專(zhuān)利名稱(chēng)：：實(shí)時(shí)序列測(cè)定的制作方法實(shí)時(shí)序列測(cè)定本申請(qǐng)是中國(guó)申請(qǐng)01815238.4的分案申請(qǐng)，該母案于2001年7月9日以國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US01/21811提交，于2003年03月06日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱(chēng)。
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種單分子測(cè)序裝置和方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種采用標(biāo)記的聚合劑和/或標(biāo)記的單體的單分子測(cè)序裝置和方法，其中所述標(biāo)記的聚合劑和/或標(biāo)記的單體在單體插入到增長(zhǎng)的聚合鏈之前，之中和/或之后可檢測(cè)的性質(zhì)發(fā)生變化。所述裝置和方法很適合于在接近實(shí)時(shí)或?qū)崟r(shí)條件下對(duì)DNA,RNA,多肽，糖類(lèi)，或類(lèi)似的生物分子的序列進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明還涉及一種采用標(biāo)記的解聚劑(dej)olymerizingagents)和/或標(biāo)記的可解聚聚合物(depolymerizablepolymer)的單分子測(cè)序裴置和方法，其中所述標(biāo)記的解聚劑和/或標(biāo)記的可解聚聚合物在單體脫離可解聚的聚合鏈之前，之中和/或之后可檢測(cè)的性質(zhì)發(fā)生變化。所述裝置和方法很適合于對(duì)DNA,RNA,多肽，糖類(lèi)，或類(lèi)似的生物分子序列進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明還涉及檢測(cè)證明標(biāo)記的聚合劑或解聚劑和標(biāo)記的或未標(biāo)記的聚合亞單位如單體或單體集合間相互作用的信號(hào)，其中所述被檢測(cè)的信號(hào)提供有關(guān)單體順序的信息。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法在接近實(shí)時(shí)或?qū)崟r(shí)條件下進(jìn)行。2.相關(guān)領(lǐng)域傳統(tǒng)DNA測(cè)序總結(jié)快速準(zhǔn)確測(cè)定DNA片段的堿基或'序列，順序是關(guān)鍵的技術(shù)進(jìn)展，其重要性十分突出。對(duì)DNA序列的了解使對(duì)生命的分子基礎(chǔ)有了更廣泛的了解。有關(guān)DNA序列的信息為科學(xué)家提供了大量生物過(guò)程的關(guān)鍵信息。DNA的堿基順序限定了RNA的堿基順序，RNA是細(xì)胞中直接編碼蛋白質(zhì)信息內(nèi)容的分子。一般用DNA序列信息推斷蛋白質(zhì)序列信息。堿基順序指示DNA結(jié)構(gòu)和其功能，并提供了分子程序，它可以限定正常的發(fā)育，遺傳疾病或癌癥的表現(xiàn)。對(duì)DNA序列的了解以及對(duì)這些序列進(jìn)行操縱的能力加速了生物技術(shù)的發(fā)展并導(dǎo)致了分子技術(shù)的發(fā)展，其提供了提出并回答重要的科學(xué)問(wèn)題的工具。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種重要的生物技術(shù)，其為核酸的序列特異性檢測(cè)提供了便利，其依賴(lài)于序列信息。DNA測(cè)序方法使科學(xué)家可以確定DNA中是否引入了改變，并分析所述政變對(duì)生物體的生物學(xué)變化的影響，而不考慮研究的生物體類(lèi)型。最終，DNA序列信息可以提供唯一地鑒定個(gè)體的方法。為理解所述的DNA測(cè)序過(guò)程，我們必須了解DNA—些知識(shí)。首先，DNA分子由四種堿基構(gòu)成，腺嘌呤(A),鳥(niǎo)。票呤(G)，胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)。這些堿基通過(guò)氫鍵相互之間以非常特異性的方式作用，例如A與T作用，G與C作用。這些堿基間的特異性相互作用稱(chēng)為堿基對(duì)。事實(shí)上，這些堿基對(duì)(以及堿基堆積作用)穩(wěn)定了雙螺旋DNA。DNA分子的兩條鏈呈現(xiàn)反平行方向，其中一條鏈?zhǔn)?'到3'方向，另一條鏈?zhǔn)?'到5'方向。術(shù)語(yǔ)5，和3，指DNA骨架的方向性，并且是描述堿基順序的關(guān)鍵。按照慣例，描述DNA序列的堿基順序采用5'到3'方向，由左向右書(shū)寫(xiě)。這樣，如果知道一條DNA鏈的序列，可以推斷出其互補(bǔ)序列。桑格DNA測(cè)序法(SangerDNASequencing)(酶合成法)(EnzvmaticSynthesis)桑格測(cè)序法是當(dāng)今最為普遍的DNA測(cè)序法(Sangeretal.,1977)。該方法利用了聚合酶的幾個(gè)特點(diǎn)其制造精確DNA分子拷貝的能力，其合成的方向性(5'到3'方向)，其需要從DNA鏈('引物，)開(kāi)始合成，其需要所述引物末端的3'OH。如果沒(méi)有3'OH，聚合^不能延長(zhǎng)DNA鏈。如果雙脫氧核苷酸(ddNTP;ddATP,ddTTP，ddGTP,ddCTP)，缺少3'OH的堿基類(lèi)似物，加入到酶測(cè)序反應(yīng)中，其整合到通過(guò)聚合酶增長(zhǎng)的鏈中。但是，一旦ddNTP整合，聚合酶不能再在該鏈的末端添加任何其他的堿基。重要地是，采用相同的堿基整合法則通過(guò)聚合酶整合ddNTP到DNA鏈，所述法則指示天然核普酸的整合，其中A限定整合T，G限定整合C(反之亦然)。焚光DNA測(cè)序法自動(dòng)DNA測(cè)岸儀的引入產(chǎn)生了測(cè)定DNA序列信息的巨大進(jìn)步(Smithetal.,1986)。使用自動(dòng)測(cè)序儀分離測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物，測(cè)定并采集(通過(guò)計(jì)算機(jī))反應(yīng)數(shù)據(jù)，并分析堿基順序以自動(dòng)推專(zhuān)出DNA片段的堿基序列。自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)含有熒光標(biāo)記的延伸產(chǎn)物。采用自動(dòng)測(cè)序儀得到的序列讀取長(zhǎng)度有賴(lài)于多種參數(shù)，但一般長(zhǎng)度為500到1000個(gè)堿基(3-18小時(shí)數(shù)據(jù)采集)。在最大能力下自動(dòng)測(cè)序儀可以平行從96個(gè)樣品采集數(shù)據(jù)。當(dāng)染料標(biāo)記的終止子化學(xué)用于測(cè)定測(cè)序產(chǎn)品時(shí)，通過(guò)ddNTP結(jié)合的焚光標(biāo)記的顏色確定堿基的身份。在對(duì)反應(yīng)組裝并加工適當(dāng)數(shù)量的循環(huán)(3-12小時(shí))后，制備的延伸產(chǎn)物上樣到自動(dòng)測(cè)序儀的單個(gè)泳道中(除去未整合的，染料標(biāo)記的ddNTP，反應(yīng)被濃縮；1-2小時(shí))。染料終止子化學(xué)的優(yōu)#在于只有在用染料標(biāo)記的ddNTP終止時(shí)延伸產(chǎn)物可見(jiàn)；過(guò)早終止的產(chǎn)物不能被檢測(cè)。因此，這樣的化學(xué)一般得到減少的背景噪音?，F(xiàn)有技術(shù)中，染料終止子化學(xué)采用4種能量轉(zhuǎn)移熒光染料(Rosenblumetal.,1997)。這些終止子包括與4種不同雙氯若丹明(d羅丹明dRhodamine)受體染料之一相連的熒光素供體染料(6-FAMJ)。所述與終止子相連的d-若丹明受體染料對(duì)于G-,A-,T-或C-分別差雙氯[RllO;i,雙氯[R6G]，雙氯[TAMRA]或雙氯[ROX]。在自動(dòng)測(cè)序儀中所述供體染科(6-FAM)有效吸收氬離子激光的能量，并蔣此能量傳遞給連接的受體染料。優(yōu)化連接終止子供體和受體部分的接頭的間隔以達(dá)到基本上100%有效的能量傳遞。從這些受體發(fā)射的熒光信號(hào)顯現(xiàn)出最小重疊的光譜，采用10nm有效濾光器(virtualfilters)由ABIPRISM377DNA序列儀采集，對(duì)應(yīng)于G-,A-,T-或C-終止子所述濾光器分別以540,570,595和625nm為中心。因此，能量傳遞染料標(biāo)記的終止子產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)并提高了光譜分辯率。這些改進(jìn)產(chǎn)生了更為準(zhǔn)確的DNA序列信息。在自動(dòng)DNA測(cè)序反應(yīng)中所用的主要的酶是水生棲熱菌(Thermusaguaticus)的DNA聚合酶I的基因工程化形式。優(yōu)化此酶，Amplira《DNA泉合酶，F(xiàn)S,以更為有效地將ddNTP整合并消除3'到5'和5'封3'核酸外切酶活性。在水生棲熱菌DNA聚合酶中以酪氨酸代替在667位天然存在的苯丙氨酸使得該酶減弱了相對(duì)于ddNTP來(lái)說(shuō)對(duì)dNTP的優(yōu)先整合(TaborandRichardson,1995;ReeveandFuller,1995)。因此，該酶中單個(gè)羥基基團(tuán)負(fù)責(zé)區(qū)別dNTP和ddNTP。消除3'到5'核酸外切酶活性，該活性使聚合酶能從新復(fù)制的DNA鏈除去錯(cuò)誤整合的堿基(校對(duì)活性)，因?yàn)樗彩咕酆厦改艹フ系膁dNTP。消除5'到3'核酸外切酶活性是因?yàn)樗鼜姆磻?yīng)產(chǎn)物的5，端驅(qū)除堿基。由于在凝膠電泳中所述反應(yīng)產(chǎn)物按大小分離，只有當(dāng)所述反應(yīng)產(chǎn)物具有共同的端點(diǎn)時(shí)才能得到可供判斷的序列數(shù)據(jù)。更具體地，引物限定了延伸產(chǎn)物的5'端，整合的，顏色編碼的ddNTP限定了所述分子的3'端的堿基身份。因此，傳統(tǒng)的DNA測(cè)序涉及分析大量具有相同5，端點(diǎn)的DNA分子，但是這些分子在所述DNA鏈的3，端的ddNTP的位置不同。基因組測(cè)序研究人員經(jīng)常需要測(cè)定DNA片段的序列，所迷片段大于500-1,000個(gè)堿基平均測(cè)序讀取長(zhǎng)度。不令人驚奇的是，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了完成此工作的方法。這些方法分為兩類(lèi)，隨機(jī)的或定向的(randomordirected),根據(jù)待測(cè)片段的大小確定采用的方法。在隨機(jī)或鳥(niǎo)槍DNA測(cè)序中，大的DNA片段(一般大于20,000堿基對(duì))斷裂為較小的片段，它們插入到克隆載體中。假定這些較小克隆內(nèi)包含的信息總量等于原始DNA片段內(nèi)包含的信息。隨機(jī)挑選多個(gè)較小克隆，制備進(jìn)行測(cè)岸反應(yīng)的DNA模板，與插入片段相鄰的載體DNA序列堿基配對(duì)的引物用于啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)(對(duì)于20kbp的插入片段需要2-7天)。然后，檢查每一加入的堿基(人工或通過(guò)軟件啟動(dòng)進(jìn)行)(PHRED，Ewingetal.,1998);每一序列反應(yīng)1-10分鐘)，通過(guò)對(duì)從較小DNA片段得到的序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)組合重建原始DNA片段序列。根據(jù)時(shí)間估計(jì)，如果采用鳥(niǎo)槍測(cè)序法(shotgunsequencing),插入片段在20kbp預(yù)計(jì)在3-10天中完成。此方法廣泛用于測(cè)定有序片段的序列，所述片段代表整個(gè)人類(lèi)基因組(http:〃www.nhgri.nih.gov/HGP/)。但是，此隨機(jī)方法一般不足以完成序列確定，由于計(jì)算機(jī)組合后在序列中經(jīng)常留下間隙。定向的策略(如下所述)經(jīng)常用于完成測(cè)序項(xiàng)目。定向或引物步行(primer-walking)測(cè)序策略可用于填充大的片段測(cè)序的隨機(jī)相(randomphase)之后殘留的間喊，以及作為對(duì)較小DNA片段測(cè)序的有效方法。此策略采用的DNA引物退火到模板的單個(gè)位點(diǎn)，并作為鏈延伸的起始位點(diǎn)。此方法需要一些序列信息以設(shè)計(jì)引物。得自第一反應(yīng)的序列用作設(shè)計(jì)用于下一反應(yīng)的引物，重復(fù)進(jìn)行這些步驟直到確定完整的序列。因此，基于引物的策略涉及從已知到未知DNA區(qū)的重復(fù)的測(cè)序步驟，所述方法最小化冗余，并不需要額外的克隆步驟。但是，此策略需要對(duì)每一-測(cè)序循環(huán)合成新的引物。設(shè)計(jì)和合成新的引物，以及合成它們所需的費(fèi)用和時(shí)間限制了對(duì)大DNA片段測(cè)序時(shí)引物步行法的常規(guī)應(yīng)用。研究人員已提示采用短引物庫(kù)以消除常規(guī)引物合成的需要(Studier，1989;SiemieniakandSlightom,1990;Kieleczawaetal.，1992;Kotleretal.,1993;BurbeloandIadarola,1994;Hardinetal"1996;Rajaetal.,1997;JonesandHardin，1998a，b;Balletal.，1998;MeiandHardin，2000;KraltchevaandHardin，2001)。由于每一引物用于引發(fā)多個(gè)反應(yīng)，所以引物庫(kù)的可獲得性最小化引物浪費(fèi)，并且可以立即獲得下一測(cè)序引物。人類(lèi)基因組計(jì)劃的最初目的之一是到2005年完成整個(gè)人類(lèi)基因組的序列測(cè)定(http:〃www.nhgri.nih.gov/HGP)。但是，此計(jì)劃提前了，在2001牟2月出版了人體基因組的'工存草圖，。由于在幾個(gè)學(xué)科的技術(shù)進(jìn)展，預(yù)計(jì)在2003年完成基因組測(cè)序，提前兩年。所有這些方面的進(jìn)展涉及DNA操縱(特別是大的DNA片段的操縱和增殖)，更快和更好的DNA測(cè)序方法的出現(xiàn)(http:/Avww.abrf.org),能操縱和分析所述數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)硬件和軟件的發(fā)展(生fe信息學(xué))，以及為產(chǎn)生和分析DNA序列有關(guān)的程序的自動(dòng)化，這些進(jìn)展是使預(yù)定時(shí)間提前的原因。單個(gè)分子DNA測(cè)序傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法是可靠的，但是耗時(shí)，工作量大且費(fèi)用高。為解決這些問(wèn)題，一些研究人員研究了基于熒光的，單分子測(cè)序方法，所述方法采用酶降解，然后進(jìn)行單個(gè)dNMP檢測(cè)和鑒定。包含熒光標(biāo)記的核苷酸的所述DNA聚合物由核酸外切酶消化，由流式細(xì)胞術(shù)^r測(cè)和鑒定標(biāo)記的核苷酸(Davisetal.，1991;Davisetal.，1992;Goodwinetal.，1997;Kelleretal.，1996;Saueretal.,1999;Werneretal.,1999)。此方法要求合成的DNA鏈包含焚光標(biāo)記的堿基。此要求限制了能測(cè)序的序列長(zhǎng)度，增加了得到任何序列數(shù)據(jù)前進(jìn)行操作的數(shù)量。一種相關(guān)的方法提議從DNA的一條鏈上順序分開(kāi)單個(gè)(未標(biāo)記的)核香酸，按照它們初始的次序限制在固體基質(zhì)上，并檢測(cè)分隔的fe苷酸的先譜發(fā)射以重建DNA序列信息(Ulmer，1997;MitsisandKwagh,1999;Dapprich,1999)。這是Praelux，Inc.開(kāi)發(fā)的方法，此公司目標(biāo)是開(kāi)發(fā)單個(gè)分子DNA測(cè)序。理論上，后一方法不象前一方法那樣易受到長(zhǎng)度的限制，但是在得到任何序列信息前需要多個(gè)操作。Li-cor,Inc.基于PCT申請(qǐng)WO00/36151提出的單分子測(cè)序法開(kāi)發(fā)基于酶合成的幕略。所述Li-cor方法涉及多個(gè)修飾的dNTP，所述修飾通過(guò)將熒光標(biāo)記連接到Y(jié)-磷酸上，淬滅部分(quenchingmoiety)連接至'jdNTP的另一位點(diǎn)上，優(yōu)選44基上。加入所述淬滅邵分以阻止連接到未整合dNTP的焚光標(biāo)記發(fā)射。一旦整合，熒光標(biāo)記和淬滅部分分離，標(biāo)記產(chǎn)生發(fā)射。所述標(biāo)記(包含在所述焦磷酸上)從聚合酶活性位點(diǎn)移開(kāi)，但是修飾的(淬滅的)堿基成為DNA泉合物的一部分。盡管一些單分子測(cè)序系統(tǒng)已經(jīng)被公開(kāi)，但它們中的許多預(yù)計(jì)或需要堿基修飾。參見(jiàn)WO01/16375A2，WO01/23610A2,WO01/25480，WO00/06770,WO99/05315,WO00/60114，WO00/36151，WO00/36512,和WO00/70073,在此引入作為參考。堿基修飾可能扭曲DNA結(jié)構(gòu)(其通常由A-型DNA構(gòu)成，該A-型DNA最接近^:的活性位點(diǎn)；Lietal.，1998a)。由于dNTP和新合成的鏈中3'-最近的約7個(gè)堿基與聚合酶的內(nèi)部區(qū)接觸(Lietal.，1998a),對(duì)于最大化酶和DNA與小溝之間的接觸，A-型DNA是重要的。如果由于堿基修飾影響DNA結(jié)構(gòu)，酶忠實(shí)性和/或功能可能改變。因此，本領(lǐng)域仍需要快速并肴效的用于單個(gè)分子DNA序列的酶DNA測(cè)序系統(tǒng)。發(fā)明概述簡(jiǎn)言之，本發(fā)明涉及1.一種組合物，其包含一種聚合劑，所述聚合劑包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到聚合劑的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在卓體整合之前，之中和/或之后發(fā)生改變。2.項(xiàng)1的組合物，其中所述聚合劑在第一種狀態(tài)下，所述可檢測(cè)的性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶在第二種狀態(tài)下具有第二個(gè)值，其中在每一單體整合過(guò)程中所述聚合劑從第一種狀態(tài)變化到第二種狀態(tài)再改變回第一科狀態(tài)3.;頁(yè)°2的組合物，其中所述聚合劑是聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。4.項(xiàng)3的組合物，其申所述泉合酶選i]DNA泉合酶I,T7DNA聚合酶，測(cè)序酶，和大腸桿菌DNA聚合^I的Klenow片段。5.項(xiàng)3的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶包含HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。6.項(xiàng)3的組合物，其中所述聚合酶包含ra《DNA聚合酶I，所述聚合酶I具有與位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記，所述位點(diǎn)選自所述Ta《聚合酶的513-518，643，647，649和653-661位點(diǎn)以及其混合或組合，其中所述標(biāo)記包含熒光分子。7.—種組合物，其中包含聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，所述酶包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到聚合劑的位點(diǎn)，其中在單體整合過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)下可檢測(cè)的性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶在第二種狀態(tài)下具有第二個(gè)值，其中在每一單體整合過(guò)程中所述聚合劑從第一種狀態(tài)變化到第二種狀態(tài)再改變回第^種狀態(tài)。8.;貞°7的組合物，其中所述聚合酶選自％《DNA聚合酶I,T7DNA聚合#，測(cè)序酶，和大腸桿菌DNA聚合^1的Klenow片段。9.項(xiàng)7的組合物，其+所述逆專(zhuān)4泉酶包含HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶。10.—種組合物，其包含聚合劑和單體，所述聚合劑包括分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記與之相連或共價(jià)連接到聚合酶上位點(diǎn)，所述單體包括分子和/或原子標(biāo)記，其中至少一種所述標(biāo)記具有可檢測(cè)的性質(zhì)，所述性質(zhì)在單體整合之前，之中，之后發(fā)生改變，所述改變是由于聚合劑標(biāo)記和單體標(biāo)記之間的相互作用。11.項(xiàng)IO的組合物，其中所述可檢測(cè)的性質(zhì)的改變是由于在每一單體整合過(guò)程中，所述聚合酶構(gòu)象從第一種構(gòu)象狀態(tài)變化到第二種構(gòu)象狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。12.項(xiàng)10的組合物，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)具有第一檢測(cè)傾向，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)具有第二檢測(cè)傾向。13.項(xiàng)12的組合物，其中所述聚合劑是聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。14.項(xiàng)13的組合物，其申所述泉合酶選自ra《DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，測(cè)序酶，和大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。15.項(xiàng)13的組合物，^中逆轉(zhuǎn)錄酶包含HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。16.項(xiàng)12的組合物，其中所述單體包含dNTP，并且所述標(biāo)記P與Y磷酸基共價(jià)連接。17.項(xiàng)10的組合物，其中所述標(biāo)記包含熒光標(biāo)記，并且所述可^r測(cè)性質(zhì)包含發(fā)射光的強(qiáng)度和/或頻率。18.項(xiàng)16的組合物，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)是基本活化的，當(dāng)所述聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)是基本不活化的，或者當(dāng)所述聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)是基本不活化的，當(dāng)處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)是基本活化的。19.項(xiàng)14的組合物，其中所述聚合酶包含r"《DNA聚合酶I，該聚合酶I具有與位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記，所述位點(diǎn)選自所述聚合酶的513-518,643,647,649和653-661位點(diǎn)以及其混合或組合，其中所述標(biāo)記包含焚光分子。20.—種組合物，其包含泉合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，所述酶包括一對(duì)標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到聚合酶的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后發(fā)生改變。21.項(xiàng)20的組合物，其中所述聚合酶在第一種狀態(tài)下，所述可^r測(cè)的性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶在第二種狀態(tài)下具有第二個(gè)值，其中在每一單體整合過(guò)程中所述聚合劑從第一種狀態(tài)變化到第二種狀態(tài)再改變回第一種狀態(tài)。22.項(xiàng)21的組合物，其中所述聚合酶選自7^DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，測(cè)序酶，和大腸桿齒DNA聚合酶I的Klenow片段。23.項(xiàng)21的組合物，^中所述逆轉(zhuǎn)錄酶包含HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。24.項(xiàng)22的組合物，其+所述聚合酶包含T^DNA聚合酶I，該聚合酶i具有與位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記，所述位點(diǎn)選自所述7i^聚合酶的513-518,643，647，649和653-661位點(diǎn)以及其混合或組合，其中所述標(biāo)記包含熒光分子。24.單分子測(cè)序裝置，其包含基體，所述基體具有第一小室，第二小室和連接這些小室的通道，其中第一小室容納有至少一種標(biāo)記的聚合酶，第二小室包括標(biāo)記的dNTP,在單體整合的循環(huán)中至少^種標(biāo)記的可^r測(cè)性質(zhì)發(fā)生可檢測(cè)的變化。25.項(xiàng)24的裝置，還包含多個(gè)單體小室，每一種標(biāo)記的dNTP—個(gè)小室。26.—種突變體7^聚合酶，其包含具有半胱氨酸殘基取代的天然聚合酶,所述取代的位點(diǎn)選自513-518，643,647，649和653-661以及其混合或組合。一^7.纟頁(yè)27的聚合酶，其中所述半胱氨酸殘基包括通過(guò)其SH基共價(jià)連4妾的標(biāo)i己。28.檢索儲(chǔ)存的信息的系統(tǒng)，其包含代表數(shù)據(jù)流的未知核苷酸序列；單分子測(cè)序儀，包括連接有標(biāo)記的聚合酶，和對(duì)應(yīng)所述聚合酶的單體，每一單沐迪接看標(biāo)記；適于激發(fā)至少一種標(biāo)記的激發(fā)源；和適于4全測(cè)至少一種標(biāo)記的響應(yīng)的4企測(cè)器，其中所述響應(yīng)在互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中改變，并且所述響應(yīng)的改變代表數(shù)據(jù)流的內(nèi)容。29.檢測(cè)單個(gè)分子序列信息的泉統(tǒng)，其包含未知的核苷酸序列；單分子測(cè)序儀，其包含連接有標(biāo)記的聚合酶以及相對(duì)所述聚合酶的單體，每一單體連接有標(biāo)記；適于激發(fā)至少一種標(biāo)記的激發(fā)源；和適于一企測(cè)至少一種標(biāo)記的響應(yīng)的一全測(cè)器，其中所述響應(yīng)在互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中改變，并且所述響應(yīng)的改變代表未知序列中每一核苷酸的身份。30.對(duì)分子序列測(cè)序的方法，其包含提供核芬酸或核苷酸類(lèi)似物的未知序列給單分子測(cè)序儀，其包含共價(jià)連接有熒光供體的聚合酶和對(duì)應(yīng)所述聚合酶的單體，每一單體共價(jià)連接有獨(dú)特的熒光受體；用激發(fā)光源的光激發(fā)焚光供體；在單體整合循環(huán)中通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)受體發(fā)射的熒光，其中受體發(fā)射光的強(qiáng)度和/或頻率在每一單體整合循環(huán)中發(fā)生變化；和將所述變化轉(zhuǎn)化為未知序列中每一核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的身份。31.單獨(dú)核酸分子或多個(gè)單獨(dú)分子平行測(cè)序的方法，包括如下步驟將復(fù)制復(fù)合物的成員固定在固體支持物上，所述復(fù)合物包含連接有標(biāo)記的聚合酶，引物或模板，之間的間隔足以使每一復(fù)合物得到有分辨能力的檢測(cè)；用協(xié)同標(biāo)記的核苷酸溫育所述復(fù)制復(fù)合物，每一核苦酸在其y-磷酸具有獨(dú)特的標(biāo)記，其中每一核普酸能單獨(dú)檢測(cè)；當(dāng)所述聚合酶在其開(kāi)放和閉合形式之間轉(zhuǎn)化，引起至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的變化，或當(dāng)焦磷酸基為所述聚合酶所釋放時(shí)，檢測(cè)所述聚合酶整合的每一核苷酸；和將所述可;f企測(cè)性質(zhì)的變化與未知核酸序列中核苷酸的序列相關(guān)聯(lián)。32.Y-磷酸修飾的核苷酸，其包含Y-磷酸修飾的dATP,dCTP，dGTP，和dTTP。33.引物序列或其部分，其選自序列1到29。單分子測(cè)序本發(fā)明提供了由至少一種分子或原子標(biāo)記修飾的聚合劑，所述標(biāo)記位于或靠近,連接于或共價(jià)連接到聚合劑上的位點(diǎn)，其中標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷變化。所述單體可以是有機(jī)的，無(wú)機(jī)的或生物有機(jī)單體如DNA,RNA，或混合的DNA/RNA序列的核普酸，氨基酸，單糖，天然存在的核苷酸的合成類(lèi)似物，天然存在的氨基酸的合成類(lèi)似物，或天然存在的單糖的合成類(lèi)似物，合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)單體，或類(lèi)似物。本發(fā)明提供了解聚劑，所述試劑用至少一個(gè)分子或原子標(biāo)記修飾，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到解聚劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記在除去單體之前，之中和/或之后，其可檢測(cè)性質(zhì)經(jīng)歷變化。所述聚合物可以是DNA，RNA,混合DNA/RM序列，其只包含天然存在的核苷酸或天然存在的核苷酸和其合成類(lèi)似物的混合物，多肽序列，其只包含天然存在的氨基酸或天然氨基酸和其合成類(lèi)似物的混合物，多糖或糖類(lèi)序列，其只包含天然存在的單糖或天然存在的單糖與其合成類(lèi)似物的混合物，或包含合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)單體的聚合物，或類(lèi)似的。本發(fā)明還提供了能檢測(cè)信號(hào)的系統(tǒng)，所述信號(hào)對(duì)應(yīng)可檢測(cè)性質(zhì)，所述性質(zhì)可證明在合成劑/聚合劑或解聚劑(分子)和其基體(單體或可解聚的聚合物)之間的相互作用，所述系統(tǒng)還能解碼信號(hào)為單體順序特異的信息或單體序列信息，優(yōu)選在實(shí)時(shí)或接近實(shí)時(shí)的情況下。