專利名稱：一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物技術，具體涉及一種快速區(qū)分蛹蟲草(Cor辦ce/w脂7/to^s)交配型 的分子檢測方法。本發(fā)明技術適用于食藥用菌生產(chǎn)、菌種選育、植物保護等相關專業(yè)領域對 蛹蟲草交配型的檢測和進行交配型基因及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究。
背景技術：
真菌的交配系統(tǒng)主要分為同宗配合(自身可育)和異宗配合(自身不育)，其中異宗配合 的菌株必須由不同的交配型個體交配才能完成有性生殖。異宗配合菌株的交配型基因調控著 個體間性的親和性，在有性生殖、子實體分化、發(fā)育、遺傳進化等方面發(fā)揮著決定性作用。 因而對自然群體中真菌交配型的研究，將加深人們對菌株遺傳背景的了解，為菌種鑒定提供 參考、為改良菌種提供指導，具有重要理論和實踐價值。
蛹蟲草(C. m沾tor!'s)最早源于我國，由于其藥用價值與冬蟲夏草(C.W"era^)相似， 故藥典中又記載為"北冬蟲夏草"，同時蛹蟲草是蟲草屬真菌的模式種，因而對蛹蟲草的研 究具有很高的經(jīng)濟和學術價值。蛹蟲草為異宗配合真菌，具有媳77-/和細77-2兩種交配型。 研究表明，只有兩個不同交配型的菌株混合培養(yǎng)，蛹蟲草才能完成有性生殖，產(chǎn)生具有藥用 價值的子實體。因而，研究快速檢測菌株交配型的方法，對于生產(chǎn)和開發(fā)蛹蟲草具有重要應 用價值。
近幾年，用PCR方法對子囊菌交配型基因進行研究和檢測的報道不斷增多，但有關蛹蟲 草交配型基因的研究屈指可數(shù)。Yokoyama等(FEMS Microbiology Letters, 2004， 237: 205-212) 于2004年研究麥角菌科真菌交配型時，設計了兩對簡并引物用于檢測蛹蟲草交配型，并將獲 得的兩個交配型基因的部分保守序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號分別為AB124614和 AB124626)。 2005年￥01 ^0111&等又成功獲得蛹蟲草的爐77-/和雄77-2兩種交配型基因的全 長序列(序列號分別是AB194982和AB084257)。但我們在試驗中用Yokoyama等設計的簡并 引物并不能有效區(qū)分國內蛹蟲草菌株的交配型。因而，有必要重新設計特異性引物，從而高 效、快速測定我國蛹蟲草菌株的交配型，為其開發(fā)利用提供技術指導。
本發(fā)明基于GenBank中登錄的蛹蟲草的2個交配型基因的全長和部分保守序列，設計了 兩對特異性引物，分別用于M477-7和M477-2交配型菌株的檢測。通過試驗條件的優(yōu)化， 保證了檢測結果特異、穩(wěn)定和可靠。若采用傳統(tǒng)的混合培養(yǎng)法，需要培養(yǎng)近兩個月才能觀察 蛹蟲草的子實體形成情況，因而本方法大大縮短了檢測時間。與傳統(tǒng)方法相比，本方法還避 免了環(huán)境因素對檢測結果的影響，保證了交配型檢測的準確性和可靠性。
3本發(fā)明中所涉及的檢測引物和檢測方法在國內外均未見報道，適用于食藥用真菌開發(fā)、 微生物等相關研究的各科研部門使用。由于對蛹蟲草的交配型進行檢測是研究其遺傳學、進 一步克隆交配型基因和研究交配型基因功能的基礎，本發(fā)明對研究蟲草屬其他真菌的有性生 殖以及指導生產(chǎn)實踐都具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服傳統(tǒng)蛹蟲草交配型檢測方法存在的缺陷，提供一種快速、準確
且勿丁保TpmjiA丌鵬j^早3c日i:坐tf、j:77丁恨觀u刀7s。牛刀7玄hi w且伎w丁土廠失踐，義、j促同乂、 工栽培蛹蟲草的產(chǎn)量和品質無疑具有重要意義。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術方案
一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，包括分別用于檢測交配型M477-7和交配 型M477-2的兩對特異性引物Cml-F/ Cml-R和Cm2-F/Cm2-R的寡核苷酸序列、兩套相應的 PCR擴增體系以及擴增程序。
