專利名稱：D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。
二背景技術(shù)：
D-氨基酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域，它是合成新藥如抗菌和抗病 毒藥物、食品添加劑如人工甜味劑的重要中間體。其中D-絲氨酸是一種內(nèi)源性 腦信息協(xié)傳物質(zhì)，它可以用于預(yù)防或治療腦缺血缺氧所致腦損傷。近年來人們 發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著區(qū)域性的高濃度D-絲氨酸，它作為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的內(nèi)源性配體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的產(chǎn)生、代謝 和生理藥理等方面具有重要作用。此外，D-絲氨酸不僅用于合成治療結(jié)核病的 特效藥D-環(huán)絲氨酸，還可作為制備其它醫(yī)藥中間體的重要原料。
D-氨基酸很難從自然界中獲得，目前研究或產(chǎn)業(yè)化一般通過拆分外消旋絲 氨酸的方法制備，拆分的方法有化學(xué)拆分、物理拆分及酶拆分。
1、 化學(xué)拆分法
2005年，秦為民等(化學(xué)試劑，2005， 11)以2-N- (N'-節(jié)基)脯氨酰-氨 基-二苯甲酮甘氨酸席夫堿Ni (II)復(fù)合物與聚甲醛反應(yīng)，生成2-N- (N'-芐基) 脯氨酰-氨基-二苯甲酮絲氨酸席夫堿Ni (II)復(fù)合物，經(jīng)水解制備了 D-或L-絲氨酸。
2007年，吳劉洋等(氨基酸和生物資源，2007， 2)以DL-絲氨酸為原料， 經(jīng)甲酯化后與L-2，3-二苯甲酰酒石酸反應(yīng)得到D-絲氨酸甲酯'L-2,3-二苯甲酰酒 石酸鹽，經(jīng)水解制得D-絲氨酸，總收率為74.8%。
2、 物理拆分法
2007年，Seung-Hee Son等(Journal of Applied Polymer Science, 2007， 104) 以界面聚合技術(shù)制備了分子印跡復(fù)合膜，該膜能選擇性透過D-絲氨酸。當(dāng)光學(xué) 拆分外消旋絲氨酸時(shí)，D-絲氨酸的擴(kuò)散速率比L-絲氨酸快，復(fù)合膜中絲氨酸對 映體過量值達(dá)80%左右。
2007年，馬云峰等(CN 1900052A)以誘導(dǎo)結(jié)晶法制備左旋絲氨酸和右旋 絲氨酸，收率96%以上。3、酶法
2006年，朱延新等(CN 1834257A)以乙酰甘氨酸為起始原料，與甲醛反 應(yīng)直接制備乙酰-DL-絲氨酸，進(jìn)而用?；富虻鞍酌覆鸱值玫紻-絲氨酸。
2006年，池田創(chuàng)等(CN 1280424C)利用高活性的L-絲氨酸脫氨酶重組菌 株，與含有DL-絲氨酸的介質(zhì)混合分解L-絲氨酸，然后從該介質(zhì)中提取殘存的 D-絲氨酸。
2007年，安樂城正等(CN 101040047A)構(gòu)建了具有D-絲氨酸合成酶活性 的基因工程菌，并利用該酶以甲醛和甘氨酸為原料制備D-絲氨酸。
2008年，龐敏等(食品與發(fā)酵工業(yè)，2008， 10)以吲哚和DL-絲氨酸為底 物，利用大腸桿菌A co//色氨酸酶酶促轉(zhuǎn)化，在生成L-色氨酸的同時(shí)得到D-
絲氨酸。
此夕卜，曰本專禾U (Japanese Published Unexamined Patent Application No. 61-152291)公開報(bào)導(dǎo)了通過微生物作用，由DL-羥甲基乙內(nèi)酰脲生成N-氨基甲 酰基-D-絲氨酸，然后水解得到D-絲氨酸的方法。日本專利(Japanese Published Unexamined Patent Application No. 5-91895)將具有酪氨酸酶活性的微生物與含 有DL-絲氨酸和酚的反應(yīng)液互相作用，將L-絲氨酸轉(zhuǎn)換成L-酪氨酸，分離提取 殘存的D-絲氨酸。
以上提及酶法制備D-絲氨酸的方法存在酶活低，L-絲氨酸分解不完全需要 進(jìn)行DL-絲氨酸分離，生成的D-絲氨酸濃度低等不利因素，用作D-絲氨酸工業(yè) 生產(chǎn)都有難度。
氨基?；赣捎诰哂懈咝院蛷V泛的底物特異性，在手性氨基酸生產(chǎn)中己 被廣泛應(yīng)用。
2000年姚文兵等(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 31)以固定化牛腎氨基?；?酶拆分DL-丙氨酸。
2005年，錢紹松等(化工進(jìn)展，2005， 24)利用米曲霉的氨基?；富钚?拆分了DL-茶氨酸，在最適條件下，L-茶氨酸收率達(dá)到理論收率的85%。
2005年，高大響等(氨基酸和生物資源，2005， 27)選育了刺孢小克銀漢 霉9980菌株，并利用其氨基酰化酶拆分了 DL-丙氨酸，D-丙氨酸得率達(dá)87.1%。
2006年，崔志芳等(化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，2006， 22)利用從豬腎中提取
4的氨基?；?，對N-乙酰-DL-蛋氨酸進(jìn)行了拆分，在最佳工藝條件下L-蛋氨酸 的產(chǎn)率可達(dá)45%。2009年，焦慶才等(精細(xì)化工，2009， 26)構(gòu)建了具有氨基?；富钚缘?基因工程菌DM202，并以該菌的固定化細(xì)胞光學(xué)拆分了 DL-丙氨酸。但到目前為止，以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)乙?；被??；覆鸱?、酸水解等歩驟制備D-絲氨酸的方法還未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。 三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本制備D-絲氨酸的方法。目前受技術(shù)和成本的限制，我國氨基酸工業(yè)中D-絲氨酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足 市場需求。本發(fā)明采用DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)?；⒚阜ú?分、酸水解等步驟得到D-絲氨酸，原料成本低，酶法拆分效率高，反應(yīng)條件溫 和，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明可以通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其歩驟為(1) 以DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為起始原料，用醋酐乙?；肗-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(2) 將含有氨基?；傅挠坞x細(xì)胞或固定化細(xì)胞或該酶提取液與pH6 10的 N-乙酰-DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在 3(TC 6(TC條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；(3) 通過等電點(diǎn)結(jié)晶法或等電點(diǎn)結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法對反應(yīng)生成 物進(jìn)行分離，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-垸氧 基丙酸；(4) 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解得到D-絲氨酸和L-絲氨酸。 上述步驟(1)所用的DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸或DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸。上述步驟(2)所用的氨基?；竵碓从趧?dòng)物內(nèi)臟或具有氨基?；富钚缘?微生物菌株或基因工程菌株。動(dòng)物內(nèi)臟來源的氨基酰化酶為豬腎或牛腎粗酶提 取液，微生物來源的氨基?；笧槊浊够虼替咝】算y漢霉或基因工程菌。氨基?；傅男螒B(tài)為粗酶提取液或游離菌體或固定化細(xì)胞。所用的N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液濃度為20g/L 500g/L，最適濃度為100g/L 350g/L， 溶液pH為6 10，調(diào)溶液pH所用的無機(jī)堿為碳酸鈉或碳酸氫鈉或氫氧化鈉或 氫氧化鉀。所述的表面活性劑為吐溫-80或十六垸基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛 基苯基醚，其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為鈷離子或鈣離子或鎂 離子或錳離子，其濃度為lxl(r2mol/L lxlO—6mol/L。上述步驟(4)所用的鹽酸質(zhì)量濃度為20% 37%，氫溴酸質(zhì)量濃度為20% 47%，回流反應(yīng)直至反應(yīng)物脫去垸氧基和乙?；?。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1) 以DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為起始原料制備D-絲氨酸，成本低廉，工藝 簡單，產(chǎn)物得率高。(2) 酶促反應(yīng)中使用的氨基酰化酶來源廣泛，酶法轉(zhuǎn)化條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高， 為大量生產(chǎn)D-絲氨酸提供了可能。