專利名稱：在柵欄內(nèi)用短期連接體形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成，具體而言，涉及用于形成三維(3D)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法 和裝置。
背景技術(shù)：
由于三維(3D)細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠比2D細(xì)胞培養(yǎng)物更接近地模擬體內(nèi)的細(xì)胞行為，因 此其十分重要。例如，對(duì)體內(nèi)組織具有高逼真度的3D體外組織模型在組織工程學(xué)和病理性 模型的建立中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，并且能將其用于研究和測(cè)試潛在的治療制劑的作用和機(jī)理。在常規(guī)技術(shù)中形成3D細(xì)胞培養(yǎng)物的困難為通過(guò)3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域來(lái)提供物 質(zhì)(如細(xì)胞培養(yǎng)基)的有效輸送。由于通常是用灌注通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)輸送物質(zhì)，因此當(dāng)細(xì) 胞結(jié)構(gòu)具有較大體積時(shí)，通過(guò)該細(xì)胞結(jié)構(gòu)輸送物質(zhì)就更加困難。在一些常規(guī)技術(shù)中，為了形 成微型細(xì)胞結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞包被在細(xì)胞外支撐物內(nèi)，例如包被在為細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供3D細(xì)胞外基 質(zhì)(ECM)支撐物的水凝膠或薄層基質(zhì)中。該細(xì)胞外支撐物形成了限制向細(xì)胞輸送物質(zhì)的屏 障。

發(fā)明內(nèi)容
因此，需要在有利于通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)輸送物質(zhì)的環(huán)境中形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用 短期連接體(transient linker)和流體管道內(nèi)的柵欄能夠有效地形成微型細(xì)胞結(jié)構(gòu)。最 初，短期連接體連接細(xì)胞，以形成細(xì)胞集合體，但不會(huì)形成限制向細(xì)胞或從細(xì)胞輸送物質(zhì)的 永久性屏障。柵欄留住了聚集的細(xì)胞但具有分布式開(kāi)口以利于通過(guò)在形成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的 不同區(qū)域來(lái)輸送物質(zhì)。柵欄可包括大致排列成U型圖形的多個(gè)微型柱體，其中，相鄰柱體間 的間隙允許流體交通，但間隙的大小能留住聚集的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供了一種形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法。該方法包括向被柵 欄部分圍繞的體積部分(volume)提供細(xì)胞和短期連接體。連接體有利于相鄰細(xì)胞的最初 粘附，以形成細(xì)胞集合體。柵欄構(gòu)成了分布式開(kāi)口，開(kāi)口的大小能留住細(xì)胞集合體。向該體 積部分提供包含細(xì)胞培養(yǎng)基的流體。通過(guò)開(kāi)口從該體積部分收回流體。培養(yǎng)保留在該體積 部分內(nèi)的聚集細(xì)胞，以形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在向該體積部分提供流體前，可將細(xì)胞懸浮在流體中 并可將連接體溶解在流體中?？梢员３滞ㄟ^(guò)該體積部分的流體的流動(dòng)。流體中的細(xì)胞的密 度可為約5百萬(wàn)至約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，并且流體中的短期連接體的濃度可為約6 μ M至約 8μΜ。所述開(kāi)口可以為分布式的，以利于通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)灌注細(xì)胞培養(yǎng)基?？蓪艡谠O(shè)置在 管道內(nèi)，并且流體可以流經(jīng)該管道。管道可包括底部和從底部延伸的相對(duì)的側(cè)壁。柵欄可包括從底部延伸并在側(cè)壁之間的多個(gè)突起物。該突起物可包括微型柱體?？蓪⒃撐⑿椭w 大致排列成U型的圖形。兩個(gè)相鄰的微型柱體間的間隙可為約10微米至約50微米。連接 體可包含聚乙烯亞胺主鏈和與主鏈鍵合的酰胼基。連接體的分子量可為約2000道爾頓至 約20000道爾頓。細(xì)胞可包括H印G2細(xì)胞或大鼠骨髓干細(xì)胞。