專利名稱：：用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒(HPV)的診斷試劑，具體涉及一種用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HPV是人乳頭瘤病毒的英文縮寫，是一組病毒的總稱，組成一個科，其病毒形態(tài)類似。目前已經(jīng)確定的HPV型別大約有80余種，依據(jù)不同型別HPV與腫瘤發(fā)生的危險性高低分為低危險型別和高危險型別HPV，高危險型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13個型別，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變的發(fā)生相關(guān)。大量的子宮頸癌病因?qū)W研究證實，高危型HPV感染是子宮頸癌發(fā)生的必要因素。HPV感染持續(xù)存在最終導(dǎo)致宮頸癌變，故宮頸癌是可預(yù)防的特殊癌癥。因此，篩查預(yù)警HPV對早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌極為重要。HPV不能在體外培養(yǎng)，所以對它的檢測嚴(yán)格依賴于其DNA序列分子水平的檢査，目前對HPV的檢測診斷方法主要有以下幾種(一)子宮頸細(xì)胞抹片及ELISA法子宮頸細(xì)胞抹片檢查是傳統(tǒng)的HPV檢測方法，但其假陰性率高，可達(dá)20%30%。ELISA方法是另一種傳統(tǒng)檢測方法，由于制備相應(yīng)型的單抗工作繁瑣，只能用于個別亞型的鑒定，到目前為止，此方法已逐漸被取代。(二)雜交捕獲檢測法美國Digene公司的HC-II雜交捕獲法檢測方法，可以檢測高、低危群體的HPV病毒，但這種分類試劑盒，假陽性率高(50%60%)、特異性低(37%64%)、且費用昂貴，未能達(dá)到一般用家的要求。(三)PCR檢測法與傳統(tǒng)的細(xì)胞抹片檢查相比，PCR檢測靈敏度高，可檢測極微量的HPVDNA。但是由于涉及多次擴(kuò)增，容易有交替污染，以至假陽性率偏高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)原理如下-T叫Man探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3，末端。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5'外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。本發(fā)明采用Taqman熒光定量PCR原理，設(shè)計針對HPV核酸序列型特異性引物，擴(kuò)增HPV型特異性核酸序列，同時設(shè)計T叫man探針，針對HPV型特異性序列，位于上下游引物之間。針對HPV序列的探針其5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)(Non-FluorescentQuencher)。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5'—3'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號?；谏鲜鲈恚景l(fā)明第一方面提供了一種用于檢測高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的試劑盒，包括高危型HPV核酸熒光PCR檢測混合液；其中，高危型HPV核酸熒光PCR檢測混合液是指含有高危型人乳頭瘤病毒的上游引物、下游引物、探針、PCR-MIX和H20的混合溶液。其中，高危型人乳頭瘤病毒特異性引物與特異性探針的濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)PCR技術(shù)所需的常規(guī)條件來確定。所述PCR-MIX為含有PCR擴(kuò)增緩沖液、Mg2+和dNTP的混合溶液，可以由Linktech購得，也可自行配制。所述高危型人乳頭瘤病毒包括HPV16型人乳頭瘤病毒、HPV18型人乳頭瘤病毒、HPV31型人乳頭瘤病毒、HPV33型人乳頭瘤病毒、HPV35型人乳頭瘤病毒、HPV39型人乳頭瘤病毒、HPV45型人乳頭瘤病毒、HPV51型人乳頭瘤病毒、HPV52型人乳頭瘤病毒、HPV56型人乳頭瘤病毒、HPV58型人乳頭瘤病毒、HPV59型人乳頭瘤病毒和HPV68型人乳頭瘤病毒。.所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液中含有一種或一種以上類型的高危型人乳頭瘤病毒特異性引物及相應(yīng)種類的高危型人乳頭瘤病毒特異性探針；其中高危型人乳頭瘤病毒特異性引物的序列選自SEQIDNO:14-39，高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的序6列選自SEQIDNO:1-13。所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液選自下列核酸熒光PCR檢測混合液中的一種或多種HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV31型核酸熒光檢測PCR混合液、HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液和HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液。上述HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液是指同時含有HPV16型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV16型人乳頭瘤病毒特異性探針、HPV56型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV56型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液是指同時含有HPV18型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV18型人乳頭瘤病毒特異性探針、HPV45型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV45型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液是指同時含有HPV35型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV35型人乳頭瘤病毒特異性探針、HPV59型