(3) N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸理化性質(zhì)差異大，用等電點(diǎn)結(jié)晶或等電點(diǎn)結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離制備，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(4) 具有原料來源豐富，價(jià)格低廉，酶法轉(zhuǎn)化時(shí)間短，操作簡便，生產(chǎn)成本低 等優(yōu)點(diǎn)。四具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下1、 取50gDL-2-氨基-3-甲氧基丙酸溶于150mL水中，用質(zhì)量濃度30%的NaOH 水溶液調(diào)pH9，控制反應(yīng)液溫度低于2(TC，緩慢滴加醋酐進(jìn)行?；磻?yīng)，同時(shí) 滴加30。/。NaOH水溶液控制pH10左右，?；瓿珊笳婵諠饪s，濃縮液調(diào)pH2， 冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸64.8g， 含量95%，摩爾收率91%。2、 將從豬腎中提取的氨基?；复置敢?0mL加入到590mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化 液含64.8gN-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸，0.6mL0.1 mol/L鈷離子，pH7.5， 40。C反應(yīng)15h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-甲氧基丙酸濃度36g/L，對N-乙酰-L-2-氨 基-3-甲氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為95%?；钚蕴棵撋?，減壓濃縮至60mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的混合結(jié)晶 32g，將32g混合結(jié)晶加入到120mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-甲氧基丙酸15.6g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸22g，結(jié) 晶母液循環(huán)套用。4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸22g和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸15.6g，分別溶于質(zhì)量濃度35%的鹽酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫色后上陽離子交換柱分離，得D-絲氨酸10.1g，比旋光["]，=-14.8° (c=10， 2N HC1)和L-絲氨酸9.6g，比旋光[ ]^=+14.5° (c=10， 2NHC1)。實(shí)施例二 D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下1、 稱取100g DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g，含量95%，摩爾收 率92%。2、 將從牛腎中提取的氨基?；复置敢?0mL加入到990mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化 液含127gN-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈷離子，pH7.5， 40°C 反應(yīng)24h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-乙氧基丙酸濃度44g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為 96%。3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 80。C，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的混合結(jié)晶 62.7g，將62.7g混合結(jié)晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-乙氧基丙酸30.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸 42g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸42g和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸30.8g，分 別溶于質(zhì)量濃度45%的氫溴酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸18.9g，比旋光[ ]，=-14.7°"=10， 2NHC1)和L-絲氨酸17g，比旋光+14.6° (c=10， 2NHC1)。實(shí)施例三D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取100g DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸126g，含量94%，摩爾收 率92%。
2、 將1000mL發(fā)酵液抽濾得到的米曲霉33g加入到990mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液 含126gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈣離子，10mL質(zhì)量濃 度1%十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5， 40。C反應(yīng)30h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丙 氧基丙酸濃度43g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結(jié)晶 60g，將60g混合結(jié)晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得1^-2-氨基-3-丙氧基丙酸32.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸44g，結(jié) 晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸44g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸32.8g，分
別溶于質(zhì)量濃度25%的鹽酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得0-絲氨酸18.3§，比旋光[州，=-14.7° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸16.4g，比旋光["]^=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例四D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取100g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的酰化方法制備得N-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸123g，含量95%，摩爾收 率93%。
2、 將1000mL刺孢小克銀漢霉9980發(fā)酵液抽濾得到的濕菌體42g加入到990mL 轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含123gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈣離 子，10mL質(zhì)量濃度0.5%吐溫-80， pH7.5， 4(TC反應(yīng)40h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度44g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結(jié)晶 64g，將64g混合結(jié)晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得匸2-氨基-3-丁氧基丙酸33g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸44g，結(jié) 晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸44g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸33g，分別 溶于質(zhì)量濃度30%的氫溴酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸17.1g，比旋光[c^卜-14.6° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸15g，比旋光["]^ = +14.8° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例五D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取200gDL-2-氨基-3-甲氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸262g，含量94%，摩爾收 率91%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體14g，加入到990mL 轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含262gN-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸，lmL O.lmol/L鎂離 子，10mL質(zhì)量濃度1%十六垸基三甲基溴化銨，pH7.5， 4(TC反應(yīng)28h。