專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及環(huán)境毒理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)目前的飲用水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和衛(wèi)生規(guī)范與國(guó)外的三大標(biāo)準(zhǔn)基本接軌，尤其是衛(wèi)生部和建設(shè)部修訂后的衛(wèi)生規(guī)范和城市供水標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)大量增加了有機(jī)污染物的毒理學(xué)指標(biāo)。但是，我國(guó)目前飲用水標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行和實(shí)施沒(méi)有相關(guān)的法律法規(guī)，在執(zhí)行中比較困難。另外，由于生物遺傳毒性，尤其是中長(zhǎng)期的生物遺傳毒性檢測(cè)需要的技術(shù)難度較大，所需時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用也較高。因此，我國(guó)通常只對(duì)常規(guī)的感官、微生物和部分理化指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。上海、天津、哈爾濱等大城市已經(jīng)報(bào)道的飲用水源監(jiān)測(cè)范圍大致如此。對(duì)于飲用水源中的復(fù)合污染物長(zhǎng)期積累導(dǎo)致的污染和生物遺傳毒性等檢測(cè)則只有零星的研究，如蠶豆根尖微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)和小鼠后代細(xì)胞彗星試驗(yàn)等。有機(jī)污染物本身有一定的生物積累性、毒性和致癌、致畸、致突變的"三致"作用，一些有機(jī)物對(duì)人的生殖功能產(chǎn)生不可逆的影響，是人類(lèi)的隱型殺手。自70年代Simmon發(fā)現(xiàn)自來(lái)水中存在致突變性有機(jī)污染物以來(lái)，在自來(lái)水及其水源水中先后發(fā)現(xiàn)多種遺傳毒性物質(zhì)。美國(guó)EPA水質(zhì)調(diào)査發(fā)現(xiàn)供水系統(tǒng)中有機(jī)污染物2110種，飲用水中含765種。1994年以來(lái)，美國(guó)在飲用水中發(fā)現(xiàn)了100多種合成有機(jī)物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等，具有"三致"作用。水源水和自來(lái)水中的有機(jī)物種類(lèi)和數(shù)量相當(dāng)大，污染問(wèn)題相當(dāng)突出。水源水中的污染物主要來(lái)自有機(jī)物，南京水源水中發(fā)現(xiàn)有機(jī)污染物，陽(yáng)性水樣中存在有多種美國(guó)EPA所列的129種優(yōu)先污染物，以及其它黑名單上的有毒有害物質(zhì)，水源水質(zhì)已受到污染。目前用于遺傳毒性研究的方法已經(jīng)超過(guò)200種，傳統(tǒng)的毒理學(xué)分析方法大多局限于對(duì)單一物質(zhì)的作用檢測(cè)，在藥物、有機(jī)污染物的毒性檢測(cè)中常用。而對(duì)于飲用水源等環(huán)境樣品的遺傳毒性檢測(cè)來(lái)說(shuō)，有其特殊性第一，水樣中并非單一物質(zhì)的污染，大多數(shù)是以混合物的形式出現(xiàn)；第二，混合物導(dǎo)致的毒性效應(yīng)并非簡(jiǎn)單的單因素效應(yīng)累加，各種物質(zhì)和因素之間有可能存在協(xié)同或拮抗作用，依靠單個(gè)物質(zhì)的分析方法并不能對(duì)環(huán)境樣品的毒性做出正確的評(píng)價(jià)；第三，飲用水源中的致毒性物質(zhì)是微量的。因此，必須根據(jù)我國(guó)的國(guó)情，探討適合于飲用水的準(zhǔn)確、快速、靈敏、實(shí)用的生物遺傳毒性和環(huán)境激素類(lèi)等有機(jī)污染物檢測(cè)新技術(shù)，對(duì)飲用水的安全性做出及時(shí)地預(yù)警預(yù)報(bào)，使社會(huì)能夠及時(shí)應(yīng)對(duì)各種水污染的出現(xiàn)并加以有效的控制。生物遺傳毒性檢測(cè)方法雖然很多，但真正經(jīng)過(guò)驗(yàn)證、有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。研究進(jìn)展表明，對(duì)于常用的檢測(cè)基因突變的Ames試驗(yàn)，各國(guó)學(xué)者都在研究敏感性和特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更高和操作更方便的方法。例如常規(guī)的試驗(yàn)采用4個(gè)測(cè)試菌株，最近有人發(fā)現(xiàn)增加測(cè)試菌株1八1535(5"/附0加//"妙&卿n',鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株)更適合用于檢測(cè)混合物的致突變性。