專利名稱：：一種高危型hpv熒光pcr篩查方法及引物、探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人類乳頭瘤病毒(HPV)的'滯查方法，特別是針對高危型HPV的熒光PCR篩查方法及引物、探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是女性的常見惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤第二位，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。國際宮頸癌生物學(xué)研究(IBSCC);f幾構(gòu)報道，93%以上的宮頸癌組織中可檢出HPV-DNA。研究表明HPV是引起宮頸癌的主要因素，流行病學(xué)研究顯示HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。大量臨床資料表明，HPV感染是引發(fā)宮頸病變的重要原因。HPV是一類特異感染人皮膚、黏膜的非均質(zhì)、雙股環(huán)形DNA病毒，基因約8kb長。根據(jù)其功能的活動時段可分為3個編碼區(qū)，即早期區(qū)、晚期區(qū)和長控區(qū)。迄今已發(fā)現(xiàn)120多種HPV亞型，依致病力大小，將HPV分為低危型和高危型兩種。低危型主要導(dǎo)致生殖道肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣、宮頸扁平濕疣類病變和4氐度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CINI級)，主要亞型有HPV6、11、42、43、44等。高危型主要導(dǎo)致高度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變，即CINII、III級和宮頸癌，主要亞型有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68這13種亞型?，F(xiàn)常用的HPV的檢測方法如下PCR檢測包括常規(guī)PCR檢測、實時熒光定量PCR檢測(FQ-PCR)和PCR結(jié)合反向點雜交技術(shù)檢測等。它們不僅可以對HPV感染者進行準(zhǔn)確的早期診斷，而且能對HPV快速分型，方法簡便、靈敏度高、特異性強。4旦熒光定量PCR檢測主要針對HPV6、11、16和18亞型感染，其他亞型感染則會漏診。雜交捕獲DNA分析該分析是由Digene公司推出的非放射性HPV-DNA分析系統(tǒng)，聯(lián)合應(yīng)用高效液相雜交法和敏感的化學(xué)發(fā)光信號擴增系統(tǒng)?，F(xiàn)為第2代雜交捕獲法(HCII),能檢測13種高危型HPV(HR-HPV)(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5種低危型HPV(LR-HPV)(6、11、42、43和44)。靈敏度和特異性均較高，操作相對筒便，條件要求低，目前已廣泛應(yīng)用。HCII的缺點為僅能定量不能分型。高危型HPV檢測(HCII)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查對于CINI患者診斷的靈敏度、特異度分別高達(dá)100%、97.2%,因此臨床意義重大。但兩種方法聯(lián)合使用價格比較貴，不適于廣大普通人群篩查。原位雜交技術(shù)使用放射性或非放射性DNA或RNA纟笨針標(biāo)記細(xì)月包或組織，能夠定位，且假陽性率低。但對病毒復(fù)制較少的宮頸癌及浸潤癌，其敏感性較低，僅為40%~50%。組合把基因自動檢測應(yīng)用基因芯片和電傳感技術(shù)對HPV進行快速分型檢測，基因芯片可對HPV多種亞型同時檢測，是多種亞型感染檢測的好方法，但應(yīng)進一步完善以提高其敏感性和特異性。針對宮頸癌的篩查，現(xiàn)在還沒有一種價格便宜，靈敏度高，特異性好的適于廣大普通人群采用的方法。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種高危型HPV的熒光PCR篩查方法。該方法針對高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同時進行第一管采用的引物如SEQIDNO:l至SEQIDNO:6所示序列，采用的探4十如SEQIDNO:19所示序列；第二管采用的引物如SEQIDNO:9至SEQIDNO:14所示序列，釆用的探針如SEQIDNO:21至SEQIDNO:23所示序列；第三管采用的引物如SEQIDNO:7、IDNO:8、SEQIDNO:15至SEQIDNO:18所示序列，采用的探針如SEQIDNO:20、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示序列。收集50pl樣品，采用常規(guī)提取DNA的方法或試劑盒提耳又純化核酸后，加入20pl滅菌水或TE等。在八排管中加入20pl反應(yīng)液及5^1純化后的核酸并混勻后，再放置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件為90-95°Cl-5分鐘，熱循環(huán)為90-95。