專利名稱：一種堆肥發(fā)酵復合菌劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌劑的生產方法，具體為 一種用于堆肥發(fā)酵的復合型微生物菌劑的制備方法。
二背景技術：
高溫好氧堆肥工藝是固體廢棄物資源化處理常用的技術，是集無害化處理和資源再生利用于一體的生物學處理方法，具有較強的物質轉化能力及易被人為控制等優(yōu)點。其過程從初始堆肥的原料階段，先后經歷升溫階段、高溫階段、降溫階段、熟化穩(wěn)定階段，最后達到腐熟。由于堆肥化是一種生物學工藝過程，在堆肥過程的不同階段對有機物的降解起關鍵作用的微生物種群不同。在工藝過程中所要控制的各種參數就是那些對微生物有影響的因素，因為它們決定微生物活動的程度，進而影響堆肥的速度與質量。傳統(tǒng)堆肥法一般都是釆用增加營養(yǎng)和改善環(huán)境條件的方法，利用堆制原料中的土著微生物來降解有機污染物，但傳統(tǒng)堆肥法存在發(fā)酵時間長、產生臭味且肥效低等問題。目前人們廣泛采用向堆肥中接入微生物菌劑來加速腐熟和改善堆肥產品質量。
堆肥物料包括城巿污泥、垃圾、作物秸桿、畜禽糞便等固體廢棄物。它的成分均由單糖、蛋白質、脂類、纖維素和半纖維素以及木質素等，其中纖維素和半纖維素以及木質素占的比重較大。因而
木質纖維素轉化為腐殖質是堆肥充分腐熟的關鍵問題，而降解纖維素的微生物主要是桿狀細菌和真菌。不同的底物成份對菌種的選擇
有不同的要求。目前已被應用或有應用報道的菌種有乳酸菌、酵母菌、綠色木霉、放線菌、光合細菌、高溫芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、灰藤黃鏈霉菌wi、蠟狀芽孢桿菌、白腐菌等。
如申請?zhí)枮?00510031158. 6的中國專利申請說明書公開了一種 固定化白腐菌劑及其在垃圾堆肥化中的應用方法，其采用植物材料 玉米芯作固定化載體，將游離白腐菌制成固定化菌劑，再將固定化 白腐菌接入增活培養(yǎng)基中奮集培養(yǎng)4 6天，濾去培養(yǎng)液，制成固定 化菌劑；在垃圾堆肥物料的溫度降至4(TC左右時接種固定化菌劑， 并調整堆料含水率，控制通風，及時翻堆至腐熟。該方法用白腐菌 較強的產木質素降解酶的能力和對重金屬的強吸附固定能力，又釆 用固定化技術降低了堆肥成品中Pb、 Cd等有毒金屬的遷移性及其總
量。但該方法由于接入菌種單一，在不同的底物中降解腐熟效果差 距較大，對物料適應性不強，影響腐熟效果。又如申請?zhí)枮?200610031262. X的中國專利說明書公開了一種在堆肥的不同堆制階
段兩次添加不同促腐發(fā)酵齊!l的垃圾堆肥法及其促腐發(fā)酵劑，其兩種 促腐發(fā)酵劑都是將不同菌種的單一發(fā)酵液按一定比例混合而制成的 復合酶液體系。在堆肥開始時添加促腐發(fā)酵劑A,以加速果膠、脂類、 蛋白質等易降解物的分解，并初步破壞木質纖維結構、促成部分木 質纖維素類難降解物的降解。在堆肥降溫階段的中后期添加促腐發(fā) 酵劑B,進一步加強對木質纖維素等難降解有機物的降解作用，促進 堆料的深度腐熟。通過兩次添加促腐發(fā)酵劑，加快了堆料的降解， 加快堆肥腐熟進程，提高了堆肥品質。但此方法需要兩次添加，需 要掌握兩次添加的時機，并且要每天翻垛一次，搡作復雜作業(yè)量較 大，而且除臭效果不盡理想。
在堆肥的生物降解和發(fā)酵過程中，開始時pH值在7左右，為好 氧發(fā)酵，兩三天內PH值上升到8.5左右，發(fā)酵方式改為半厭氧發(fā)酵， pH值逐步下降。土著微生物中真菌在pH5. 5-8. 0的環(huán)境中大量生長繁殖，促進底物中纖維成份的降解。如何在堆肥發(fā)酵早期接入外源微生物，促進快速升溫，并迅速降低堆肥的pH值，縮短前期發(fā)酵的時間和進程，以促進底物中土著微生物特別是真菌的生長，從而提高纖維降解的效率，并縮錯堆肥發(fā)酵時間，是目前堆肥發(fā)酵領域人們不斷探索的新課題。

發(fā)明內容
本發(fā)明是要提供一種適宜在堆肥早期接入的微生物復合菌劑，通過加強早期酸化，增強底物真菌活動，以實現(xiàn)快速腐熟，從而提升堆肥品質，提高堆肥生產效率。
本發(fā)明提出的一種堆肥發(fā)酵復合菌劑的制備方法，該方法分別
使用產朊假絲酵母(Ca"4'^ )、植物乳桿萆(丄""o^d〃M
/acto)、枯草芽孢桿菌(5a"7/w^wto7^),經過以下的培養(yǎng)過程單體菌種固體斜面培養(yǎng)—種子液擴大培養(yǎng)一復合發(fā)酵液培養(yǎng)；