為了克服S9(不加體外代謝活化系統(tǒng))制備上的困難和不穩(wěn)定性，Josephy等將沙門(mén)氏菌的芳香胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和人類(lèi)細(xì)胞色素P-450基因CyplAZ引入細(xì)胞，構(gòu)建了新的Ames測(cè)試株(JosephyPD,GruzP,NohmiT.Recentadvancesintheconstructionofbacterialgenotoxicity.MutaRes,1997,(386):1-223)。Quillardet則提出使用sfiA-lacZ融合基因的SOS顯色檢測(cè)法，彌補(bǔ)了Ames試驗(yàn)需要使用多種菌株的缺點(diǎn)(QullardetP，HofnungM.TheSOSChromotest,acolorimetricbacterialassayforgenotoxinsprocedures.MutatRes,1985，147(3):65-78)。在此基礎(chǔ)上，Oda等人又建立了SOS/Umu測(cè)試法，使試驗(yàn)的樣品量減少，無(wú)菌操作要求降低，更方便進(jìn)行數(shù)量多的水樣的檢測(cè)(OdaY,etal;Evaluationofthenewsystem(umu-test)forthedelectionofenvironmentalmutagensandcarcinogens;MutatRes;1985:147(50):129)。最近幾年來(lái)也有一些研究者使用生物標(biāo)記的方法檢測(cè)環(huán)境污染物的遺傳毒理效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外己有諸多研究報(bào)道Clements等用蝌蚪細(xì)胞DNA損傷研究除草劑對(duì)水生生物的遺傳毒性(ClementsC,RalphS,PetrasM,1997.GenotoxicityofselectherbicidesinRanacatesbeianatadpolesusingthealkalinesing-cellgelDNAelectrophoresis(Comet)assay.Environ.Molec.Mutag.29:277-288);Mitchelmore等利用魚(yú)和水生生物的DNA損傷作為檢測(cè)遺傳毒性的生物標(biāo)記物研究水污染的致癌作用(MitchelmoreCL,BirmelinC,ChipmanJK，etal.EvidenceforcytochromeP450catalysisandfreeradicalinvolvementintheproductionofDNAstrandbreaksbyinvolvementintheproductionofDNAstrandbreaksbybenzo[a〗pyreneandnitroaromaticsinmussel(MytilusedulisL)digestiveglandcells.AquatToxicol,1998,41:193-212);Hartmann等曾用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)和姐妹染色單體交換(SCE)技術(shù)研究重金屬污染的遺^專(zhuān)毒理效應(yīng)(HartmannA,PlappertU，PoetterF,etal.2003.Comparativestudywiththealkalinecometassayandthechromosomeaberrationtest[J].MutatRes,536:27-38)。綜合上述材料可以看出Ames試驗(yàn)和SOS/Umu測(cè)試試驗(yàn)法均是檢測(cè)DNA的損傷程度的方法，Ames致突變?cè)囼?yàn)是目前廣泛使用的一種測(cè)試方法，但由于其所需菌株較多，操作復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高而限制了其應(yīng)用；SOS/Umu試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法操作過(guò)程非常繁瑣，在操作過(guò)程中需要多次轉(zhuǎn)化培養(yǎng)板以及菌體所需培養(yǎng)基的配置和保存的條件比較苛刻，所用的試劑，生物標(biāo)記物的特異性不夠顯著且花費(fèi)相當(dāng)高。因此，為了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)水源水中的遺傳毒性物質(zhì)，迫切需要建立一種簡(jiǎn)便、快速的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)水源水中的遺傳毒性物質(zhì)的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，在保持試驗(yàn)操作常規(guī)化的前提下，可以節(jié)省大量時(shí)間。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種檢測(cè)水源水中遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，包括以下步驟1)將菌株TA1535接種到液體LB或者營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基里，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜得到菌懸液，用無(wú)菌水調(diào)整菌懸液濃度至OD奶為0.2-0.3;2)取至少四個(gè)濃度梯度的水樣樣品濃縮物各lOO)al，分別加入到550-650W步驟l)所述的菌懸液中，35士2。