C5-20秒，50-62°C30-60秒，共30-40個循環(huán)。優(yōu)選的，所述方法的反應(yīng)條件為94。C2分鐘，熱循環(huán)為94。C10秒，55°C35秒，共40個循環(huán)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種高危型HPV的熒光PCR篩查引物，這類引物是針對高危型HPV基因序列的，選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示序列中的至少一種。本發(fā)明還提供了高危型HPV熒光PCR篩查引物對，針對高危型HPV基因序列，選自以下所示序列的引物對中的至少一對SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。本發(fā)明的第四個目的是提供高危型HPV熒光PCR篩查探針，該類探針是針對高危型HPV基因序列，選自SEQIDNO:19至SEQIDNO:25所示序列中的至少一種。本發(fā)明的第五個目的是提供一種高危型HPV的熒光PCR篩查試劑盒，該試劑盒針對高危型HPV，包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:25所示序列中的至少一種。本發(fā)明的第六個目的是提供一種高危型HPV的熒光PCR篩查試劑盒，該試劑盒針對高危型HPV，包含以下所示序列的引物對中的至少一對SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。上述的高危型HPV包含14種亞型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67和68型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的針對14種高危型HPV的熒光PCR篩查方法及其引物、探針和試劑盒針對14種高危型HPV的篩查，其特異性和敏感性高，可操作性強，能同時檢測14種高危亞型，且價格相對便宜，很適合廣大普通群眾的需求。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。以下實施例主要是通過將本發(fā)明的篩查高危型HPV的熒光PCR的方法與HC2高危HPVDNA檢測方法進行對照實驗。其中所用到的引物序列如SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示，探針序列如SEQIDNO.19至SEQIDNO:25所示。具體見序列表。HC2(HybridCapture2)高危HPVDNA檢測試劑盒是Digene公司開發(fā)的針對13種高危HPV的DNA檢測試劑盒，是目前獲美國FDA批準(zhǔn)唯一可在臨床使用的HPVDNA檢測技術(shù)，并獲歐洲CE組織認(rèn)證及中國藥監(jiān)局SDA注冊。該試劑盒可對HPV高危亞型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13種進行檢測，其基本原理是在分子水平采用基因雜交-化學(xué)發(fā)光-信號放大的檢測技術(shù)對HPVDNA進行定量檢測。試驗步驟如下1、樣品DNA雙鏈被釋放并分解成為可以雜交的核苷酸單鏈。2、DNA單鏈與RNA組合探針結(jié)合為RNA-DNA雜合體。3、第一抗體(特異性抗體)與DNA-RNA雜交復(fù)合物固定在微孔壁上。4、偶聯(lián)有堿性磷酸酶的第二抗體與RNA-DNA雜合體結(jié)合。5、堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光，判讀光的強弱可確定堿性磷酸酶的含量，從而確定RNA-DNA雜合體的含量。(檢測結(jié)果解釋判定標(biāo)準(zhǔn):RLU/Cutoff》1為陽性,<1為陰性。)本發(fā)明的高危HPV熒光PCR檢測技術(shù)采用Taqman探針技術(shù)，可檢測14種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67、68)，該技術(shù)精心設(shè)計七條探針，皆采用FAM/BHQ標(biāo)記方法，在不影響特異性的情況下盡可能的對上述14種亞型進行合并，具體引物揮:針見表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對上述亞型引物探針組合與HC2HPV試劑盒對比實驗，陽性實驗結(jié)果完全一致，陰性實驗結(jié)果中242號標(biāo)本(RLU/Cutoff為0.8)焚光PCR結(jié)果(CT:34.6434)為陽性，檢出率高于HC2HPV試劑盒，具體實驗結(jié)果見表2、表3，表2是HC2HPV陽性品使用熒光PCR對比實驗結(jié)果，表3是HC2HPV陰性品使用熒光PCR法對比實驗結(jié)果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述實驗的具體操作為收集50jLil樣品，采用常規(guī)提取DNA的方法或試劑盒提取純化核酸后，加入20pl滅菌水。在八排管中加入2(Vl反應(yīng)液及5pl純化后的核酸并混勻后，再放置于焚光定量PCR儀中反應(yīng)，同時在三種反應(yīng)條件下進行90。Cl分鐘，熱循環(huán)為90。C5秒，50。