專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種e -葡萄糖苷酶的制備
方法。
背景技術(shù)：
大豆是畜禽的主要蛋白飼料，在飼料成分中占有很大比例，大豆中含有豐富的大 豆異黃酮。最初人們對大豆異黃酮的研究是針對人體的，研究發(fā)現(xiàn)在人體大豆異黃酮對防 治癌癥、預(yù)防心血管疾病、防治女性老年骨質(zhì)疏松等都具有明顯的療效。近年來大豆異黃酮 的研究開始在動物上開展，大量的動物試驗表明，大豆異黃酮具有促進(jìn)動物生長、增強機體 免疫力、提高動物泌乳性能、增加產(chǎn)蛋量、提高繁殖機能、促進(jìn)動物體內(nèi)養(yǎng)分再分配、提高蛋 白質(zhì)合成效率和改善畜禽胴體及瘦肉率等多種營養(yǎng)生理功能。但大豆異黃酮主要以糖苷形 式存在，占總量的97% _98%，結(jié)合型大豆異黃酮不能滲入腸上皮細(xì)胞。必須經(jīng)微生物水解 為苷元，才能被吸收并進(jìn)入外周循環(huán)，這樣大部分大豆異黃酮資源并不能很好的被動物體 利用，造成了資源的浪費。 研究發(fā)現(xiàn)，|3 _葡萄糖苷酶可將結(jié)合型的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為具有生理活性的游離 型苷元，從而有效的提高大豆異黃酮的生物利用率。該酶最初是在苦杏仁中被發(fā)現(xiàn)，隨后在 酵母、細(xì)菌、真菌等微生物中也純化出了 P-葡萄糖苷酶。但不同來源的P-葡萄糖苷酶具 有明顯的種屬特異性，不同的菌株不同的培養(yǎng)條件會影響P-葡萄糖苷酶的發(fā)酵水平，同 時目前的對P-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)多采用深層發(fā)酵法，固態(tài)發(fā)酵由于產(chǎn)P-葡萄糖苷酶產(chǎn) 量低其應(yīng)用一直受到限制，但固態(tài)發(fā)酵比深層發(fā)酵具有經(jīng)濟優(yōu)勢，它可以利用豐富、廉價的 農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵底物，發(fā)酵粗產(chǎn)物可直接作為酶源。本發(fā)明從菌種的篩選出發(fā)到固體培 養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以使在固體培養(yǎng)條件下也能實現(xiàn)P-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)，為P-葡 萄糖苷酶的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種13 -葡萄糖苷酶的制備方法， 該方法成本低、產(chǎn)酶量高、可大規(guī)模推廣利用。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種P-葡萄糖苷酶的制備方法， 包括以下步驟 (1)制備培養(yǎng)基包括 (A)制備斜面種子培養(yǎng)基將皮馬鈴薯、蔗糖和瓊脂加入水中，經(jīng)12rC滅菌 20min，得到斜面種子培養(yǎng)基，其中，皮馬鈴薯含量為200g/l，蔗糖含量為20g/l，瓊脂含量 為20g/l ; (B)制備固體種子培養(yǎng)基按照重量l : 1比例將麩皮加入水中，攪拌均勻，經(jīng) 12rC滅菌30min，得到固體種子培養(yǎng)基； (c)制備固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量百分比90 100% : o 10% : i 3%的比例將麩皮、米糠和氯化氨混合，經(jīng)12rC滅菌30min，得到固體生產(chǎn)培養(yǎng)基； (2)制備斜面種子將黑曲霉菌株劃線接種在斜面種子培養(yǎng)基上，于2『C恒溫培
養(yǎng)5d后，得斜面種子； (3)制備種子將步驟(2)得到的斜面種子種在固體種子培養(yǎng)基中，于28t:下恒溫 培養(yǎng)72h，得到種子； (4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)所獲得的種子以106 108cfu/g固體培養(yǎng)基的接種量， 接種到固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為其0. 5X的MgS(^ 7H20和質(zhì) 量百分比為其1. 5%的KH2P04，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量65 75%，PH5. 5 6. 5，于25 30。C培養(yǎng)48 80h，得P-葡萄糖苷酶。 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明篩選出P-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌種，利用豐富、廉價 的農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵底物，產(chǎn)品成本低，質(zhì)量好，優(yōu)化后得到的酶活性很高，作為飼料添加 劑應(yīng)用于豆粕型日糧中，可顯著的提高其吸收利用率，從而提高動物飼養(yǎng)的經(jīng)濟效益。
具體實施例方式
本發(fā)明的P-葡萄糖苷酶的制備方法，包括以下步驟