C振蕩培養(yǎng)2-3h，以DMSO為溶劑對(duì)照，以4-NQO為陽(yáng)性對(duì)照；3)振蕩培養(yǎng)后加入2.5-3.0mlB-Buffer混勻，再加入5-10iul氯仿振蕩混勻，加入500-800jalONPG溶液，35土2。C溫育顯色30-50min;4)加入300-50(^lNa2CO3溶液終止顯色，測(cè)定顯色后溶液的0042()和OD550;5)計(jì)算樣品和溶劑對(duì)照的酶活性，并計(jì)算誘導(dǎo)率IR，若1&2.0，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，表明水樣樣品含有遺傳毒性物質(zhì)。其中，步驟1)是將菌株TA1535接種到LB液體培養(yǎng)基里，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜14-18小時(shí)得到菌懸液。優(yōu)選地，步驟l)中所述菌懸液OD595為0.28-0.3。優(yōu)選地，步驟2)中設(shè)置四個(gè)濃度梯度的水樣樣品濃縮物，分別相當(dāng)于水樣樣品的2L、1L、0.5L禾卩0.25L。優(yōu)選地，步驟3)中氯仿的體積為8-10pl。優(yōu)選地，步驟3)為37°C溫育顯色50min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的有益效果1)本發(fā)明檢測(cè)水源水中遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，可以在保持試驗(yàn)操作常規(guī)化，測(cè)試結(jié)果精確、靈敏的前提下，省略很多步驟，節(jié)省大量時(shí)間；2)本發(fā)明檢測(cè)水源水中遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，操作簡(jiǎn)單，整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程無(wú)菌要求低。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，其目的僅在于更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍包括并不僅限于所舉之例。實(shí)施例1一種檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法本實(shí)施例所述檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法主要包括如下步驟1)將菌株TA1535(購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)菌種保藏中心DSMZ，保藏編號(hào)是DSM9274)接種到液體LB培養(yǎng)基里過(guò)夜培養(yǎng)(14-18小時(shí))得菌懸液，其中LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。2)調(diào)整菌懸液的濃度，使其00595達(dá)到0.28-0.30。吸取過(guò)夜培養(yǎng)的TA1535菌懸液lOOpl于1.5ml離心管里，5000rpm離心5min收集菌體，用無(wú)菌水稀釋到l.Oml，觀(guān)!(定其OD595的值。然后利用菌體和無(wú)菌水調(diào)整其濃度，使其OD595達(dá)到0.28-0.30。分別取600|al該菌懸液到5ml試管里用于下一步試驗(yàn)。3)取100|al四個(gè)梯度濃度的水樣樣品濃縮物(分別相當(dāng)于水樣樣品的2L、1L、0.5L和0.25L)，分別加到裝有菌懸液的5ml試管里，混勻后用報(bào)紙包好，放在37°C搖床振蕩培養(yǎng)3h。另夕卜，取100ialDMSO(二甲基亞砜)加到裝有菌懸液的5ml試管里作為溶劑對(duì)照，取1001^14-NQO(4-硝基喹啉-l-氧化物)(lmg/lmlDMSO)加到裝有菌懸液的5ml試管里作為陽(yáng)性對(duì)照。4)3小時(shí)后，再往每個(gè)試管中加入2.7mlB-buffer，混勻后加入lO^il氯仿，振蕩混勻。其中B-buffer的主要成分是磷酸氫二鈉20.18g/L，磷酸二氫鈉5.5g/L，氯化鉀0.75g/L，硫酸鎂0.25g/L，用之前需要加2-疏基乙醇(270ul/100ml)。5)往每個(gè)試管中加入600plONPG溶液，放在37°C溫箱中溫育顯色50分鐘。其中ONPG溶液是將45mgONPG(鄰硝基苯-g-D-吡喃半乳糖苷)溶解在10ml磷酸鹽緩沖液中；磷酸鹽緩沖液的配方為磷酸氫二鈉4.344g，磷酸二氫鈉2.172g，無(wú)菌水400ml，pH7.0±0.2，121。C高壓滅菌20分鐘。6)顯色后往每個(gè)試管中加入400^1終止試劑，終止顯色反應(yīng)。其中終止試劑的成分為無(wú)水碳酸鈉52.995g溶于450ml無(wú)菌水后再稀釋至500ml。