并且所述復合發(fā)酵液培養(yǎng)是將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子液以體積比0. 2-0. 5: 0.5-1: 0.5-0.8混合后，按5%-10%的量接入高溫滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基液中，在25-3(TC靜置培養(yǎng)7-10d;當發(fā)酵液pH值達到3. 5-4. 0，活體微生物數量達到1x 1()9個/ml以上，制備完成。
上述的發(fā)酵培養(yǎng)基液為'
蔗糖10-20g ，蛋白胨0. 5-5g，酵母粉l-2g,磷酸二氫鉀0. 5-1. 0g,硫酸銨O. 5-1. 0g,氯化鈣0. 5g，硫酸鎂0. 3-0. 6g,乙酸鈉l-3g，碳酸氫鈉2-4g,硫酸亞鐵0. 01-0.02g，水1000ml， pH值7。
產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌三種菌種相互之間
5沒有拮抗和抑制作用。堆體發(fā)酵進行時，先是好氧狀態(tài)，再到半好 氧或厭氧狀態(tài)。由于枯草芽孢桿菌具有很強的淀粉糖化酶、纖維素 酶活性以及蛋白酶活性，可先將淀粉水解產生糖類。植物乳桿菌和 產朊假絲酵母菌能夠利用堆肥中原有的單糖和水解糖，產生乳酸和 其他有機酸小分子。并且乳酸具有抑制其他細菌生長的功能，造成
堆體pH值下降。在半好氧或厭氧狀態(tài)下，當pH在5.5-8.0,真菌適 合生長，而細菌受到抑制，真菌能夠利用這些厭氧狀態(tài)下產生的有 機酸，大量繁殖。本發(fā)明由于外源微生物的接入使得堆體中的微生 物活動加劇，產生大量的熱，使堆體溫度快速升高。不僅三種外源 菌參與并加劇了堆肥物料的降解，而且為底物中真菌的生長繁殖提
供了良好的環(huán)境，促進真菌的活動。由于真菌是以纖維素為底物并 具有較高的降解效率，使得堆體的發(fā)酵過程加快。又由于植物乳桿 菌和產朊假絲酵母發(fā)酵能夠產生小分子有機酸，可以中和堆肥中氨 氣等堿性氣體，從而消除臭味。
本發(fā)明的復合菌劑，選擇功能不同的三種菌相配伍，在堆肥早 期接入，在外源微生物的促進下，能快速提升堆體溫度和降低堆體 pH值，縮短堆體發(fā)酵的前期時間，并為底物中真菌的繁殖創(chuàng)造條件， 引發(fā)土著微生物的活動，強化纖維素的降解，從而使堆肥發(fā)酵的周 期縮短，降解質量提升。并且能夠消除堆肥臭味，改善環(huán)境質量。
四

圖1為本發(fā)明堆肥復合發(fā)酵菌劑的工藝流程圖。
圖2為復合發(fā)酵菌劑在堆肥中使用時堆體溫度變化圖。
圖3為復合發(fā)酵菌劑在堆肥中使用時堆體pH值變化圖。
五具體實施方式
本發(fā)明所釆用的產朊假絲酵母(C""AWfl W/fe)、植物乳桿菌
(丄ac/o6ad〃Ry /ac/^ )、才古萆芽孢才干菌(5""'〃w51 sw6"7/s ), 三種菌禾中的標準株均來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，三種菌編號分別為枯草芽孢桿菌10035，植物乳桿菌6009 ,產朊假絲酵母31395。
結合附圖l所示，本發(fā)明實施的具體步驟為
1、 單體菌種固體斜面培養(yǎng)。
(1) 固體斜面的制備。
植物乳桿菌斜面培養(yǎng)基配方牛肉膏5g,酵母膏5g，蛋白胨10g,葡萄糖10g，乳糖5g,氯化鈉5g,瓊脂15g， pH值5.5-6.5，蒸餾水1000ml。
產朊假絲酵母釆用馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15-20g， pH值7. 2-7. 4,蒸餾水1000ml。
枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配方葡萄糖20g,蛋白胨15g，氯化鈉5g，牛肉膏0. 5g,瓊脂15g，自然pH值，蒸餾水1000ml。
(2) 固體斜面培養(yǎng)。
分別將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌菌種接入固體斜面，其中枯草芽孢桿菌'培養(yǎng)溫度為30-35°C，培養(yǎng)時間16-24h;產朊假絲酵母和植物乳桿菌培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時間24-36h。
2、 種子液擴大培養(yǎng)。(1)種子培養(yǎng)液制備。