單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合酶本發(fā)明提供了用至少一種分子或原子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合酶的位點(diǎn)，其中在單體整合之前，之中和/或之后，所述標(biāo)記的可^r測(cè)性質(zhì)經(jīng)歷改變。所述單體可以是DNA,RM的核苷酸或混合的DNA/RNA單體或通過(guò)聚合酶可聚合的合成的類(lèi)似物。本發(fā)明提供了用至少一種分子或原子標(biāo)記修飾的外切核酸酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到外切核酸酶的位點(diǎn)，其中在釋放單體之前，之中和/或之后，所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)經(jīng)歷改變。所述聚合體可以是DNA，RNA或混合的DNA/RNA序列，所述序列包含通過(guò)外切核酸酶可解聚的天然存在的單體或合成的類(lèi)似物。本發(fā)明提供了用至少一種分子或原子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中所述標(biāo)記在聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第一可檢測(cè)傾向，在聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二可檢測(cè)傾向。本發(fā)明提供了用至少一種發(fā)色團(tuán)修飾的聚合酶，所述發(fā)色團(tuán)位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中在聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)發(fā)色團(tuán)的發(fā)射光強(qiáng)度和/或頻率具有第一值，在聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)發(fā)色團(tuán)的發(fā)射光強(qiáng)度和/或頻率具有第二值。本發(fā)明提供了用至少一種熒光活性分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中所述標(biāo)記在聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第一熒光傾向，在聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二熒光傾向。本發(fā)明提供了用分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中在聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是可充分被檢測(cè)的，當(dāng)在聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本檢測(cè)不到的，或者在聚合酶處于第一構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本檢測(cè)不到的，當(dāng)在聚合酶處于第二構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是可充分祐j企測(cè)的。本發(fā)明提供了用至少一個(gè)分子或原子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用，其中所述聚合酶標(biāo)記在與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用前具有第一檢測(cè)傾向，當(dāng)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用時(shí)具有第二檢測(cè)傾向。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在每一焦磷酸基釋放時(shí)，此檢測(cè)傾向的變化循環(huán)發(fā)生。本發(fā)明提供了用至少一個(gè)發(fā)色團(tuán)修飾的聚合酶，所述發(fā)色團(tuán)位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用，其中在發(fā)色團(tuán)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用前發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光強(qiáng)度和/或頻率具有第一值，當(dāng)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用時(shí)具有第二值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每一焦磷酸基釋放時(shí)此檢測(cè)傾向的變化循環(huán)發(fā)生。本發(fā)明提供了用至少一個(gè)熒光活性分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用，其中所述聚合酶標(biāo)記在焦磷酸基釋放前從第一狀態(tài)變化，并且在所述焦磷酸基從釋放位點(diǎn)擴(kuò)散開(kāi)時(shí)從第二種狀態(tài)變化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每一焦磷酸基釋放時(shí)此檢測(cè)傾向的變化循環(huán)發(fā)生。本發(fā)明提供了用分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到一位點(diǎn)，所述位點(diǎn)與釋放的焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用，其中所述聚合酶標(biāo)記從在焦磷酸基釋放前的可充分檢測(cè)狀態(tài)變化為釋放所述基團(tuán)后聚合酶標(biāo)記與焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用時(shí)的基本檢測(cè)不到的狀態(tài)，或者從焦磷酸基釋放前的基本檢測(cè)不到的狀態(tài)變化為釋放所述基團(tuán)后聚合酶標(biāo)記與焦磷酸基上的標(biāo)記相互作用時(shí)的可充分檢測(cè)狀態(tài)。多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合劑或解聚劑本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子和/或原子標(biāo)記修飾的單體聚合試劑，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后發(fā)生改變，或者其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)由于內(nèi)標(biāo)記的相互作用在單體整合之前，之中和/或之后發(fā)生變化。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子和/或原子標(biāo)記修飾的解聚劑，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到解聚劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體釋放之前，之中和/或之后發(fā)生改變，或者其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)由于內(nèi)標(biāo)記的相互作用在單體釋》文之前，之中和/或之后發(fā)生變化。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子和/或原子標(biāo)記修飾的單體聚合試劑，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在所述聚合劑處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，且在所述聚合劑處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合劑從第一種狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子和/或原子標(biāo)記修飾的單體解聚劑，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到解聚劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記對(duì)的至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在所述解聚劑處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，且在所述解聚劑處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中在單體釋放循環(huán)中所述解聚劑從第一種狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。優(yōu)選地，所述第一種狀態(tài)和第二種狀態(tài)是不相同的，以使檢測(cè)信號(hào)發(fā)質(zhì)。，PZ人"Z人、多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合酶本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，所述標(biāo)記中的至少一個(gè)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷變化，其中聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)的可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，且在所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)可檢測(cè)性質(zhì)具有第二個(gè)值，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，所述標(biāo)記中的至少一個(gè)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)的可-險(xiǎn)測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，且在所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)可檢測(cè)性質(zhì)具有第二個(gè)值，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種構(gòu)象狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種構(gòu)象狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子或原子修飾的聚合酶，其位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，所述標(biāo)記中的至少一個(gè)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)或第二種狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)相互作用形成生色團(tuán)，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，所述標(biāo)記中的至少一個(gè)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第一種熒光傾向，在所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第二種熒光傾向，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種構(gòu)象狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種構(gòu)象狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，所述標(biāo)記中的至少一個(gè)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是基本活化的，在所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本不活化的，或者在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)是基本不活化的，在所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本活化的，其中在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種構(gòu)象狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種構(gòu)象狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，在單體整合過(guò)程中在焦磷酸釋放之中和/或之后所述標(biāo)記中的至少一個(gè)經(jīng)歷變化，其中在所述焦磷酸釋放之前所述標(biāo)記處于第一種狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)的可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，在所述焦磷酸釋放之中和/或之后所述標(biāo)記處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中在單體整合循環(huán)中所述標(biāo)記從第一種狀態(tài)變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回其第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，由于在焦磷酸釋放過(guò)程中所迷聚合酶的構(gòu)象變化所述標(biāo)記中的至少一個(gè)經(jīng)歷位置變化，其中當(dāng)所述標(biāo)記位于其第一個(gè)位置時(shí)所述標(biāo)記對(duì)的可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述標(biāo)記位于其第二個(gè)位置時(shí)具有第二個(gè)值，其中在釋放循環(huán)中所述標(biāo)記從第一個(gè)位置變到第二個(gè)位置再變回其第一個(gè)位置。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子或原子修飾的聚合酶，其位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，其中由于在焦磷酸釋放過(guò)程中所述聚合酶的構(gòu)象變化所述標(biāo)記改變相對(duì)間隔，其中所述標(biāo)記相互作用形成的生色團(tuán)在所述標(biāo)記的第一種間隔距離時(shí)具有第一種發(fā)射圖語(yǔ)，當(dāng)在所述標(biāo)記的第二種間隔距離時(shí)具有第二種發(fā)射圖i普，在焦磷酸釋放循環(huán)中所述間隔距離從其第一種狀態(tài)變?yōu)槠涞诙N狀態(tài)再變回其第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，其中由于在焦磷酸釋放過(guò)程中所述聚合酶的構(gòu)象變化所述標(biāo)記改變相對(duì)間隔，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第一種熒光傾向，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第二種熒光傾向，其中在焦磷酸釋放循環(huán)中所述傾向從其第一個(gè)值變?yōu)榈诙€(gè)值再變回其第一個(gè)值。本發(fā)明提供了用至少一對(duì)分子標(biāo)記修飾的聚合酶，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)上，其中由于在焦磷酸釋放過(guò)程中所述聚合酶的構(gòu)象變化所述標(biāo)記改變相對(duì)間隔，其中當(dāng)所述標(biāo)記具有第一種間隔時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是充分熒光活性的，當(dāng)所述標(biāo)記具有第二種間隔時(shí)所述標(biāo)記對(duì)基本是無(wú)熒光活性的，或者當(dāng)所述標(biāo)記具有第一種間隔時(shí)所述標(biāo)記對(duì)基本是無(wú)熒光活性的，當(dāng)所述標(biāo)記具有第二種間隔時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是充分熒光活性的，其中在焦磷酸釋放循環(huán)中所述熒光活性經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到當(dāng)性質(zhì)從第一種狀態(tài)改變?yōu)榈诙N狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)時(shí)，所述性質(zhì)經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)。優(yōu)選地，第一種和第二種狀態(tài)是不同的，這樣所述檢測(cè)信號(hào)可以發(fā)生變化。但是，沒(méi)有變化的結(jié)果可以證明聚合介質(zhì)或解聚介質(zhì)的其它性質(zhì)。采用標(biāo)記的聚合劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)整合到增長(zhǎng)的分子鏈中的方法，其包含監(jiān)測(cè)原子或分子標(biāo)記的可^r測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含監(jiān)測(cè)原子或分子標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在所述聚合劑處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，在所述聚合劑處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中在單體整合循環(huán)中，所述試劑從第一種狀態(tài)變化為第二種狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。優(yōu)選地，第一和第二種狀態(tài)是不同的，這樣檢測(cè)信號(hào)可以發(fā)生變化。但是，沒(méi)有變化的結(jié)果可以證明聚合介質(zhì)的其它性質(zhì)。采用標(biāo)記的聚合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)或是否整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含監(jiān)測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合酶上的位點(diǎn)，其中在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷變化，且當(dāng)聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中這些值表示所述位點(diǎn)經(jīng)歷改變，并且在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種狀態(tài)變化為第二種狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)或是否整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含監(jiān)測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合酶上的位點(diǎn)，其中在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象15變化，其中在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可才企測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，其中所述值表示所述位點(diǎn)經(jīng)歷改變，并且在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種狀態(tài)變化為第二種狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)或是否整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含將標(biāo)記的聚合酶暴露于光，監(jiān)測(cè)所述標(biāo)記的聚合酶發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率的步驟，其中所述標(biāo)記的聚合酶包含聚合酶，其包括的標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，且其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記以第一種強(qiáng)度和/或頻率發(fā)射熒光，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)以第二種強(qiáng)度和/或頻率發(fā)射熒光，其中所述強(qiáng)度和/或頻率的變化表示所述位點(diǎn)經(jīng)歷變化且在單體整合循環(huán)中所述聚合酶從第一種狀態(tài)變化為第二種狀態(tài)再變回第一種狀態(tài)。本發(fā)明也提供了采用多個(gè)標(biāo)記的聚合酶的上述方法，其可以同時(shí)并行和/或整體上并行測(cè)序。這樣的平行性可用于確保置信度。這樣的平行性也可用于對(duì)給定的3爭(zhēng)種類(lèi)基因(geneacrossspecies)快速^r測(cè)DNA序列的同源性程度，或用于快速篩選患者DNA的特異性基因特征或用于快速篩選DNA序列多態(tài)性。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)或是否整合到與聚合酶有關(guān)的增長(zhǎng)的DNA鏈上，其中有標(biāo)記位于所述聚合酶上以使當(dāng)堿基整合后焦磷酸基釋放時(shí)，在其擴(kuò)散離開(kāi)所述聚合酶之前，所述聚合酶標(biāo)記與焦磷酸上的標(biāo)記相互作用引起所述標(biāo)記之一的可檢測(cè)性質(zhì)或在熒光對(duì)的情況下與兩個(gè)標(biāo)記都有關(guān)的可檢測(cè)性質(zhì)的變化。優(yōu)選地，第一和第二種狀態(tài)不同，以使檢測(cè)信號(hào)發(fā)生變化。但是，沒(méi)有變化的結(jié)果可能證明所述聚合介質(zhì)的其它特性。采用標(biāo)記的聚合劑的設(shè)備本發(fā)明提供了單分子測(cè)序裝置，其包含其上沉積了至少一種標(biāo)記的聚合劑的基片(substrat)。所述標(biāo)記的聚合劑可被放置在合適的泉合介質(zhì)中(well),凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)內(nèi)。所述基體也能包括單體區(qū)域，范圍(area),孔(well)，凹槽，通道，容器(reservoir)或基體上的其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，其通過(guò)能支持單體分子運(yùn)輸?shù)骄酆蟿┑闹辽僖粋€(gè)連接結(jié)構(gòu)如通道，凹槽，或類(lèi)似的連接到聚合劑限制結(jié)構(gòu)(confinementstructure)。備選地，所述基體能包括包含每一單體的結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)通過(guò)能支持單體分子運(yùn)輸?shù)骄酆蟿┑倪B接結(jié)構(gòu)連接到聚合劑限制結(jié)構(gòu)。所述基體也能細(xì)分為多種聚合劑限制結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)連接到單體容器。備選地，每一聚合劑限制結(jié)構(gòu)能具有其自己的單體容器或足夠的單體容器以使每一容器包含特異性單體。本發(fā)明也提供了單分子測(cè)序裝置，其包含基體，所述基體具有通過(guò)分子系《連(moleculartether)或連接基團(tuán)連接到所述基體表面的至少一個(gè)標(biāo)記的聚合劑，其中所述系鏈或連接基團(tuán)的一端結(jié)合到(bondto)基片表面的位點(diǎn)上，另一端結(jié)合到聚合劑的位點(diǎn)上或與所述聚合劑堅(jiān)固連接的分子上的位點(diǎn)上。在此處，術(shù)語(yǔ)'結(jié)合到'意指化學(xué)和/或物理相互作用，其在通常的聚合條件下足以保持聚合劑在給定的基體區(qū)域內(nèi)。所述的化學(xué)和/或物理相互作用包括，但不限于，共價(jià)結(jié)合(covalentbonding),離子結(jié)合，氫鍵結(jié)合，非極性結(jié)合，靜電吸引，偶極間相互作用，或其它任何足以完全保持聚合劑在所需的基體區(qū)域內(nèi)電子或量子力學(xué)的相互作用。其上連接有被束縛的標(biāo)記的聚合劑的所述基體可以放置在容器中，所述容器包括合適的聚合介質(zhì)。備選地，所述標(biāo)記的聚合劑可被束縛或錨定在基體上的區(qū)域，范圍，孔，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)之上或之內(nèi)，它們可以^L合適的聚合介質(zhì)填充。所述基體也能包括基體上的單體區(qū)域，范周，孔，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，它們可與聚合劑結(jié)構(gòu)通過(guò)至少一種能支持單體分子運(yùn)輸?shù)剿鼍酆蟿┑倪B接結(jié)構(gòu)連接。備選地，所述基體包括包含每一單體的結(jié)構(gòu),其中每一結(jié)構(gòu)通過(guò)至少一種能支持單體分子運(yùn)輸?shù)剿鼍酆蟿┑倪B接結(jié)構(gòu)連接到聚合劑結(jié)構(gòu)。所述基體還可被細(xì)分為多種聚合劑結(jié)構(gòu)，每一結(jié)構(gòu)具有至少一種被束縛的聚合劑，其中每一結(jié)構(gòu)連接到單體貯存器(monomerreservoir)。備選地，每一聚合劑結(jié)構(gòu)可具有其自己的單體J3i存器或足夠多的單體貯存器，每一特異性單體都有一個(gè)儲(chǔ)存器。這些裝置所用的單體包括但不限于，dNTP，標(biāo)記的dNTP,ddNTP,標(biāo)記的ddNTP，氨基酸，標(biāo)記的氨基酸，單糖，標(biāo)記的單糖或根據(jù)待測(cè)序聚合物的類(lèi)型其合適的混合物或組合。采用標(biāo)記的聚合酶的裝置本發(fā)明提供了單分子測(cè)序裝置，其包含基體，所述基體具有至少一種標(biāo)記的聚合酶沉積其上。所述標(biāo)記的聚合酶能被放置在合適的聚合介質(zhì)中，基體的表面，或者所述聚合酶可被限制在基體上的區(qū)域，范圍，孔，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它們可以被合適的聚合介質(zhì)填充。所述基體也能包括基體上的單體區(qū)域，范圍，孔，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，它們可與聚合劑限制結(jié)構(gòu)通過(guò)至少一種能支持單體分子運(yùn)輸?shù)剿鼍酆厦傅倪B接結(jié)構(gòu)連接。備選地，所述基體包括包含每一單體的結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)通過(guò)至少一種能支持單體分子運(yùn)輸?shù)剿鼍酆厦傅南拗平Y(jié)構(gòu)中的聚合酶的連接結(jié)構(gòu)連接到聚合酶限制結(jié)構(gòu)。所述基體還可被細(xì)分為多種聚合酶限制結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)都與單體貯存器連接。備選地，每一聚合酶限制結(jié)構(gòu)可具有其自己的單體貯存器或4個(gè)單體貯存器，每一個(gè)儲(chǔ)存器包括特異性單體。本發(fā)明也提供了單分子測(cè)序裝置，其包含基體，所述基體具有通過(guò)分子系鏈或連接基團(tuán)連接到所述基體表面的至少一種標(biāo)記的聚合酶，其中所述系鏈或連接基團(tuán)的一端結(jié)合到基體的表面，另一端結(jié)合到(直接地或間接地)所述聚合酶的位點(diǎn)上，或與所述聚合酶堅(jiān)固連接的分子上的位點(diǎn)上。在此處，術(shù)語(yǔ)'結(jié)合到'意指化學(xué)和/或物理相互作用，其在通常的聚合條件下足以保持聚合酶在給定的基體區(qū)域內(nèi)。所述的化學(xué)和/或物理相互作用包括，但不限于，共價(jià)結(jié)合，離子結(jié)合，氫鍵結(jié)合，非極性結(jié)合，靜電吸引，偶極間相互作用，或其它任何足以完全保持聚合酶在所需的基體區(qū)域內(nèi)的電子或量子力學(xué)相互作用。具有被束縛的標(biāo)記的聚合劑連接其上的所述基體可以放置在容器中，所述容器包括合適的聚合介質(zhì)。備選地，它們的聚合劑可被束綽或錨定在基體上的區(qū)域，范圍，孑L，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它們可以被合適的聚合介質(zhì)填充。所述基體也能包括基體上的單體區(qū)域，范圍，孔，凹槽，通道或其它類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，它們可通過(guò)至少一通道連接到聚合酶結(jié)構(gòu)。備選地，所述基體包括包含每一單體的結(jié)構(gòu)，其中每一結(jié)構(gòu)通過(guò)至少一種能支持單體分子運(yùn)輸?shù)皆诰圬澝赶拗平Y(jié)構(gòu)中的聚合酶的連接結(jié)構(gòu)連接到聚合酶結(jié)構(gòu)。所述基體可被細(xì)分為多種聚合酶結(jié)構(gòu)，每一結(jié)構(gòu)具有至少一種束縛的聚合酶，其中每一結(jié)構(gòu)連接到單體貯存器。備選地，每一聚合酶結(jié)構(gòu)能具有其自己的單體貯存器或4個(gè)貯存器，每一儲(chǔ)存器包含特異性單體。這些裝置所用單體包括^f旦不限于，dNTP,標(biāo)記的dNTP,ddNTP,標(biāo)記的ddNTP，或其混合物或組合。采用單分子測(cè)序裝置的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用于單分子測(cè)序的方法，其包含步驟為提供多種單體給限制或束綽于基體的標(biāo)記的聚合劑，監(jiān)測(cè)所述標(biāo)記可檢測(cè)性質(zhì)隨時(shí)間的變化。