7)測(cè)定顯色反應(yīng)終止后溶液的光密度OD42o禾nOD55o的值，利用以下公式計(jì)算水樣和溶劑對(duì)照的酶的活性，并計(jì)算誘導(dǎo)率IR。1000*(A420-1.75*A550)IU=-T傘稀595其中，T為顯色時(shí)間，V為菌體稀釋倍數(shù)。IR=IU(水樣樣品)/IU(溶劑對(duì)照)只有當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的IR值大于2.0時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。當(dāng)水樣樣品在2L的劑量下1&2.0，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，反應(yīng)為陽(yáng)性，表明水樣樣品中含有遺傳毒性物質(zhì)；當(dāng)1.0<IR<2.0時(shí)，反應(yīng)為可疑，表明水樣樣品中可能含有遺傳毒性物質(zhì)，此時(shí)需結(jié)合別的試驗(yàn)方法來(lái)驗(yàn)證；當(dāng)IR《1.0時(shí)，反應(yīng)為陰性，表明水樣樣品中不含遺傳毒性物質(zhì)。實(shí)施例2:本發(fā)明簡(jiǎn)易方法與SOS/imm標(biāo)準(zhǔn)方法可靠性、靈敏度差異比較為了比較兩種方法的可靠性和靈敏度差異，在相同試驗(yàn)條件下分別用兩種不同的方法測(cè)定了廣州某地自來(lái)水中DNA原始損傷物質(zhì)，試驗(yàn)三次重復(fù)。本實(shí)施例所使用的簡(jiǎn)易方法與實(shí)施例1相同，其與SOS/nmu標(biāo)準(zhǔn)方法的比較結(jié)果具體見(jiàn)表1。表1相同試驗(yàn)條件下兩種方法的比較標(biāo)準(zhǔn)方法簡(jiǎn)易方法OD5950.28±0.090.28±0.03IR3.64±0.113.83±0.23從表1可以看出，兩種方法的IR值在oci.05的水平上并不存在顯著差異。實(shí)施例3:本發(fā)明簡(jiǎn)易方法與SOS/umu標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏度差異比較為了比較兩種方法的可靠性和靈敏度差異，在相同試驗(yàn)條件下分別用兩種不同的方法測(cè)定了廣州某地自來(lái)水中DNA原始損傷物質(zhì)，試驗(yàn)三次重復(fù)。本實(shí)施例所述的檢測(cè)水源水中的遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，步驟如下1)將菌株TA1535(購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)菌種保藏中心DSMZ，保藏編號(hào)是DSM9274)接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基里過(guò)夜培養(yǎng)(14-16小時(shí))得菌懸液，其中營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g,牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.4。吸取過(guò)夜培養(yǎng)的TA1535菌懸液100^1于1.5ml離心管里，5000rpm離心5min收集菌體，用無(wú)菌水稀釋到1.0ml，測(cè)定其ODs95的值。然后利用菌體和無(wú)菌水調(diào)整其濃度，使其OD595達(dá)到0.21-0.28。取60(^1該菌懸液到5ml試管里用于下一步試驗(yàn)。2)同實(shí)施例l。3)3小時(shí)后，再往每個(gè)試管中加入2.7mlB-buffer，混勻后加入8(^1氯仿，振蕩混勻。其中B-buffer的主要成分是磷酸氫二鈉20.18g/L，磷酸二氫鈉5.5g/L，氯化鉀0.75g/L，硫酸鎂0.25g/L，用之前需要加2-疏基乙醇(270ul/100ml)。4)往每個(gè)試管中加入80(^1ONPG溶液，放在35°C溫箱中溫育顯色30分鐘。其中ONPG溶液是將45mgONPG(鄰硝基苯-e-D-吡喃半乳糖苷)溶解在10ml磷酸鹽緩沖液中；磷酸鹽緩沖液的配方為磷酸氫二鈉4.344g，磷酸二氫鈉2.172g，無(wú)菌水400ml，pH7.0±0.2，121°C高壓滅菌20分鐘。5)顯色后往每個(gè)試管中加入400(al終止試劑，終止顯色反應(yīng)。其中終止試劑的成分為無(wú)水碳酸鈉52.995g溶于450ml無(wú)菌水后再稀釋至500ml。6)測(cè)定顯色反應(yīng)終止后溶液的光密度OD42o和OD55()的值，利用以下公式計(jì)算水樣和溶劑對(duì)照的酶的活性，并計(jì)算誘導(dǎo)率IR。1000*(A420-1.75*A550)II>-T*V*A595其中，T為顯色時(shí)間，V為菌體稀釋倍數(shù)。IR=IU沐樣樣品)/IU(溶劑對(duì)照)只有當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的IR值大于2.0時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。