快速檢測蛹蟲草爐77-/交配型的一對特異性引物0111^/0111-11，其特征在于，Cml-F的 寡核苷酸序列為5' -CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3', Cml-R的寡核苷酸序列為5' -ATATACCTTCGCGATC ATTG-3'。
快速檢測蛹蟲草M477-7交配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序，其特征在于，PCR擴增 體系包括10x buffer 2.5 nL， 2.5 mM dNTP2.0 pL， 10mM正向和反向引物各0.5 ^L， 2.5 U爾L r叫DNA聚合酶0.2 nL， 10ng^iLDNA模板l.OpL， ddH20補足至25 ^L。 PCR擴增程序為 預變性95。C 5 min; 95°C 40s， 60°C 30 s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán);隨后95。C 40s， 58°C 30 s， 72°C 30s擴增24個循環(huán)；最后延伸72'C 10min; 4'C保存。
利用特異性引物Cml-F和Cml-R及相應的PCR擴增體系和PCR擴增程序檢測蛹蟲草交配 型時，旭77-/交配型菌株均可得到一條18(^ 左右的條帶，而M477-2交配型菌株沒有擴增產(chǎn) 物。
快速檢測蛹蟲草M477-2交配型的一對特異性引物Cm2-F/Cm2-R，其特征在于，Cm2-F的 寡核苷酸序列為5' -CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3', Cm2-R的寡核苷酸序列為5' -GGGATGCCGTTCGAGGAGAG -3'。
快速檢測蛹蟲草M477-2交配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序，其特征在于，PCR 擴增體系包括10x buffer 2.5 iaL， 2.5 mM dNTP 2.0 |iL， 10mM正向和反向引物各0.5 pL， 2.5 U L r呵DNA聚合酶0.2 ^L， 10ng/(iLDNA模板l.OpL， ddH20補足至25 |aL。 PCR擴增程 序為預變性95'C5min; 95°C 40s， 66。C30s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán)；隨后95°C 40s， 64°C 30 s， 72°C 30s擴增24個循環(huán)；最后延伸72°C 10min; 4。C保存。利用特異性引物Cm2-F/Cm2-R及相應的PCR擴增體系和PCR擴增程序檢測蛹蟲草交配型 時，M477-2交配型菌株均可得到一條210bp左右的條帶，而M477-7交配型菌株沒有擴增產(chǎn)物。
本發(fā)明的核心在于用于檢測蛹蟲草交配型的兩對特異性引物。所用引物是根據(jù)
GenBaiik數(shù)據(jù)庫中蛹蟲草兩個交配型基因的部分保守序列(序列號分別為AB124614和 AB124626)和全長序列(序列號分別是AB194982和AB084257)設計的。隨機選取14個蛹 蟲草單分生孢子菌株，利用引物Cml-F/Cml-R對其DNA進行PCR擴增時，M477-7交配型 菌株可以擴增得到一條180bp左右的條帶，M477-2交配型菌株沒有擴增產(chǎn)物；利用引物 Cm2-F/Cm2-R進行PCR擴增時，M477-2交配型的菌株可以擴增得到一條210b p左右的條帶， M4Ti-7交配型菌株沒有擴增產(chǎn)物。
本發(fā)明適用于蛹蟲草兩種交配型的快速檢測。蛹蟲草是一種重要的藥用兼食用真菌，具 有很高的經(jīng)濟價值，有性生殖產(chǎn)生的子實體正是蛹蟲草的藥用和食用部位。蛹蟲草為異宗配 合真菌，所以利用不同交配型的菌株混合培養(yǎng)可以大大增加子實體產(chǎn)生的幾率。傳統(tǒng)的交配 型檢測方法費時、費力，本發(fā)明可實現(xiàn)蛹蟲草交配型的快速檢測且檢測結果十分可靠。本發(fā) 明可直接用于指導生產(chǎn)，可以大大了增加蛹蟲草出草的概率，提高子實體的產(chǎn)量和品質，對 于蛹蟲草的生產(chǎn)和開發(fā)具有十分重要的經(jīng)濟意義。


圖1特異性引物Cml-F/Cml-R對蛹蟲草單分生孢子菌株DNA的PCR擴增電泳圖
M代表Marker-DL2000;泳道1和泳道2分別為M477-7交配型和雄77-2交配型標準 菌株；泳道3為空白對照，泳道4-17為蛹蟲草單分生孢子菌株。