轉(zhuǎn)化液 中L-2-氨基-3-甲氧基丙酸濃度85.5g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的摩 爾轉(zhuǎn)化率為94%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的混合結(jié)晶 123g，將123g混合結(jié)晶加入到500mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-甲氧基丙酸60.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸 86.2g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸86.2g和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸60.8g， 分別溶于質(zhì)量濃度35%的鹽酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸42.4g，比旋光["]^=-14.5°"=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸37.6g，比旋光[";^=+14.7° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例六D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1 、稱取200g DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實(shí)施例1相同
9的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸246g，含量95%，摩爾收 率91%。
2、 將從豬腎中提取的氨基?；复置敢?0mL加入到980mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化 液含246gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，lmL0.1mol/L鎂離子，pH7.5，40。C 反應(yīng)30h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丙氧基丙酸濃度85.4g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-
丙氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為94%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結(jié)晶 125g，將125g混合結(jié)晶加入到500mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-丙氧基丙酸61.7g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸 83g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸83g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸61.7g，分
別溶于質(zhì)量濃度30%的氫溴酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸34.6g，比旋光["]，=-15° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸30.9g，比旋光["]，=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例七D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取200g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸242g，含量95%，摩爾收 率91%。
2、 取2000mL米曲霉發(fā)酵液離心所得濕菌體55g，加入到990mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn) 化液含242gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，1mL O.lmol/L錳離子，10mL質(zhì) 量濃度0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，pH7.5， 4(TC反應(yīng)48h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度85g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為94。/0。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結(jié)晶 129g，將129g混合結(jié)晶加入到500mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-丁氧基丙酸63.2g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸86.7g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸86.7g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸63.2g， 分別溶于質(zhì)量濃度25%的氫溴酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀
釋脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸33.6g，比旋光["]，=-14.6° (c=10，
2NHC1)和L-絲氨酸28.9g，比旋光[ ]^= + 14.6° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例八D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取300g DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸溶于900mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的酰化方法制備得N-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸386g，含量94%，摩爾收 率92%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體15g，制備以卡拉膠 為載體的固定化細(xì)胞，并將固定化細(xì)胞加入到1200mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含386g N-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸，1.2mL0.1mol/L錳離子，12mL質(zhì)量濃度0.5% 聚乙二醇辛基苯基醚，pH7.5， 50。C反應(yīng)36h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-乙氧基丙酸 濃度107g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為94%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液中固定化細(xì)胞濾出，重復(fù)使用；濾出的轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基 丙酸和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的混合結(jié)晶181g，將181g混合結(jié)晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-乙氧基丙酸90g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘 干得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸90g，分 別溶于質(zhì)量濃度30%的鹽酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得0-絲氨酸57.2§，比旋光["]，=-14.6° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸49.7g，比旋光["]^=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例九D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備歩驟如下 1、稱取300gDL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于900mL水中，采用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸373g，含量95%，摩爾收 率92%。