該方法也包括將可檢測(cè)性質(zhì)與發(fā)生單體添加(計(jì)時(shí))和/或每一整合的單體的身份和/或?qū)φ蠁误w的序列的近乎同時(shí)的確定相聯(lián)系。本發(fā)明提供了用于單分子測(cè)序的方法，其包含步驟為提供多種單體給限制或束縛于基體的標(biāo)記的聚合劑，將所述標(biāo)記的聚合劑持續(xù)或間歇暴露于光，測(cè)定所述標(biāo)記發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率隨時(shí)間的變化。該方法可進(jìn)一步包含將測(cè)定的所述標(biāo)記發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率隨時(shí)間的變化與發(fā)生單體添加(計(jì)時(shí))和/或每一整合的單體的身份和/或?qū)φ蠁误w的序列的近乎同時(shí)的確定相聯(lián)系。本發(fā)明提供了用于單分子測(cè)序的方法，其包含步驟為提供多種單體給限制或束縳于基體的標(biāo)記的聚合酶，監(jiān)測(cè)所述標(biāo)記可檢測(cè)性質(zhì)隨時(shí)間的變化。該方法也包括將可檢測(cè)性質(zhì)與發(fā)生單體添加(計(jì)時(shí))和/或每一整合的單體的身份和/或?qū)φ蠁误w的序列的近乎同時(shí)的確定相聯(lián)系。本發(fā)明提供了用于單分子測(cè)序的方法，其包含步驟為提供多種單體給限制或束縛于基體的標(biāo)記的聚合酶，將所述標(biāo)記的聚合酶持續(xù)或間歇暴露于光，測(cè)定所述標(biāo)記發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率隨時(shí)間的變化。該方法可進(jìn)一步包含將測(cè)定的所述標(biāo)記發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率隨時(shí)間的變化與發(fā)生單體添加(計(jì)時(shí))和/或每一整合的單體的身份和/或?qū)φ蠁误w的序列的近乎同時(shí)的確定相聯(lián)系。切、同標(biāo)記系統(tǒng)本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的聚合劑和標(biāo)記的單體，其中所述至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在所述標(biāo)記在單體插入之前，之中和/或之后相互作用時(shí)發(fā)生改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，定位聚合酶上的所述標(biāo)記，以使所述標(biāo)記在單體插入之前，之中和/或之后相互作用。在單體插入之后從所述單體釋放的標(biāo)記如，P和/或y磷酸標(biāo)記的dNTP,即位于|3和/或y磷酸基上的標(biāo)記的情況下，所述聚合劑上的標(biāo)記可被設(shè)計(jì)為只在所述標(biāo)記從所述聚合劑釋放后與所述單體上的標(biāo)記相互作用，其中所述釋放在單體插入后。可以通過(guò)將所述聚合酶標(biāo)記連接到聚合酶上的位點(diǎn)，使所述位點(diǎn)在整合發(fā)生過(guò)程中發(fā)生移動(dòng)，從而改變所述兩標(biāo)記間的相對(duì)間隔，優(yōu)化聚合劑內(nèi)的標(biāo)記的放置來(lái)增強(qiáng)所述聚合酶標(biāo)記和dNTP標(biāo)記之間的相互作用，或在堿基整合過(guò)程中從所述聚合劑釋放時(shí)和擴(kuò)散離開(kāi)所述聚合劑之前，優(yōu)化聚合劑內(nèi)的標(biāo)記的放置，來(lái)增強(qiáng)所述聚合酶標(biāo)記和所述焦磷酸上的標(biāo)記的相互作用。本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的聚合劑和標(biāo)記的單體，其中當(dāng)所述標(biāo)記在足以引起可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離內(nèi)時(shí)，所述至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生改變。如果可檢測(cè)性質(zhì)是通過(guò)能量傳遞到其它標(biāo)記或由于一個(gè)標(biāo)記淬滅了另一標(biāo)記的熒光或引起了焚光強(qiáng)度和/或頻率的可測(cè)量的變化，從而在一種標(biāo)記中誘發(fā)了熒光，那么通過(guò)使所述標(biāo)記相互接近，即縮短各標(biāo)記的間隔距離可引起可測(cè)量的改變。通常，引起所述可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量的改變所需的距離在約IOOA之內(nèi)(小于或等于)，優(yōu)選在50A之內(nèi)，具體為25A之內(nèi)，具體為15A之內(nèi)，最優(yōu)選在10A之內(nèi)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到足以引起標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離有賴(lài)于許多參數(shù)，包括標(biāo)記的位置，標(biāo)記的性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)，外部環(huán)境，激發(fā)源強(qiáng)度和頻率波段的寬度，溫度，壓力等。本發(fā)明提供了標(biāo)記的聚合劑和一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的單體前體，其中在單體插入之前，之中和/或之后所述標(biāo)記相互作用時(shí)，至少一個(gè)標(biāo)記發(fā)射的焚光強(qiáng)度和/或頻率改變。本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的解聚劑和標(biāo)記的可解聚聚合物，其中在單體釋放之前，之中和/或之后所述標(biāo)記相互作用時(shí)，至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生改變。解聚劑上的標(biāo)記可被設(shè)計(jì)為在每一單體釋放之前，之中和/或之后相互作用。本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的解聚劑和標(biāo)記的聚合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記在足以引起所述可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量的改變的距離內(nèi)時(shí)，所述至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生改變。如果所述的可檢測(cè)性質(zhì)是通過(guò)能量傳遞到其它標(biāo)記或由于一個(gè)標(biāo)記淬滅了另一標(biāo)記的熒光或引起了熒光強(qiáng)度和/或頻率的可測(cè)量的變化，從而在一個(gè)標(biāo)記中誘發(fā)了熒光，那么通過(guò)使所述標(biāo)記相互接近，即縮短各標(biāo)記的間隔距離可引起可測(cè)量的改變。通常，引起所述可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量的改變所需的距離在約IOOA之內(nèi)(小于或等于)，優(yōu)選在50A之內(nèi)，具體為25A之內(nèi)，具體為15A之內(nèi)，最優(yōu)選在10A之內(nèi)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到足以引起標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離有賴(lài)于許多參數(shù)，包括標(biāo)記的位置，標(biāo)記的性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)，外部環(huán)境，激發(fā)源強(qiáng)度和頻率波段的寬度，溫度，壓力等。本發(fā)明提供了標(biāo)記的解聚劑和標(biāo)記的聚合物，其中在單體釋放之前，之中和/或之后所述標(biāo)記相互作用時(shí)，至少一個(gè)標(biāo)記發(fā)射的焚光強(qiáng)度和/或頻率改變。采用聚合酶的協(xié)同標(biāo)記系統(tǒng)本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體，其中所述至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在所述標(biāo)記在單體插入之前，之中和/或之后相互作用時(shí)發(fā)生改變。聚合酶上的所述標(biāo)記可被設(shè)計(jì)為所述標(biāo)記在單體插入之前，之中和/或之后相互作用。在單體插入之后/人所述單體釋》文的標(biāo)記如，|3和/或Y磷酸標(biāo)記的dNTP，即位于|3和/或Y磷酸基上的標(biāo)記的情況下，所述聚合劑上的標(biāo)記可被設(shè)計(jì)為只在所述標(biāo)記從所述聚合劑釋放后與所述單體上的標(biāo)記相互作用，其中所述釋放在單體插入后。在第一種情況下，所述聚合酶的標(biāo)記必須位于聚合酶的位點(diǎn)上，該位點(diǎn)在單體插入過(guò)程中-開(kāi)始結(jié)合和鍵合到增長(zhǎng)的聚合物中時(shí)使所述聚合酶標(biāo)記與單體標(biāo)記相互作用。而在第二種情況下，所述聚合酶標(biāo)記必須位于聚合酶位點(diǎn)上，在焦磷酸擴(kuò)散離開(kāi)聚合酶進(jìn)入聚合介質(zhì)之前，該位點(diǎn)使聚合酶標(biāo)記與現(xiàn)位于焦磷酸上的單體標(biāo)記相互作用。本發(fā)明提供了協(xié)同標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體，其中當(dāng)所述標(biāo)記在足以引起所述可^r測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離內(nèi)時(shí)，所述至少一個(gè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生改變。如果所述的可檢測(cè)性質(zhì)是通過(guò)能量傳遞到其它標(biāo)記或由于一個(gè)標(biāo)記淬滅了另一標(biāo)記的熒光或引起了熒光強(qiáng)度和/或頻率的可測(cè)量的變化，從而在一個(gè)標(biāo)記中誘發(fā)了焚光，那么通過(guò)使所述標(biāo)記相互接近，即縮短各標(biāo)記的間隔距離可引起可測(cè)量的改變。通常，所述的距離或極接近的距離在約iooA到約10A之間。備選地，所述距離為小于或等于約iooA,優(yōu)選小于或等于約50A,具體為小于或等于約25A,具體為小于或等于約15A，最優(yōu)選小于或等于約ioA。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到足以引起標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離有賴(lài)于許多參數(shù)，包括標(biāo)記的位置，標(biāo)記的性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)(聚合介質(zhì))，外部環(huán)境，激發(fā)源強(qiáng)度和頻率波段的寬度，溫度，壓力等。本發(fā)明提供了標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體前體，其中所述標(biāo)記形成熒光活性對(duì)如供體-受體對(duì)，并且當(dāng)標(biāo)記相互作用時(shí)，至少一個(gè)標(biāo)記(通常為供體-受體對(duì)中的受體標(biāo)記)發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或頻率發(fā)生改變。本發(fā)明提供了標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體前體，其中所述標(biāo)記形成熒光活性對(duì)如供體-受體對(duì)，并且當(dāng)標(biāo)記間的距離足以或接近改變所述焚光的或者是強(qiáng)度和/或頻率時(shí)，至少一個(gè)標(biāo)記(通常為供體-受體對(duì)中的受體標(biāo)記)發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或頻率發(fā)生改變。通常，所述的距離或極接近的距離在約iooA到約ioA之間。備選地，所述距離為小于或等于約iooA,優(yōu)選小于或等于約50A,具體為小于或等于約25A,具體為小于或等于約15A，最優(yōu)選小于或等于約ioA。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到足以引起標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的可測(cè)量改變的距離有賴(lài)于許多參數(shù)，包括標(biāo)記的位置，標(biāo)記的性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)，外部環(huán)境，激發(fā)源強(qiáng)度和頻率波段的寬度，溫度，壓力等。本發(fā)明提供了單分子測(cè)序系統(tǒng)，其包含一容器，其中具有限制或束縛在其內(nèi)表面上的至少一種標(biāo)記的聚合酶，并具有包含多種與內(nèi)表面接觸的標(biāo)記的單體的溶液。分子數(shù)據(jù)流讀取方法和裝置本發(fā)明提供了單分子測(cè)序方法，包括如下步驟將多種標(biāo)記的單體提供給限制在容器內(nèi)表面上的標(biāo)記的聚合酶，暴露所述標(biāo)記的聚合酶于光，測(cè)定在每一后繼的單體添加或插入到增長(zhǎng)的聚合物鏈過(guò)程中所述標(biāo)記的聚合酶發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或頻率。該方法還進(jìn)一步包含將測(cè)定的發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率與整合的發(fā)生和/或每一插入或添加的單體的鑒定相聯(lián)系,這得到對(duì)增長(zhǎng)的核酸序列-DM序列，醒序列或混合的DNA/RNA序列的接近實(shí)時(shí)或?qū)崟r(shí)的序列讀出。本發(fā)明提供了重現(xiàn)儲(chǔ)存的信息的系統(tǒng)，其包含具有代表數(shù)據(jù)流的已知元件(element)的序列的分子，單分子測(cè)序儀，其包含聚合酶，該酶具有至少一個(gè)與之連接的標(biāo)記，適于激發(fā)聚合酶上至少一個(gè)標(biāo)記的激發(fā)源，適于檢測(cè)聚合酶上被激發(fā)的標(biāo)記的響應(yīng)的檢測(cè)器，其中所述來(lái)自至少一個(gè)標(biāo)記的所述響應(yīng)在元件的互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中變化，且所述變化代表數(shù)據(jù)流的內(nèi)容。本發(fā)明提供了從單個(gè)分子測(cè)定序列信息的系統(tǒng)，包含具有已知元件的序列的分子，單分子測(cè)序儀，其包含聚合酶，該酶有至少一個(gè)與之連接的標(biāo)記，適于激發(fā)聚合酶上至少一個(gè)標(biāo)記的激發(fā)源，適于檢測(cè)聚合酶上被激發(fā)的標(biāo)記的響應(yīng)的檢測(cè)器，其中所述來(lái)自至少一個(gè)標(biāo)記的所述響應(yīng)在元件的互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中變化，所述元件的互補(bǔ)序列代表分子的元件序列。本發(fā)明提供了從單個(gè)分子測(cè)定序列信息的系統(tǒng)，包含具有已知元件的序列的分子，單分子測(cè)序儀，其含有連接了至少一個(gè)焚光標(biāo)記的聚合酶，適于激發(fā)聚合酶和/或單體上的至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源，適于檢測(cè)所述聚合酶和/或單體上至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的至少一種熒光強(qiáng)度檢測(cè)器，其中每次新的核苦酸或核普酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)所述信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生變化，發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列中的具體的核苦酸或核苷酸類(lèi)似物，以使測(cè)序的數(shù)據(jù)流完整重現(xiàn)。本發(fā)明提供了儲(chǔ)存和重現(xiàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，包含代表給定的數(shù)據(jù)流的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的序列；單分子測(cè)序儀，其包含共價(jià)連接了至少一個(gè)熒光標(biāo)記的聚合酶；適于激發(fā)聚合酶和/或單體上至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源；適于^r測(cè)所述聚合酶和/或單體上的至少一個(gè)焚光標(biāo)記發(fā)射的熒光的熒光檢測(cè)器，其中在每次新的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射或不發(fā)射熒光，并且發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列的具體的核苦酸或核苷酸類(lèi)似物，以使在完整測(cè)序時(shí)重現(xiàn)數(shù)據(jù)流。此處所用術(shù)語(yǔ)單體意指通過(guò)給定的聚合酶能整合到增長(zhǎng)的分子鏈的任何化合物。這樣的單體包括但不限于，天然存在的核苷酸(例如，ATP,GTP,T丁P，UTP，CTP，dATP，dGTP，dTTP,dUTP，dCTP，合成的類(lèi)似物)，每種核苷酸的前體，非天然存在的核苷酸和它們的前體或任何可借助給定的聚合酶整合到增長(zhǎng)的聚合鏈中的其它分子。此外，用于蛋白或蛋白類(lèi)似物合成的氨基酸(天然的或合成的)，用于糖類(lèi)合成的單糖或其它單體的綜合體(syntheses)。本文所用術(shù)語(yǔ)聚合酶意指任何分子或分子組合，其能聚合一組單體到具有預(yù)先確定的單體序列的聚合物中，包括但不限于天然存在的聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，突變的天然聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，其中所述突變包含用其它氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)或許多氨基酸，所述聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的一個(gè)或多個(gè)或許多氨基酸的插入或缺失，或一個(gè)或多個(gè)聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，非天然存在的聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的部分偶聯(lián)。所述術(shù)語(yǔ)聚合酶也包含合成的分子或分子組合，其能聚合聚合物，所述聚合物具有預(yù)先確定的單體序列，或任何其它分子或分子組合，其具有額外的序列以利于標(biāo)記的純化和/或固定和/或分子相互作用，所述分子或分子組合能聚合聚合物，所述聚合物具有預(yù)先確定的或限定的或模板的單體序列。單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合劑或解聚劑本發(fā)明提供了包含聚合劑的組合物，所述聚合劑包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含聚合劑的組合物，所述聚合劑包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體聚合過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含解聚劑的組合物，所述解聚劑包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可4全測(cè)性質(zhì)在除去單體之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含聚合劑的組合物，所述聚合劑包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合酶本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述整合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含外切核酸酶的組合物，所述外切核酸酶包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含外切核酸酶的組合物，所述外切核酸酶包括至少一種分子和/或原子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含酶的組合物，所述酶被修飾以在與合適的修飾的單體作用之前，之中，和/或之后產(chǎn)生可檢測(cè)的響應(yīng)，其中所述單體是核芬酸，核苷酸類(lèi)似物，氨基酸，氨基酸類(lèi)似物，單糖，單糖類(lèi)似物或其混合物或結(jié)合。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一個(gè)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第一種檢測(cè)傾向，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二種^r測(cè)傾向。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一個(gè)生色團(tuán)，所述生色團(tuán)位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記發(fā)射光的強(qiáng)度和/或頻率具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一個(gè)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第一種熒光傾向，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二種熒光傾向。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本活化的，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本失活的，或當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是充分失活的，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記是基本活化的。多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合和解聚劑本發(fā)明提供了包含聚合劑的組合物，所述聚合劑包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可才全測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含聚合劑的組合物，所述聚合劑包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在單體聚合過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含解聚劑的組合物，所述解聚劑包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含解聚劑的組合物，所述解聚劑包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述試劑上的位點(diǎn)，其中所述可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的聚合酶本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在單體整合之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在單體聚合過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明-提供了包含外切核酸酶的組合物，所述外切核酸酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶上的位點(diǎn)，其中所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體之前，之中和/或之后經(jīng)歷改變。本發(fā)明提供了包含外切核酸酶的組合物，所述外切核酸酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到所述聚合酶的位點(diǎn)，其中所述可檢測(cè)性質(zhì)在除去單體過(guò)程中當(dāng)所述聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)具有第;一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)的可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)或第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)相互作用形成生色團(tuán)。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記具有第一種熒光傾向，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二種焚光傾向。本發(fā)明提供了包含聚合酶的組合物，所述聚合酶包括至少一對(duì)分子標(biāo)記，所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連或共價(jià)連接到位點(diǎn)，在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象改變，其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是基本活化的，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是基本失活的，或當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是基本失活的，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記對(duì)是充分活化的。采用標(biāo)記的聚合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含監(jiān)測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合酶上的位點(diǎn)或與之相連，或共價(jià)連接到單體上的位點(diǎn)，其中在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷變化，且當(dāng)聚合酶處于第一種狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，并且在每一單體添加過(guò)程中從第一個(gè)值循環(huán)變化為第二個(gè)值。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含監(jiān)測(cè)標(biāo)記的可檢測(cè)性質(zhì)的步驟，其中所述標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到聚合酶上的位點(diǎn)或與之相連，或共價(jià)連接到單體上的位點(diǎn)，其中在單體整合過(guò)程中所述位點(diǎn)經(jīng)歷構(gòu)象變化，其中在所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述可檢測(cè)性質(zhì)具有第一個(gè)值，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)具有第二個(gè)值，并且在添加每一單體過(guò)程中從第一個(gè)值循環(huán)變化為第二個(gè)值。本發(fā)明提供了確定單體何時(shí)整合到增長(zhǎng)的分子鏈的方法，其包含暴露標(biāo)記的聚合酶于光，監(jiān)測(cè)所述標(biāo)記的聚合酶和/或單體發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率的步驟，其中所述標(biāo)記的聚合酶包含聚合酶，其包括的標(biāo)記位于或靠近，與之相連，或共價(jià)連接到位點(diǎn)，所述位點(diǎn)在單體整合過(guò)程中經(jīng)歷構(gòu)象變化，或所述標(biāo)記或與之相連，或共價(jià)連接到單體上的位點(diǎn)，且其中當(dāng)所述聚合酶處于第一種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)所述標(biāo)記以第一種強(qiáng)度和/或頻率發(fā)射熒光，當(dāng)所述聚合酶處于第二種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)以第二種強(qiáng)度和/或頻率發(fā)射焚光，并且在添加每一單體的過(guò)程中，從第一個(gè)值循環(huán)變化為第二個(gè)值。采用標(biāo)記的聚合酶的單分子測(cè)序裝置本發(fā)明提供了包含單分子測(cè)序裝置的組合物質(zhì)，所述裝置包含具有小室或片狀表面的基體，其中至少一種標(biāo)記的聚合酶被限制于此，還有多種小室(每一個(gè)小室都包括一種特異性單體)和多種連接這些小室的通道，其中每一復(fù)制復(fù)合物相距足夠遠(yuǎn)以實(shí)現(xiàn)單獨(dú)地從每一復(fù)合物收集數(shù)據(jù)。本發(fā)明提供了單分子測(cè)序方法，包含如下步驟提供多種單體給限制在基體上的標(biāo)記的聚合酶，將標(biāo)記的聚合酶暴露于光，測(cè)定標(biāo)記的聚合酶發(fā)生的熒光的強(qiáng)度和/或頻率。所述方法還可包括將測(cè)定的發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率與特定引物向增長(zhǎng)的DNA鏈中的整合相聯(lián)系的步驟。協(xié)同標(biāo)記的單體和標(biāo)記的聚合劑本發(fā)明提供了包含協(xié)同標(biāo)記的聚合劑和標(biāo)記的單體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記相互作用時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生變化。