圖2特異性引物Cm2-F/Cm2-R對蛹蟲草單分生孢子菌株DNA的PCR擴增電泳圖
各泳道的菌株編號同圖l。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術內容是一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，包括M477-7交配型的 特異性引物對Cml-F/Cml-R和M477-2交配型特異性引物對Cm2-F/Cm2-R，及其相應的PCR擴 增體系和PCR擴增程序。
引物Cml-F的寡核苷酸序列為5'-CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3';引物Cml-R的寡 核苷酸序列為5' -ATATACCTTCGCGATCATTG-3'。
引物Cm2-F的寡核苷酸序列為5'-CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3';引物Cm2-R 的寡核苷酸序列為5' -GGGATGCCGTTCGAGGAGAG -3'。用引物對Cml-F/Cml-R在蛹蟲草M477-7交配型菌株中可以特異性地擴增得到一條 180bp左右的條帶；用引物對Cm2-F/Cm2-R在M477-2交配型的菌株中可以特異性地擴增得 到一條210bp左右的條帶。
蛹蟲草交配型的快速檢測方法如下
1. 收集所需檢測樣本的菌絲或組織，單子囊孢子菌株、單分生孢子菌株的菌絲和子實體組織 均可。
2. 采用CTAB/NaCl法提取所需檢測樣本的DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取DNA 進行定量分析。
3. 利用由生物公司合成的特異性引物Cml-F/Cml-R和Cm2-F/Cm2-R對上述提取的樣本 DNA進行PCR擴增。
4. 引物Cml-F/Cml-R的擴增體系和擴增程序如下
PCR擴增體系25pL，包括10x buffer 2.5 nL， 2.5 mM dNTP2.0 ^L， 10mM正向和反向引 物各0.5pL， 2.5U/nLr叫DNA聚合酶0,2nL， 10ng/nLDNA模板l.OpL， ddH20補足至 25 ^L。 PCR擴增程序為預變性95。C 5 min; 95°C 40s， 60°C 30 s， 72°C 30s先擴增6 個循環(huán)；隨后95。C40s， 58。C30s， 72°C 30s擴增24個循環(huán)；最后延伸72°C 10min; 4°C 保存。
5. 引物Cm2-F/Cm2-R的擴增體系和擴增程序如下
PCR擴增體系25pL，包括10x buffer 2.5 pL， 2.5 mM dNTP2.0 pL， lOmM正向和反向引 物各0.5 nL， 2.5 U/pL 7^ DNA聚合酶0.2 pL， lOng/pLDNA模板l.OpL， ddH20補足至 25 ^L。 PCR擴增程序為預變性95。C 5 min; 95°C 40s， 66°C 30 s， 72°C 30s先擴增6 個循環(huán)；隨后95'C40s， 64°C 30 s， 72°C 30s擴增24個循環(huán)；最后延伸72°C lOmin; 4°C 保存。
6. 取8pL擴增產(chǎn)物用1.4%的瓊脂糖凝膠進行電泳。100V穩(wěn)定電壓電泳40min后，將凝膠置
于溴化乙錠溶液中浸泡5-10min，移至清水中漂洗，經(jīng)Alpha凝膠成像儀系統(tǒng)記錄電泳結 果，利用Marker對擴增條帶大小進行標記。
實施例1:弓l物Cml-F/Cml-R和Cm2-F/Cm2-R檢測蛹蟲草單分生孢子菌株的交配型
利用引物Cml-F/Cml-R和Cm2-F/Cm2-R對14個蛹蟲草單分生孢子菌株進行交配型快速 檢測。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增體系包括10x buffer 2.5 ^L， 2.5 mM dNTP 2.0 pL， 10mM正向和反向引物各0.5 ^L， 2.5 U/pL ra《DNA聚合酶0.2 |aL， 10ng/nLDNA模板l.OpL， ddH20補足至25 pL。引物對Cml-F/Cml-R的PCR擴增程序為預變性95°C 5 min; 95°C 40s， 60°C 30 s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán)；隨后95°C 40s， 58°C 30 s， 72°C 30s擴增24個循環(huán)；最后延伸72°C 10min; 4'C保存。