專利名稱：利用腸桿菌同時制取氫氣和2，3-丁二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用腸桿菌作為目標(biāo)菌種來厭氧發(fā)酵同時產(chǎn)生氫氣和2， 3- 丁二 醇的方法，屬于生物化工技術(shù)方面。
背景技術(shù)：
氫能是一種值得期待的新型環(huán)保的能源。氫氣的來源廣，燃燒值高，氫的熱值高于 所用化石燃料和生物質(zhì)燃料；氫氣本身無色無味無毒，是最環(huán)保的能源之一 ；氫氣在燃燒 時，效率很高，這是化石燃料和其他生物燃料難以相比的。氫氣的存在形式多樣，氫氣可以 以氣態(tài)，液態(tài)或者固態(tài)金屬氫化物出現(xiàn)，能適應(yīng)儲運及各種應(yīng)用環(huán)境的要求。由于氫具有的 優(yōu)點，可以同時滿足資源、環(huán)境和持續(xù)發(fā)展的要求，在未來能源體系中，氫能將成為各種能 源形式之間轉(zhuǎn)化的最優(yōu)良載體。氫能作為一種清潔、高效、安全、可持續(xù)的新能源，被視為21 世紀(jì)最具有發(fā)展?jié)摿Φ哪茉础?2，3-丁二醇是一種極具價值的液體燃料，其燃燒值可與甲醇、乙醇相媲美，2， 3- 丁二醇也是一種非常有潛力的化工原料。2， 3- 丁二醇脫水形成的甲乙酮可作樹脂、油 漆等溶劑；再進(jìn)一步脫水可形成1，3-丁二烯，可用于合成橡膠、聚酯和聚亞胺酯；酯化形式 的2，3-丁二醇是合成聚亞胺的前體，可應(yīng)用藥物、化妝品、洗液等；通過催化脫氫得到的二 乙酰化形式的2， 3-丁二醇可以用作高價值香料的食品添加劑；2， 3-丁二醇自身可以作為 單體用來合成高分子化合物；左旋的2，3-丁二醇由于具有較低的凝固點可用作抗凍劑；2， 3_ 丁二醇與甲乙酮脫氫形成辛烷異構(gòu)體，可生產(chǎn)高級航空用油；2， 3- 丁二醇與乙酸反應(yīng)生 成2， 3- 丁二醇二乙酸酯，此酯類可加到奶油中改善風(fēng)味；2， 3- 丁二醇在我國還被添加到白 酒中，以改善白酒的風(fēng)味；2，3-丁二醇的結(jié)構(gòu)中含有兩種具有旋光性的手性化合物，因此 具有很高的醫(yī)用和藥用價值。 目前，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的方式有多種，主要的菌種包括梭菌屬(Clostridium)、脫硫 弧菌屬(Desulfovibrio) 、士矣希氏菌屬(Escherichia)、固氮菌屬(Azotobacter)、腸桿菌屬 (Enterobacter)、擰檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、甲烷球菌屬(Methanococcus)等，對這些 菌種的研究主要集中在氫氣的產(chǎn)生上；而厭氧發(fā)酵產(chǎn)生2，3-丁二醇的菌種也有很多，主要 包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、產(chǎn)氣 氣桿菌屬(Aerobacter aerogenes)、產(chǎn)氣腸桿菌屬(Enterobacter aerogenes)、嗜水氣單 胞菌(Aeromonas hydrophila)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)的一些微生物。通常情況 下，上述菌種只能單一產(chǎn)生氫氣或2， 3- 丁二醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵同時產(chǎn)生氫氣和2， 3- 丁二 醇的方法。
本發(fā)明實現(xiàn)過程如下 產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteriaceace Bacterium M580)是一禾中屬于腸桿菌屬的菌種，本發(fā)明所篩選的基質(zhì)是基于陜西浐河河底深層污泥，該污泥經(jīng)過梯度馴化和稀釋，經(jīng)過 多次篩選分離純化后得到一株能同時高產(chǎn)氫氣和2，3丁二醇的菌種，經(jīng)過16S rDNA鑒定該 菌種和產(chǎn)氣腸桿菌(EnterobacteriaceaceBacterium M580)的同源性達(dá)到了 98%，因此可 以石角定該菌禾中為Enterobacteriaceace Bacterium M580。 該菌禾中Enterobacteriaceace Bacterium M580在厭氧的條件下制備氧氣禾口 2， 3-丁二醇，其制備工藝具體如下 (1) Enterobacteriaceace Bacterium M580禾中子培養(yǎng) 從凍藏管中吸取200 L種子液到平板上進(jìn)行種子的活化，然后將上述平板上的 種子接種到種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的組成如下 葡萄糖10-12g/L;胰蛋白胨2-4g/L;牛肉膏1.5-2g/L;酵母粉0. 5-0.8g/L; NaCl 1. 5-3g/L ;K2HP040. 5_2g/L。將上述培養(yǎng)基用磷酸調(diào)節(jié)其pH值到5. 8_7. 0 ;種子液采 用lOOmL搖瓶進(jìn)行。