本發(fā)明提供了包含協(xié)同標(biāo)記的解聚劑和標(biāo)記的可解聚單體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記相互作用時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可^r測(cè)性質(zhì)發(fā)生變化。協(xié)同標(biāo)記的單體和標(biāo)記的聚合酶本發(fā)明提供了包含協(xié)同標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記相互作用時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生變化。本發(fā)明提供了包含協(xié)同標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記位于足以引起發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率的變化的距離內(nèi)時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)發(fā)生變化。本發(fā)明提供了包含標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體前體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記相互作用時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)發(fā)射的萸光強(qiáng)度和/或頻率發(fā)生變化。本發(fā)明提供了包含標(biāo)記的聚合酶和標(biāo)記的單體前體的組合物，其中當(dāng)所述標(biāo)記位于足以引起發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率的變化的距離內(nèi)時(shí)，所述標(biāo)記中至少一個(gè)發(fā)射的熒光強(qiáng)度和/或頻率發(fā)生變化。本發(fā)明提供了單分子測(cè)序裝置，其包含容器，容器內(nèi)表面上限制有至少一種標(biāo)記的聚合酶，且有包含大量與內(nèi)表面接觸的標(biāo)記的單體的溶液，或一亞組標(biāo)記的單體和一亞組未標(biāo)記的單體，它們一起提供了用于聚合的所有單體前體。本發(fā)明提供了用于單分子測(cè)序的方法，包括如下步驟提供大量標(biāo)記的單體給限制在容器內(nèi)表面的標(biāo)記的聚合酶，將標(biāo)記的聚合酶暴露于光，測(cè)定所述標(biāo)記的聚合酶發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或頻率。所述方法還包括將測(cè)定的發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或頻率與特定的單體向增長(zhǎng)的DM鏈中的整合相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供了再現(xiàn)儲(chǔ)存的信息的系統(tǒng)，包括(a)包含具有代表數(shù)據(jù)流的元件(element)的序列的分子；(b)單分子測(cè)序儀，其包含聚合酶，該酶具有至少一個(gè)與之連接的標(biāo)記；(c)適于激發(fā)聚合酶上至少一個(gè)標(biāo)記的激發(fā)源；(d)適于檢測(cè)聚合酶或單體上標(biāo)記的響應(yīng)的檢測(cè)器，其中在元件的互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中來(lái)自至少一個(gè)標(biāo)記的所述響應(yīng)變化，且所述變化代表數(shù)據(jù)流的內(nèi)容。本發(fā)明提供了從單個(gè)分子測(cè)定序列信息的系統(tǒng)，包含(a)具有元件的序列的分子；(b)單分子測(cè)序儀，其包含聚合酶，該酶有至少一個(gè)與之連接的標(biāo)記；(c)適于激發(fā)聚合酶或單體上至少一個(gè)標(biāo)記的激發(fā)源；(d)適于檢測(cè)聚合酶上所述標(biāo)記的響應(yīng)的檢測(cè)器，其中在元件的互補(bǔ)序列聚合過(guò)程中來(lái)自至少一個(gè)標(biāo)記的所述響應(yīng)變化，且代表分子的元件的序列。本發(fā)明提供了從單個(gè)分子測(cè)定序列信息的系統(tǒng)，包含(a)具有元件的序列的分子；(b)單分子測(cè)序儀，其含有連接了至少一個(gè)熒光標(biāo)記的聚合酶；(c)適于激發(fā)聚合酶和/或單體上的至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源；(d)適于檢測(cè)所述聚合酶上至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的至少一種強(qiáng)度的檢測(cè)器，其中每次新的核苦酸或核苦酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)所述焚光標(biāo)記的發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生變化或不發(fā)射熒光，發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列中的具體的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物，以使測(cè)序完成時(shí)數(shù)據(jù)流重現(xiàn)。本發(fā)明提供了儲(chǔ)存和重現(xiàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，包含(a)代表給定數(shù)據(jù)流的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的序列；(b)單分子測(cè)序儀，其包含共價(jià)連接了至少一個(gè)焚光標(biāo)記的聚合酶；(c)適于激發(fā)聚合酶上至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源；(d)適于檢測(cè)所述聚合酶的至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的熒光檢測(cè)器，其中在每次新的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射或不發(fā)射熒光，發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列的具體的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物，以使在完成測(cè)序時(shí)重現(xiàn)數(shù)據(jù)流。本發(fā)明提供了儲(chǔ)存和重現(xiàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，包含(a)代表給定數(shù)據(jù)流的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的序列；(b)單分子測(cè)序儀，其包含共價(jià)連接了至少一個(gè)熒光標(biāo)記的聚合酶；(c)適于激發(fā)聚合酶或單體上至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源；(d)適于檢測(cè)所述聚合酶或單體上至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的熒光檢測(cè)器；其中在每次新的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射或不發(fā)射熒光，發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列的具體的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物，以使在完成測(cè)序時(shí)重現(xiàn)數(shù)據(jù)流。本發(fā)明提供了對(duì)分子序列測(cè)序的方法，包含(a)代表給定數(shù)據(jù)流的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物的序列；(b)單分子測(cè)序儀，其包含共價(jià)連接了至少一個(gè)熒光標(biāo)記的聚合酶；(c)適于激發(fā)聚合酶或單體上至少一個(gè)熒光標(biāo)記的激發(fā)光源；(d)適于檢測(cè)所述聚合酶上的至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的熒光檢測(cè)器，其中在每次新的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物聚合到互補(bǔ)序列時(shí)至少一個(gè)熒光標(biāo)記發(fā)射或不發(fā)射熒光，發(fā)射的持續(xù)時(shí)間或缺少發(fā)射或發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍證明聚合到序列的具體的核苦酸或核苦酸類(lèi)似物，以使在完成測(cè)序時(shí)重現(xiàn)數(shù)據(jù)流。本發(fā)明提供了合成Y磷酸修飾的核苷酸的方法，包含將分子標(biāo)記連接于焦磷酸基，將》f飾的焦磷酸與d麗P相接觸以產(chǎn)生Y磷酸標(biāo)記的dNTP。本發(fā)明提供了用于5'末端標(biāo)記生物分子的方法，包括使生物分子與能將y磷酸標(biāo)記的atp的y磷酸基傳遞到生物分子的5'末端的激酶接觸，產(chǎn)生共價(jià)修飾的生物分子。本發(fā)明提供了末端標(biāo)記多肽或糖類(lèi)的方法，包括如下步驟將多肽或糖類(lèi)與能傳遞原子或分子標(biāo)記到蛋白或多肽的羧基或氨基末端，或Y磷酸標(biāo)記的atp的y磷酸基到生物分子的5'末端的試劑接觸，產(chǎn)生共價(jià)修飾的生物分子。附圖簡(jiǎn)述參照下述說(shuō)明與附圖可以更好的理解本發(fā)明，附圖中相似的元件已作了相同的編號(hào)。圖1表示FRET洽f生為分隔熒i^^和受體的距離的函數(shù)；圖2表示7^DNApolI(Klen/^l)的大片段的開(kāi)放和閉合的三元復(fù)M形式；圖3表示大片段DNA聚*I,在3ktq(閉合的'黑')和1tau(開(kāi)放的？tt，)之間的重疊；圖4表示20%變性聚丙烯^圖像，其含有來(lái)自DNA延伸實(shí)^^按大小分離的i謝標(biāo)記產(chǎn)物，所述實(shí)驗(yàn)Y-ANSJ#ii-dATP;圖5表示(A)實(shí)際涉及的圖像(B)減弱的磷光圖像(C)采用Y-ANS^鄰吏-dNTP的DNA延伸^J^中產(chǎn)生的產(chǎn)物的增強(qiáng)的磷光圖像；圖6表示(A)6。/。變性的聚丙烯S5h^凌劃交圖像；(B)實(shí)際膠的減弱的磷光圖像；(C)實(shí)際膠的增強(qiáng)的磷光圖像，其包含采用Y-ANSJ類(lèi)菱-dNTP的DNA延伸碧中產(chǎn)生的產(chǎn)物。圖12表示信號(hào)強(qiáng)度和碧動(dòng)力學(xué)提供有關(guān)縱身#^信息。延伸DNA鏈中的^"核苷酸的信號(hào)強(qiáng)^于測(cè)定，確i^支持石i^身4射勺數(shù)據(jù)。其中綠實(shí)^4示當(dāng)合中包括四種天^f亥苷S^(dATP,dCTP,dGTP，dTTP)時(shí)產(chǎn)生的^產(chǎn)物。紅虛《汰示當(dāng)反應(yīng)中包^#有的，磁基修飾的核苷酸時(shí)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物。如明確顯示的，序列的連貫^^^^^爭(zhēng)影響顛產(chǎn)物強(qiáng)度和/il^動(dòng)力學(xué)，這些鑒定特征t^到特有的選4奪4tt的軟件中以在^""測(cè)序位置Ji^得有關(guān)4tt身^^高置信值。發(fā)明詳述本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種方法，該方法采用標(biāo)記的轉(zhuǎn)如dNTP和/或標(biāo)記的聚射'J如聚合酶和/或與聚合劑相連接的標(biāo)記試劑如聚合酶相連蛋白(polymeraseassociatedproteins)或探針以在所述聚合酶M活性的過(guò)程中直接讀取準(zhǔn)確的單體序列如RNA或DNA序列的4Mjf列。本發(fā)明的方法適用于蛋白質(zhì)合^Uf唐ll^^/f封可^f序列的合成，其中所述^^序列提供有用的信息如RNA或DNA襯，蛋白，糖類(lèi)，〉洽的生物襯的序列，或轉(zhuǎn)的/0/1^有才聘列，其儲(chǔ)存了數(shù)據(jù)流。設(shè)計(jì)釆用這些方法的方法和裝置以創(chuàng)造出新的方法解^^的研究問(wèn)題，如監(jiān)測(cè)復(fù)制過(guò)程中構(gòu)象的變化，在多種序列中分析聚^^齡的忠實(shí)度。設(shè)計(jì)本發(fā)明的單個(gè)^H^^則系統(tǒng)以改進(jìn)熒光M化學(xué)，計(jì)算才;ut模，選擇石tt(base《alling)的算法，生物^"的基因X^呈化，特別是實(shí)時(shí)或接近實(shí)時(shí)測(cè)序。本發(fā)明人^^現(xiàn)了所#法可適用于解聚劑如外切核酸酶，其中所述聚^^序列通:W聚而非聚合確定。而且，本發(fā)明的單個(gè)分子系統(tǒng)可修正用于平^^/或大量平^^則，其中所述標(biāo)記的聚^^在基體上排成列。采集自這些列的數(shù)據(jù)可用于i^列置4t^和/或同時(shí)觀碎許多不同來(lái)源的DNA區(qū)以鑒定類(lèi)似性或不同。本發(fā)明的單分子測(cè)序系統(tǒng)可能用于替代當(dāng)今的DNA測(cè)序技術(shù)，因?yàn)檫@種方法可以縮短時(shí)間，降低與測(cè)序過(guò)程有關(guān)的勞動(dòng)，和費(fèi)用，并且可以產(chǎn)生可高度放大的測(cè)序系統(tǒng)，其以每個(gè)反應(yīng)至少1到2個(gè)數(shù)量級(jí)改進(jìn)了所述DNA序列的發(fā)現(xiàn)方法。收集發(fā)射信號(hào)的沖莫式，可以是直接地，如通過(guò)IntensitifedChargeCoup1edDevise(ICCD)或在電子檢測(cè)前通過(guò)一個(gè)中間體或一系列中間體擴(kuò)增信號(hào)，其中所述信號(hào)被解碼，為每一堿基指定了置信度值以揭示互補(bǔ)于模板的序列的序列。因此，本發(fā)明也提供了擴(kuò)增熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的技術(shù)，其采用物理光擴(kuò)增4支術(shù)或分子級(jí)聯(lián)試劑(molecularcascadingagent)擴(kuò)增單個(gè)分子焚光反應(yīng)產(chǎn)生的光。本發(fā)明的單分子測(cè)序技術(shù)能(l)使其易于通過(guò)簡(jiǎn)單的測(cè)序其基因組或其部分對(duì)生物體分類(lèi)或鑒定生物體內(nèi)的變異；(2)更易于快速鑒定病原體或基因改變的病原體，特別是在極端環(huán)境下如戰(zhàn)爭(zhēng)所用的病原體；和(3)為法律強(qiáng)制或軍事應(yīng)用快速鑒定人。本發(fā)明的單分子測(cè)序技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案涉及策略性定位于DNA聚合酶上的一對(duì)標(biāo)記以使在聚合反應(yīng)過(guò)程中當(dāng)dNTP整合時(shí)，所述標(biāo)記改變相對(duì)間隔。此相對(duì)改變引起可檢測(cè)性質(zhì)的改變，如一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)記的熒光強(qiáng)度和/或頻率的改變。所述可檢測(cè)性質(zhì)的這些變化的時(shí)間圖譜證明每一單體整合的發(fā)生，并提供有關(guān)每一整合發(fā)生時(shí)哪一種特定的dNTP整合的證明。所述引物對(duì)不是必須共價(jià)連接到聚合酶，而是可連接到與所述聚合酶連接的分子，以這樣的方法連接在堿基整合過(guò)程中所述堿基的相對(duì)間隔發(fā)生改變。本發(fā)明的單分子測(cè)序技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案涉及策略性定位于DNA聚合酶上的單個(gè)標(biāo)記，其與dNTP上的標(biāo)記或每一dNTP上的分隔的標(biāo)記相互作用。對(duì)于每一dNTP所述標(biāo)記可以是不同的，如色彩編碼的標(biāo)記，其發(fā)射不同色彩的熒光。在聚合過(guò)程中當(dāng)下一dNTP整合時(shí)，通過(guò)特征熒光信號(hào)(顏色)或熒光信號(hào)的強(qiáng)度和/或頻率的改變指示堿基的身份。聚合酶的整合速度可以是不同的和/或可控的以產(chǎn)生基本"實(shí)時(shí)"或接近"實(shí)時(shí)"或?qū)崟r(shí)讀取聚合酶活性和堿基序列?？梢悦啃r(shí)>100,000堿基的速度從每一聚合酶收集序列數(shù)據(jù)。本發(fā)明的單分子測(cè)序技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案中，每一標(biāo)記的聚合酶包括位于所述聚合酶上或之內(nèi)的供體標(biāo)記和受體標(biāo)記，其中當(dāng)dNTP結(jié)合，dNTP整合和/或鏈延伸過(guò)程中所述標(biāo)記間距離改變。此內(nèi)標(biāo)(inter-tag)距離的改變導(dǎo)致焚光標(biāo)記發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和/或波長(zhǎng)的變化。監(jiān)測(cè)發(fā)射光的強(qiáng)度和/或波長(zhǎng)的變化可以提供有關(guān)聚合發(fā)生以及整合堿基的身份的信息或數(shù)據(jù)。在另一實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)聚合酶上的標(biāo)記與dNTP上的標(biāo)記相互反應(yīng)，其中所述相互反應(yīng)改變了所述標(biāo)記之一個(gè)或兩個(gè)的可檢測(cè)性質(zhì)。采用標(biāo)記的dNTP監(jiān)測(cè)每一熒光標(biāo)記的聚合酶的聚合反應(yīng)以測(cè)定從其得到的堿基整合數(shù)據(jù)的效力。已開(kāi)發(fā)了特定的檢測(cè)和方法以及特定的分析設(shè)備以測(cè)定和定量熒光數(shù)據(jù)，使每一整合的dNTP得到檢測(cè)并證實(shí)。同時(shí)，本發(fā)明人證實(shí)了標(biāo)記的dNTP，其由合適的聚合酶聚合，并開(kāi)發(fā)了分析所述反應(yīng)發(fā)射的熒光并解譯堿基身份的軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解本領(lǐng)域已知的合適的熒光活性對(duì)，它們從商家可以獲得，如位于Oregon的MolecularProbes或BiosearchTechnologies,Inc.位于Novato，CA。本發(fā)明所用標(biāo)記的DNA聚合酶通過(guò)基因工程化提供一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)可以允許本發(fā)明實(shí)施不同的實(shí)施方案。一旦找到合適的候選聚合酶，突變和/或修飾所述聚合酶內(nèi)特定的氨基酸，該反應(yīng)為本領(lǐng)域所知；然而前題是，所述突變和/或修飾不對(duì)聚合效率產(chǎn)生顯著不利影響。使所述突變的和/或修飾的氨基酸適于促進(jìn)標(biāo)記的結(jié)合如染料或熒光供體或受體分子，如果是在光活化的標(biāo)記情況下。工程化聚合酶一旦形成，可以與一個(gè)或多個(gè)合適的標(biāo)記接觸，并用于本發(fā)明的裝置和方法中。工程化聚合酶使其起DNA堿基身份的直接分子感受器的作用，這為快速且可能實(shí)時(shí)的酶DNA測(cè)序系統(tǒng)提供了一條途徑。本發(fā)明所述單分子測(cè)序系統(tǒng)可以顯著縮短時(shí)間，降低與測(cè)序過(guò)程有關(guān)的勞動(dòng)強(qiáng)度和費(fèi)用，并可高度放大。本發(fā)明所述單分子測(cè)序系統(tǒng)(l)可以每個(gè)反應(yīng)至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)地改進(jìn)序列發(fā)現(xiàn)方法；(2)不受長(zhǎng)度的限制，所述限制與降解堿基的單個(gè)分子方法有關(guān)；(3)可以對(duì)所需(靶)DNA序列直接測(cè)序，特別是基因組，而無(wú)需克隆或PCR擴(kuò)增，此兩種方法都引入錯(cuò)誤到序列中。本發(fā)明系統(tǒng)可以筒單的通過(guò)對(duì)目的基因組或基因組任何所需部分測(cè)序容易地進(jìn)行生物體分類(lèi)或鑒定生物體內(nèi)的變異。本發(fā)明系統(tǒng)適于快速鑒定病原體或工程化病原體，其對(duì)于評(píng)價(jià)與健康有關(guān)的影響，普通DM診斷，包括癌癥檢測(cè)和/或定性，基因組分析，或更廣泛形式的基因變異檢測(cè)具有重要意義。本發(fā)明所述單個(gè)分子DNA測(cè)序系統(tǒng)可以成為單個(gè)分子基因分析的啟動(dòng)平臺(tái)(enablingplatform)技術(shù)。本發(fā)明的單分子測(cè)序系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)所述系統(tǒng)取消了測(cè)序反應(yīng)處理，凝膠或毛細(xì)管加載，電泳，數(shù)據(jù)匯編；(2)所述系統(tǒng)顯著節(jié)約了勞力，時(shí)間和成本；(3)所述系統(tǒng)可以接近實(shí)時(shí)或?qū)崟r(shí)獲得數(shù)據(jù)，處理數(shù)據(jù)并確定整合的發(fā)生(計(jì)時(shí)，持續(xù)時(shí)間，等)，堿基序列等；(4)所述系統(tǒng)可以微陣列的形式對(duì)平行或大量平行的樣品進(jìn)行處理；(5)所述系統(tǒng)可以在一天或更少的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速基因組測(cè)序；(6)所述系統(tǒng)需要很少量分析材料；(7)所述系統(tǒng)可以進(jìn)行動(dòng)物的快速基因鑒定，篩選和表征，包括人或病原體；(8)所述系統(tǒng)可以大幅提高序列的容許能力；(9)所述系統(tǒng)可以避免PCR，RT-PCR和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中引入的錯(cuò)誤；(10)所述系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地獲得序列信息用于檢測(cè)等位基因特異的突變(allele-specificmutation);(ll)所述系統(tǒng)可以快速進(jìn)行醫(yī)療診斷，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)；(12)所述系統(tǒng)可以改進(jìn)堿基檢索，例如在大量不同序列中測(cè)定聚合酶的整合速率；分析不同的前后序列中的^"誤；后生型分析；蛋白糖基化分析；蛋白質(zhì)鑒定；(13)所述系統(tǒng)可以創(chuàng)造新的加強(qiáng)的(robust)(堅(jiān)固的(rugged))單個(gè)分子檢測(cè)裝置；(14)所述系統(tǒng)可以開(kāi)發(fā)與生物分子相適合的系統(tǒng)和程序；(15)所述系統(tǒng)可以開(kāi)發(fā)基因的毫微級(jí)設(shè)備(nanomachines)或毫微米技術(shù)；(16)所述系統(tǒng)可以構(gòu)建大的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，且(17)所述系統(tǒng)對(duì)于低的突變發(fā)生檢測(cè)具有高靈敏度。單個(gè)分子DNA測(cè)序的簡(jiǎn)述在本發(fā)明的單個(gè)分子DM測(cè)序系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)標(biāo)記連接到聚合酶上的適當(dāng)位點(diǎn)，一個(gè)獨(dú)特的標(biāo)記連接到四種核芬酸的每一個(gè)上dATP，dTTP，dCTP，dGTP。每一dNTP上的標(biāo)記^皮設(shè)計(jì)為具有獨(dú)特的發(fā)射特征(signature)(即，不同的發(fā)射頻率光譜或顏色)，整合時(shí)可以直接檢測(cè)到。當(dāng)標(biāo)記的dNTP整合到增長(zhǎng)的DNA聚合體上時(shí)，由于聚合酶標(biāo)記和dNTP標(biāo)記的相互作用，特征性焚光信號(hào)或堿基發(fā)射的特征波行被發(fā)射。所述焚光信號(hào)，即發(fā)射強(qiáng)度和/或頻率，被檢測(cè)和分析以確定DNA堿基序列。挑選用于本發(fā)明的標(biāo)記的聚合酶和/或dNTP的標(biāo)準(zhǔn)是聚合酶和/或dNTP上的標(biāo)記不干擾Watson-Crick的堿基配對(duì)或?qū)酆厦富钚詿o(wú)顯著不良影響。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)包含連接到末端(Y)磷酸的標(biāo)記的dNTP通過(guò)天然"《聚合酶與未標(biāo)記的dNTP—起或只采用標(biāo)記的dNTP整合。因?yàn)樗肈NA鏈在它們的分子組成上不包括任一dNTP標(biāo)記，所以?xún)?yōu)選在(3和/或y磷酸基上標(biāo)記dNTP,這樣可最小化酶變形(enzymedistortion)和背景熒光。本發(fā)明的測(cè)序系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案涉及將熒光供體如熒光素或熒光素型分子^:置于聚合酶上，獨(dú)特的熒光受體如d-若丹明或類(lèi)似的分子放置于每一dNTP上，其中每一獨(dú)特的受體，當(dāng)與聚合酶上的供體相互作用時(shí)，產(chǎn)生的熒光光譜包括至少一種可進(jìn)行區(qū)別的頻率或光譜特征。當(dāng)輸入的，標(biāo)記的dNTP與聚合酶結(jié)合用于DM延長(zhǎng)時(shí)，分析檢測(cè)到的焚光信號(hào)或光譜，確定整合的堿基的身份。本發(fā)明的測(cè)序系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施方案涉及聚合酶上的焚光標(biāo)記和dNTP上的獨(dú)特的淬滅劑，其中所述淬滅劑優(yōu)選對(duì)聚合酶標(biāo)記具有可進(jìn)行區(qū)別的淬滅效果。結(jié)果，每一輸入的淬滅劑標(biāo)記的dNTP的身份才艮據(jù)其對(duì)聚合酶焚光標(biāo)記的發(fā)射的獨(dú)特淬滅效果而確定。再一次，檢測(cè)整合過(guò)程中產(chǎn)生的信號(hào)并分析確定所整合的每一堿基，其序列產(chǎn)生DNA堿基序列。試劑任何聚合劑如DNA或RNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，或類(lèi)似的或以逐步的方式聚合單體的聚合劑。本發(fā)明所用合適的聚合酶包括但不限于可從其宿主分離的任何聚合酶，所述分離的量足以用于純化和使用和/或以足夠本發(fā)明使用的量基因工程化到其它生物用于表達(dá)，分離和純化，如DNA或RNA聚合酶，所述聚合酶聚合DM，RNA或混合序列到延伸的核酸聚合體中。本發(fā)明所用的優(yōu)選的聚合酶包括天然聚合酶的突變體或突變的變體，其中所述突變體具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，所述取代可用于連接原子或分子標(biāo)記，所述標(biāo)記具有可才企測(cè)性質(zhì)。DNA聚合酶的實(shí)例包括但不限于，采用RNA或DM模板的HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶，來(lái)源于水生棲熱菌或大腸桿菌的DNA聚合酶I,喧菌體T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶或類(lèi)似的。RNA聚合酶例如但不限于T7RNA聚合酶或類(lèi)似的,^郎.劑，如DNA，RM或混合的DNA/RNA聚合體情況下的核酸外切酶，多肽和酶情況下的蛋白酶，或可以順序解聚多糖的酶系統(tǒng)。到聚合體的單體。本發(fā)明所用的合適的核苷酸包括但不限于天然存在的核苷酸，合成的其類(lèi)似物，連接了原子和/或分子標(biāo)記的類(lèi)似物，或其混合物或組合。位點(diǎn)相連的原子成分，特別是銪位移試劑(Europiumshiftagent),nmr活性原子或類(lèi)似的。定位點(diǎn)連接的原子成分，特別是熒光染料如d-若丹明受體染料包括二氯[RllO]，二氯[R6G]，二氯[TAMRA],二氯[ROX]或類(lèi)似的，萸光素供體染料包括熒光素，6-FAM，或類(lèi)似的；吖啶包括吖啶橙，吖啶黃，二氨基吖啶，pH7，或類(lèi)似的；芳香烴包括2-曱基苯并唑，乙基p-二曱基氨基苯曱酸鹽，苯酚，吡咯，苯，曱苯，或類(lèi)似的；芳基次甲基染料包括金胺0，結(jié)晶紫，H20，結(jié)晶紫，甘油，孔雀綠或類(lèi)似的；香豆素染料包括7-曱氧基香豆素-4-乙酸，香豆素1,香豆素30,香豆素314，香豆素343,香豆素6或類(lèi)似的；青色素(cyanine)染料包括1，1，-二乙基-2，2，碘化青色素，隱青色素(cryptocyanine)，龍?zhí)壳嗌?Indocarbocyanine)(C3)染料，龍二碳青色素(Indodicarbocyanine)(C5)染料，錠三碳青色素(Indotricarbocyanine)(C7)染料，氧碳青色素(Oxacarbocyanine)(C3)染料，氧二碳青色素(Oxadicarbocyanine)(C5)染料，氧三碳青色素(0xatricarbocyanine)(C7)染料，石輿化松柏氰醇(Pinacyanoliodide),Stainsall,硫碳青色素(Thiacarbocyanine)(C3)染料，乙醇，硫碳青色素(Thiacarbocyanine)(C3)染料，n-丙醇，硫二碳青色素(Thiadicarbocyanine)(C5)染料，硫三碳青色素(Thiatricarbocyanine)(C7)染料，或類(lèi)似的；Dipyrrhi染料包括N,N'-Difl麗oboryl-l,9-二曱基-5-(4-硤代苯基)-dipyrrin，N，N'-Difluoroboryl-l，9-二曱基—5-[(4-(2-三曱基曱硅烷乙炔基(trimethylsilylethynyl))，N，N'-Difluoroboryl-l，9-二曱基-5phenydipyrrin,或類(lèi)似的；部花青(Merocyanine),包括4-(二氰亞曱基)-2-曱基-6-(p-二曱基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(DCM)，乙腈，4-(二氰亞甲基)-2-曱基-6-(p-二曱基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(DCM),曱醇，4-二曱胺-4'-硝基1,2-二苯乙烯，部花青540，或類(lèi)似的；混雜(Miscellaneous)染4十，包括4',6-二脒基(Diamidino)-2-苯基p引哚(DAPI),4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，二甲亞石風(fēng)，7-苯曱胺-4-硝基苯-2-氧-1,3-二唑,丹酰甘氨酸(Dansylglycine),H20，丹酰甘氨酸，二烷(dioxane),Hoechst33258,DMF，Hoechst33258，H20,熒光黃CH，吡氧p塞溱(Piroxicam)，石危酸奎寧(Quininesulfate),0.05MH2S04，硫酸查寧，0.5MH2S04，Squarylium染料III，或類(lèi)似的；寡亞苯(01igophenylenes)包括2，5-二苯基嗨唑(PP0)，耳關(guān)苯，P0P0P,p-四聯(lián)苯，p-三聯(lián)苯，或類(lèi)似的；嗨嗪，包括紫色高氯酸羥曱苯酯(Cresylvioletperchlorate),尼羅藍(lán)(NileBlue),曱醇，尼羅紅(NileRed),尼羅藍(lán)，乙醇，嚼溱l，隨。