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV59型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液是指同時含有HPV39型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV39型人乳頭瘤病毒特異性探針、HPV51型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV51型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液是指同時含有HPV58型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV58型人乳頭瘤病毒特異性探針、HPV52型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV52型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV31型核酸熒光檢測PCR混合液是指含有HPV31型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV31型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液和是指含有HPV33型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV31型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。上述HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液是指含有HPV68型人乳頭瘤病毒特異性引物、HPV31型人乳頭瘤病毒特異性探針和PCR-MIX的混合溶液。7優(yōu)選的，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性引物為各類型HPV中的HPVLl基因的特異性引物c更優(yōu)選的，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性引物的序列如下HPV16-1HPV16-2HPV56-1HPV56-2HPV18-1HPV18-2HPV45-1HPV45-2磨35-1HPV35-2HPV59-1HPV59-2HPV39-1HPV39-2HPV51-1訓(xùn)5卜2HPV58-1HPV58-2HPV52-1HPV52-2HPV31-15'-ATGTACCAATGTTGCAGTAAATC-3'5'-TTCACTTTTGTTAGCCTGTAATG-3'5，-ACGCACTAGTATATTTTATCATGC-3'5'-GATATGCACTAACTTTGGGAATG-3'5'-AAGCGTAAACGTGTTCCC-3'5'-TGCGAGTCACATAATCATCAG-3'5'-GGTATCCGCATATCAGTATAGG-3'5'-ACGACCAATTTCCATACCTAC-3'5'-GATTTCCAGACACATCATTTTATG-3'5'-ACCACTAATACCTACTCCTAATG-3'5'-AGTTACCTGATCCCAATAAATTTG-3'5'-ACTGAGTCCTACCCCTAAAG-3'5'—GATGATTATGTTACACGCACAG-3'5'-TGATATGCAGACACCTTTGG-3'5'-TGAAGCTGAAACAGGTTTTATAC-3'5'-TTGCATAAGATGAAGACATAGATG-3'5'-GTCCTCTGCACTCACATAC-3'5'-ATGGACTAGACATAGATGTTACAG-3'5'-CCTGTCTCTAAGGTTGTAAGC-3'5'-AAAATAGGGATGTCCTACTGTTAG-3'5，-ACAGTAGGCCATCCATATTATTC-3，SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDIDNO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:NO:HPV3卜2HPV33-1HPV33-2HPV68—15'-ACGAACCCTAAATACCCTATATTG-3，5'-ATTTAAGTCCTATTGTGCCTTTAG-3'5'-AGCATAAACATCATACAAACCATC-3'5,—TTTTACAGATGGCATTGTGG—3'SEQIDNO:35SEQIDNO:36SEQIDNO:37SEQIDNO:38探針<HPV68-25'-GTGCGTGTCACATAATCATC-3'SEQIDNO:39優(yōu)選的，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針為各類型HPV中的HPVLI基因的特異性更優(yōu)選的，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的序列如下HPV165'-3gTcCaTaGcAcCaa-3'SEQIDNO:1HPV565'-ttcAcgAUGctTgccg-3'SEQIDNO::2HPV185'-3cTcTtGcCaCsG朋-3'SEQIDNO::3HPV455'-alGcCcAaAcCaAac-3'SEQIDNO::4HPV355'-cctGccTccAgcGttt-3'SEQIDNO::5HPV595'-cccGacCgaTttCEiaca-3'SEQIDNO:6HPV395'-tccTgcTtgCgaCcac-3'SEQIDNO:7HPV515'-cccAcaCacAccAcacc-3'SEQIDNO::8腦585'-tccTttGccAccAcacg-3'SEQIDNO:9HPV525'-atcGagAacTgcCtgca-3'SEQIDNO:10HPV315'-tcCtGaCaCcTtTgg-3'SEQIDNO:11HPV335'-ccaCacCgtGccAaatg-3'SEQIDNO:12HPV685'-acaAccTtcGccActg-3'SEQIDNO:13所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的兩端均設(shè)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的，熒光基團(tuán)選自FAM或VIC，淬滅基團(tuán)為非熒光淬滅基團(tuán)。