引物對Cm2-F/Cm2-R的PCR 擴增程序為預變性95°C 5 min; 95'C 40s， 66°C 30 s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán)；隨后95°C 40s， 64。C30s， 72°C 30s擴增24個循環(huán);最后延伸72°C 10min; 4'C保存。用1.4%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測PCR擴增結果。引物對Cml-F/Cml-R在交配型的單分生孢子菌株中 可以特異性地擴增得到一條180bp左右的條帶，檢測結果見圖1;引物對Cm2-F/Cm2-R在 M477-2交配型的單分生孢子菌株中可以特異性地擴增得到一條210b p左右的條帶，檢測結 果見圖2。
實施例2:引物Cml-F/Cml-R和Cm2-F/Cm2-R檢測蛹蟲草單子囊孢子菌株的交配型。
利用引物Cml-F/Cml-R和Cm2-F/Cm2-R對13個蛹蟲草單子囊孢子菌株進行交配型檢 測。PCR擴增體系和擴增程序均同實例1的蛹蟲草單分生孢子菌株交配型檢測的步驟。引物 對Cml-F/Cml-R在M477-7交配型的單子囊孢子菌株中可以特異性地擴增得到一條180bp左 右的條帶，檢測結果見圖3;引物對Cm2-F/Cm2-R在M477-2交配型的單子囊孢子菌株中可 以特異性地擴增得到一條210b p左右的條帶，檢測結果見圖4。

圖3特異性引物Cml-F/Cml-R對蛹蟲草單子囊孢子菌株DNA的PCR擴增電泳圖
M代表Marker-DL2000; 泳道1和2分別為M477-/交配型和M477-2交配型標準； 泳道3-15為蛹蟲草單子囊孢子菌株；泳道16為空白對照。
圖4特異性引物Cm2-F/Cm2-R對蛹蟲草單子囊孢子菌株DNA的PCR擴增電泳圖 各泳道的菌株編號同圖3。序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)大學
<120> —種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法
<160> 4
<210> 1
<211>20
<212>DNA
<213>蛹蟲草(Co "辦ce/w wn7ito^is) <400> 1
cgcattcaga agtgagtgca
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>蛹蟲草(Corc 戸戸？m'/!'f""'s) <400>2
atataccttc gcgatcattg
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>蛹蟲草(Cor辦ceps/w7/tor/51) <400> 3
cgacatacgc ttgtcaagaa sagc
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>蛹蟲草(CoW戸/m/wz7to"'s) <400> 4
gggatgccgt tcgaggagag
權利要求
1.一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，包括分別用于檢測交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的兩對特異性引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R的寡核苷酸序列、兩套相應的PCR擴增體系以及擴增程序。
2. 如權利要求l所述一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，快速檢測蛹蟲草M477-7交 配型的一對特異性引物Cml-F/Cml-R，其特征在于，0111- 的寡核苷酸序列為5'-CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3'， 0111-11的寡核苷酸序列為5'-ATATACCTTCGCGATC ATTG-3'。