C30秒，共30個循環(huán)；95°C5分鐘，熱循環(huán)為95°C20秒，62°C60秒，共35個循環(huán)；94°C2分鐘，熱循環(huán)為94°C10秒，55。C35秒，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果近似。在本發(fā)明的實施例中，僅將上述表2、表3的數(shù)據(jù)列舉出來，作為代表說明實驗結(jié)果。表2、表3的實驗結(jié)果為在94。C2分鐘，熱循環(huán)為94。C10秒，55。C35秒，共40個循環(huán)的反應(yīng)條件下得到的。上述表2，表3的實驗結(jié)果證實了本發(fā)明的高危型HPV檢測引物與探針的可用性。以下實驗數(shù)據(jù)均在反應(yīng)條件為94°C2分鐘，熱循環(huán)為94°C10秒，55°C35秒，共40個循環(huán)的設(shè)置下得到的。在實際操作中希望能夠盡量減少檢測管數(shù)，因此，對現(xiàn)有的引物與探針進行了分組混合，并證實14種高危型HPV熒光PCR檢測試劑可以最終分為3組，即同一個標(biāo)本進行3管PCR檢測即可得知是否有此14種高危HPV感染。表4為將表1中的引物探針進行分組來同時檢測的方案表。表5和表6為分組實驗結(jié)果，其中，表5為組1的實驗結(jié)果，表6為組2和組3的實驗結(jié)果。從分組與單項對比的實驗情況，初步得出可以將14種高危亞型分為三組，從而實現(xiàn)了在不降低靈敏度和特異性的情況下減少檢測管數(shù)，降低成本的目的。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>為進一步驗證熒光PCR引物探針的分組可靠性，對26份臨床樣品分別使用HC2HPV檢測試劑盒與本發(fā)明的分三組同時反應(yīng)的篩查方法進行同步檢測。實驗結(jié)果見表7，表7是26份臨床樣品HC2HPV與三組熒光PCR同步檢測結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述的同步實驗表明，本發(fā)明的三組熒光PCR檢測方法配套引物探針與HC2HPV試劑盒結(jié)果完全符合。上述用到了18條引物和7條探針，序列分別如SEQIDNO:1至SEQIDNO:25所示。用這些引物和探針也可以組裝成試劑盒，用來檢測HPV。這些引物可以根據(jù)具體情況進行配對和使用，探針也可以根據(jù)具體需要進行選用。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>綜合上述實驗結(jié)果，將本發(fā)明的高危型HPV焚光PCR篩查方法及引物探針和含本發(fā)明所述的引物探針組成的試劑盒與HC2高危HPVDNA檢測試劑以及HPV16/18型焚光PCR方法進行比較，比較的具體情況如表8所述。由表8的比較分析可見，本發(fā)明的高危型HPV熒光PCR篩查方法及引物探針和含本發(fā)明所述的引物探針組成的試劑盒的特異性、敏感性高，可操作性強，能同時檢測14種高危亞型，且價格相對便宜，很適合廣大普通群眾的需求。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。序列表<120>—種高危型HPV熒光PCR篩查方法及引物、探針和試劑盒<160〉25<210>1<211>27<212>人工序列1635F<400>1cccagagtatgggcttaatgataagaa27<210>1<211>24<212>人工序列163135R<400〉2gtctccatcgttttctttgtcctc24<210〉1<211〉30<212>人工序列31F<400>3ggaaatccagtatatgaattaagtgataaa30<210>1<211>30<212〉人工序列52F<400>4caatcctatatatgaaattaacaacgaaaa30<210>1<211>29<212〉人工序列33585267R<400>5ttccttgtcctcttcctctattaaatcta29<210>1<211>30<212>人工序列67F<400〉6caatccagtatataacttaaatgacgaaaa30<210〉1<211〉24<212>人工序列PV1845F<400>7ggacatggtccagattagatttgc24<210〉1<211〉20<212〉人工序列PV1845R<400>8acgttccgaaagggtttcct20<210>1<211>26<212〉人工序列PV3968F<400>9tgaaaagacttggtgcagattagact26<210>1<211〉28<212>人工序列PV3968R<400>10tgtaacacatttaaacgttgtgaaagtg<210>1<211〉22<212>人工序列PV3358F<400>11tcaaggacgtggtgcaaattag<210〉1<211>25<212>人工序列PV3358R<400>12ctgcatttaaacgtgctgatatttc<210〉1<211>21<212>人工序列PV51F<400>13gcgcactaatgacagcaaggt<210>1<211>24<212〉人工序列PV51R<400〉14cggtgcgtgtgatatattcttctg2822252124<210〉1<211>23<400>15agtgtgggcat卿aggtttgg<210>1<211>26<212>人工序列PV56R<400