更優(yōu)選的，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性核酸探針的3，端使用朋Q1淬滅基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記；其中HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV58和HPV68型人乳頭瘤病毒特異性核酸探針的5'端使用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，HPV56、9HPV45、HPV59、HPV51、HPV52、HPV31和HPV33型人乳頭瘤病毒特異性核酸探針的5，端使用VIC熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒還包括Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV陽性對照品或H20。所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液、Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV陽性對照品或H20分別獨立包裝。本發(fā)明第二方面，公開了上述用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的使用方法，包括如下步驟1)樣品的核酸裂解處理將樣品洗滌后加入核酸提取液充分混勻，沸水水浴后離心，取上清液作為PCR反應(yīng)模板；2)試劑配制將每種類型的高危型HPV核酸熒光PCR檢測混合液中分別加入Taq酶；3)PCR擴(kuò)增在步驟2中制得的混合液中分別加入步驟1中制得的PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并且分別設(shè)置陽性對照組和陰性對照組同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；4)通過檢測PCR反應(yīng)體系中熒光信號值來確定樣品中HPV的含量，熒光通道檢測選用FAM和VIC通道。上述陽性對照是指以等量的陽性對照品替換樣本制得的對照組。上述陰性對照是指以等量的H20替換樣本制得的對照組。所述步驟3)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95'C保溫2分鐘；93°C10秒和62°C50秒交替循環(huán)40次；單點熒光檢測在62'C。所述步驟4)的檢測過程中，以6-15個循環(huán)的熒光信號作為基線值，以剛好超過H20檢測熒光曲線的最高點的值作為閾值點。上述用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的使用方法，在定性檢測高危型人乳頭瘤病毒時，如果與高危型HPV病毒核酸熒光PCR檢測混合液中Taqraan探針一端的熒光基團(tuán)相對應(yīng)的檢測通道的檢測結(jié)果為Ct<40，則檢測樣本為該類型的高危型HPV病毒陽性樣本。當(dāng)上述檢測混合液FAM、VlC通道Ct值》40,檢測樣本判定為陰性。上述樣品包括生殖泌尿道分泌物棉拭子及宮頸細(xì)胞和組織活檢標(biāo)本等。本發(fā)明采用Taqman熒光PCR法對樣品中的高危型HPV進(jìn)行檢測，該檢測方法具有如下特點(1)縮短了檢測時間，整個過程所需時間只需2小時左右，操作簡便；(2)特異性引物和探針的設(shè)計使其結(jié)合了PCR的高靈敏性、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量的優(yōu)點，其敏感性和特異性均高于其它傳統(tǒng)方法，避免了交叉反應(yīng)；(3)在檢測過程中采用閉管體系，以及全自動定量分析，不需要普通定性PCR的后處理，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染造成的假陽性結(jié)果；(4)Taqman熒光探針經(jīng)處理后，只有與待測模板完全匹配的結(jié)合，才會發(fā)生熒光報告基團(tuán)的切割，產(chǎn)生熒光的消長，因而也避免了引物非特異性擴(kuò)增而導(dǎo)致假陽性的問題。本發(fā)明采用組合的方式對樣品中的高危型HPV進(jìn)行檢測，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點-(1)提高了檢測效率。現(xiàn)有的檢測技術(shù)，均為每種HPV單獨檢測，由于熒光定量PCR儀上的樣品放置孔有限，因此一次試驗只能檢測幾個標(biāo)本。本發(fā)明以組合方式將不同型的HPV混合進(jìn)行檢測，使得每次試驗的檢測標(biāo)本數(shù)增加，從而提高了檢測效率；(2)降低檢測成本。本發(fā)明中將不同型的HPV檢測液混合，節(jié)省了成本，更適合用于臨床使用。圖lHPV16型和HPV56型陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖2HPV18型和HPV45型陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖3HPV35型和HPV59型陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖4HPV39型和HPV51型陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖5HPV58型和HPV52型陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖6HPV(31、33、68型)陽性對照品擴(kuò)增曲線圖。圖7標(biāo)本l擴(kuò)增曲線圖。圖8標(biāo)本2擴(kuò)增曲線圖。圖9標(biāo)本3擴(kuò)增曲線圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方:原料及試劑廠家特異性引物BiosearchTaq酶LinktechTaqman探針BiosearchPCR-MIXLinktech儀器型號廠家PCR儀ABI7000ApplicationBinaryInterface實施例1人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒檢測混合液的制備方法:1、按照如下序列合成寡核苷酸探針-<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>探針序列HPV35:5'-FAM-cctGccTccAgcGttt-BHQ1HPV59:5'-VIC-cccGacCgaTttCaaca-BHQ1HPV(39、51型)核酸熒光PCR檢測混合液引物序列HPV39-1:5'-GATGATTATGTTACACGCACAG-3，HPV39-2:5'-TGATATGCAGACACCTTTGG-3'HPV51-1:5'-TGAAGCTGAAACAGGTTTTATAC-3'HPV51-2:5'-TTGCATAAGATGAAGACATAGATG-3'探針序列HPV39:5'-FAM-tccTgcTtgCgaCcac-朋Q1HPV51:5，-VIC-cccAcaCacAccAcacc-BHQ1HPV(58、52型)核酸熒光PCR檢測混合液引物序列HPV58-1:5'-GTCCTCTGCACTCACATAC-3'HPV58-2:5'-ATGGACTAGACATAGATGTTACAG-3'HPV52-1:5'-CCTGTCTCTAAGGTTGTAAGC-3'HPV52-2:5'-AAAATAGGGATGTCCTACTGTTAG-3'探針序列HPV58:5'-FAM-tccTttGccAccAcacg-BHQ1HPV52:5，-VIC-atcGagAacTgcCtgca-BHQlHPV(31型)核酸熒光PCR檢測混合液引物序列HPV31-1:5'-ACAGTAGGCCATCCATATTATTC-3'HPV31-2:5'-ACGAACCCTAAATACCCTATATTG-3'探針序列HPV31:5'-VIC-tcCtGaCaCcTtTgg-BHQlHPV(33型)核酸熒光PCR檢測混合液引物序列HPV33-1:5'-ATTTAAGTCCTATTGTGCCTTTAG-3'HPV33-2:5'-AGCATAAACATCATACAAACCATC-3'探針序列HPV33:5'-VIC-ccaCacCgtGccAaatg-BHQlHPV(68型)核酸熒光PCR檢測混合液引物序列HPV68-1:5'-TTTTACAGATGGCATTGTGG-3'HPV68-2:5'-GTGCGTGTCACATAATCATC-3'探針序列HPV68:5'-FAM-acaAccTtcGccActg-BHQ12、核酸熒光PCR檢測混合液的制備(1)、HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)16型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2^1/test;13人乳頭瘤病毒(HPV)56型上游引物1.2jalZtest;下游引物1.2(_iIZtest;探針0.2^d/test;PCRMlX-20pl/test;去離子水10.4nl/test混勻。(2)、HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)18型上游引物1.2^1/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2nl/test;人乳頭瘤病毒(HPV)45型上游引物1.2til/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2pl/test;PCRMlX-20jxl/test;去離子水10.化l/test混勻。(3)、HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)35型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2(al/test;人乳頭瘤病毒(HPV)59型上游引物1.2nl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2|al/test;PCRMlX-20nl/test;去離子水10.化l/test混勻。(4)、HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)39型上游引物1.2pd/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2nl/test;人乳頭瘤病毒(HPV)51型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2^U/test;探針0.2^1/test;PCRMlX-20nl/test;去離子水10.4nl/test混勻。(5)、HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)58型上游引物L(fēng)2)il/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2^1/test;人乳頭瘤病毒(HPV)52型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2nl/test;PCRMlX-20nl/test;去離子水10.4^test混勻。(6)、HPV31型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)31型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2pl/test;PCRMlX-20(il/test;去離子水13pl/test混勻。(7)、HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(PV)33型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2^d/test;探針0.2pl/test;PCRMIX-20|il/test;去離子水13(J/test混勻。(8)、HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液的制備將人乳頭瘤病毒(HPV)68型上游引物1.2pl/test;下游引物1.2pl/test;探針0.2^1/test;PCRMIX-20|al/test;去離子水13|il/test混勻。實施例2人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒的使用14標(biāo)本來源所用標(biāo)本來自于臨床醫(yī)療單位。2.1檢測標(biāo)本的處理標(biāo)本中加入lml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，13,000rpm離心5分鐘。沉淀加無菌生理鹽水lml混勻，13，OOOrpm離心5分鐘，再重復(fù)洗滌一次。沉淀直接加入50^1核酸提取液充分混勻，沸水浴10分鐘，然后13,000rpm離心5分鐘，取上清4jil作為PCR反應(yīng)模板。2.2試劑配制(1)取36|ulHPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4plTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(2)取36julHPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4|_dTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(3)取36^1HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4plTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpra離心數(shù)秒。