產朊假絲酵母液體培養(yǎng)基配方為固體培養(yǎng)基去除瓊脂。枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基配方為固體培養(yǎng)基去除瓊脂。植物乳桿菌液體培養(yǎng)基配方(MRS液體培養(yǎng)基)胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,檸檬酸氫；銨2g，葡萄糖20g， CH3C00Na 3H20 5g， 吐溫80ml, K風2g, MgS04 . 7H20 0. 5g, MnS04 . H20 0. 25g,蒸餾水 1000ml, pH6. 9 ± 0. 1。
(2)擴大培養(yǎng)。
將純化培養(yǎng)的產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌，分 別從保藏的斜面培養(yǎng)基上接種至上述的種子液擴大培養(yǎng)基。每個 250ml的發(fā)酵瓶中裝lOOml，培養(yǎng)溫度28-32'C,搖床上培養(yǎng)，轉速 180rpm,培養(yǎng)24-36h，菌數含量達到1 x 109/ml。
3、復合發(fā)酵液培養(yǎng)。'
實施例一
在1000ml水中加入蔗糖10g，蛋白胨0. 5g,酵母粉lg，磷酸二 氫鉀0.5,硫酸銨1. 0g,氯化錦0. 5g，硫酸鎂0. 36g，硫酸亞鐵 0. 02g，乙酸鈉1.0g，碳酸氫鈉O. 5g, pH值7. 0。培養(yǎng)基115。C滅菌 30min。將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子液以體 積比0.2: 0.5: 0. 5混合后，按10%的量接入高溫滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng) 基液中，在25'C靜置培養(yǎng),0d;當發(fā)酵液不再產生氣泡時，發(fā)酵終 止。此時pH值為4.0，味酸，有白色膜狀物漂浮在發(fā)酵液表層，活 體微生物數量達到1 x 1()9個/ml以上，培養(yǎng)完成。
實施例二
在1000ml水中加入蔗糖15g蛋白胨2g,酵母粉2g，嫌酸二氫 鉀0. 5g，硫酸銨l.Og,氯化鈣0.5g，硫酸鎂0. 5g,硫酸亞鐵 0. Olg，乙酸鈉1.0g，碳酸氫鈉O. 5g, pH值7. 0。培養(yǎng)基115。C滅 菌30min。將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子液以 體積比0. 5: 1: 0. 8混合后，按5%的量接入高溫滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng) 基液中，在30'C靜置培養(yǎng)7d;當發(fā)酵液不再產生氣泡時，發(fā)酵終止。此時pH值為3.8，味酸，有白色膜狀物漂浮在發(fā)酵液表層。搖勻后 顯微計數能夠達到1 x 109個/1111,培養(yǎng)完成。
實施例三
在1000ml水中加入蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母粉2g,磷酸二氫 鉀0. 5g，硫酸銨1. 0g ，氯化鉤0. 5g ，硫酸鎂0. 5g ,硫酸亞鐵 0. 02g ，乙酸鈉l. 0g，碳酸氫鈉1.5g ， pH值7. 0。培養(yǎng)基115。C 滅菌30min，分別將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種 子液以體積比O. 5: 0.5: 0.'8混合后，按10%的量接入高溫滅菌后的 發(fā)酵培養(yǎng)基液中，在28'C靜置培養(yǎng)7d。當發(fā)酵液不再產生氣泡時， 發(fā)酵已經終止。此時pH值為3.5，味酸，有白色膜狀物漂浮在發(fā)酵 液表層。搖勻后顯微計數能夠達到lxl()9個/ml以上，培養(yǎng)完成。
此實施例為最佳實施例。 實施例四
在1000ml水中加入蔗糖10g蛋白胨5g,酵母粉2g，磷酸二氫 鉀0.5g,硫酸銨1. Og,,化錦0. 5g，硫酸鎂0. 36g，硫酸亞鐵 0. 02g ，乙酸鈉1. Og，碳酸氫鈉2. 5g， pH值7. 0。 培養(yǎng)基115。C滅 菌30min，分別將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子 液以體積比0.4: 0.8: 0.6混合后，按8%的量接入高溫滅菌后的發(fā) 酵培養(yǎng)基液中，在30'C靜置培養(yǎng)7d。當發(fā)酵液不再產生氣泡時，發(fā) 酵已經終止。此時pH值為4，味酸，有白色膜狀物漂浮在發(fā)酵液表 層。搖勻后顯微計數能夠達到lxl()9個/fnl以上，培養(yǎng)完成。