將種子培養(yǎng)基在搖床中培養(yǎng)10個小時左右，培養(yǎng)條件為35t:，轉(zhuǎn)速為 100-160rmp。 (2) Enterobacteriaceace Bacterium M580發(fā)酵液培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下 葡萄糖18-25g/L ;胰蛋白胨5-8g/L ;牛肉膏2_3g/L ;酵母粉l_3g/L ;NaC13-6g/L ; K2HP041. 5-3g/L ;KH2P041. 5_3g/L， L_半胱氨酸0-1. 2g/L，微量元素液(MnS04. 7H20 0. Olg/ L，ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H3B030. 01g/L，CaCl2. 2H200. 01g/L， NaMo040. 01g/L， A1K(S04)20. Olg/ L)8-15mL ;將上述培養(yǎng)基用磷酸調(diào)節(jié)其pH值到5. 8_6. 8，在12rC高溫滅菌20min。反應(yīng)裝 置采用250mL的搖瓶，其裝樣量為150mL，接種量按3 % -6 %的接種量進(jìn)行。接完種后用硅膠 塞塞好反應(yīng)裝置，向反應(yīng)瓶中沖入惰性氣體(氬氣或氮氣等)使之形成厭氧環(huán)境，然后用石 蠟密封好反應(yīng)瓶口。發(fā)酵體系的培養(yǎng)條件為35t:，轉(zhuǎn)速為100-160rmp，培養(yǎng)時間為10-14 小時 在排氣孔用氣袋收集產(chǎn)生的氣體，利用氣相色譜的TCD檢測器檢測其中的氫氣含 量，發(fā)酵液即為含有2， 3- 丁二醇的發(fā)酵液。反應(yīng)完后，發(fā)酵液經(jīng)過離心等處理后，利用氣相 色譜的FID檢測器即可檢測其中2， 3- 丁二醇的含量。 本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果本發(fā)明使用產(chǎn)氣腸桿菌 EnterobacteriaceaceBacterium M580進(jìn)行厭氧發(fā)酵同時產(chǎn)生氫氣禾口 2，3-丁二醇，發(fā)酵過 程簡單，反應(yīng)周期短，具有較高的應(yīng)有價值。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1 : 發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下 葡萄糖18g/L ;胰蛋白胨6g/L ;牛肉膏2g/L ;酵母粉lg/L ;NaCl 4g/L ;K2HP042g/ L ;KH2P042g/L ;L-半胱氨酸0. 3g/L ;微量元素液(MnS04. 7H200. 01， ZnS04. 7H20 0. 05， H3B030. 01， CaCl2. 2H200. 01， NaMo040. 01， A1K(S04)20. 01) 10mL ;培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5. 8。將 上述培養(yǎng)基分配到250mL的三角瓶中，其中培養(yǎng)基的裝樣量為150mL。上述培養(yǎng)基在121°C 下高溫滅菌20min。
將活化后的種子液接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35t:，轉(zhuǎn)速為
150rmp。然后將上述種子液按4%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用硅膠塞塞好三角瓶 口，用石蠟密封瓶口。然后向反應(yīng)瓶中沖入氬氣使之形成厭氧的環(huán)境。將上述培養(yǎng)裝置放 置于搖床中培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為35t:，轉(zhuǎn)速為130rmp，發(fā)酵過程持續(xù)12小時。利用氣袋收 集產(chǎn)生的氫氣，定時檢測氫氣含量，細(xì)胞濃度和2，3-丁二醇的含量。發(fā)酵完后細(xì)胞濃度達(dá) 到了 4. 35(0De。。)，150mL培養(yǎng)基中總共產(chǎn)生了 366mL氫氣，同時發(fā)酵液中2，3-丁二醇的產(chǎn) 量達(dá)到了 0. 962g。發(fā)酵完后氫氣的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 1. 17mol/mo1葡萄糖，2， 3-丁二醇的轉(zhuǎn)化 率達(dá)到了理論轉(zhuǎn)化率的70%。
實施例2 :