—、制備培養(yǎng)基包括， 1、制備斜面種子培養(yǎng)基將皮馬鈴薯、蔗糖和瓊脂加入水中，經(jīng)12rC滅菌20min， 得到斜面種子培養(yǎng)基，其中，皮馬鈴薯含量為200g/l，蔗糖含量為20g/l，瓊脂含量為20g/ 1 ; 2、制備固體種子培養(yǎng)基按照重量1 : 1比例將麩皮加入水中，攪拌均勻，經(jīng) 12rC滅菌30min，得到固體種子培養(yǎng)基； 3、制備固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量百分比90 100% : 0 10% : l 3%的比例 將麩皮、米糠和氯化氨混合，經(jīng)12rC滅菌30min，得到固體生產(chǎn)培養(yǎng)基。
二、制備斜面種子將黑曲霉菌株劃線接種在步驟1的斜面種子培養(yǎng)基上，于28t: 恒溫培養(yǎng)5d后，得斜面種子，放置4t:冰箱內(nèi)保存，備用； 三、制備種子將步驟2制備的斜面種子種在步驟1的固體種子培養(yǎng)基中，于28°C 下恒溫培養(yǎng)72h，得到種子； 四、發(fā)酵生產(chǎn)將步驟3所獲得的種子以106 108cfu/g固體培養(yǎng)基的接種 量，接種到步驟l的固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為其0.5%的 MgS04 7H20和質(zhì)量百分比為其1. 5 %的KH2P04，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量65 75 % ， 5 6. 5，于25 30。C培養(yǎng)48 80h，得P -葡萄糖苷酶，檢測活力達(dá)到300 430U/g。 其中，酶單位U定義在lmin內(nèi)催化生產(chǎn)1 y mol/L對硝基本分的酶量為1個酶單 位。 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明 顯。 實施例1 (1)培養(yǎng)基的制備包括， ①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，經(jīng)121 。C滅菌20min ; ②固體種子培養(yǎng)基250ml的三角瓶中加入麩皮10g，按與麩皮重量1 : 1比例加 入自來水，攪拌均勻，經(jīng)12rC滅菌30min ; ③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基250ml三角燒瓶中裝入麩皮、米糠和氯化氨按重量百分比 90%: 9%: 1%的比例配制而成的固體培養(yǎng)基10g，經(jīng)12rC滅菌30min ;
(2)斜面種子制備將黑曲霉菌株劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養(yǎng)基上，于 28 °C恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用； (3)種子制備將步驟(2)斜面種子在步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于2『C下恒 溫培養(yǎng)72h ; (4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)所獲得的種子以106cfU/g固體培養(yǎng)基的接種量，接種
到步驟(1)③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加0. 5% MgS04 *71120和1. 5% KH2P04，
調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量65%，PH5. 5，于25t:培養(yǎng)56h，得P -葡萄糖苷酶，檢測活力達(dá)到
300 430U/g。 實施例2 (1)培養(yǎng)基的制備包括， ①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，經(jīng)121 。C滅菌 20min ; ②固體種子培養(yǎng)基250ml的三角瓶中加入麩皮10g，按與麩皮重量1 : 1比例加 入自來水，攪拌均勻，經(jīng)12rC滅菌30min ; ③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基250ml三角燒瓶中裝入麩皮、米糠和氯化氨，按重量百分比 95% : 4% : 1%的比例配制而成的固體培養(yǎng)基10g，經(jīng)121。C滅菌30min ;
(2)斜面種子制備將黑曲霉菌株劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養(yǎng)基上，于 28 °C恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用； (3)種子制備將步驟(2)斜面種子在步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于2『C下恒 溫培養(yǎng)72h ; (4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)所獲得的種子以1(fcfu/g固體培養(yǎng)基的接種量，接種到
步驟(1)③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加0. 5% MgS04 7H20和1. 5% 1(112 04，調(diào)