泰170,或類(lèi)似的；多環(huán)芳香烴，包括9,lO-雙(苯乙炔基)蒽，9,10-二苯蒽，蒽，萘，茈，芘，或類(lèi)似的；多烯/聚炔烴，包括1,2-二苯乙炔，1，4-二苯丁二烯，1，6-二苯己三烯，卩-胡蘿卜素，芪(Stilbene),或類(lèi)似的；氧化還原活性的生色團(tuán)，包括蒽醌，偶氮苯，苯醌，二茂鐵，核黃素，Tris(2,2'-二吡啶基)釕(II),四吡咯(Tetrapyrrole),膽紅素，葉綠素a,二乙醚，葉綠素a，曱醇，葉綠素b,二質(zhì)子化的四苯葉啉(Diprotonatedtetraphenylporphyrin),氧化蘇木精，Magnesiumoctaethylporphyrin，Magnesiumoctaethylporphyrin(Mg0EP),酞氰鎂(Magnesiumphthalocyanine)(MgPc)，Pr0H,酞氰鎂(MgPc)，嘧咬，Magnesiumtetramesitylporphyrin'(MgTMP)，四苯基吟淋鎂(Magnesiumtetraphenylporphyrin)(MgTPP),八乙基p卜p林，酞氰(Pc)，H、吩，四-t-丁基氮雜卟吩(Tetra-t-butylazaporphine),四—1-丁基萘青色素(Tetra-t-butylnaphthalocyanine),四(2，6-二氯苯基)口卜啉(Tetrakis(2，6-dichlorophenyl)porphyrin),四(o-胺苯基)p卜淋(Tetrakis(o-aminophenyl)porphyrin),Tetramesitylporphyrin(TMP),四苯外啉(Tetraphenylporphyrin)(TPP),維生素B12，八乙基p卜啉鋅(Zincoctaethylporphyrin)(Zn0EP),肽氰鋅(Zincphthalocyanine)(ZnPc),嘧吱,Zinctetramesitylporphyrin(ZnTMP)，Zinctetramesitylporphyrinradicalcation,四苯基葉淋鋅(ZnTPP),或類(lèi)似的；氧雜蒽(Xanthenes),包括曙紅Y，熒光素，堿性乙醇(basicethanol),熒光素，乙醇，若丹明123，若丹明6G，若丹明B,玫J鬼紅(RoseBengal),Sulforhodamine101，或類(lèi)似的；或其混合物或組合或其合成的衍生物或FRET熒光團(tuán)-淬滅劑對(duì)，包括DL0-FB1(5'-FAM/3'-BHQ-l)DL0-TEB1(5'-TET/3'-BHQ-1),DLO-JB1(5'-JOE/3'-BHQ-l),DL0-HB1(5'-HEX/3'-BHQ-1),DLO-C3B2(5'-Cy3/3'-BHQ-2),DLO-TAB2(5'-TAMRA/3'-BHQ-2)，(5'-麗/3'-BHQ-2),(5'-Cy5.5/3'-BHQ-3)，(5'-TET/3'-BHQ-l),(5'-HEX/3'-BHQ-l),(5'-TAMRA/3'-BHQ-2)，(5'-Cy5/3'-BHQ-3),DLO-C5B3MB0-FB1MB0-JB1MBO-C3B2(5'-Cy5/3'-BHQ-3)，(5'-FAM/3'-BHQ-l),(5'-JOE/3'-BHQ-1)，(5'-Cy3/3'-BHQ-2),(5'-ROX/3'-BHQ-2);DL0-RB2DLO-C55B3MB0-TEB1MB0-HB1MB0-TAB2MB0—C5B3MB0-RB2MBO-C55B3(5'-Cy5.5/3'-BHQ-3)或類(lèi)似得自BiosearchTechnologiesInc.ofNovato，'CA,的FRET對(duì)，具有nmr活性集團(tuán)的標(biāo)記，具有光鐠特征的標(biāo)記，所述特征可以被容易地鑒定，如IR,,遠(yuǎn)IR,可見(jiàn)UV，遠(yuǎn)UV或類(lèi)似的。酶的選擇本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)水生棲熱菌(r力er/wt^a《wa"cws)的DNA聚合酶-;TsgDNA聚合酶I-是很適于本發(fā)明的單個(gè)分子裝置，系統(tǒng)和方法。DNA聚合酶有時(shí)在本文中簡(jiǎn)寫(xiě)為&《，其有許多特點(diǎn)，發(fā)明人可以利用來(lái)構(gòu)建標(biāo)記的聚合酶，用于本申請(qǐng)公開(kāi)的本發(fā)明。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它聚合酶也能適用于本發(fā)明的單分子測(cè)序系統(tǒng)。由于7a《DNA聚合酶I耐受在其活性位點(diǎn)內(nèi)或附近有許多突變(如Pateletal，J.MolBiol,,volume308,pages823—837,引入作為參考)，所以所述酶更能耐受酶標(biāo)記修飾并也能整合較大范圍的修飾的核香酸基體?？色@得DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)對(duì)ra《DM聚合酶有13種結(jié)構(gòu)解釋?zhuān)谢驔](méi)有DNA模板/引物，dNTP,或ddNTP,其允許足夠的信息以在聚合酶內(nèi)部挑選氨基酸位點(diǎn)，使該位點(diǎn)上連接原子和/或分子標(biāo)記，如焚光標(biāo)記，而不對(duì)聚合酶活性產(chǎn)生不良影響。參見(jiàn)，例如，Eom等.,1996,Li等，1998a，Li等，1998b。此外，本發(fā)明人具有一書(shū)寫(xiě)的程序以幫助鑒定優(yōu)化的標(biāo)記添加位點(diǎn)。所述程序?qū)Ρ扰c聚合酶的開(kāi)放和閉合形式有關(guān)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)以鑒定出聚合酶結(jié)構(gòu)中的某些區(qū)域，這些位置可用來(lái)優(yōu)化所述聚合酶上標(biāo)記和dNTP間的極端構(gòu)象(confoniiationextremes)的不同或優(yōu)化所述聚合酶上兩個(gè)標(biāo)記之間間距的變化，從而提高或最大化所述標(biāo)記或標(biāo)記對(duì)的可檢測(cè)性質(zhì)的變化。DNA聚合酶在大腸桿菌中有效表達(dá)所述7^<7DM聚合酶在大腸桿菌中有效表達(dá)，可以有效生產(chǎn)和純化新生的聚合酶和其變體用于快速鑒定，表征和優(yōu)化，用于本發(fā)明的單個(gè)分子DNA測(cè)序系統(tǒng)的工程化&《DNA聚合酶。蛋白序列中沒(méi)有半胱氨酸所述A《DNA聚合酶不含有半胱氨酸，這可以容易的產(chǎn)生含半胱氨酸的突變體，其中單個(gè)半胱氨酸在策略位點(diǎn)被放置或取代現(xiàn)存的氨基酸，其中所述插入的半胱氨酸作為標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)。酶的處理能力可以被改變盡管天然Z3《DNA聚合酶可以不代表本發(fā)明的測(cè)序系統(tǒng)的優(yōu)化的聚合酶，因?yàn)樗皇翘幚砟芰軓?qiáng)的聚合酶(在解離前整合50-80個(gè)核苷酸)，通過(guò)適當(dāng)修飾的堿基選擇軟件(basecallingsoftware),可以補(bǔ)償?shù)吞幚砟芰?。備選地，所述7^《DNA聚合酶的處理能力能通過(guò)將處理能力增強(qiáng)序列插入到聚合酶基因的基因工程化而得到增強(qiáng)。預(yù)計(jì)高處理能力聚合酶可以最小化可能由模板解離效應(yīng)引起的并發(fā)癥(complication),其能改變聚合速率。通過(guò)引入T7DNA聚合酶的76氨基酸'處理能力結(jié)構(gòu)域(processivitydomain)，到ra《的H和螺旋(位于聚合酶內(nèi)'拇指(thumb)'區(qū)的頂端)之間，可以在基因水平上改變r(jià)^的處理能力。所述處理能力結(jié)構(gòu)域也包括T7DNA聚合酶的硫氧化蛋白結(jié)合域(TBD)，導(dǎo)致聚合酶依賴(lài)碌u氧化蛋白提高T^聚合酶的處理能力和比活性。參見(jiàn)Bedfordetal.，1997;Bedfordetal.，1999。7<2《DNA聚合酶具有5，到3，外切核酸酶活性且是熱穩(wěn)定的單鏈M13DNA和合成的寡核苦酸用于開(kāi)始的研究。優(yōu)化聚合酶活性之后，所述測(cè)序系統(tǒng)用于從分離的染色體-雙鏈DM分子直接測(cè)定序列信息。通常，加熱雙鏈DNA分子的樣品足以產(chǎn)生或保持雙鏈DM分子的鏈?zhǔn)紻NA形式用于測(cè)序。為利于單鏈狀態(tài)，保持用于單分子DNA測(cè)序的工程化酶中的天然&《DNA聚合酶的5，到3，外切核酸酶活性。'7a^Man，分析利用聚合酶的這種活性。這種外切核酸酶活性釆用切口轉(zhuǎn)平移反應(yīng)才幾制(nick-translationreactionmechanicsm)除去可能從復(fù)制起點(diǎn)的下游發(fā)生變性的一條雙螺旋的鏈(duplexstrand)。通過(guò)合成的寡核苷酸引物(如果需要特異性反應(yīng)啟動(dòng))或DNA分子上的切口(如果處理多個(gè)反應(yīng))可以啟動(dòng)從工程化聚合酶的合成以確定整個(gè)DNA分子的序列。聚合酶沒(méi)有3，到5，外切核酸酶活性.、所述ragDNA聚合酶不包含3，到5，外切核酸酶活性，這意味著所述聚合酶不能使檢測(cè)到熒光信號(hào)的堿基被產(chǎn)生另一特征焚光信號(hào)的堿基所取換。所有聚合酶都會(huì)產(chǎn)生復(fù)制錯(cuò)誤。所述3，到5，外切核酸酶活性用于校對(duì)新復(fù)制的DNA鏈。由于DM聚合酶缺少此校對(duì)功能，堿基整合中的錯(cuò)誤會(huì)成為DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤。raDM聚合酶的錯(cuò)誤率是每合成~100，000個(gè)堿基有1個(gè)錯(cuò)誤，這樣低的錯(cuò)誤率是以確保相對(duì)高的忠實(shí)度。例如參見(jiàn)EckertandKunkel，1990;Clineetal.，1996。已才是示和i正明對(duì)于聚合酶，此外切核酸酶活性的消除揭示了整合中降低的忠實(shí)度。因此，&<7聚合酶必須-必要地-在初始核苷酸的選擇和/或整合過(guò)程中更準(zhǔn)確，因此是本發(fā)明所用的極好選擇。通過(guò)確定它們合成已知序列的錯(cuò)誤率分析本發(fā)明的工程化聚合酶的錯(cuò)誤率。所述錯(cuò)誤率確定平行進(jìn)行的最佳反應(yīng)數(shù)量，以賦予測(cè)序信息的連貫性置信值。優(yōu)選的數(shù)目是1或10或更多。例如，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn);威基(basecontext)影響聚合酶的準(zhǔn)確度和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，此信息用于賦予置信值給單個(gè)配對(duì)堿基(basecalls)。但是，根據(jù)特定測(cè)序項(xiàng)目的目的，盡快產(chǎn)生基因組序列可能更為重要。例如為了初始的鑒定目的或?qū)撛诓≡w的快速篩選，優(yōu)選以降低的準(zhǔn)確度產(chǎn)生，或繪制，病原體的基因組序列。7s《DNA聚合酶是挑選的用于單個(gè)分子DNA測(cè)序的酶工程化聚合酶使其起DNA堿基身份的直接分子檢測(cè)器的作用使最快速酶性DNA測(cè)序系統(tǒng)成為可能。對(duì)于如上所述的原因，&《DNA聚合酶是在基因水平進(jìn)行修飾和改造，以適于單個(gè)分子DNA測(cè)序的最佳酶。此外，復(fù)制中有關(guān)DNA聚合酶結(jié)構(gòu)和功能的基本研究問(wèn)題可采用此技術(shù)領(lǐng)先的單個(gè)分子檢測(cè)系統(tǒng)和在其它學(xué)科的分子模型解決。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)天然7^MA聚合酶整合y-標(biāo)記的dNTP,產(chǎn)生延伸的DNA聚合體。重要的是，修飾的核苦酸的整合不損及聚合酶的活性，通過(guò)整合Y-標(biāo)記的核苦酸進(jìn)行的引物鏈延伸遵守Waston-Crick堿基配對(duì)法則。檢測(cè)標(biāo)記的聚合酶-核香酸之間的相互作用檢測(cè)聚合酶-核苷酸相互作用的優(yōu)選方法涉及基于熒光共振的能量傳遞(fluorescenceresonanceenergytransfer—based).(FRET-based)的方法，最大化信號(hào)和最小化噪音。當(dāng)從受體的發(fā)射比從供體的發(fā)射更強(qiáng)時(shí)，即，在激發(fā)頻率時(shí)受體的熒光量子產(chǎn)出高于供體時(shí)，存在基于FRET的方法?？蓮挠?jì)算模型估計(jì)FRET方法的效率。例如參見(jiàn)Fureyetal.,1998;Cleggetal.,1993;Mathiesetal.,1990。能量傳遞的效率(E)可從公式(1)計(jì)算E=1/(1+[R/R。]6)(1)其中在E=0.5時(shí)，R。是Forester必需距離(Forestercriticaldistance)。R?？蓮墓?l)計(jì)算R。=(9.79x103)(kVQJJ1"(2)其中n是介質(zhì)的折光指數(shù)(對(duì)于水溶液n-l.4),K2是涉及兩個(gè)轉(zhuǎn)變偶極(transitiondipoles)的相對(duì)角度的幾何方向因子(ge訓(xùn)etricorientationfactor)&2通常為2/3),JDA[M-1cm3]重疊積分代表供體發(fā)射和受體吸收的標(biāo)準(zhǔn)化的光謙重疊，Q。是量子產(chǎn)出(quantumyield)。所述重疊積分由公式(3)得到Jw=[J"FD(X)eeA(X)m〗/[/FD(入)d入](3)其中F。是供體發(fā)射，Sa是受體吸收。Q。從公式(4)計(jì)算QD-Q"ID/(ARF/AD)(4)其中L和Im是供體和參照化合物(0.INNaOH中熒光素)的熒光強(qiáng)度，Arf和Ad是參照化合物和供體的吸收。Qkf是O.INNaOH中熒光素的量子產(chǎn)出，記為0.90。供體和受體之間的距離R視聚合酶的不同構(gòu)型(例如構(gòu)象)來(lái)測(cè)定，其目的是為了得到構(gòu)象平均值。如果兩個(gè)標(biāo)記都在聚合酶上，則R是處于開(kāi)放和閉合構(gòu)象的供體和受體之間的距離，而如果供體在聚合酶上，受體在dNTP上，當(dāng)dNTP與聚合酶結(jié)合且所述聚合酶處于閉合形式時(shí)，R是供體和受體之間的距離。標(biāo)記的y-磷酸和所選用于標(biāo)記的開(kāi)放和閉合的聚合酶構(gòu)象中的氨基酸位點(diǎn)之間的距離決定了最佳的染料組合。如果所述在供體和受體之間的距離(R)與R。相同(R。是Forster必需距離)，F(xiàn)RET效率(E)是50%。如果R大于1.5R。，所述能量傳遞效率可忽略不計(jì)(E〈0.02)。鑒定酶內(nèi)的位點(diǎn)，在此位點(diǎn)開(kāi)放形式的R/Ro和閉合形式的R/R。之間的差異超過(guò)1.6,如果需要，這些距離和/或距離差別可以通過(guò)基因工程提高。圖1是FRET效率相對(duì)于距離的圖示。熒光染料選擇方法當(dāng)聚合酶處于其閉合構(gòu)型時(shí)，挑選染料組以最大化標(biāo)記的dNTP和聚合酶上標(biāo)記之間能量的傳遞效率，當(dāng)聚合酶處于開(kāi)放構(gòu)型時(shí)，最小化dNTP上標(biāo)記(非有效結(jié)合或在溶液中)和聚合酶上標(biāo)記之間的能量傳遞。如果反應(yīng)介質(zhì)中每一核苷酸的摩爾濃度不超過(guò)約lfiM，計(jì)算所得標(biāo)記的核苷酸間平均距離大于或等于約250A。因?yàn)榇司嚯x幾倍大于聚合酶在其開(kāi)放到閉合構(gòu)象中分離的位點(diǎn)間的距離，可觀察到聚合酶和游離dNTP間的最小化的FRET背景。優(yōu)選地，核苷酸濃度降低到l^M以下。降低dNTP濃度到至少L的10%以下可進(jìn)一步最小化背景熒光，并提供方便的控制聚合酶反應(yīng)速率的方法用于實(shí)時(shí)監(jiān)控。在這樣的條件下，聚合反應(yīng)速度與dNTP濃度成線(xiàn)性比例，因此，對(duì)調(diào)節(jié)高度敏感。此外，使用單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)可以改進(jìn)對(duì)每一dNTP上獨(dú)特的標(biāo)記的鑒定。較低波長(zhǎng)激發(fā)激光用于達(dá)到高選擇性。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光供體與聚合酶上位點(diǎn)連接，所述聚合酶包含更易于供體連接的取代的氨基酸，如半胱氨酸，四個(gè)獨(dú)特的熒光受體連接到每一dNTP上。例如將熒光素連接到聚合酶上的位點(diǎn)，若丹明，若丹明衍生物和/或熒光素衍生物連接到每一dNTP。設(shè)計(jì)每一供體-受體熒光團(tuán)對(duì)的吸收光i普使其足以與其它熒光團(tuán)對(duì)區(qū)分，以使激發(fā)后進(jìn)行分離鑒定。優(yōu)選的，選擇所述供體以使激發(fā)光活化供體，其然后有效地傳遞激發(fā)能給受體之一。能量傳遞后，受體發(fā)射獨(dú)特特征的熒光。熒光供體的發(fā)射光諳必須與熒光受體的吸收光譜顯著重疊才能有效地進(jìn)行能量傳遞。但是本發(fā)明的方法也能采用二，三或四個(gè)獨(dú)特的焚光供體-受體對(duì)通過(guò)并行反應(yīng)進(jìn)行。對(duì)熒光團(tuán)的選擇不僅有賴(lài)于其酶的適應(yīng)性(compatibility),還有其光譜和光化學(xué)性質(zhì)。例如，受體熒光團(tuán)在供體熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)不具有任何顯著的吸收是關(guān)鍵的，稍不重要的(也是需要的)是，供體熒光團(tuán)在受體熒光團(tuán)的檢測(cè)波長(zhǎng)不具有發(fā)射。這些光鐠特征可通過(guò)對(duì)熒光團(tuán)的環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行的化學(xué)修飾削弱。盡管可修改dNTP以在幾個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，包括石威基，糖和磷酸基，但優(yōu)選對(duì)dNTP標(biāo)記于j3和/或y磷酸。標(biāo)記dNTP的末端磷酸具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)輸入的，標(biāo)記的dNTP結(jié)合到聚合酶的活性位點(diǎn)時(shí)，從聚合酶上的供體到dNTP上的受體出現(xiàn)顯著的FRET。受體獨(dú)特的熒光鑒定整合了哪一種dNTP。一旦標(biāo)記的dNTP被整合到增長(zhǎng)的DNA鏈，所述熒光受體，其目前是結(jié)合到,焦磷酸基上，隨著焦磷酸基的裂解被釋放到介質(zhì)中。實(shí)際上，增長(zhǎng)的DNA鏈根本不包括熒光受體分子?；旧希現(xiàn)RET只發(fā)生在聚合酶上的供體和輸入的受體標(biāo)記的dNTP之間，一次一個(gè)。此方法好于受體備選連接到dNTP的d麗P部分內(nèi)的位點(diǎn)，或者使用具有多個(gè)修飾的dNTP。如果受體連接的位點(diǎn)不是(3或Y磷酸基，其成為增長(zhǎng)的DNA鏈的一部分，所述DNA鏈將包含多個(gè)熒光受體?？赡馨l(fā)生對(duì)聚合反應(yīng)和FRET檢測(cè)的干擾。如果聚合介質(zhì)(背景)中標(biāo)記的dNTP的熒光有問(wèn)題，可將碰撞淬滅劑加入到聚合介質(zhì)中，所述淬滅劑不與dNTP上受體共價(jià)作用但淬滅介質(zhì)中標(biāo)記的dNTP的焚光。當(dāng)然，也可改造所述淬滅劑，使其與聚合酶上的供體沒(méi)有明顯接觸。為使碰撞淬滅劑與聚合酶上的供體之間的相互作用最小化，可優(yōu)選使聚合酶的標(biāo)記位于內(nèi)部且避開(kāi)碰撞淬滅劑，或可將所述碰撞淬滅劑制備成大的空間體積或與空間體積大的基團(tuán)相連以降低所述淬滅劑與聚合酶之間的相互作用。檢測(cè)聚合酶-核普酸之間相互作用的另一優(yōu)選方法涉及應(yīng)用核苷酸特異的淬滅劑，以淬滅聚合酶上熒光標(biāo)記的發(fā)射。這樣，用熒光團(tuán)標(biāo)記聚合酶，而每一dNTP用熒光團(tuán)的淬滅劑標(biāo)記。一般，DABCYL(4-(4'-二曱基氨苯基偶氮(dimethylaminophenylazo)))安息香酸是通用的淬滅劑，其吸收熒光團(tuán)的能量，所述熒光團(tuán)如5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(AEANS),并消散熱量。優(yōu)選的，為每一dNTP選擇淬滅劑，以使當(dāng)每一淬滅劑靠近熒光團(tuán)時(shí)，得到不同的淬滅效果。因此，當(dāng)其被整合到增長(zhǎng)的DM鏈中時(shí)，淬滅的程度用于鑒定每一dNTP。此優(yōu)選的檢測(cè)方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是來(lái)自單個(gè)源的熒光發(fā)射使背景噪音可忽略不計(jì)。盡管較不優(yōu)選，如果只有二或三種合適的淬滅劑被鑒定，然后4個(gè)dNTP中有2或3個(gè)被標(biāo)記，每次采用標(biāo)記的dNTP的不同的對(duì)進(jìn)行一系列的聚合反應(yīng)。組合這些反應(yīng)結(jié)果，得到所述DNA分子的完整序列。標(biāo)記ra<聚合酶和dNTP的位點(diǎn)選擇盡管本發(fā)明可以結(jié)合具有可檢測(cè)性質(zhì)的任何類(lèi)型的原子和/或分子標(biāo)記，但仍然描述了采用優(yōu)選類(lèi)型的標(biāo)記，即熒光標(biāo)記進(jìn)行位點(diǎn)選擇和標(biāo)記結(jié)合的方法。聚合酶和/或dNTP的熒光標(biāo)記設(shè)計(jì)連接到聚合酶或dNTP的熒光探針或淬滅劑，以最小化對(duì)DNA聚合劑化學(xué)標(biāo)記聚合酶和dNTP。通常，通過(guò)用編碼更易與分子標(biāo)記反應(yīng)的氨基酸，如半胱氨酸(通過(guò)誘變)，的密碼子來(lái)取代編碼聚合酶的DNA序列中所選的氨基酸的密碼子來(lái)標(biāo)記聚合酶。一旦制備了突變的DM序列，所述突變體插入到大腸桿菌中用于表達(dá)。表達(dá)后，分離并純化突變體聚合酶。然后檢測(cè)純化的突變體聚合酶的聚合酶活性?；钚源_認(rèn)后，突變體聚合酶與摩爾稍過(guò)量的所需標(biāo)記反應(yīng)以得到靠近化學(xué)計(jì)量的標(biāo)記。備選地，所述聚合酶能用過(guò)量的標(biāo)記處理并根據(jù)時(shí)間函數(shù)進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)?shù)玫浇咏瘜W(xué)計(jì)量的標(biāo)記時(shí)，標(biāo)記反應(yīng)停止。如果突變體聚合酶包括幾個(gè)位點(diǎn)，所述位點(diǎn)包括能用所需分子標(biāo)記進(jìn)4行標(biāo)記的靶殘基，那么標(biāo)記反應(yīng)也能在特定的反應(yīng)條件下進(jìn)行，如采用保護(hù)基團(tuán)或竟?fàn)幮砸种苿┖涂赡娴淖钄嗷?，其隨后被除去。如果突變體聚合酶中耙氨基酸殘基靠近活性dNTP結(jié)合位點(diǎn)，首先加入飽和水平的保護(hù)基團(tuán)或竟?fàn)幮砸种苿┮员Ｗo(hù)靶殘基，隨后加入可逆阻斷基團(tuán)以使非靶殘基失活。然后從靶殘基除去保護(hù)基團(tuán)或竟?fàn)幮砸种苿盟铇?biāo)記處理突變體聚合酶以標(biāo)記靶殘基。最后，從突變體聚合酶中的非靶殘基化學(xué)除去阻斷基團(tuán)，由于靶殘基上標(biāo)記基本上完全分離得到標(biāo)記的突變體聚合酶。備選地，如果靶殘基不靠近活性位點(diǎn)，所述聚合酶可用阻斷基團(tuán)處理以使非靶殘基失活。除去未反應(yīng)的阻斷基團(tuán)后，用標(biāo)記靶殘基的所需標(biāo)記處理突變體聚合酶。最后，從突變體聚合酶中非靶殘基化學(xué)除去阻斷基團(tuán)，以得到標(biāo)記的突變體聚合酶。選擇ra(聚合酶的氨基酸位點(diǎn)發(fā)明人已鑒定了7^《聚合酶中的某些氨基酸，所述氨基酸有可能經(jīng)受得住突變和隨后的標(biāo)記結(jié)合如熒光標(biāo)記的連接。而許多位點(diǎn)能進(jìn)行半胱氨酸取代和標(biāo)記結(jié)合，采用下列標(biāo)準(zhǔn)鑒定聚合酶中優(yōu)選的位點(diǎn)(l)它們不與其它蛋白接觸；(2)它們不改變聚合酶的構(gòu)象或折疊；和(3)它們不涉及蛋白功能。采用突變研究的組合完成挑選，包括序列分析數(shù)據(jù)，計(jì)算機(jī)研究包括分子?？?moleculardocking)數(shù)據(jù)和分析聚合酶活性和忠實(shí)度。位點(diǎn)突變后，采用計(jì)算機(jī)研究來(lái)精制分子模型并幫助鑒定其它潛在的突變位點(diǎn)。間4妄地，通過(guò)采用進(jìn)化追蹤方法(evolutionarytracemethod)才艮據(jù)進(jìn)化時(shí)間和蛋白功能之間的關(guān)系研究序列中的改變，鑒定出對(duì)功能并不重要的蛋白表面的區(qū)，參見(jiàn)，例如Lichtargeetal.,1996。在此方法中，通過(guò)將進(jìn)化突變和結(jié)構(gòu)同源物對(duì)比，發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)或功能重要的氨基酸殘基。所述聚合酶是進(jìn)行此類(lèi)研究的理想系統(tǒng)，因?yàn)橛性S多晶體和共晶體結(jié)構(gòu)和許多可得的序列。本發(fā)明人突變/標(biāo)記位點(diǎn)的選擇排除了結(jié)構(gòu)/功能重要的區(qū)域。此外，對(duì)不同構(gòu)象狀態(tài)的可得的聚合酶晶體結(jié)構(gòu)的視覺(jué)觀察和覆蓋，對(duì)鑒定靠近dNTP結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸位點(diǎn)有進(jìn)一步的幫助。所選氨基酸位點(diǎn)中的一些位點(diǎn)定位于稍微偏內(nèi)部，優(yōu)選環(huán)繞聚合酶中的活性區(qū)，其在堿基整合中經(jīng)歷改變，如dNTP結(jié)合區(qū)，堿基整合區(qū)，焦磷酸釋放區(qū)，等。優(yōu)選這些內(nèi)部位點(diǎn)，是因?yàn)檫@些位點(diǎn)上的標(biāo)記在檢測(cè)過(guò)程中顯示降低的背景信號(hào)，即當(dāng)使用熒光標(biāo)記的dNTP時(shí)，減少了聚合酶和非特異性連接標(biāo)記的dNTP之間的相互作用。一旦制備了標(biāo)記的突變體聚合酶，且最小化了全溶劑環(huán)境中的能量，由于突變和/或標(biāo)記對(duì)聚合酶結(jié)構(gòu)的影響的估算可提供有關(guān)相對(duì)的標(biāo)記定位和分隔的信息。然后此數(shù)據(jù)用于^r測(cè)前估計(jì)FRET效率。當(dāng)然，如果dNTP用猝滅劑標(biāo)記，這些考慮是不重要的。本發(fā)明的另一方面涉及構(gòu)建對(duì)于用于標(biāo)記dNTP和聚合酶的原子和/分子才示i己d口突光才示i己的分子力學(xué)力場(chǎng)參凄t(molecularmechanicsforcefieldparameters),和對(duì)于聚合酶上熒光標(biāo)記的氨基酸和/或dNTP的參數(shù)。力場(chǎng)參數(shù)采用量子力學(xué)研究以獲得相關(guān)的分子內(nèi)構(gòu)象的局部電荷分布和能量(即對(duì)于二面角限定)，所述構(gòu)象得自已知的聚合酶晶體結(jié)構(gòu)。采用靜電模型評(píng)估每一可離子化殘基的離子化狀態(tài)，其中采用UHBD程序處理蛋白為低介電區(qū)，溶劑為高電介質(zhì)。參見(jiàn)例如，Antosiewiczetal.，1994;BriggsandAntosiewicz,1999;Mad眼etal.,1995。通過(guò)對(duì)每一殘基解Poisson-Boltzmann方程計(jì)算每一可離子化殘基的離子化的靜電自由能。調(diào)整這些離子化的自由能以將偶合的滴定方式(titrationbehavior)考慮在內(nèi)，所述方式導(dǎo)致一組前后一致的(self-consisitent)預(yù)計(jì)的離子化狀態(tài)。然后重新計(jì)算這些預(yù)計(jì)的離子化自由能。重新計(jì)算這些預(yù)計(jì)的離子化自由能以考慮到由于dNTP結(jié)合引起的離子化的改變。對(duì)未預(yù)期的離子化狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)研究，產(chǎn)生蛋白中每一殘基的一組局部電荷，即，根據(jù)結(jié)合標(biāo)記或氨基酸取代的類(lèi)型，蛋白中的每一可離子化的殘基都能具有不同的帶電狀態(tài)。為進(jìn)一步有助于氨基酸位點(diǎn)選擇，主要采用UHBD程序通過(guò)溶劑，和任選通過(guò)溶解的離子(即，離子強(qiáng)度)歸選，從Z3《聚合酶/DNA復(fù)合物的分子表面性質(zhì)得到靜電勢(shì)圖。所述圖提供了有關(guān)dNTP結(jié)合位置和在建議的突變/標(biāo)記位點(diǎn)處的靜電環(huán)境的指導(dǎo)。設(shè)計(jì)產(chǎn)生的分子模型，考慮到新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行持續(xù)的改進(jìn)，從而改進(jìn)分子模型，改進(jìn)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算和改進(jìn)力場(chǎng)參數(shù)，以使所述模型能較好地預(yù)測(cè)系統(tǒng)行為以改進(jìn)標(biāo)記化學(xué)和/或標(biāo)記定位，預(yù)計(jì)新的聚合酶突變體，堿基整合速率和聚合酶忠實(shí)度。分子?？磕M用于預(yù)計(jì)在聚合酶結(jié)合袋(bindingpocket)內(nèi)，天然和熒光標(biāo)記的dNTP的?？糠较?。最佳?？繕?gòu)型是在明確的溶劑環(huán)境存在下能量最小化的。與所選進(jìn)行標(biāo)記的聚合酶中氨基酸位點(diǎn)相結(jié)合，?？垦芯坑糜诜治鰳?biāo)記之間如何相互作用，以及預(yù)計(jì)每一選擇的氨基酸位點(diǎn)的FRET效率。除靜電計(jì)算外，所有的停靠，量子力學(xué)，分子力學(xué)，和分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算都是和將是采用HyperChem(v6.O)計(jì)算機(jī)程序計(jì)算。HyperChem軟件在PC中運(yùn)行于Windows操作系統(tǒng)下。多個(gè)用于數(shù)據(jù)分析或用于FRET預(yù)測(cè)(如下所述)的計(jì)算程序是和將是在采用Linux操作系統(tǒng)和運(yùn)4t于Linux下的UHBD程序在PC上完成的。