其培養(yǎng)基的組成如下 葡萄糖20g/L ;胰蛋白胨5g/L ;牛肉膏3g/L ;酵母粉1. 5g/L ;NaCl 4g/L ; K2HP041. 5g/L ;KH2P041. 5g/L ;微量元素液(MnS04. 7H20 0. 01， ZnS04. 7H200. 05， H3B030 . 01， CaCl2. 2H20 0. 01， NaMo040. 01， A1K(S04)20. 01) 10mL ;培養(yǎng)基的pH用濃度為0. 2mol/L的擰 檬酸緩沖液體系(pH = 4.0)調(diào)到6.4。培養(yǎng)的裝置采用250mL的三角瓶，其中裝樣量為 150mL。上述培養(yǎng)基在121。C高溫滅菌20min。 將平板上的種子接種到種子液中，在35t:，轉(zhuǎn)速為130rmp的條件下培養(yǎng)8個小 時。然后按照4%的接種量接種到發(fā)酵瓶中，用硅膠塞塞好反應(yīng)瓶，用石蠟密封瓶口 ，向反 應(yīng)瓶中沖入氬氣作為保護(hù)氣。將反應(yīng)裝置放置于搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35t:，轉(zhuǎn)速為 130rmp，培養(yǎng)時間為12個小時。用集氣袋收集產(chǎn)生的氫氣，利用氣相色譜定時檢測反應(yīng)產(chǎn) 生的氫氣、細(xì)胞濃度和2，3-丁二醇的含量。發(fā)酵完后細(xì)胞濃度達(dá)到了 3. 92(0D6。。) ， 150mL培 養(yǎng)基中總共產(chǎn)生了 398mL氫氣，同時發(fā)酵液中2， 3- 丁二醇的量達(dá)到了 0. 9g。其中氫氣的轉(zhuǎn) 化率達(dá)到了 1. 28mol/mo1葡萄糖，2， 3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了理論轉(zhuǎn)化率的66%。
權(quán)利要求
腸桿菌Enterobacteriaceace Bacterium M580在同時制取氫氣和2，3-丁二醇中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖18-25g/L ;胰蛋白胨5-8g/L ;牛肉膏2_3g/L ;酵母粉l_3gg/L ;NaCl 3_6g/L ; K2HP041. 5-3g/L ;KH2P041. 5_3g/L， L_半胱氨酸0-1. 2g/L，微量元素液8_15mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用途，其特征在于微量元素液組成如下MnS04. 7H20 0. 01g/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H3B030. 01g/L， CaCl2. 2H200. 01g/L， NaMo040 . 01g/L， A1K(S04)20. 01g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述用途，其特征在于具體生產(chǎn)方法如下(1) Enterobacteriaceace Bacterium M580禾中子培養(yǎng)吸取種子液到平板上進(jìn)行種子的活化，然后將平板上的種子接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖10-12g/L ;胰蛋白胨2-4g/L ;牛肉膏1. 5-2g/L ;酵母粉0. 5-0. 8g/L ;NaCl 1. 5-3g/L ;K2HP040. 5-2g/L ;將上述培養(yǎng)基用磷酸調(diào)節(jié)其pH值到5. 8-7. 0 ;(2) Enterobacteriaceace Bacterium M580發(fā)酵培養(yǎng) 將發(fā)酵培養(yǎng)基用磷酸調(diào)節(jié)其pH值到5. 8-6. 8，在12rC高溫滅菌； 將上述種子液按3% _6%的接種量接種到發(fā)酵搖瓶中，接種完后向反應(yīng)瓶中沖入惰性氣體使之形成厭氧環(huán)境，將上述培養(yǎng)裝置放置于空氣浴中恒溫培養(yǎng)，在排氣孔用氣袋收集 產(chǎn)生的氣體，經(jīng)過處理后即可得到純凈的氫氣；發(fā)酵液即為含有2，3-丁二醇液體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述用途，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度為30 3『C，轉(zhuǎn)速為 100-160rmp，培養(yǎng)時間為10-14小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用腸桿菌Enterobacteriaceace Bacterium M580同時制取氫氣和2，3-丁二醇的方法，包括Enterobacteriaceace Bacterium M580的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。具體地說，將種子液按3％-6％的接種量接種到發(fā)酵搖瓶中，接種完向反應(yīng)瓶中沖入惰性氣體使之形成厭氧環(huán)境，將上述培養(yǎng)裝置放置于空氣浴中恒溫培養(yǎng)，在排氣孔用氣袋收集產(chǎn)生的氣體，經(jīng)過處理后即可得到純凈的氫氣；發(fā)酵液即為含有2，3-丁二醇液體。本發(fā)明操作過程簡單，發(fā)酵周期短，具有較強(qiáng)的實用性和發(fā)展前景。
文檔編號C12R1/01GK101709280SQ20091021950
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者范代娣, 陳火晴, 馬曉軒, 馬沛, 駱艷娥 申請人:西北大學(xué)