當(dāng)水樣樣品在2L的劑量下IR22.0，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，反應(yīng)為陽(yáng)性，表明水樣樣品中含有遺傳毒性物質(zhì)；當(dāng)1.0<IR<2.0時(shí)，反應(yīng)為可疑，表明水樣樣品中可能含有遺傳毒性物質(zhì)，此時(shí)需結(jié)合別的試驗(yàn)方法來(lái)驗(yàn)證;當(dāng)IR《1.0時(shí)，反應(yīng)為陰性，表明水樣樣品中不含遺傳毒性物質(zhì)。本實(shí)施例所述的簡(jiǎn)易方法與SOS/umu標(biāo)準(zhǔn)方法的比較結(jié)果，具體見(jiàn)表1。8表2相同試驗(yàn)條件下兩種方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2可以看出，兩種方法的IR值c^0.05的水平上并不存在顯著差異。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于，包括以下步驟1)將菌株TA1535接種到液體LB或者營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基里，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜得到菌懸液，用無(wú)菌水調(diào)整菌懸液濃度至OD595為0.2-0.3；2)取至少四個(gè)濃度梯度的水樣樣品濃縮物各100μl，分別加入到550-650μl步驟1)所述的菌懸液中，35±2℃振蕩培養(yǎng)2-3h，以DMSO為溶劑對(duì)照，以4-NQO為陽(yáng)性對(duì)照；3)振蕩培養(yǎng)后加入2.5-3.0mlB-Buffer混勻，再加入5-10μl氯仿振蕩混勻；加入500-800μlONPG溶液，35±2℃溫育顯色30-50min；4)加入300-500μlNa2CO3溶液終止顯色，測(cè)定顯色后溶液的OD420和OD550；5)計(jì)算樣品和溶劑對(duì)照的酶活性，并計(jì)算誘導(dǎo)率IR，若IR≥2.0，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，表明水樣樣品含有遺傳毒性物質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于步驟l)將菌株TA1535接種到液體LB培養(yǎng)基里，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜14-18小時(shí)得到菌懸液。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于步驟l)中所述菌懸液00595為0.28-0.3。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于步驟2)中設(shè)置四個(gè)濃度梯度的水樣樣品濃縮物，分別相當(dāng)于水樣樣品的2L、1L、0.5L和0,25L。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于所述步驟3)中氯仿的體積為8-10)al。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，其特征在于所述步驟3)為37°C溫育顯色50min。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)水源水遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，包括以下步驟將菌株TA1535接種到液體LB或者營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基里，振蕩培養(yǎng)，用無(wú)菌水調(diào)整菌懸液濃度至OD₅₉₅為0.2-0.3，得菌懸液；取至少四個(gè)濃度梯度的水樣樣品濃縮物，分別加入到所述的菌懸液中，振蕩培養(yǎng)，以DMSO為溶劑對(duì)照，以4-NQO為陽(yáng)性對(duì)照；振蕩培養(yǎng)后加入B-Buffer混勻，再加氯仿振蕩混勻；加入ONPG溶液，溫育顯色30-50min；加入Na₂CO₃溶液終止顯色，測(cè)定顯色后溶液的OD₄₂₀和OD₅₅₀；算樣品和溶劑對(duì)照的酶活性，并計(jì)算誘導(dǎo)率IR。本發(fā)明檢測(cè)水源水中遺傳毒性物質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，可以在保持試驗(yàn)操作常規(guī)化，測(cè)試結(jié)果精確、靈敏的前提下，省略很多步驟，節(jié)省大量時(shí)間。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101619342SQ200910041518公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2009年7月29日優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日發(fā)明者孫國(guó)萍,張國(guó)霞,張家強(qiáng),曾國(guó)驅(qū),許玫英,俊郭申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所