實施例五
在1000ml水中加入蔗糖15g蛋白胨2g，酵母粉lg，磷酸二氫 鉀0. 5g，硫酸銨1. Og,氯化鈣0. 5g，硫酸鎂0. 36g，硫酸亞鐵
90. 02g,乙酸鈉2. 0g,碳酸氫鈉O. 5g， pH值7. 0。 培養(yǎng)基115。C滅 菌30min,分別將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子 液以體積比O. 2: 1: 0. 5混合后，按10%的量接入髙溫滅菌后的發(fā) 酵培養(yǎng)基液中，在28匸靜置培養(yǎng)8d。當發(fā)酵液不在產生氣泡時，發(fā) 酵已經終止。此時pH值為3.8，味酸，有白色膜狀物漂浮在發(fā)酵液 表層。搖勻后顯微計數能夠達到lxlO'個/ml以上，培養(yǎng)完成。
4、復合發(fā)酵菌劑在堆,中的使用。
按以上步驟及實施例l-5制成的復合菌劑，使用時按l: 20-100 接入堆肥底物，將底物水分調節(jié)到50-60%,并混勻，堆肥按長寬高 2mxl.2mxl.0m,堆成條垛狀，每周翻堆一次，六周后堆肥底物完 全腐熟。
經對比實驗測量，堆體溫度比不接入的對照組升溫提前(如附 圖2)， pH值下降期提前(如附圖3)，發(fā)酵周期可縮短10d左右。
權利要求
1、一種堆肥發(fā)酵復合菌劑的制備方法，其特征是該方法分別使用產朊假絲酵母(Candida utiminl.gifis)、植物乳桿菌(Lactobaciminl.gifminl.gifus minl.gifactis)、枯草芽孢桿菌(Baciminl.gifminl.gifus subtiminl.gifis)，經過以下的培養(yǎng)過程單體菌種固體斜面培養(yǎng)—種子液擴大培養(yǎng)—復合發(fā)酵液培養(yǎng)；所述復合發(fā)酵液培養(yǎng)是將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌的種子液以體積比0.2-0.5∶0.5-1∶0.5-0.8混合后，按5％-10％的量接入高溫滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基液中，在25-30℃靜置培養(yǎng)7-10d；當發(fā)酵液pH值達到3.5-4.0，活體微生物數量達到1×109個/mminl.gif以上，制備完成；上述的發(fā)酵培養(yǎng)基液的配方為蔗糖10-20g，蛋白胨0.5-5g，酵母粉1-2g，磷酸二氫鉀0.5-1.0g，硫酸銨0.5-1.0g，氯化鈣0.5g，硫酸鎂0.3-0.6g，乙酸鈉1-3g，碳酸氫鈉2-4g，硫酸亞鐵0.01-0.02g，水1000mminl.gif。
2、 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基液 的配方為蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨l.Og， 氯化鈣0.5g ，硫酸鎂0.5g ，硫酸亞鐵0.02g ，乙酸鈉l.Og，碳酸氫 鈉1. 5g ，水1000ml， pH值7. 0。
全文摘要
本發(fā)明提出一種適宜在堆肥早期接入的微生物復合菌劑的制備方法，分別使用產朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌，經過單體菌種固體斜面培養(yǎng)、種子液擴大培養(yǎng)、復合發(fā)酵液培養(yǎng)制得。其活體微生物數量可達到1×10⁹個/ml以上。應用于城市垃圾的堆肥處理或畜禽糞便高溫堆肥處理。在堆肥初期接入，通過加強早期酸化，增強底物真菌活動，實現(xiàn)快速腐熟，從而提升堆肥品質，提高堆肥生產效率。
文檔編號C12N1/00GK101486969SQ200910113229
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月18日 優(yōu)先權日2009年2月18日
發(fā)明者晶 于, 孫寧川, 張云舒, 徐萬里, 偉 王, 葛春輝, 邵華偉, 鐘新才 申請人:新疆農業(yè)科學院土壤肥料與農業(yè)節(jié)水研究所 被以下專利引用 (3),