3. 如權利要求l所述一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，快速檢測蛹蟲草M477-7交 配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序，其特征在于，PCR擴增體系包括10x buffer 2.5 ^L， 2.5 mM dNTP2.0 ^L， 10mM正向和反向引物各0.5 ^L， 2.5 U L T叫DNA聚合酶0.2 |uL， 10ng/nLDNA模板l.O(aL， ddH20補足至25 |iL。 PCR擴增程序為預變性95r5min; 95°C 40s， 6(TC30s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán);隨后95。C 40s， 58。C30s， 72°C 30s擴增24個循 環(huán)；最后延伸72'C 10min; 4'C保存。
4. 利用權利要求2所述快速檢測蛹蟲草M477-7交配型的一對特異性引物Cml-F/Cml-R和權 利要求3所述快速檢測蛹蟲草M477-7交配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序檢測蛹蟲草交 配型時，^77-/交配型菌株均可得到一條18(^ 左右的條帶，而M477-2交配型菌株沒有擴 增產(chǎn)物。
5. 如權利要求l所述一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，快速檢測蛹蟲草M477-2交 配型的一對特異性引物Cm2-F/Cm2-R，其特征在于，Cm2-F的寡核苷酸序列為5'-CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3' ， Cm2-R的寡核苷酸序列為5'-GGGATGCCGTTCGAGGAGAG -3'。
6. 如權利要求1所述一種快速區(qū)分蛹蟲草交配型的分子檢測方法，快速檢測蛹蟲草M477-2 交配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序，其特征在于，PCR擴增體系包括10x buffer 2.5 HL， 2.5 mM dNTP 2.0 pL， 10mM正向和反向引物各0.5 ^L， 2.5 U/)iL r叫DNA聚合酶 0.2(iL， 10ng/pLDNA模板l.OpL， ddH20補足至25 pL。 PCR擴增程序為預變性95。C 5 min; 95°C 40s， 66°C 30 s， 72°C 30s先擴增6個循環(huán)；隨后95°C 40s， 64°C 30 s， 72°C 30s 擴增24個循環(huán)；最后延伸72°C lOmin; 4'C保存。
7. 利用權利要求5所述快速檢測蛹蟲草M4I7-2交配型的一對特異性引物Cm2-F/Cm2-R和權 利要求6所述快速檢測蛹蟲草M477-2交配型的PCR擴增體系和PCR擴增程序檢測蛹蟲草交 配型時，M477-2交配型菌株均可得到一條210bp左右的條帶，而M477-7交配型菌株沒有擴 增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速區(qū)分蛹蟲草MAT1-1和MAT1-2交配型的分子檢測方法，包括兩對檢測交配型的特異性引物(Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R)和兩套相應的PCR擴增體系和擴增程序。引物對Cm1-F/Cm1-R用于蛹蟲草MAT1-1交配型的檢測，另一引物對Cm2-F/Cm2-R用于MAT1-2交配型的檢測，用這兩對特異性引物及其相應的PCR擴增體系和PCR擴增程序可以實現(xiàn)對蛹蟲草交配型的快速檢測。本發(fā)明的檢測結果特異性強，穩(wěn)定，可靠，快速，較生物學檢測的時間大大縮短。本發(fā)明不僅適用于食藥用菌生產(chǎn)、菌種選育、植物保護等相關專業(yè)領域對蛹蟲草交配型的檢測和進行交配型基因及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，對研究蟲草屬其他真菌的有性生殖以及指導生產(chǎn)實踐都具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK101649350SQ200910085789
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權日2009年6月1日
發(fā)明者張國珍, 袁雪芬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學