〉16gg犯ctttcagtatcatccagcctat<210>1<211>26<212>人工序列PV59F<400>17tggatcttctgagcaactatcatacc<210>1<211>20<212>人工序列PV59R<400〉18cgtctgacggttggacgttt<210>1<211>28<212〉人工序列PV5TFB<400>19tggaaatcctttttctcaaggacgtggt<210>1<211>26<212>人工序列PV1845FB<楊>20cgaggaagaggaagatgcagacaccg<210>1<211>28<212>人工序列PV3968FB<400〉21cagcaggacgaggatgaaggagacaatg<210>1<211>34<212〉人工序列PV3358FB<400>22tttaatagaggaagaggacaaggaaaaccatgga<210〉1<211〉24<212〉人工序列PV51FB<400>23ttgccacctgcacctgtgtctcga<210>1<211>25<212>人工序列PV56FB<400>2426283424taggtgctgggctaagtggccatcc25<210〉1<211〉18<212>人工序列PV59FB<400〉25acgccccccgaagccacg18權(quán)利要求1、一種高危型HPV熒光PCR篩查方法，其特征在于，針對高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同時進行第一管采用的引物如SEQIDNO1至SEQIDNO6所示序列，采用的探針如SEQIDNO19所示序列；第二管采用的引物如SEQIDNO9至SEQIDNO14所示序列，采用的探針如SEQIDNO21至SEQIDNO23所示序列；第三管采用的引物如SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO15至SEQIDNO18所示序列，采用的探針如SEQIDNO20、SEQIDNO24和SEQIDNO25所示序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高危型HPV熒光PCR篩查方法，其特征在于，所述方法的反應(yīng)條件為90-95°C1-5分鐘，熱循環(huán)為90-95°C5-20秒，50-62。C30-60秒，共30-40個循環(huán)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高危型HPV熒光PCR篩查方法，其特征在于，所述方法的反應(yīng)條件為94°C2分鐘，熱循環(huán)為94°C10秒，55°C35秒，共40個循環(huán)。4、高危型HPV熒光PCR篩查引物，其特征在于，針對高危型^PV基因序列，選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示序列中的至少一種。5、高危型HPV熒光PCR篩查引物對，其特征在于，針對高危型HPV基因序列，選自以下所示序列的引物對中的至少一對SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16和SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。6、高危型HPV熒光PCR篩查探針，其特征在于，針對高危型HPV基因序列，選自SEQIDNO:19至SEQIDNO:25所示序列中的至少一種。7、一種高危型HPV熒光PCR篩查試劑盒，其特征在于，針對高危型HPV基因序列，所述試劑盒包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:25所示序列中的至少一種。8、一種高危型HPV熒光PCR篩查試劑盒，其特征在于，針對高危型HPV基因序列，所述試劑盒包含以下所示序列的引物對中的至少一對SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16和SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。全文摘要本發(fā)明提供了一種高危型HPV的熒光PCR篩查方法及其引物、探針和試劑盒。該方法針對高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同時進行。反應(yīng)條件為90-95℃1-5分鐘，熱循環(huán)為90-95℃5-20秒，50-62℃30-60秒，共30-40個循環(huán)。該試劑盒包含SEQIDNO1至SEQIDNO25所示序列中的至少一種或包含本發(fā)明中的引物對中的至少一對。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高危型HPV的熒光PCR篩查方法及其引物、探針和試劑盒針對14種高危型HPV的篩查，其特異性和敏感性高，可操作性強，能同時檢測14種高危亞型，且價格相對便宜，很適合廣大普通群眾的需求。文檔編號C12Q1/70GK101613764SQ20091004162公開日2009年12月30日申請日期2009年8月3日優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日發(fā)明者劉文寬,榮周,蘇曉波申請人:廣州銳達(dá)生物科技有限公司;呼吸疾病國家重點實驗室