聚合酶結(jié)構(gòu)分析對(duì)于DNA聚合酶I(DNApolI)(來(lái)源于大腸桿菌，水生棲熱菌(7:a^;a"-cz^),p耆^y旨肪芽孑包斥干菌(及sfearof力ei7ffo;7力//〃》，T7p菹菌體)，和人pol(3所得到的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明(復(fù)制型)聚合酶具有共同的力學(xué)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。聚合酶保持'開(kāi)放式，(非有效的)構(gòu)象和'閉合，(有效的)構(gòu)象的使Ts。DNA所述這些結(jié)構(gòu)對(duì)于鑒定在堿基整合中發(fā)生變化的聚合酶的區(qū)域有重要意義。添加核苷酸到聚合酶/1物/模板復(fù)合物中是從其從開(kāi)放構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)殚]合構(gòu)象的原因。這些結(jié)構(gòu)的對(duì)比提供了有關(guān)在核苷酸整合中聚合酶內(nèi)部發(fā)生的構(gòu)象變化的信息。具體地，在閉合構(gòu)象中，手指狀結(jié)構(gòu)域(fingerdomain)的頂端向內(nèi)旋轉(zhuǎn)46,從而定位dNTP于聚合酶活性位點(diǎn)中的引物鏈的3，末端。此末端堿基對(duì)的幾何形狀精確相符于其結(jié)合袋的形狀。正確，互補(bǔ)的堿基的結(jié)合有利于閉合構(gòu)象的形成，而錯(cuò)誤的dNTP結(jié)合不誘發(fā)此構(gòu)象變化。當(dāng)所述酶處于閉合構(gòu)象時(shí)，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。參考圖2,7a《DNApolI的大片段(KLen7^l)開(kāi)放和閉合的三元復(fù)合體(ternarycomplex)形式以它們的Ca繪圖的疊印形式顯示。所述三元復(fù)合體包括酶，ddCTP和引物/模板雙螺旋DM。開(kāi)放式結(jié)構(gòu)顯示為洋紅色，閉合結(jié)構(gòu)顯示為黃色。蛋白左上方部分外觀雜亂顯示'手指，區(qū)處于開(kāi)放和閉合構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)中。從包含引物和結(jié)合的ddGTP的ra《聚合酶的兩種不同晶體結(jié)構(gòu)，采用程序確定氨基酸位置在聚合酶的開(kāi)放和閉合構(gòu)象中相對(duì)于結(jié)合的ddGTP的Y磷酸的變化，鑒定突變和標(biāo)記位置發(fā)生最大變化的20個(gè)氨基酸位點(diǎn)。對(duì)頁(yè)于每一氨基酸計(jì)算它們的oc和P碳原子與結(jié)合的ddGTP的Y磷酸基之間的距離。表i,n，in和iv給出了對(duì)于r^聚合酶得自?xún)蓚€(gè)不同組的結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)的列表。表I:相對(duì)于殘基的a碳在聚合酶的開(kāi)放形式到閉合形式之間的2ktq數(shù)據(jù)經(jīng)歷最大位置變化的20個(gè)氨基酸位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表II:相對(duì)于殘基的P碳在聚合酶的開(kāi)放形式到閉合形式之間的2ktq數(shù)據(jù)經(jīng)歷最大位置變化的20個(gè)氨基酸位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表III:相對(duì)于殘基的a碳在聚合酶的開(kāi)放形式到閉合形式之間的3ktq數(shù)據(jù)經(jīng)歷最大位置變化的20個(gè)氨基酸位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表IV:相對(duì)于殘基的(3碳在聚合酶的開(kāi)放形式到閉合形式之間的3ktq數(shù)據(jù)經(jīng)歷最大位置變化的20個(gè)氨基酸位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>上面所列氨基酸代表優(yōu)選的氨基酸位點(diǎn)用于半胱氨酸取代和隨后的標(biāo)記連接，因?yàn)檫@些位點(diǎn)代表7^聚合酶中的位點(diǎn)，在堿基整合中經(jīng)歷顯著的變化。為進(jìn)一步改進(jìn)氨基酸位點(diǎn)的選擇，對(duì)處于開(kāi)放和閉合構(gòu)象端(exfreme)的聚合酶，觀察那些鑒定的氨基酸位點(diǎn)，以使最后挑選的氨基酸位點(diǎn)，當(dāng)被修飾以攜帶熒光標(biāo)記采用FRET方法進(jìn)行分析時(shí)，最大化信號(hào)和最小化背景噪音。預(yù)計(jì)不會(huì)顯著影響蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)或活性的氨基酸改變組成了在聚合酶中的一組優(yōu)選的氨基酸位點(diǎn)以進(jìn)行誘變和熒光修飾，這樣，所述標(biāo)記可以被遮蔽，從而免與游離的dNTP發(fā)生相互作用。下列3組說(shuō)明本發(fā)明所用方法以從以上所列氨基酸列表中估選氨基酸位點(diǎn)，所述列表中的氨基酸在聚合酶從開(kāi)放形式轉(zhuǎn)化為閉合形式時(shí)在相對(duì)于結(jié)合的ddGTP的位置經(jīng)歷最大改變。參照?qǐng)D3A-C,顯示了3ktq(閉合的'黑，)和ltau(開(kāi)放的'淺藍(lán)，)之間的重疊，W(DNA聚合酶I的大片段。參看圖3A，來(lái)自3ktq的結(jié)合的DNA顯示為紅色而與3ktq結(jié)合的ddCTP是綠色。當(dāng)聚合酶從開(kāi)放(1tau)變?yōu)殚]合(3ktq)時(shí)，可發(fā)現(xiàn)3個(gè)殘基移動(dòng)最大，即Asp665,Pro656，和Leu657?；谶M(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，Pro656顯示具有加帽(capping)0-螺旋的作用。Leu657的側(cè)鏈非常接近閉合(3ktq)形式的蛋白的另一部分。添加較大的側(cè)鏈/標(biāo)記被認(rèn)為減小了聚合酶獲得完全閉合的，活性構(gòu)象的能力。相反地，Asp665在聚合酶閉合和開(kāi)放構(gòu)象中是完全溶劑暴露的(solventexposed)。參看圖3B，顯示了rs《聚合酶的3ktq(閉合)和ltau(開(kāi)放)構(gòu)象的重疊部分的活性位點(diǎn)的近視圖。開(kāi)放和閉合構(gòu)象之間的大的位移是明顯的。參看圖3C,3ktq(缺少DNA和ddCTP)的分子表面圖像的近^L圖。所述分子表面兩個(gè)區(qū)域被染色，對(duì)于Asp655為藍(lán)色，對(duì)于Leu657為綠色。在此圖像中，相信Leu657極接近所述蛋白的另一部分，因?yàn)樵谀粗附Y(jié)構(gòu)域中，分子表面的綠色部分被'連接，到手指區(qū)的部分。此圖顯示了聚合酶的此區(qū)域，觀察手掌區(qū)，右邊的手指區(qū)，左邊的拇指區(qū)。聚合酶變體的誘變和測(cè)序得到編碼7M(DNA聚合酶的基因并在大腸桿菌菌林DH1的pTTQ18中表達(dá)。參見(jiàn)，例如，Engelke等，1990。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)用于誘變的備選的氨基酸包括表I-IV中所列氨基酸，其改進(jìn)的列表或混合物或組合。本發(fā)明人采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子學(xué)方法分別在每一靶氨基酸位點(diǎn)引入半胱氨酸密碼子。參見(jiàn)Sambrooketal.,1989和Allenetal.，1998。/人表達(dá)突變體聚合酶的分離的克隆純化DNA，采用染料-終止子熒光化學(xué)測(cè)序，在ABIPRISM377自動(dòng)測(cè)序儀上4全測(cè)，采用GeneCodes，Inc.的Sequencher進(jìn)行分析。酶變體的表達(dá)和純化本發(fā)明人已經(jīng)證明ra《酶能整合y標(biāo)記的dNTP以合成延伸的DNA序列。下一步涉及構(gòu)建突變體，所述突變體能攜帶設(shè)計(jì)與dNTP上標(biāo)記相互反應(yīng)的標(biāo)記，和優(yōu)化聚合酶用于單分子測(cè)序。采用如上所述和實(shí)驗(yàn)部分的標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變構(gòu)建突變體。然后將所述構(gòu)建體插入到大腸桿菌，并表達(dá)。在充足的大腸桿菌生長(zhǎng)以進(jìn)行隨后的聚合酶分離和純化后，得到突變體&《聚合酵o盡管通過(guò)計(jì)算機(jī)控制基于反饋的非發(fā)酵基體的供應(yīng)來(lái)培養(yǎng)大腸桿菌到光密度超過(guò)100，但所得的3kg大腸桿菌細(xì)胞團(tuán)在聚合酶優(yōu)化過(guò)程中是過(guò)量的。當(dāng)然，制備優(yōu)化的聚合酶構(gòu)建體時(shí)，需要使用如此大的產(chǎn)量。在產(chǎn)生優(yōu)化的聚合酶過(guò)程中，從培養(yǎng)在10L供氧充分的采用得自Amgen的富集培養(yǎng)基的分批培養(yǎng)液中的大腸桿菌細(xì)胞團(tuán)塊得到突變體。為了快速篩選聚合酶突變體，在2L帶檔板的搖瓶中培養(yǎng)大腸桿菌來(lái)制備突變體。用6L的制備式離心機(jī)收獲細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)French壓碎器裂解，離心去除細(xì)胞碎片。為減少大腸桿菌核酸序列的干擾，優(yōu)選也除去其它核酸。采用核酸酶(隨后熱變性核酸酶)或，優(yōu)選采用如Murphyetal.,NatureBiotechnology17,822，1999，所述的基于壓縮試劑的核酸沉淀改進(jìn)方法。因?yàn)閞s聚合酶的熱穩(wěn)定性明顯大于一般的大腸桿菌蛋白，從污染&《聚合酶的蛋白中純化7^《聚合酶或其變體可通過(guò)對(duì)粗聚合酶在75。C下60分鐘的熱處理來(lái)完成，這降低了大腸桿菌蛋白污染約100倍。此大腸桿菌蛋白污染的降低以及高的初始表達(dá)水平，在方便的起始步驟產(chǎn)生幾乎純的"《聚合酶或其變體；當(dāng)然突變體聚合酶仍保持天然聚合酶的熱穩(wěn)定性。對(duì)于常規(guī)測(cè)序和PCR篩選，通常需要進(jìn)一步的有限純化。單步離子交換，一4i在pH8.0的QSepharose上，通常足以得到對(duì)這些實(shí)l全足夠純的產(chǎn)品。優(yōu)選的，也進(jìn)行第二步純化步驟，以確保污染不會(huì)模糊隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二步純化涉及SDS-PAGE和CD-監(jiān)測(cè)的解鏈實(shí)驗(yàn)。dNTP位點(diǎn)選擇以接受熒光標(biāo)記采用AutoDock計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行分子?？磕M以預(yù)測(cè)天然和熒光標(biāo)記的dNTP的?？糠较?Morrisetal.，1998;Soaresetal.，1999)。在停靠模擬中利用AutoDock計(jì)算機(jī)程序中釆用的有效LamarckianGenetic算法可允許存在構(gòu)象的適應(yīng)性。也進(jìn)行一亞組蛋白側(cè)鏈的移動(dòng)以在其?？繒r(shí)容納dNTP。那么，最好的?？繕?gòu)型是在溶劑環(huán)境下能量最小化的。得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可鑒定聚合酶活性中心的氨基酸，這些氨基酸與催化有關(guān)，并與模板/引物DNA鏈或要整合的dNTP接觸。使用計(jì)算機(jī)輔助化學(xué)模型如?？垦芯胯b定和支持dNTP的位點(diǎn)，所述位點(diǎn)可被標(biāo)記并預(yù)計(jì)在特異性位點(diǎn)攜帶特異性標(biāo)記的dNTP的FRET效率。通常，通過(guò)將dNTP和所需標(biāo)記反應(yīng)或通過(guò)將前體如焦-粦酸基或-威基與所需標(biāo)記反應(yīng)，然后完成dNTP的合成來(lái)標(biāo)記dNTP。用于DNA聚合酶反應(yīng)的核苷酸的化學(xué)修飾本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了合成方法用于修飾熒光團(tuán)和熒光能量傳遞化合物使之對(duì)于不同的信號(hào)檢測(cè)具有不同的光學(xué)性質(zhì)，對(duì)于核苷酸/核苷合成子，在堿基，糖或磷酸骨架位置的加入修飾，并產(chǎn)生在核堿基(nucleobases)，糖或磷酸骨架上包含取代的四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)的互補(bǔ)組。Y-磷酸修飾的dNTP的合成本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天然7s《聚合酶能夠聚合磷酸修飾的dNTP或ddNTP。因?yàn)閺?fù)制的DNA不包含非天然堿基，優(yōu)選在P和/或y磷酸基標(biāo)記dNTP或ddNTP，這樣聚合酶活性不受顯著不良影響，可產(chǎn)生長(zhǎng)DNA鏈。本發(fā)明人合成了y-ANS-磷酸dNTP,其中所述ANS通過(guò)磷酰胺鍵連接到磷酸。盡管這些標(biāo)記的dNTP容易通過(guò)天然7^《聚合酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶整合，但ANS只是多種可以通過(guò)P和/或Y磷酸基連接的標(biāo)記中的一種。本發(fā)明采用標(biāo)記的dNTP或ddNTP與聚合酶聯(lián)合進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。通過(guò)共價(jià)鍵或親合連接在磷酸位置(a,|3和/或Y)和/或其它核普酸位置修飾dNTP。設(shè)計(jì)標(biāo)記使記其在下一單體加入序列前乂人石威基除去。除去標(biāo)記的一個(gè)方法是將標(biāo)記放置于Y和/或P磷酸上。當(dāng)焦磷酸從增長(zhǎng)的DNA序列解離時(shí)，所述標(biāo)記被除去。另一方法是通過(guò)可分裂鍵將標(biāo)記結(jié)合到單體上的一個(gè)位置。在整合之后和在下一單體整合之前除去所述標(biāo)記，采用光，聚合介質(zhì)中的化學(xué)^t裂解試劑，和/或熱分裂可分裂^t。下面給出一個(gè)對(duì)于合成其它Y-標(biāo)記的dNTP的通用合成路線(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>其中FR是熒光標(biāo)記，L是連接基團(tuán)，X才艮據(jù)反應(yīng)介質(zhì)的pH值是H或反荷離子(counterioin),Z是能與焦磷酸的羥基反應(yīng)的集團(tuán)，Z，是與dNMP反應(yīng)后的基團(tuán)。優(yōu)選地，Z是C1，Br,I,OH，SH，NH2,NHR,C02H,C02R，SiOH,SiOR,GeOH,GeOR，或類(lèi)似的反應(yīng)功能團(tuán)或離去基團(tuán)，其中R是烷基，芳基，芳烷基，烷芳基,其囟化類(lèi)似物或雜原子類(lèi)似物，Z，是O,NH,NR,C02,SiO，GeO,其中R是烷基，芳基，芳烷基，烷芳基,其卣化類(lèi)似物或雜原子類(lèi)似物。所述合成涉及在DCC和二氯曱烷中將Z為末端的熒光標(biāo)記，F(xiàn)R-L-Z與焦磷酸基，P206X3H反應(yīng)，以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的焦磷酸。在制備熒光標(biāo)記的焦磷酸后，其與嗎啉為末端的dNMP在酸性THF中反應(yīng)以產(chǎn)生在其Y畫(huà)磷酸上具有熒光標(biāo)記的dNTP。因?yàn)樽罱K的反應(yīng)帶有熒光標(biāo)記，并要大于起始物質(zhì)，所以可直接進(jìn)行從未修飾的起始物質(zhì)和標(biāo)記的焦磷酸的分離。下面表示FR-L基的普遍合成方法<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>首先在二異丙胺存在下熒光素與嘧啶中的異丁酰酐(isobutyryl素。所述羥基保護(hù)的熒光素然后與DDC和二氯曱烷中的N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，隨后加入l-羥基-6-氨基己烷以產(chǎn)生羥基為末端的FR-L基。此基團(tuán)然后與焦磷酸反應(yīng)以在它們的Y-磷酸基標(biāo)記dNTP或標(biāo)記氨基酸。參見(jiàn)，例如，Ward等,1987;Engelhardt等，1993;Little等，2002;Hobbs,1991。通過(guò)對(duì)每一dNTP使用不同的熒光標(biāo)記，可設(shè)計(jì)標(biāo)記使每一標(biāo)記發(fā)射不同的發(fā)射光譜。可通過(guò)產(chǎn)生具有非重疊發(fā)射頻率(non-overlappingemissionfrequencies)-多色(multicolor)的標(biāo)記來(lái)區(qū)分發(fā)射光i普，或者每一標(biāo)記可具有非重疊發(fā)射光譜特點(diǎn)，如獨(dú)特的發(fā)射波段，獨(dú)特的吸收波段和/或獨(dú)特的強(qiáng)度特征。對(duì)每一dNTP采用不同的標(biāo)記的系統(tǒng)改進(jìn)了與這樣堿基的算法有關(guān)的置信度值。上述熒光素的合成方案也適于其它染料，如四氯熒光素(J0E),或N，N，N，，N，-四曱基-6-羧基若丹明(TAMRA)。一般地，在堿性水溶液和碳化二亞胺，如DEC中進(jìn)行Y-磷酸標(biāo)記反應(yīng)。其它焚光團(tuán)分子和dNTP可被類(lèi)似地修飾。堿基標(biāo)記的dNTP的合成盡管優(yōu)選在13和/或Y磷酸標(biāo)記dNTP,但也可在^成基和/或糖部分標(biāo)記dNTP同時(shí)保持它們的聚合酶反應(yīng)活性。優(yōu)先挑選用于修飾的位點(diǎn)不千擾Watson-Crick堿基配對(duì)。下面表示用于堿基修飾的普遍方案。采用熒光標(biāo)記酶進(jìn)行聚合酶活性分析聚合酶發(fā)展過(guò)程中監(jiān)測(cè)聚合酶變體的活性。在備選氨基酸突變?yōu)榘腚装彼岷蜔晒鈽?biāo)記半胱氨酸之后檢測(cè)聚合酶活性。用于監(jiān)測(cè)天然聚合酶整合熒光標(biāo)記的dNTP的能力的檢測(cè)也可用于篩選聚合酶變體。由于&聚合酶變體改變了氨基酸序列，所述檢測(cè)提供了突變體特征數(shù)據(jù)，如熱穩(wěn)定性，忠實(shí)度，聚合速率，相對(duì)于天然堿基，經(jīng)修飾的堿基的親和性。在與用于分析通過(guò)天然7^聚合酶將熒光標(biāo)記的dNTP整合到DM聚合物的類(lèi)似的條件下進(jìn)行突變體r^聚合酶活性^r測(cè)。為測(cè)定突變體"《聚合酶活性，在聚合酶反應(yīng)緩沖液中與5，-"P末端標(biāo)記的引物/單鏈模板雙螺旋和適當(dāng)標(biāo)記的dNTP—起孵育純化的突變體7s《聚合酶。在ABI377DNA測(cè)序儀(用于熒光標(biāo)記的堿基)，F(xiàn)ujiBAS1000磷光成像系統(tǒng)(phosphorimagingsystem),或其它合適或類(lèi)4以的^企測(cè)器或^:觀'J系纟充上，通過(guò)檢測(cè)與延伸的引物有關(guān)的焚光相對(duì)量監(jiān)測(cè)聚合酶的整合焚光標(biāo)記的dNTP的能力。此檢測(cè)用于確認(rèn)突變體聚合酶整合了標(biāo)記的dNTP并確認(rèn)堿基整合中已獲得了熒光的特征。這些檢測(cè)使用末端標(biāo)記引物(end-labeledprimer),熒光標(biāo)記的dNTP和無(wú)熒光標(biāo)記的合適的;威基。然后所述產(chǎn)物進(jìn)行按大小分離并用于延伸分析。按照需要，所述反應(yīng)在固定溫度反應(yīng)條件或熱循環(huán)下進(jìn)行。引物延伸分析采用與通過(guò)焚光標(biāo)記的DNA聚合酶檢測(cè)單個(gè)堿基整合的類(lèi)似方法檢測(cè)W(DNA聚合酶整合Y-磷酸dNTP變體的能力。參見(jiàn)例如Furey等，1998。這些實(shí)驗(yàn)表明不能推理帶有熒光標(biāo)記的聚合酶降低了聚合活性。本發(fā)明人已經(jīng)表明天然A《聚合酶整合Y標(biāo)記的dNTP,單獨(dú)地或共同地產(chǎn)生長(zhǎng)DNA鏈。為測(cè)定聚合酶活性，在4尋自PromegaCorporationofMadison,Wisconsin的聚合酶反應(yīng)緩沖液中與5，-32P或熒光末端標(biāo)記的引物(TOP)/單鏈模板(B0T-T)雙螺旋和表V所示合適的dNTP—起孵育聚合酶。按照需要，反應(yīng)在固定溫度反應(yīng)條件或熱循環(huán)下進(jìn)行。所述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行按大小分離并采用磷光成像或熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定量。通過(guò)與其天然對(duì)應(yīng)物(counterpart)對(duì)比確定每一標(biāo)記的dNTP整合的相對(duì)效率。表V引物鏈頂部5，GGTACTAAGCGGCCGCATG3'57模板鏈B0T-T3'CCATGATTCGCCGGCGTACTC5'BOT-C3'CCATGATTCGCCGGCGTACCC5'BOT-G3'CCATGATTCGCCGGCGTACGC5'BOT-A3'CCATGATTCGCCGGCGTACAC5'BOT-3T3'CCATGATTCGCCGGCGTACTTTC5'BOT-SauYCCATGATTCGCCGGCGTACCTAG5'表V中，'TOP，表示檢測(cè)DNA雙螺旋的引物鏈。模板鏈的變體由'BOT，代表。DNA模板的相關(guān)特點(diǎn)在連字號(hào)后給出。例如，BOT-T，BOT-C,BOT-G,BOT-A用于分別對(duì)dA，dG,dC，和dT的多個(gè)核普酸或核苦酸變體監(jiān)測(cè)聚合酶整合效率和忠實(shí)度。在徹底純化標(biāo)記的dNTP之前，采用'BOT-Sau，才莫板進(jìn)行初步分析以確保聚合酶不被與標(biāo)記的dNTP—起共純化的化學(xué)物質(zhì)抑制。設(shè)計(jì)'BOT-Sau，模板以監(jiān)測(cè)標(biāo)記的dATP之前天然dGTP的整合(即，聚合酶活性的陽(yáng)性對(duì)照)。對(duì)有希望的標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行更進(jìn)一步的純化。類(lèi)似地，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定標(biāo)記的dNTP整合后聚合酶是否繼續(xù)延伸，實(shí)驗(yàn)采用相同的末端標(biāo)記的'TOP'引物，合適的'BOT，引物，熒光標(biāo)記的dNTP和標(biāo)記的核苷酸的適當(dāng)3，堿基，單獨(dú)或一起進(jìn)行。接著按大小分離產(chǎn)物并分析確定相對(duì)的延伸效率。分析y-磷酸標(biāo)記的核苷酸整合的忠實(shí)度a(DNA聚合酶缺少3，到5，外切核酸酶活性(校對(duì)活性)。如果在單個(gè)分子DM測(cè)序中所用聚合酶具有3，到5，外切核酸酶活性，所述聚合酶將能添加另一堿基以取代由于校對(duì)活性被除去的堿基。此新添加的堿基能產(chǎn)生特征熒光信號(hào)證實(shí)模板中加入的堿基的整合，產(chǎn)生錯(cuò)誤鑒定的DNA序列，這樣會(huì)使本發(fā)明的單分子測(cè)序系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題。如果修飾的dNTP的整合錯(cuò)誤率超過(guò)100中約1個(gè)錯(cuò)誤的閾值水平，測(cè)序反應(yīng)優(yōu)選并列進(jìn)行，采用產(chǎn)生序列信息所需的優(yōu)選數(shù)目，所述信息對(duì)每一由錯(cuò)誤率確定的堿基配對(duì)具有高忠實(shí)度。較大的錯(cuò)誤率需要更多的平行試驗(yàn)，而較小的錯(cuò)謨率需要較少的平行試驗(yàn)。實(shí)際上，如果錯(cuò)誤率足夠低，通常小于1000個(gè)整合堿基中l(wèi)個(gè)錯(cuò)誤，優(yōu)選5000中l(wèi)個(gè)錯(cuò)誤，特別是10000中1個(gè)錯(cuò)誤，那么不需要平行試驗(yàn)。插入或缺失潛在的是更嚴(yán)重的錯(cuò)誤類(lèi)型，要保證每個(gè)樣品最少有3個(gè)重復(fù)。如果進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)，不能確定哪一個(gè)是正確的。.因此，此系統(tǒng)產(chǎn)生高質(zhì)量數(shù)據(jù)需要3個(gè)反應(yīng)。BOT變體模板用于表征由表V所示由工程化聚合酶整合每一y標(biāo)記的dNTP的正確度。寡核苷酸用作DNA模板，每一個(gè)只在整合的第一堿基不同。采用這些模板的試驗(yàn)用于測(cè)定每一堿基的相對(duì)整合效率，以及聚合酶區(qū)分標(biāo)記的dNTP的能力。開(kāi)始，采用聚合酶變體的實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)簡(jiǎn)單的序列，單鏈醒模板進(jìn)行。從UniversityofHouston的Dr.Hardin'slaboratory獲得大量具有序列特征的模板，包括超過(guò)300個(gè)純化模板。例如一系列包含長(zhǎng)度可變的polyA或polyT序列。如果需要，構(gòu)建額外的限定的序列模板，利于進(jìn)行選擇堿基的算法。相對(duì)熒光強(qiáng)度分析采用SPEX212儀器或類(lèi)似的儀器通過(guò)測(cè)量溶液焚光，得到聚合酶對(duì)標(biāo)記的dNTP作用的直接測(cè)定。此儀器成功地用于4企測(cè)來(lái)自ANS標(biāo)記的Y-磷酸dNTP的熒光信號(hào)，所述廠磷酸dNTP被毫微摩爾濃度的7^《聚合酶整合。所述SPEX212儀器包括450瓦氙弧光源，雙重發(fā)射并雙重激發(fā)的單色儀(dualemissionanddual'excitationmonochromators)，冷卻的(cooled)PMT(最近升級(jí)為同時(shí)T-模式各向異性數(shù)據(jù)收集(anisotropydatacollection)),Hi-Tech終止流動(dòng)附件(stopped-flowaccessory)。此儀器能檢測(cè)在標(biāo)記的焦磷酸從ANS標(biāo)記的v-磷酸dNTP釋放時(shí)熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)和/或吸收光語(yǔ)的變化，如對(duì)由r^和RNA聚合酶和蛇毒磷酸二酯酶釋放的ANS焦f奔酸所-證實(shí)的。通過(guò)在聚合酶(對(duì)照沒(méi)有酶)和DM引物/模板[poly(dA).poly(dT)〗(對(duì)照沒(méi)有引物/模板DM)存在下，合適的緩沖液(即得自Promega公司的緩沖液)中孵育Y磷酸標(biāo)記的dATP或TTP(對(duì)照未修飾的dATP和TTP),已經(jīng)或正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)所述聚合酶整合標(biāo)記的dNTP時(shí)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度和/或頻率，吸收和/或發(fā)射光譜，以及DM聚合體濃度的變化。實(shí)驗(yàn)試管與對(duì)照試管相對(duì)比時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)時(shí)間和/或溫度的函數(shù)的測(cè)量值的變化可以明確確定聚合酶是否整合Y磷酸標(biāo)記的dNTP?？苫谶@些測(cè)量值的變化對(duì)每一標(biāo)記的dNTP進(jìn)行激發(fā)和熒光發(fā)射的優(yōu)化。單個(gè)分子檢測(cè)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)優(yōu)選采用顯微鏡方法進(jìn)行單個(gè)分子熒光的檢測(cè)。在本發(fā)明中可以使用共焦掃描顯微鏡(Confocal-scanningmicroscopy),但優(yōu)選非掃描方法。由于聚合酶活性可用于檢測(cè)焚光信號(hào)的顯微鏡包括任何類(lèi)型的顯微鏡，優(yōu)選浸油(oi1-immersion)型顯微鏡。顯微鏡的優(yōu)選環(huán)境為振動(dòng)和溫度的變化受到控制的環(huán)境，并配有高靈敏度數(shù)字相機(jī)。雖然很多相機(jī)可用于記錄熒光j言號(hào)，4尤選CCD增強(qiáng)型，如PrincetonInstruments的iPentaMax。檢測(cè)方法涉及以足以誘發(fā)標(biāo)記熒光的波長(zhǎng)照射樣品，優(yōu)選以?xún)?nèi)反射形式(internal-reflectionformat)。如果熒光標(biāo)"i己是供體-受體對(duì)，那么激發(fā)頻率必須足以激發(fā)供體。盡管可使用任何類(lèi)型的光源，優(yōu)選的光源是激光。將同一樣品在多個(gè)熒光發(fā)射波長(zhǎng)下快速連續(xù)或同時(shí)成像經(jīng)常是有利的。對(duì)于同時(shí)多色成l象，優(yōu)選的圖4象分離器(imagespliUer)可以^f吏CCD同時(shí)捕獲所有的顏色圖像。備選地，可使用多個(gè)相機(jī)，每一個(gè)透過(guò)不同波長(zhǎng)特異性的光學(xué)濾鏡觀察樣品。標(biāo)記檢測(cè)實(shí)際上，當(dāng)然，有賴(lài)于許多變量，還包括所用特異性標(biāo)記，電，焚光，化學(xué)，物理，電化學(xué)，質(zhì)量同位素(massisotope),或其它性質(zhì)。利用研究級(jí)NikonDiaphotTMD倒置外熒光顯微鏡(invertedepifluorescencemicroscope)得到單個(gè)分子熒光成像，用激光照射和更靈敏的相機(jī)升級(jí)。而且，單個(gè)分子技術(shù)是已充分發(fā)展并商業(yè)化的技術(shù)。參見(jiàn)例如，Pecketal.，1989;Ambroseetal.,1994;Goodwinetal.,1997;Bro畫(huà)retal.，1999;CastroandWi11iams，1997;Davisetal.，1991;Davisetal.,1992;Goodwinetal.，1997;Kelleretal.，1996;Michaelisetal"2000;OrritandBernard,1990;0rritetal.,1994;Saueretal.,1999;Ungeretal.,1999;Zhuangetal.，2000。外熒光顯微鏡可采用488nra氬離子激光改型為損耗波(evanescent-wave)激發(fā)。本發(fā)明人曾在核酸雜交研究的檢測(cè)中使用此光照幾何學(xué)(illuminationgeometry)?，F(xiàn)有設(shè)置已用12-bit512x512pixelPrincetonInstrumentsI-PentaMAXgenerationIV增強(qiáng)型CCD相才幾吵,換現(xiàn)有的CCD相機(jī)進(jìn)行升級(jí)，其已成功用于大量類(lèi)似的單個(gè)分子應(yīng)用中。