節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量70%， PH56.0，于28t:培養(yǎng)72h，得P _葡萄糖苷酶，檢測活力達(dá)到
300 430U/g。 實施例3 (1)培養(yǎng)基的制備包括， ①斜面種子培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，經(jīng)121 。C滅菌 20min ; ②固體種子培養(yǎng)基250ml的三角瓶中加入麩皮10g，按與麩皮重量1 : 1比例加 入自來水，攪拌均勻，經(jīng)12rC滅菌30min ; ③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基250ml三角燒瓶中裝入麩皮和氯化氨按，重量百分比 98% : 2%的比例配制而成的固體培養(yǎng)基10g，經(jīng)12rC滅菌30min ; (2)斜面種子制備將黑曲霉菌株劃線接種在步驟(1)①斜面種子培養(yǎng)基上，于 28 °C恒溫培養(yǎng)5d后，放置4°C冰箱內(nèi)保存，備用；
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(3)種子制備將步驟(2)斜面種子在步驟(1)②固體種子培養(yǎng)基中，于2『C下恒 溫培養(yǎng)72h ; (4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)所獲得的種子以108cfu/g固體培養(yǎng)基的接種量，接種 到步驟(1)③固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加0. 5% MgS04 *71120和1. 5% KH2P04， 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量75%，PH6. 5，于3(TC培養(yǎng)80h，得P -葡萄糖苷酶，檢測活力達(dá)到 300 430U/g。 上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備培養(yǎng)基包括(A)制備斜面種子培養(yǎng)基將皮馬鈴薯、蔗糖和瓊脂加入水中，經(jīng)121℃滅菌20min，得到斜面種子培養(yǎng)基，其中，皮馬鈴薯含量為200g/l，蔗糖含量為20g/l，瓊脂含量為20g/l。(B)制備固體種子培養(yǎng)基按照重量1∶1比例將麩皮加入水中，攪拌均勻，經(jīng)121℃滅菌30min，得到固體種子培養(yǎng)基。(C)制備固體生產(chǎn)培養(yǎng)基按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例將麩皮、米糠和氯化氨混合，經(jīng)121℃滅菌30min，得到固體生產(chǎn)培養(yǎng)基。(2)制備斜面種子將黑曲霉菌株劃線接種在斜面種子培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)5d后，得斜面種子。(3)制備種子將步驟(2)得到的斜面種子種在固體種子培養(yǎng)基中，于28℃下恒溫培養(yǎng)72h，得到種子。(4)發(fā)酵生產(chǎn)將步驟(3)所獲得的種子以106～108cfu/g固體培養(yǎng)基的接種量，接種到固體生產(chǎn)培養(yǎng)基上，在固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比為其0.5％的MgSO4·7H2O和質(zhì)量百分比為其1.5％的KH2PO4，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的起始含水量65～75％，PH5.5～6.5，于25～30℃培養(yǎng)48～80h，得β-葡萄糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-葡萄糖苷酶的制備方法，本發(fā)明通過篩選，選擇黑曲霉為出發(fā)菌株，以106～108cfu/g的接種量接種于麩皮、米糠和氯化氨，按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例配制而成的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的起始含水量為65～75％，pH5.5～6.5，于25～30℃培養(yǎng)48～80h，檢測β-葡萄糖苷酶的活性可達(dá)到300～430U/g；本發(fā)明采用固態(tài)發(fā)酵，利用廉價和豐富的農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵底物，同時對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使β-葡萄糖苷酶在固體發(fā)酵條件下也達(dá)到很高的產(chǎn)量，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號C12N9/42GK101705213SQ20091015380
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者孫建義, 錢利純 申請人:浙江大學(xué)