(4)取36)alHPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4plTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(5)取36^1HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4plTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(6)取36^1HPV31型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4(alTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(7)取36^1HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4plTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。(8)取36|alHPV68型核酸熒光PCR檢測混合液與0.4jalTaq酶，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。2.3加樣上述各混合液36ial分別置于薄壁PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板中，然后將已處理標(biāo)本、陽性對照品、H204(^1分別加入薄壁PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板中，蓋好薄壁PCR反應(yīng)管蓋或PCR反應(yīng)板膜，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。152.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置95t:保溫2分鐘；再按93'CX10秒一62'CX50秒，循環(huán)40次；單點熒光檢測在62。C。反應(yīng)體系為40pl。熒光通道檢測選擇選用FAM和VIC通道。2.5檢測結(jié)果檢測結(jié)果標(biāo)本1HPV52，58型標(biāo)本2HPV56型標(biāo)本3HPV16，18，45，56型HPV16，56型陽參HPV18，45型陽參HPV35，59型陽參HPV39，51型陽參HPV58，52型陽參HPV31型陽參HPV33型陽參HPV68型陽參檢測結(jié)果如圖1-10中所示'。上述檢測結(jié)果與臨床單位檢測結(jié)果一致。實施例3人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒臨床靈敏度和特異性試驗3.1標(biāo)本臨床已進(jìn)行HPV高危型分型的的標(biāo)本50個3.2標(biāo)本的處理、試劑配置、加樣和PCR擴(kuò)增同實例13.3檢測結(jié)果50例標(biāo)本中，人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒檢測結(jié)果與臨床單位檢測結(jié)果均為陽性42例，人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒靈敏度為97.67%;人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒檢測結(jié)果與臨床單位檢測結(jié)果均為陰性7例，人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒特異性為100%;人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測試劑盒準(zhǔn)確性為98%。具體試驗結(jié)果見下表。檢測結(jié)果標(biāo)本編號臨床單位檢測結(jié)果試劑盒檢測結(jié)果11616258583161645858511、33、6811、33、68616167—一性性性性性性性性852一958581016161133331259591352、5852、581452521533331616161716161816、31、5216、31、5219-一2016、3116、3121-一22525223一—2458582552522616162733、52、1133、52、1128161629一—3052523116、3316、333258583316163416、18、52、5816、18、52、583531、35、51、5931、35、51、593616163745、52、5845、52、583816163933334016164168684218、3318、334333334456564516164616、6816、6847一一48-—4916、52、5816、52、5850585817序列表<110>上海之江生物科技有限公司<120>用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒及其制備和應(yīng)用<130>090003<160>39<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>15<212>DNA<213>探針<400>1agtccategcaccaa15<210>2<211>17<212>DNA<213>探針<400>2ttcacgattgcttgccg17<210>3<211>15<212>DNA<213>探針<400>3actcttgccacagaa15<210>4<211>15<212>DNA<213>探針<400>4atgccc3犯cc幼ac15<210>5<211>16<212>DNA<213>探針<400>5cctgcctccagcgttt16<210>6<211〉17<212>DNA<213>探針<400>6cccgaccgatttcaaca17<210>7<211>16<212>DNA<213>探針<400>7tcctgcttgcgaccac16<210>8<211〉17<212>DNA<213>探針<400>8cccacacacaccacacc17<210〉9<211>17<212>DNA<213>探針<400>9tcctttgccaccacacg17<210>10<211>17<212>DNA<213>探針<400>10atcgagaactgcctgca1720<210>11<211>15<212>DNA<213>探針<400>11tcctgacacctttgg<210>12<211>17<212>DNA<213>探針<400>12ccacaccgtgccaaatg<210>13<211>16<212>DNA<213>探針<400>13acaaccttcgccactg<210>14<211>23<212>DNA<213>引物21<400>14atgtaccaatgttgcagtaaate<210>15<211〉23<212>DNA<213>引物<400>15ttcacttttgttagcctgtaatg<210>16<211>24<212>DNA<213>引物<400>16acgcactagtatattttatcatgc<210>17<211>23<212>DNA<213>引物<400>17gatatgeactaactttgggaatg<210>18<211>1823232423<212>DNA<213>引物<400>18aagcgtaaacgtgttccc<210>19<211>21<212>DNA<213>引物<400>19tgcgagtcacataatcatcag<210>20<211>22<212>DNA<213>引物<400>20ggtatccgcatatcagtatagg<210>21<211>21<212>DNA<213〉引物<400>21acgaccaatttccatacctac說明書第19/24頁18212223<210>22<211>24<212>DNA<213>引物<400>22gatttccagacacatcattttatg24<210>23<211>23<212>DNA<213>引物<400>23accactaatacctactcctaatg23<210>24<211>24<212>DNA<213>引物<400>24agttacctgatcccaataaatttg24<210>25<211>20<212>DNA<213>引物<400>25<210>26<211>22<212>DNA<213>引物<400>26gatgattatgttacacgcacag<210>27<211>20<212>DNA<213>引物<400>27tgatatgcagacacctttgg<210>28<211>23<212>DNA<213>引物<400>28tgaagctgaaacaggttttatac<210>29<211>24<212>DNA說明書第21/24頁202220<213>引物<400>29ttgcataagatgaagacatagatg24<210>30<211>19<212>DNA<213>引物<400>30gtcctctgcactcacatac19<210>31<211>24<212>DNA<213>引物<400>31atggactagacatagatgttacag24<210>32<211>21<212>DNA<213>引物<400>32cctgtctctaaggttgtaagc21<210>3326<211>24<212>DNA<213>引物<400>33aaaatagggatgtcctactgttag24<210>34<211>23<212>DNA<213>引物<400>34acagtaggccatccatattattc23<210>35<211>24<212>DNA<213>引物<400>35acgaaccctaaataccctatattg24<210>36<211>24<212>DNA<213>引物<400>36atttaagtcctattgtgcctttag24<210>37<211>24<212>DNA<213>引物<400>37昭cata幼catcatecaaaccatc24<210>38<211>20<212>DNA<213>引物<400>38ttttacagatggcattgtgg20<210>39<211>20<212>DNA<213>引物<400>39gtgcgtgtcacataatcatc20權(quán)利要求1.一種用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，包括高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液；其中，高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液中含有高危型人乳頭瘤病毒特異性引物、高危型人乳頭瘤病毒特異性探針、PCR-MIX和H2O。2.如權(quán)利要求l所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒包括HPV16型人乳頭瘤病毒、HPV18型人乳頭瘤病毒、HPV31型人乳頭瘤病毒、HPV33型人乳頭瘤病毒、HPV35型人乳頭瘤病毒、HPV39型人乳頭瘤病毒、HPV45型人乳頭瘤病毒、HPV51型人乳頭瘤病毒、HPV52型人乳頭瘤病毒、HPV56型人乳頭瘤病毒、HPV58型人乳頭瘤病毒、HPV59型人乳頭瘤病毒和HPV68型人乳頭瘤病毒。3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液中含有一種或一種以上類型的高危型人乳頭瘤病毒特異性引物及相應(yīng)種類的高危型人乳頭瘤病毒特異性探針；其中高危型人乳頭瘤病毒特異性引物的序列選自SEQIDNO:]4-39,高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的序列選自SEQIDN0:H3。4.如權(quán)利要求1所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液選自下列核酸熒光PCR檢測混合液中的一種或多種HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液、HPV58型和HPV52型核酸熒光PCK檢測混合液、HPV31型核酸熒光檢測PCR混合液、HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液和HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液。5.如權(quán)利要求l所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性引物為HPVLI基因的特異性引物。6.如權(quán)利要求5所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDN0:14-17;HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDN0:18-21;HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDN0:22-25;HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDNO:26-29;HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDNO:30-33;HPV31型核酸熒光檢測PCR混合液中的特異性引物的序列為SEQIDN0:34-35;HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液或HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性引物的序列為SEQIDNO:36-39。