此相機(jī)在所用染料發(fā)射波長(zhǎng)的整個(gè)范圍中達(dá)到量子效率超過(guò)45%,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)此范圍。它們現(xiàn)存顯微鏡的垂直調(diào)正傾向于使振動(dòng)問(wèn)題最小化，且所述儀器現(xiàn)安裝在抗震桌上。優(yōu)選的高靈敏度成像系統(tǒng)基于Olympus1X70-S8F倒置外熒光顯微鏡。此系統(tǒng)整合了低背景組件并以大于每秒80幅的速率捕捉單個(gè)分子熒光圖像，其量子效率在熒光活性標(biāo)記的發(fā)射波長(zhǎng)范圍的60%-70%之間。在多個(gè)單個(gè)分子熒光成像中，優(yōu)選最小化數(shù)據(jù)采集通道內(nèi)多個(gè)熒光發(fā)射器的出現(xiàn)，如CCD或其它數(shù)字成像系統(tǒng)視野的單個(gè)像素或像素箱(pixel-bin)。有限數(shù)量的數(shù)據(jù)采集通道如像素在任何給定的數(shù)字成像裝置中可以獲得。隨機(jī)間隔，密集定位的熒光發(fā)射器通常產(chǎn)生增強(qiáng)的像素或像素箱的折射，它們被多重占據(jù)(multiply-occupied)，在數(shù)據(jù)分析中是成問(wèn)題的。當(dāng)視野中發(fā)射器的密度提高時(shí)，成問(wèn)題的數(shù)據(jù)通道也增加。而通過(guò)降低視野中發(fā)射器的密度可以降低視野內(nèi)不同數(shù)據(jù)采集區(qū)的多重占據(jù)，此發(fā)射器密度的降低可以提高數(shù)據(jù)采集通道或像素的折射，使根本看不到發(fā)射器，以此導(dǎo)致無(wú)效的數(shù)據(jù)采集。提高和/或最大化數(shù)據(jù)采集效率的優(yōu)選方法包括控制發(fā)射器(標(biāo)記的聚合酶分子)間隔。以幾種方法達(dá)到此間隔。首先，固定所述聚合酶在基體上以使只有單個(gè)聚合酶位于每一數(shù)據(jù)采集通道內(nèi)或成像系統(tǒng)視野內(nèi)的像素區(qū)。通過(guò)錨定捕獲試劑或連接基團(tuán)化學(xué)連接到所述基體完成固定。通過(guò)挑選天然的大捕獲試劑，通過(guò)將它們偶聯(lián)或?qū)⑺鼈兘Y(jié)合到增強(qiáng)它們空間體積的或靜電排斥體積的分子，或通過(guò)在選擇的最大化聚合分子間聚集(例如，低離子強(qiáng)度以最大化靜電排斥)的排斥條件下固定，可以間隔捕獲或連接試劑到有用的距離。備選地，所迷聚合酶可以與有關(guān)蛋白相聯(lián)，所述蛋白提高了聚合酶的空間體積或聚合系統(tǒng)的靜電排斥體積以使每一聚合分子間的聚集不能接近比成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)通道分辨尺寸更大的距離。采用單個(gè)分子檢測(cè)系統(tǒng)的聚合酶活性檢測(cè)這些檢測(cè)基本如本文所述對(duì)聚合酶活性的檢測(cè)進(jìn)行。如上所述，用于篩選目的的檢測(cè)聚合酶活性間的主要差異涉及固定聚合體的某部分，如聚合酶，耙DNA或引物連接蛋白到固體支持物上，以能觀察到單個(gè)的復(fù)制事件。可以有多種固定方法可供選擇，包括但不限于在納米管(nanotube)，或其它類(lèi)似的納米結(jié)構(gòu)之內(nèi)或之上和/或在多孔基質(zhì)之內(nèi)或之上，使一種分子聚合體共價(jià)和/或非共價(jià)連接到表面如有機(jī)表面，無(wú)機(jī)表面。可以設(shè)計(jì)這些固定化技術(shù)以提供特定區(qū)域用于所述可檢測(cè)性質(zhì)的檢測(cè)，如熒光，腿R,或類(lèi)似的，其中所述間隔足以減少或最小化具有多個(gè)發(fā)射器的數(shù)據(jù)采集通道。這樣，用于單分子測(cè)序的優(yōu)選數(shù)據(jù)采集方法是確保在成像裝置的視野內(nèi)所述熒光標(biāo)記的聚合酶被間隔開(kāi)，以使每一數(shù)據(jù)采集通道只能觀察到單個(gè)聚合酶的活性。分析單分子測(cè)序系統(tǒng)的熒光信號(hào)檢測(cè)器產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)代表1到4個(gè)依賴(lài)于時(shí)間的熒光數(shù)據(jù)流，其包含波長(zhǎng)和強(qiáng)度一個(gè)數(shù)據(jù)流代表被監(jiān)測(cè)的每一焚光標(biāo)記的堿基。采用PHRED計(jì)算機(jī)程序計(jì)算堿基身份和可靠性。如果需要，本發(fā)明人可以書(shū)寫(xiě)計(jì)算機(jī)程序以翻譯具有偏頗和重疊數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)流。在這樣的情況下進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)以根據(jù)與聚集片段的延伸序列有關(guān)的可靠性指數(shù)和困難性的變化給每一堿基身份指定置信界限?？煽啃灾笖?shù)代表與理想值相比在觀察到的熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度之間的適合度。所述信號(hào)分析的結(jié)果是具有相關(guān)確定性概率(associatedprobabilitiesofcertainty)^;纟戔'1"生DNA序歹'J。it匕夕卜，在需要時(shí)，所述數(shù)據(jù)儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中用于動(dòng)態(tài)查詢(xún)進(jìn)行鑒定和比較。6-10，完全匹配的序列或具有共同的使用者確定的同一性水平的序列。進(jìn)行多重試驗(yàn)，以使可按照與聚集片段的延伸序列有關(guān)的可靠性指數(shù)和困難性的變化給每一堿基身份指定置信界限。可靠性指數(shù)代表與理想值相比在觀察到的熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度之間的適合度。所述信號(hào)分析的結(jié)果是具有相關(guān)確定性沖既率的線(xiàn)性DNA序列。信息學(xué)單個(gè)分子檢測(cè)系統(tǒng)熒光信號(hào)的分析為了確定模板或耙分子的整個(gè)序列，采集數(shù)據(jù)，使來(lái)自部分信息的數(shù)據(jù)匯集成從多個(gè)聚合酶分子得到的序列的信息。用多個(gè)單個(gè)分子得到的結(jié)果聯(lián)系在一起的重要驅(qū)動(dòng)力量是經(jīng)過(guò)不確定的時(shí)間段從單個(gè)分子得到數(shù)據(jù)的可能性。在典型的光漂白(photobleaching)效率為2*104時(shí)，預(yù)計(jì)在永62久光漂白前，典型的染料分子經(jīng)歷50,000個(gè)激發(fā)/發(fā)射循環(huán)。采集自給定分子的數(shù)據(jù)可能由于系統(tǒng)間過(guò)渡為無(wú)光學(xué)活性(在目的時(shí)間范圍時(shí))的三重體(triplet)狀態(tài)而被中斷。因此即使采取了對(duì)光漂白的預(yù)防，得自任何給定分子的數(shù)據(jù)對(duì)于充分長(zhǎng)度的模板序列必然是片段性的數(shù)據(jù)，為了得到靶DNA分子的全部序列需對(duì)這些亞序列共同處理。此外，在某些例子中，進(jìn)行與參考對(duì)照的反應(yīng)，類(lèi)似于微陣列分析是有用的。參考序列和試驗(yàn)樣品之間的信號(hào)的對(duì)比用于鑒定各序列或序列組合物的不同和近似性。這樣的反應(yīng)用于DM聚合物的快速篩選以測(cè)定各聚合物之間的同源程度，以確定DNA聚合物的多態(tài)性，或用于鑒定病原體。實(shí)施例r^聚合酶的克隆和誘變克隆/人美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;Manassas，VA)獲得具有編碼DM聚合酶I(TaqpolI)的水生棲熱菌全長(zhǎng)序列的嗜菌體t宿主菌抹Charon35。從感染的大腸桿菌宿主的裂解物采用下面的DM寡核苷酸引物直接擴(kuò)增TaqpolI:TaqpolI正向5'-gcgaattcatgagggggatgctgcccctctttgagccc-3'TaqpolI反向5'-gcgaattcaccctccttggcggagcgccagtcctccc—3'每一合成的DNA寡核苷酸的劃線(xiàn)部分代表緊接TaqpolI基因前后的工程化EcoRI限制性位點(diǎn)。采用如上所述的反向引物以及下述的正向引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生具有基因N-末端缺失的額外的構(gòu)建體TaqpolI—A293—trimk5'-aatccatgggccctggaggaggccccctggcccccgc—3'下劃線(xiàn)部分對(duì)應(yīng)具有編碼丙氨酸第一密碼子的工程化NcoI限制性位點(diǎn)(ATG起始代表核糖體結(jié)合位點(diǎn)后的表達(dá)載體)。理想地，TaqpolI基因的全長(zhǎng)和截短的構(gòu)建體連接到單個(gè)的EcoRI位點(diǎn)(全長(zhǎng))和NcoI/EcoRI消化的pRSET-b表達(dá)載體。大腸桿菌菌株JM109用作工程化載體的所有體內(nèi)操縱的宿主。誘變一旦產(chǎn)生了合適的構(gòu)建體，在天然Taq聚合酶的優(yōu)選的氨基酸位點(diǎn)包括513-518,643,647，649和653-661引入個(gè)別的半胱氨酸突變。下列氨基酸殘基對(duì)應(yīng)氨基酸643到661之間的氨基酸，其中xxx代表在天然聚合酶中插入的氨基酸殘基。643—AlaxxxxxxxxxPhexxxValxxxxxxGluAlaValAspProLeuMetArgArgAla-661重疊引物用于通過(guò)基于PCR的誘變(采用PfuDM聚合酶)引入點(diǎn)突變到天然基因。互補(bǔ)正向和反向引物的每一個(gè)包含編碼所需突變的氨基酸殘基的密碼子。采用這些引物的PCR產(chǎn)生有裂口的(knicked),非曱基化的雙鏈質(zhì)粒，其包含所需突變。為除去模板DNA，用Dpnl限制酶處理整個(gè)PCR產(chǎn)物(在序列GATC中的曱基化鳥(niǎo)苷處進(jìn)行酶切)。模板質(zhì)粒消化后，轉(zhuǎn)化突變的質(zhì)粒并體內(nèi)連4矣。下列合成的DM寡核苷酸引物用于如下所述的誘變，其中小寫(xiě)字母表示在指示的位點(diǎn)已被修飾產(chǎn)生所需半胱氨酸取代。然后通過(guò)自動(dòng)測(cè)序篩選突變體。丙氨酸643到半胱氨酸的取代TaqPol廠Ala643Cys—fwd5'-CCACACGGAGACCtgCAGCTGGATGTTCGGCG-3'TaqPolIAla643Cys—rev5'-CGCCGAACATCCACGAGcaGGTCTCCGTGTGG-3'苯丙氨酸647到半胱氨酸的取代TaqPolI一Phe647Cys一fwd5'-CCGCCAGCTGGATGTgCGGCGTCCCCCGGGAGGCC-3'TaqPolI_Phe647Cys—rev5'-GGCCTCCCGGGGGACGCCGcACATCCACGTGGCGG-3'纈氨酸649到半胱氨酸的取代TaqPolI—Val649Cys一fwd5'-GCCAGCTGGATGTTCGGCtgCCCCCGGGAGGCCGTGTaqPolI-Val649Cys-rev5'-CCACGGCCTCCCGGGGGcaGCCGAACATCCAGCTGGC-3'谷氨酸652到半胱氨酸的取代TaqPol1—Glu652Cys隱fwd5'-GGCGTCCCCCGGtgcGCCGTGGACCCCCTGATGCGC-3'TaqPolI—Glu652Cys陽(yáng)rev5'-GCGCATCAGGGGGTCCACGGCgcaCCGGGGGACGCC-3'丙氨酸653到半胱氨酸的取代TaqPolI一Ala653Cys—fwd5'-GGCGTCCCCCGGGAGtgCGTGGACCCCCTGATGCGC-3'TaqPolI—Ala653Cys—rev5'-GCGCATCAGGGGGTCCACGcaCTCCCGGGGGACGCC-3'纈氨酸654到半胱氨酸的取代TaqPolI一Val654Cys一fwd5'-GTCCCCCGGGAGGCCtgtGACCCCCTGATGCGC-3'TaqPolI—Val654Cys—rev5'-GCGCATCAGGGGGTCacaGGCCTCCCGGGGGAC-3'天冬氨酸655到半胱氨酸的取代TaqPolI—D655C—fwd5'-CCCCGGGAGGCCGTGtgCCCCCTGATGCGCCGG-3'TaqPolI—D655C—rev5'-CCGGCGCATCAGGGGGcaCACGGCCTCCCGGGG-3'脯氨酸656到半胱氨酸的取代TaqPolI—pro656Cys—fwd-CGGGAGGCCGTGGACtgCCTGATGCGCCGGGCG-3'TaqPolI—Pro656Cys—rev5'-CGCCCGGCGCATCAGGcaGTCCACGGCCTCCCG-3'亮氨酸657到半胱氨酸的取代TaqPolI隱Leu657Cys—fwd5'-GCCGTGGACCCCtgcATGCGCCGGGCGTaqPolI丄eu657Cys—rev5'-GGCCGCCCGGCGCATgcaGGGGTCCACGGC-3'曱硫氨酸658到半胱氨酸的取代TaqPolI一Met658Cys一fwd5'-GCCGTGGACCCCCTGtgtCGCCGGGCGGCC-YTaqPolI一Met658Cys-rev5'-GGCCGCCCGGCGacaCAGGGGGTCCACGGC-精氨酸659到半胱氨酸的取代TaqPolI一Arg659Cys—fwd5，-GCCGTGGACCCCCTGATGtGCCGGGCGGCCAAGACC-3'TaqPolI—Arg659Cys—rev5，-GGTCTTGGCCGCCCGGCaCATCAGGGGGTCCACGGC-3'精氨酸66Q到半胱氨酸的取代TaqPolI一Arg660Cys一fwd5,-GACCCCCTGATGCGCtGcGCGGCCAAGACCATC-3'TaqPolI—Arg660Cys—rev5，-GATGGTCTTGGCCGCgCaGCGCATCAGGGGGTC-3'丙氨酸661到半胱氨酸的取代TaqPolI一Ala661Cys—fwd5，-CCCCTGATGCGCCGGtgcGCCAAGACCATCAAC-3'TaqPol1—Ala661Cys—rev5，-GTTGATGGTCTTGGCgcaCCGGCGCATCAGGGG-3'所得突變體Taq聚合酶然后與所需的原子或分子標(biāo)記反應(yīng)以通過(guò)半胱氨酸的SH-基標(biāo)記突變體結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸，并篩選天然和/或標(biāo)記的dNTP整合和整合效率。堿基整合過(guò)程中聚合酶突變體也進(jìn)行焚光活性篩選。因此，本發(fā)明也涉及Taq聚合酶突變體，其具有添加到一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的半胱氨酸殘基，所述位點(diǎn)選自513-518，643,647,649和653-661。半胱氨酸取代和采用修飾的dNTP證實(shí)聚合酶活性后，所述Taq聚合酶突變體通過(guò)插入的半胱氨酸殘基的SH-基與標(biāo)記反應(yīng)。合成修飾的dNTP(Y—AmNS)dATP的合成合成核苷酸類(lèi)似物，其包含連接到Y(jié)-磷酸鍵的熒光團(tuán)1-氨基萘-5-磺酸(l-ami廳aphalene-5-sulfonate)(JBiol.Chem.254，12069-12073，1979)。稍微改變Yarbrough及合作者對(duì)(y-AmNS)ATP所述方法，合成dATP類(lèi)似物-(Y-AmNS)dATP。此實(shí)施例說(shuō)明了YANS標(biāo)記的dATP的制備，圖示于圖4。1—氛基茶一5-石黃酸(447mg,2mmo1，40eq.,來(lái)自Lancaster)力口入至'J10ml&0中，用1NNaOH調(diào)pH為5.8。用注射濾器除去不溶物質(zhì)，得到此pH值的基本飽和的溶液(0.18到0.2M)。4mL12.5mM5'三磷酸-2'-脫氧腺苷二鈉鹽(O.05mmol，1eq.)和2mL1M1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(DEC,2mmol,40eq.，來(lái)自Lancaster)22。C加入到反應(yīng)容器中。加入10ml1-氨基萘-5-磺酸溶液引發(fā)反應(yīng)，持續(xù)2.5h。間歇加入0.1NHCl使pH保持在5.65-5.75。2.5h后,稀釋反應(yīng)液到50ml，調(diào)整到0.05M三乙基銨二碳酸氫鹽緩沖液中(TEAB,pH—7.5)。所述反應(yīng)產(chǎn)物在50mlDEAE-SEPHADEX離子交換柱(A-25-120)于低溫下進(jìn)行層析，采用~pH7.51.0MTEAB水溶液(IOOmL)，1.0M碳酸氬鈉水溶液(100mL)，和~pH7.5，0.05MTEAB水溶液(100mL)平tf。采用-pH7，5TEAB水:容液0.05到0.9M線(xiàn)性梯度洗脫柱。采集約10ml級(jí)分。合適的稀釋后得到所述級(jí)分的吸光度和熒光圖(UV366nm)。所述熒光級(jí)分在未反應(yīng)的dATP的峰后在~0.7M緩沖液洗脫，顯示出亮藍(lán)色焚光。匯集含產(chǎn)物級(jí)分，冷凍干燥并與&0/乙醇(70/30)共蒸發(fā)兩次。殘余物溶于水并冷凍干燥。"P麗R()H去耦合(decoupled),600MHz,D20,Me3P04外參比,293K,pH6.1)5(ppm)—12.60,—14.10，—25.79。參照化合物dATP給出下列共振峰31PNMR(dATP,Na+)在D20293K，5(ppm)-11.53(y)，-13.92(a),-24.93(卩)。采用二極管陣列UV4企測(cè)HPLC，可以容易的通過(guò)在366nmANS基的不同的吸光度鑒定含有所要產(chǎn)物的級(jí)分。此外，"P麗R光譜記錄了水溶液中Y-磷酸標(biāo)記的dATP和常規(guī)的dATP。對(duì)于每一化合物，觀察到三個(gè)特征共振，確認(rèn)在Y-標(biāo)記的dATP中的三磷酸部分。力-麗R,HPLC和UV光譜的結(jié)合分析提供正確化合物形成的支持信息。相同的合成方法用于制備Y-ANS磷酸修飾的dGTP,dTTP，dCTP。通過(guò)Taq聚合酶整合Y-磷酸標(biāo)記的dNTP下述實(shí)施例表明了商業(yè)可得的Taq聚合酶有效整合ANS-y-磷酸dNTP,如下合成并定性。在第一個(gè)實(shí)例中，描述了ANS-y-磷酸dATP的整合以從引物模板產(chǎn)生延伸的DNA產(chǎn)物。在延伸緩沖液中進(jìn)行所述反應(yīng)，采用20%變性聚丙烯酰胺凝膠按大小分離所得的放射標(biāo)記產(chǎn)物。采用磷光成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。參考圖5，泳道1在延伸緩沖液中包含5，放射標(biāo)記的'T0P，探針。泳道2包含TaqDNA聚合酶，50^iMdGTP與DM雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-SauO。泳道3包含TaqDNA聚合酶50]uMdATP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-Sau')。泳道4包含TaqDNA聚合酶，50(iMANS-y-dATP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-Sau')。泳道5包含TaqDNA聚合酶，50^MdGTP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-卩)。泳道6包含泳道5的溢出(spill-over)。泳道7包含TaqDNA聚合酶，50一dATP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-T')。泳道8包含TaqDNA聚合酶，50^MANS-Y-dATP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-T)。泳道9包含TaqDNA聚合酶，50]uMdGTP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-3T0。泳道10包含TaqDNA聚合酶，50|oMdATP與DM雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'B0T-3T')。泳道11包含TaqDNA聚合酶，ANS-y-dATP與DNA雙鏈溫育(放射標(biāo)記的TOP,采用過(guò)量的'BOT-3T')。泳道12在延伸緩沖液中包含5，放射標(biāo)記的'TOP'探針。泳道13在延伸緩沖液中包含5，放射標(biāo)記的"TOP"探針和TaqDNA聚合酶。寡核苷酸序列表示于表V中。泳道1和泳道4的定量對(duì)比表明當(dāng)ANS-y-dATP包含在反應(yīng)中時(shí)檢測(cè)到很少的非特異性，單個(gè)堿基延伸，但是第一個(gè)整合的堿基應(yīng)該是dGTP(其不添加到反應(yīng)中)。通道1和8的定量分析表明當(dāng)反應(yīng)中包含ANS-y-dATP時(shí)約71%的TOP引物通過(guò)模板指導(dǎo)的單個(gè)堿基延伸，第一個(gè)整合的堿基應(yīng)該是dATP。因此，TaqDNA聚合酶整合Y標(biāo)記的核苷酸。與聚合酶整合Y標(biāo)記的核香酸能力同等重要的是其在整合修飾的dATP之后延伸DNA引物的能力。泳道1和11的對(duì)比表明在整合Y標(biāo)記的核苷酸后DNA鏈延伸。因此整合修飾的核苦酸對(duì)聚合酶活性無(wú)害。注意，通過(guò)整合ANS-Y核苷酸延伸引物鏈也是根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)法則。實(shí)際上，通過(guò)添加此標(biāo)記到68Y-磷酸，核苷酸整合的忠實(shí)度提高了至少15倍。下一個(gè)實(shí)例說(shuō)明了采用所有4種ANS標(biāo)記的y-磷酸dNTP合成延伸的DM聚合物。這些反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物在20%變性聚丙烯酰胺凝膠分離，干燥膠并暴露于FujiBAS1000顯影板(imagingplate)過(guò)夜顯影。參考圖6，(A)為實(shí)際膠的圖像，(B)為減弱的磷光圖像和(C)增強(qiáng)的磷光圖像。對(duì)A,B和C的泳道描述如下泳道1是包含純化的10-堿基的引物的對(duì)照，通過(guò)a-"PdCTP的模板介導(dǎo)的添加延伸到11和12堿基。泳道2包含同樣的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘(以變性模板)，將反應(yīng)降為37。C(以退火引物-模板)，加入TaqDM聚合酶和所有四種天然dNTP(每種100iiM)，反應(yīng)液在37。C下溫育60分鐘。泳道3包括同樣標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C溫育3分鐘，向反應(yīng)液中加入DNA聚合酶和所有四種廠修飾的dNTP(每種lOO^M)，并在37。C下60分鐘溫育該反應(yīng)液。泳道4包括對(duì)照，純化的10-堿基引物，其通過(guò)a-32P-dCTP的添加延伸到11和12堿基，與泳道5-8的反應(yīng)并列循環(huán)。泳道5包括同樣的"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DM在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種天然dNTP(每種100iLiM)。反應(yīng)液進(jìn)行96。C10秒，3rC1分鐘，70°C5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道6包括同樣的"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種y修飾的dNTP(每種100^M)。反應(yīng)液進(jìn)行96。C10秒，37°Cl分鐘，70°C5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道7包含未純化的，10-堿基"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DM在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種天然dNTP(每種100^M)。反應(yīng)液進(jìn)行96。CIO秒,37°C1分鐘，7(TC5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道8包含未純化的，10-石威基"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96°C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種Y修飾的dNTP(每種lOOpM)。反應(yīng)液進(jìn)行96。CIO秒，37°C1分鐘，70°C5分鐘的25個(gè)循環(huán)。這些涉及標(biāo)記的dNTP的反應(yīng)的證據(jù)是與涉及天然核苷酸的反應(yīng)相比焦磷酸裂解(pyrophosphorolysis)的大幅降低。下述實(shí)例說(shuō)明了采用所有四種ANS標(biāo)記的y-磷酸dNTP合成長(zhǎng)DNA聚合物。每一引物延伸反應(yīng)液分為兩個(gè)部分，一部分經(jīng)20%變性凝膠電泳(如上所述)，而另一部分經(jīng)6%變性凝膠電泳以更好的估計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度。干燥凝膠并顯影(過(guò)夜)于FujiBAS1000顯影板。參照?qǐng)D7,(A)為實(shí)際凝膠，(B)為實(shí)際膠的減弱的磷光圖像，(C)為實(shí)際膠的增強(qiáng)的磷光圖像。對(duì)泳道A,B和C的描述如下泳道1包括123標(biāo)記物，其大小標(biāo)準(zhǔn)指示于每一排左側(cè)。泳道2包括對(duì)照，純化的10-堿基引物，其通過(guò)a-"P-dCTP的模板介導(dǎo)的添加延伸到11和12石威基。泳道3包括同樣的標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘(以變性模板)，將反應(yīng)降為37°C(以退火引物-模板)，加入TaqDNA聚合酶和所有四種天然dNTP(每種100|jM),反應(yīng)液在37。C溫育60分鐘。泳道4包括同樣的"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種Y修飾的dNTP(每種100nM),反應(yīng)液在37。C溫育60分鐘。泳道5包括對(duì)照，純化的10-堿基引物，其通過(guò)a-"P-dCTP的模板介導(dǎo)的添加延伸到11和12堿基，其與泳道5-8的反應(yīng)并列循環(huán)。泳道6包括同樣的"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種天然dNTP(每種1OO(jM)。反應(yīng)液進(jìn)行96。C10秒，37°C1分鐘，70°C5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道7包括同樣的"P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37°C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種y_標(biāo)記的dNTP(每種100^M)。反應(yīng)液進(jìn)行96。C10秒，37°C1分鐘，7(TC5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道8包含未純化的，10-堿基，32P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96°C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種天然dNTP(每種1Q0^M)。反應(yīng)液進(jìn)行96°C10秒，"°C1分鐘，70°C5分鐘的25個(gè)循環(huán)。泳道9包含未純化的，10-堿基，32P-標(biāo)記的引物，其與雙鏈質(zhì)粒DNA在96。C下溫育3分鐘，將反應(yīng)降為37。C10分鐘，此期間加入TaqDNA聚合酶和所有四種y-標(biāo)記的dNTP(每種lOO^M)。反應(yīng)液進(jìn)行96。C10秒，37°Cl分鐘，7(TC5分鐘的25個(gè)循環(huán)。此反應(yīng)中對(duì)天然和Y修飾的dNTP的大部分延伸產(chǎn)物是幾百個(gè)堿基長(zhǎng)，這些產(chǎn)物中相當(dāng)大的百分比由于太大不能進(jìn)入凝膠。因此，表明采用Y-磷酸標(biāo)記的dNTP通過(guò)Taq聚合酶產(chǎn)生了長(zhǎng)的DNA聚合物，其是無(wú)標(biāo)記的或天然的DNA聚合物鏈。不同的聚合酶與y-修飾的核苷酸的反應(yīng)不同在制造商建議的反應(yīng)緩沖液中37。C溫育指明的酶(TaqDNA聚合酶，測(cè)序酶，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，T7DNA聚合酶，Klenow片段，戶(hù)/wDNA聚合酶)，50nm指明的核香酸30-60分鐘，經(jīng)20%變性凝膠分離分析反應(yīng)產(chǎn)物。TaqDM聚合酶有效地使用了y修飾的核普酸以合成延伸的DM聚合物準(zhǔn)確性提高，如圖4-6所示.大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片^爻有效地使用了Y1奮飾的核苷酸，但并未顯示出如圖8所示的釆用其它酶觀察到的忠實(shí)度的極大改進(jìn)(extremefidelityimprovement)。戶(hù)尸i;DNA聚合酶沒(méi)有有效使用Y修飾的核苷酸，因此不是如圖9所示單分子測(cè)序系統(tǒng)的優(yōu)選酶。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶有效使用Y標(biāo)記的核苦酸，如圖io所示顯著改進(jìn)了忠實(shí)度。難于檢測(cè)天然T7DNA聚合酶產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物中的聚合活性(由于存在核酸外切酶活性)。但是，其基因修飾的衍生物，測(cè)序酶表明相對(duì)于未修飾的核香酸，Y修飾的核苷酸被有效整合，改進(jìn)了整合忠實(shí)度。天然T7DNA聚合酶和測(cè)序酶的試驗(yàn)結(jié)果示于圖11。因此，對(duì)于Taq聚合酶或HIV1逆轉(zhuǎn)錄酶，由于采用了本發(fā)明的Y修飾的dNTP改進(jìn)了忠實(shí)度，可以進(jìn)行單個(gè)分子DNA測(cè)序。但是，不是所有的聚合酶同等地利用了本發(fā)明Y修飾的dNTP，具體的說(shuō)，Klenow，測(cè)序酶，HIV1逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq聚合酶整合了本發(fā)明的修飾的核苷酸，而P/VDNA聚合酶沒(méi)有表現(xiàn)出整合了本發(fā)明的修飾的核苷酸。改進(jìn)的PCR-產(chǎn)生DNA長(zhǎng)序列核酸合成的忠實(shí)度是采用PCR完成長(zhǎng)目標(biāo)分子擴(kuò)增的限制因素。在引物延伸產(chǎn)物的合成中核苦酸的錯(cuò)誤整合限制了可以有效擴(kuò)增的目標(biāo)的長(zhǎng)度。在Huangetal.，1992，Nucl.AcidsRes.20:4567-4573(引入作為參考)中記述了3，-末端堿基與模板錯(cuò)配對(duì)引物延伸的影響。錯(cuò)誤整合核苷酸的存在可能產(chǎn)生成熟前中斷鏈合成，這樣降低了未來(lái)擴(kuò)增循環(huán)的模板鏈數(shù)量，從而降低了長(zhǎng)目標(biāo)擴(kuò)增的效率。