核苷酸。
85.與miR-21互補(bǔ)的反義寡核苷酸在制備用于診斷纖維變性的藥物中的用途。
86.一種用于診斷纖維變性的與miR-21互補(bǔ)的反義寡核苷酸。
87.一種用于診斷纖維變性的方法，所述方法包括以下步驟a.提供假定患有纖維變性的患者的樣品；b.測(cè)定miR-21的表達(dá)；其中與對(duì)照樣品相比miR-21水平升高，說明了纖維變性或其誘因。
88.一種用于篩選有藥物活性的用于治療和/或預(yù)防纖維變性或其誘因的化合物的方 法，所述方法包括以下步驟a.提供含有miR-21的樣品；b.使候選物質(zhì)與樣品接觸；c.測(cè)定候選物質(zhì)對(duì)樣品的作用；其中miR-21的改變表明有藥物活性的化合物。
89.—種用于診斷、預(yù)防和/或治療纖維變性的微小RNA(miRNA)的啟動(dòng)子區(qū)，所述 啟動(dòng)子區(qū)包含鈣/cAMP反應(yīng)元件蛋白(CREB)和/或血清應(yīng)答因子(SRF)結(jié)合位點(diǎn)的修 飾，其中miRNA是miR-21，且纖維變性定義為作為修復(fù)或反應(yīng)性過程的器官或組織中過 量纖維性結(jié)締組織的形成或發(fā)展。
90.權(quán)利要求89的啟動(dòng)子區(qū)，其中miRNA是SEQIDNO 1。
91.權(quán)利要求89或90的啟動(dòng)子區(qū)，其中所述修飾選自點(diǎn)突變、截短、缺失和倒置。
92.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的啟動(dòng)子區(qū)，其中所述啟動(dòng)子區(qū)選自SEQIDNO:2 SEQ ID NO 4。
93.一種miR-21缺陷型細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含權(quán)利要求89的啟動(dòng)子區(qū)。
94.一種化合物，所述化合物包含與配體綴合的修飾寡核苷酸，其中所述化合物具有 以下結(jié)構(gòu)(III)(5，WxQz1 (Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L (3，) (III)其中每個(gè)Q獨(dú)立地為2’ -修飾核苷；
95.權(quán)利要求94的化合物，其中Rd為膽固醇。
96.權(quán)利要求94或95的化合物，其中ζ1、ζ2、ζ3和ζ4中的每一個(gè)為 A
97.權(quán)利要求94的化合物，其中R1為-CH2ORb。
98.權(quán)利要求97的化合物，其中R9為0H。
99.權(quán)利要求98的化合物，其中R1和R9為反式。
100.權(quán)利要求94的化合物，其中R9為OH。
101.權(quán)利要求100的化合物，其中R1和R3為反式。
102.權(quán)利要求94的化合物，其中R3為-CH2ORb。
103.權(quán)利要求102的化合物，其中R1為OH。
104.權(quán)利要求103的化合物，其中R1和R3為反式。
105.權(quán)利要求102的化合物，其中R9為OH。
106.權(quán)利要求102的化合物，其中R3和R9為反式。
107.權(quán)利要求94的化合物，其中R9為CH2ORb。
108.權(quán)利要求107的化合物，其中R1為OH。
109.權(quán)利要求108的化合物，其中R1和R9為反式。
110.權(quán)利要求94的化合物，其中X為NC(O)R7。
111.權(quán)利要求110的化合物，其中R7為-CH2(CH2) 3CH2NHC (O) Rd。
112.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中每個(gè)2’-修飾核苷獨(dú)立選自2’ -O-甲 氧基乙基核苷、2’ -氟核苷、2’ -O-甲基核苷或二環(huán)核苷。
113.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中每個(gè)2’-修飾核苷都是2’ -O-甲氧基 乙基核苷。
114.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中每個(gè)2’-修飾核苷都是2’ -O-甲基核苷。
115.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中至少一個(gè)核苷包含修飾核苷堿基。
116.權(quán)利要求115的化合物，其中所述修飾核苷堿基是5-甲基胞嘧啶。
117.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中至少一個(gè)核苷包含胞嘧啶，其中所述胞 嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
118.權(quán)利要求117的化合物，其中每個(gè)胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
119.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與 SEQ ID NO 11的核苷堿基序列有至少95%互補(bǔ)性。
120.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列與 SEQ ID NO 11的核苷堿基序列有100%互補(bǔ)性。
121.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 15-23。
122.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 16。
123.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 17。
124.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 18。
125.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 19。
126.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 20。
127.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 21。
128.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 22。
129.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η= 23。
130.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷堿基。
131.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少16個(gè)連續(xù)核苷堿基。
132.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少17個(gè)連續(xù)核苷堿基。
133.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少18個(gè)連續(xù)核苷堿基。
134.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷堿基。
135.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷堿基。
136.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少21個(gè)連續(xù)核苷堿基。
137.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列的至少22個(gè)連續(xù)核苷堿基。
138.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述修飾寡核苷酸的核苷堿基序列由 SEQ ID NO 12的核苷堿基序列組成。
139.—種包含以下結(jié)構(gòu)(III)的化合物(
全文摘要
本發(fā)明涉及微小RNA的啟動(dòng)子區(qū)、微小RNA、特別是miR-21的用途、以及用于診斷的相關(guān)成分和用于制備治療和/或預(yù)防纖維變性和/或纖維變性相關(guān)疾病的藥物的相關(guān)成分。另外，本發(fā)明涉及針對(duì)miR-21的靶標(biāo)的反義寡核苷酸。還包括miR-21缺陷型細(xì)胞、啟動(dòng)子區(qū)和miR-21的靶標(biāo)及其敲除生物。最后，本發(fā)明涉及用于診斷纖維變性和/或纖維變性相關(guān)疾病的方法以及用于篩選用于治療纖維變性和/或纖維變性相關(guān)疾病的有藥物活性的化合物的方法。本發(fā)明還涉及用于治療、改善和/或預(yù)防纖維變性的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述組合物調(diào)節(jié)用于治療、改善和/或預(yù)防纖維變性的miRNA的活性。在某些實(shí)施方案中，組合物抑制用于治療、改善和/或預(yù)防纖維變性的miR-21的活性。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102027113SQ200980115916
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者C·格羅斯, J·鮑爾薩赫斯, S·恩格爾哈德特, T·圖姆 申請(qǐng)人:朱利葉斯·馬克西米利安-維爾茨堡大學(xué)