2、 取lOOOmL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體14g，制備以海藻酸 鈣為載體的固定化細(xì)胞，并將固定化細(xì)胞加入到1200mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含 373g N-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，L2mL O.lmol/L鈷離子，12mL質(zhì)量濃 度0.5%吐溫-80， pH7.5， 5CTC反應(yīng)35h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丙氧基丙酸濃度 106g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為93%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液中固定化細(xì)胞濾出，重復(fù)使用；濾出的轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基 丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結(jié)晶178g，將178g混合結(jié)晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-丙氧基丙酸95.6g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘 干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸132g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸132g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸95.6g，分 別溶于質(zhì)量濃度35%的氫溴酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋
脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸55g，比旋光[ol，--14.5° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸47.8g，比旋光[ ]^=+14.6° (c=10， 2NHC1)。
實(shí)施例十D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取300g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于900mL水中，釆用與實(shí)施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸374g，含量94%，摩爾收 率93%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體15g，制備以海藻酸 鈣為載體的固定化細(xì)胞，并將固定化細(xì)胞加入到1200mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含 374g N-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，1.2mL O.lmol/L鈷離子，12mL質(zhì)量濃 度0.5%吐溫-80， pH7.5， 50。C反應(yīng)35h。轉(zhuǎn)化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度 99.7g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
3、 將上述轉(zhuǎn)化液中固定化細(xì)胞濾出，重復(fù)使用；濾出的轉(zhuǎn)化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結(jié)晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基 丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結(jié)晶178g，將178g混合結(jié)晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-丁氧基丙酸90.5g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結(jié)晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結(jié)晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸131g，結(jié)晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸131g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸90.5g,分
別溶于質(zhì)量濃度20%的鹽酸中回流至反應(yīng)完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸50.8g，比旋光["]，=-14.7° (c=10， 2N HC1)和L-絲氨酸41.3g，比旋光["]^=+14.6° (c=10， 2NHC1)。
權(quán)利要求
1、一種D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，用醋酐乙?；肗-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(2)將含有氨基酰化酶的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞或該酶提取液與pH6～10的N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在30℃～60℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；(3)通過等電點(diǎn)結(jié)晶法或等電點(diǎn)結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法對反應(yīng)生成物進(jìn)行分離，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解得到D-絲氨酸和L-絲氨酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 所用的DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸或DL-2-氨基-3-乙氧 基丙酸或DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(2) 所用的氨基?；竵碓从趧?dòng)物內(nèi)臟或具有氨基酰化酶活性的微生物菌株或基因 工程菌株；氨基?；傅男螒B(tài)為粗酶提取液或游離菌體或固定化細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(2) 所用的N-乙酰-DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸水溶液濃度為20g/L 500g/L，最適濃度 為100g/L 350g/L，溶液pH為6 10，調(diào)溶液pH所用的無機(jī)堿為碳酸鈉或碳 酸氫鈉或氫氧化鈉或氫氧化鉀。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(2) 所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚， 其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為鈷離子或鈣離子或鎂離子或錳離 子，其濃度為lxl(r2mol/L lxl(r6mol/L。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(4) 所用的鹽酸質(zhì)量濃度為20% 37%，氫溴酸質(zhì)量濃度為20% 47%，回流反應(yīng)直 至反應(yīng)物脫去烷氧基和乙?；?。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及D-絲氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。該制備方法以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)醋酐乙酰化得N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；然后將含有氨基酰化酶的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞或該酶提取液與N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液混合，在30℃～60℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用等電點(diǎn)結(jié)晶或等電點(diǎn)結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解后即得D-絲氨酸和L-絲氨酸。該方法具有原料價(jià)格低廉，操作簡便，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12P41/00GK101659978SQ200910183530
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日 公開號200910183530.發(fā)明者茜 劉, 劉均忠, 焦慶才, 熊吉濱, 趙根海 申請人:南京大學(xué)