低水平的核苷酸錯(cuò)誤整合可能對(duì)長(zhǎng)于lOkb的序列是至關(guān)重要的。圖4的數(shù)據(jù)顯示對(duì)于天然Taq聚合酶采用y標(biāo)記的dNTP的DNA合成的忠實(shí)度得到改進(jìn)，使較長(zhǎng)DNA延伸成為可能，而71不需要添加具有3，_到5，外切核酸酶，或"校對(duì)"活性的聚合酶，而這些是如Chengetal.,U.S.Pat.Nos.5,512,462(引入作為參考)中長(zhǎng)距離PCR方法所需的。因此本發(fā)明提供了改進(jìn)的PCR系統(tǒng)，用于得到提高了延伸長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增的DM產(chǎn)物，其包含在PCR反應(yīng)條件下將天然Taq聚合酶與本發(fā)明Y標(biāo)記的dNTP相接觸。由于使用了本發(fā)明的Y修飾的dNTP改進(jìn)了堿基整合正確性，可以得到長(zhǎng)度延伸的PCR產(chǎn)物。信號(hào)強(qiáng)度和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供有關(guān)堿基身份的信息在延伸的DNA鏈中每一核芬酸的信號(hào)強(qiáng)度用于檢測(cè)，確認(rèn)或支持堿基身份的數(shù)據(jù)。參照?qǐng)D12，實(shí)線(xiàn)條對(duì)應(yīng)于合成反應(yīng)中包含4種天然核苷酸(dATP,dCTP,dGTP，dTTP)時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物。虛線(xiàn)對(duì)應(yīng)于當(dāng)在反應(yīng)中包含本發(fā)明的，堿基修飾的核苷酸時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物。清楚顯示，序列的連貫性和堿基修飾影響反應(yīng)產(chǎn)物的強(qiáng)度和/動(dòng)力學(xué)，這些鑒定方式被整合到本發(fā)明的選擇堿基的軟件中以在每一測(cè)序位點(diǎn)提供堿基身份的高置信度值。所有引用和所列文獻(xiàn)用于參考。雖然本發(fā)明已作出了全面和完整的描述，但應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明也可不如具體所述地實(shí)施。盡管參照其優(yōu)選實(shí)施方案公開(kāi)了本發(fā)明，根據(jù)所讀的內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和改變，這些都包括在本發(fā)明如上所述和權(quán)利要求的范圍和精神中。序列表(1)信息總括(iii)序列號(hào)23(2)SEQIDNO:1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度絲(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolIFor(B)位置(D)其他信息用于擴(kuò)增全長(zhǎng)TAQPOLI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:1:TaqPolI正向5,_gcgaattcatgagg卿atgctgcccctctttgagccc-3(2)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolIrev(B)位置(D)其他信息用于擴(kuò)增全長(zhǎng)TaqPolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:2:TaqPolI反向5'-gcgaattcsccctccttggcggagcgccagtcctccc-3(2)SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一A293一trunk(B)位置(D)其他信息用于擴(kuò)增截短的TaqDNAPolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:3:TaqPolI—A293—trunk5'-aatccatgggccctggaggaggccccctggcccccgc-3,(2)SEQIDNO:4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Ala643Cys一ftvd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNAPolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:4:半胱氨酸取代643位的丙氨酸TapPolI一Ala643cys一正向5'-CCACACGGAGACCtgCAGCTGGMGTTCGGCG-3'(2)SEQIDNO:5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Ala643Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNAPolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:5:TaqPoI一Ala643Cys一反向5"-CGCCGAACATCCACGAGcaGGTCTCCGTGTGG-3'(2)SEQIDNO:6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPoll—Phe647Cys—fWd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:6:647位的笨丙氨酸取代半胱氨酸TaqPolI—Phe647Cys—正向5'-CCGCCAGCTGGATGTgCGGCGTCCCCCGGGAGGCC-3,(2)SEQIDNO:7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1119堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Phe647Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:7:647位的苯丙氨酸取代半胱氨酸TaqPoI一Pl]e643Cys—反向5,-GGCCTCCCGGGGGACGCCGcACMCCACGTGGCGG-3(2)SEQIDNO:8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Val649Cys—f\vd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:8:649位的纈氨酸取代半胱氨酸TaqPolI—Val649Cys—正向5'-GCCAGCTGGATGTTCGGCtgCCCCCGGGAGGCCGTGG-3(2)SEQIDNO:9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型:單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Val649Cys—rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:9:TaqPolI—Va649Cys—反向5,-CCACGGCCTCCCG'GGGGcaGCCGAACATCCAGCTGGC-3'(2)SEQIDNO:10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI_Glu652Cys—fWd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:10:半胱氨酸取代652位的谷氨酸TaqPolI—Glu652Cys—正向5,-GGCGTCCCCCGGtgcGCCGTGGACCCCCTG跳CGC_3(2)SEQIDNO:11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Glu652Cys—rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:11:TaqPolI—Glu652Cys—反向5'-GCGCATCAGGGGGTCCACGGCgcaCCG■GGGGACGCC-3'(2)SEQIDNO:12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Ala653CysJVd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:12:半胱氨酸取代653位的丙氨酸TaqPolI—Ala653Cys—正向5,-GGCGTCCCCCGGGAGtgCGTGGACCCCCTGATGCGC-3,(2)SEQEDNO:13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Ala653Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQJDNO:13:TaqPolI—Ala653Cys—反向5'-GCG,CATCAGGGGGTCCACGcaCTCCCGGGGGACGCC-3'(2)SEQE)NO:14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Val654Cys—fwd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:14:半胱氨酸取代654位的纈氨酸TaqPolI_Val654Cys—正向5'-GTCCCCCGGGAGGCCtgtGACCCCCTGATGCGC-3'(2)SEQIDNO:15的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPol1—Va!654Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:15:TaqPolI—Val654Cys—反向5'—GCGCMCAGGGGGTC織GGCCTCCCG咖GAC-3,(2)SEQIDNO:16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(be)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一D655C—fwd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:16:半胱氨酸取代655位的天冬氨酸TaqPolIJD655C—正向5,-CCCCGGGAGGCCGTGtgCCCCCTGATGCGCCGG-3，(2)SEQIDNO:17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(k)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI_D655C—rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變.到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:17:TaqPolI一D655C一反向5'-CCGGCGCATCAGGGGGcaCACGGCCTCCCGGGG-3'(2)SEQIDNO:IS的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(k)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Pro656Cys一fWd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:18:半胱氨酸取代656位的脯氨酸TaqPolI—Pro656Cys—正向5,—CGGGAGGCCGTGGACtgCCTGATGCGCCGGGCG-3'(2)SEQIDNO:19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Pro656Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:19:TaqPolI—Pro656Cys—反向5'-C:CCCGGC:CMCAGGcaGTCCACGGCCTCCCG—3,(2)SEQIDNO:20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Leu657Cys—fWd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQEDNO:20:半胱氨酸取代657位的亮氨酸TaqPolI—Leu657Cys—正向5,-GCCGTGGACCCCtgcATGCGCCGGGCGGCC-3.'(2)SEQEDNO:21的J言息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Leu657Cys—rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQE)NO:21:TaqPolI一Leu657Cys一反向5'-GGCCGCCCGGCGCM1gcaGGGGTCCACGGC-3'(2)SEQIDNO:22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Met658CysJWd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描迷SEQIDNO:22:半胱氨酸取代658位的甲硫氨酸TaqPolI—Met658Cys—正向51-GCCGTGGACCCCCTGtgtCGCCGGGCGGCC-3'(2)SEQIDNO:23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI_Met658Cys_rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:23:TaqPolI—Met658Cys—反向5，-GGCCGCCCGGCGacaCAGGGGGTCCACGGC-3，(2)SEQIDNO:24的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Arg659Cys—fwd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:24:半胱氨酸取代659位的精氨酸TaqPolI一Arg659Cys一正向5'-GCCGTGGACCCCCTGMGtGCCGGGCGGCC脇ACC-3'(2)SEQIDNO:25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸'(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(k)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Arg659Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變'到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQEDN。25:TaqPolI—Ai'g659Cys—反向5,二GGTCTTGGCCGCCCGGCaCATCAGGGGGTCCACGGC-3(2)SEQIDNO:26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI—Arg660Cys—fwd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:26:半胱氨酸^i代660位的精氨酸TaqPolI一Arg660Cys—正向5'-GACCCCCTGATGCGCtGcGCGGCCAAGACC'ATC-3'(2)SEQIDNO:27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度石錄(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI一Arg660Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:27:TaqPolI—Arg660Cys—反向5，-GM1GGTCTTGGCCGCgCaGCGCM1CAGGGGGTC-31(2)SBQEDNO:28的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)4定詞TaqPolI一Arg661Cys一fwd(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:28:半胱氨酸取代661位的丙氨酸TaqPol1—Arg660Cys—正向5,-CCCCTGATGCGCCGG.tgcGCCAAGACC'ATC,.AAC-3,;(2)SEQIDNO:29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型合成DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞TaqPolI_Ala661Cys一rev(B)位置(D)其他信息用于引導(dǎo)cys突變到TaqDNApolI編碼序列(xi)序列描述SEQIDNO:29:TaqPolI—Ai'g661Cys—反向5,-GTTGM1GGTCTTGGCgcaCCGGCGCATCAGGGG-3.'(2)SEQ1DN0:30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度CB)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他倌息包含用于標(biāo)記連接的突變TaqDNA聚合酶的多肽區(qū)(xi)序列描述SEQIDNO:30:CysSerTrpMetPheGlyValProArgGluAlaValAspProLeuMet6436446456466476486"65Q651652653654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQIDNO:31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(xi)序列描述SEQIDNO:31:AlaSerTrpMetCysGlyValProArgGlu.Al'aAspProLeuMetS43644645646647648649650651652653654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQIDNO:32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(xi)序列描述SEQIDNO:32:AlaSerTrpMetPheGlyCysProArgGl'UAlaValAsp'.ProLeuMet643644645646647648649650651652653654'655656657658ArgArgMa659660661(2)SEQIDNO:33的信息(i).序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包舍用于Tag附著的突變的TagDNA聚令酶多肽區(qū)(ix)序列描迷SEQIDNO:33:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgCys.MaVal-AspptoLeuMet643644645646647648649650651652653654"65'5656657658ArgArgMa659660561(2)SEQIDNO:34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)4建詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:34:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluCysValAspProLeuMet643644645646647648649650651652653654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQEDNO:35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQEDNO:35:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluAlaCysAspProLeuMet64364464564<56^64864965065165265365465565665，658ArgArgMa659660661(2)SEQIDNO:36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(JB)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:36:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluAla'ValCysProLeuMet643644645646647648649650651652653654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQDDNO:37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征'(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:37:Ala3erTrpMetPheGly'ValProArgGluAlaValAspCysLeuMet6436446456"647648649650651652,653654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQIDNO:38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(be)序列描述SEQIDNO:38:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluAla.ValAspProCysMet6436446456466476486496506516526'53654655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQIDNO:39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:39:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluAlaValAspProLeuCys6436"645646647648649650651652653554655656657658ArgArgAla659660661(2)SEQIDNO:40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:40:AlaSerTrpMetPheGlyValProArgGluAlaValAspProLeuMet643644645"6647648649650651552653654655656657658CysArgMa659660661(2)SEQIDNO:41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸.(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:41:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>(C)鏈型單鏈CD)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:44:SerCysSerAlaAlaVal513514515516517518(2)SEQIDNO:45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:45:SerThrCysAla'Ala'Val513514515516517518'(2)SEQIDNO:46的信息(i)序列特征CA)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈CD)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:46:SerThrSerCysAlaVal513514515516517518(2)SEQIDNO:47的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞(B)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQ1DNO:47:SerThrSerAlaCysVal513514515516517518(2)SEQIDNO:48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構(gòu)型(ii)分子類(lèi)型TagDNA聚合酶多肽區(qū)(iii)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞OB)位置(D)其他信息包含用于Tag附著的突變的TagDNA聚合酶多肽區(qū)(ix)序列描述SEQIDNO:48:SerThrSerAlaMaCys5135145155165175189權(quán)利要求1.含有聚合酶的組合物，其包含分子標(biāo)記、引物、模板和對(duì)應(yīng)該聚合酶的單體類(lèi)型，所述標(biāo)記與該聚合酶上的位點(diǎn)相連，至少一種單體類(lèi)型包括與該單體的β-、γ-或末端-磷酸基連接的分子標(biāo)記，至少一種所述標(biāo)記是具有能在單體摻入時(shí)被檢測(cè)到的熒光性質(zhì)的熒光標(biāo)記，且單體摻入的順序與模板中單體的相應(yīng)順序的互補(bǔ)體對(duì)應(yīng)。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。3.權(quán)利要求l的組合物，其中所述聚合酶選自r"《DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，測(cè)序酶，和大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。5.權(quán)利要求l的組合物，所述聚合酶標(biāo)記包含供體熒光標(biāo)記，每種單體類(lèi)型包括不同的、與該單體的(3-、Y-或末端-磷酸基連接的受體熒光標(biāo)記，且其中所述熒光性質(zhì)是在每一次摻入單體之時(shí)在聚合酶標(biāo)記與摻入單體上的標(biāo)記之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。6.權(quán)利要求l的組合物，其中所有標(biāo)記都是熒光標(biāo)記，且熒光性質(zhì)包含熒光發(fā)射光的強(qiáng)度和/或頻率。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述熒光性質(zhì)是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中單體標(biāo)記是供體熒光標(biāo)記而聚合酶標(biāo)記是受體熒光標(biāo)記，或聚合酶標(biāo)記是供體熒光標(biāo)記而單體標(biāo)記是受體焚光標(biāo)記，且其中當(dāng)兩種標(biāo)記彼此靠近時(shí)發(fā)生FRET。8.含有聚合酶的組合物，其包含供體焚光標(biāo)記、引物、模板和對(duì)應(yīng)該聚合酶的單體類(lèi)型，所述標(biāo)記與該聚合酶上的位點(diǎn)相連，所述模板含有未知的核苦酸序列，每種單體類(lèi)型包括不同的與該單體的P-或？磷酸基連接的受體熒光標(biāo)記，在每一次摻入單體之時(shí)在聚合酶供體熒光標(biāo)記與摻入單體上的熒光受體標(biāo)記之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，且單體摻入的順序與^^板中單體的相應(yīng)順序的互補(bǔ)體對(duì)應(yīng)。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述聚合酶選自r"《DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶，測(cè)序酶，和大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。12.單分子測(cè)序裝置，其包含第一小室，其容納有至少一種復(fù)制復(fù)合物，該復(fù)合物包含聚合酶，引物和模板，所述聚合酶具有與其位點(diǎn)連接的供體熒光標(biāo)記，第二小室，其容納有對(duì)應(yīng)所述聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的脫氧核苷三磷酸(dNTP)類(lèi)型，且部分或全部的dNTP具有受體熒光標(biāo)記與其(3-或？磷酸基連接，連接這些小室的通道，其中在每一次摻入dNTP之時(shí)在聚合酶標(biāo)記與摻入的dNTP上的標(biāo)記之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，且單體摻入的順序與模板中單體的相應(yīng)順序的互補(bǔ)體對(duì)應(yīng)，和適于在CCD照相機(jī)視野內(nèi)檢測(cè)熒光、并將FRET事件轉(zhuǎn)換為每一復(fù)制復(fù)合物的dNTP摻入順序的檢測(cè)儀，所述熒光在每一復(fù)制復(fù)合物產(chǎn)生FRET事件時(shí)產(chǎn)生的。13.權(quán)利要求12的裝置，所述第二小室包含4個(gè)小室，每一種dNTP類(lèi)型一個(gè)小室，且不同dNTP類(lèi)型包括不同的受體焚光標(biāo)記。14.在單分子水平對(duì)核酸分子測(cè)序的方法，其包含使包含未知核苷酸序列的核酸模板與測(cè)序組合物接觸，所述組合物包含聚合酶、引物和對(duì)應(yīng)所述聚合酶的單體，所述聚合酶具有與該酶上的位點(diǎn)連接的熒光供體，每一單體具有與其|3-、丫-或末端-磷酸基連接的獨(dú)特的熒光受體；用來(lái)自激發(fā)光源的光激發(fā)熒光供體；檢測(cè)每一次摻入單體之時(shí)在聚合酶供體熒光標(biāo)記與摻入單體上的熒光受體標(biāo)記之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)時(shí)發(fā)射的熒光；和將單體摻入順序讀取為模板中相應(yīng)的單體順序。15.權(quán)利要求14的方法，其中每一復(fù)制復(fù)合物的聚合酶、模板或引物固定在支持物上。16.權(quán)利要求14的方法，其中復(fù)制復(fù)合物的聚合酶、模板或引物固定在支持物的區(qū)域，孑L,槽，或通道中。17.權(quán)利要求14的方法，還包含多個(gè)聚合酶、引物和模板以形成多個(gè)復(fù)制復(fù)合物，所述聚合酶具有與該酶上的位點(diǎn)連接的熒光供體。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)序方法，其可以對(duì)單個(gè)的DNA或RNA分子或其部分進(jìn)行直接或基本上實(shí)時(shí)的測(cè)序。所述方法涉及用原子和/分子標(biāo)記改造聚合酶和/或dNTP，所述標(biāo)記具有可被檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的性質(zhì)。文檔編號(hào)C12P19/34GK101525660SQ20091000230公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2001年7月9日優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日發(fā)明者涂曉春,理查德·威爾森,蘇珊·H·哈丁,詹姆斯·M·布里格斯,高肖聯(lián)申請(qǐng)人:維西根生物技術(shù)公司