7.如權(quán)利要求1所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針為HPVLI基因的特異性探針。8.如權(quán)利要求7所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述HPV16型和HPV56型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDNO:1-2;HPV18型和HPV45型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDN0:3-4;HPV35型和HPV59型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDN0:5-6;HPV39型和HPV51型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDNO:7-8;HPV58型和HPV52型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDN0:9-10;HPV31型核酸熒光檢測PCR混合液中的特異性探針的序列為SEQIDNO:11;HPV33型核酸熒光PCR檢測混合液或HPV68型核酸熒光PCR檢測混合液中的特異性探針的序列為SEQIDN0:12-13。9.如權(quán)利要求1所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的兩端均設(shè)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。10.如權(quán)利要求9所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)選自FAM或VIC。11.如權(quán)利要求9所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述淬滅基團(tuán)為非熒光淬滅基團(tuán)。12.如權(quán)利要求11所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述淬滅基團(tuán)為BHQ1基團(tuán)。13.如權(quán)利要求8所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的3'端使用朋Q1淬滅基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記；其中HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV58和HPV68型高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的5'端使用F細(xì)熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，HPV56、HPV45、HPV59、HPV51、HPV52、HPV31和HPV33型高危型人乳頭瘤病毒特異性探針的5'端使用VIC熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。14.如權(quán)利要求1所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV陽性對照品或H20。15.如權(quán)利要求14所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液、Taq酶、核酸抽提液、高危型HPV陽性對照品或仏0分別獨立包裝。16.如權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的使用方法，包括下列步驟1)樣品的核酸裂解處理將樣品洗滌后加入核酸提取液混勻，沸水水浴后離心，取上清液作為PCR反應(yīng)模板；2)試劑配制在每種類型的高危型人乳頭瘤病毒核酸熒光PCR檢測混合液中分別加入Taq酶；3)PCR擴(kuò)增在步驟2中制得的混合液中分別加入步驟1中制得的PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并且分別設(shè)置陽性對照組和陰性對照組同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；4)檢測各個PCR反應(yīng)體系中的熒光信號值，熒光通道檢測選用FAM和VIC通道。17.如權(quán)利要求16所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括在定性檢測高危型人乳頭瘤病毒時，如果與高危型HPV病毒核酸熒光PCR檢測混合液中Taqman探針相對應(yīng)的檢測通道的檢測結(jié)果為Ct<40，則檢測樣本為該類型的高危型HPV病毒陽性樣本。18.如權(quán)利要求16所述的用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95。C保溫2分鐘；93。C10秒和62°C50秒交替循環(huán)40次；單點熒光檢測在62°C。全文摘要本發(fā)明涉及宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變的輔助診斷試劑盒，公開了一種用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，包括高危型HPV核酸熒光PCR檢測混合液和Taq酶。本發(fā)明還公開了上述用于檢測高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒的制備方法和使用方法。本發(fā)明的試劑盒，可以用于檢測高危型人乳頭瘤病毒，克服了現(xiàn)有技術(shù)對人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型檢測的假陽性率高、特異性低和費用昂貴等問題。文檔編號C12R1/93GK101503741SQ200910047010公開日2009年8月12日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者朱勤瑋,朱旭平,馬麗麗申請人:上海之江生物科技有限公司