細(xì)胞可包含醛基。細(xì)胞可包 括已經(jīng)被修飾而在修飾的細(xì)胞的表面上形成醛基的細(xì)胞。通過(guò)在分布式開(kāi)口的下游施加抽 吸力可以驅(qū)使流體的流動(dòng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置。該裝置包括管道；在該 管道內(nèi)流動(dòng)的流體，該流體包含細(xì)胞、短期連接體和細(xì)胞培養(yǎng)基，該連接體有利于相鄰細(xì)胞 的最初粘附，以形成細(xì)胞集合體；以及用于留住在流體中形成的聚集細(xì)胞的管道內(nèi)的柵欄， 該柵欄構(gòu)成了允許流體流過(guò)的分布式開(kāi)口。柵欄可包括大致排列成U形圖形的多個(gè)突起 物。突起物可包括微型柱體。管道可具有底部和從底部延伸的相對(duì)的側(cè)壁，并且突起物可 從底部延伸。流體中的細(xì)胞的密度可為約5百萬(wàn)至約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，并且流體中的短期 連接體的濃度可為約6μΜ至約8μΜ。細(xì)胞可懸浮在流體中。連接體可溶解在流體中。連 接體可包含聚乙烯亞胺主鏈和與主鏈鍵合的酰胼基。連接體的分子量可為約2000道爾頓 至約20000道爾頓。細(xì)胞可包含醛基。細(xì)胞可包括H印G2細(xì)胞或大鼠骨髓干細(xì)胞。通過(guò)在 分布式開(kāi)口的下游施加抽吸力可以驅(qū)使流體的流動(dòng)。當(dāng)結(jié)合附圖回顧對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
的下列描述時(shí)，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 而言，本發(fā)明的其他方面和特點(diǎn)將變得清晰。


在僅以示例的方式說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方式的附圖中，圖1為用于形成細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的流體管道(本發(fā)明的示例性實(shí)施方式)的透視 圖；圖2和3為圖1的流體管道在使用過(guò)程中的俯視平面圖；圖4為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的代表性3D細(xì)胞集合體的共聚焦圖像；圖5為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的代表性3D細(xì)胞集合體的掃描電子顯微照片 (SEM)；圖6為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式在微型流體通道內(nèi)形成的代表性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透射 光圖像；圖7為在圖6的微型流體通道內(nèi)但在不同的條件下形成的對(duì)照細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透射光 圖像；圖8至11為在不同流速下形成的代表性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的共聚焦圖像；圖12為顯示活細(xì)胞百分比與流速的相關(guān)性的柱形圖；圖13為在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的流體通道內(nèi)灌注HepG2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng) 物的共聚焦圖像；圖14為圖13的細(xì)胞培養(yǎng)物的透射光圖像；圖15為在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的流體通道內(nèi)灌注原代大鼠骨髓干細(xì)胞的 細(xì)胞培養(yǎng)物的共聚焦圖像；圖16為圖15的細(xì)胞培養(yǎng)物的透射光圖像；
圖17為說(shuō)明用于形成細(xì)胞培養(yǎng)物的可選擇性的流體管道的示意圖，其為本發(fā)明 的實(shí)施方式的示例；以及圖18為用于形成細(xì)胞培養(yǎng)物的另一個(gè)流體管道的透視圖，其為本發(fā)明的實(shí)施方 式的示例。
具體實(shí)施例方式圖1、2和3顯示了用于形成和培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的流體管道100，該流體管道為本發(fā)明 的實(shí)施方式的示例。流體管道100可以形成流體裝置或者為該裝置內(nèi)用于提供流體通道的 那部分。該裝置可具有未在圖1、2和3中顯示的其他部件或特征，用于提供在特殊應(yīng)用中 使用該裝置可能需要的功能。流體管道100具有底部102、從底部102延伸的相對(duì)的側(cè)壁104、入口 106、出口 108
和蓋子(未顯示)。入口 106與流體來(lái)源(未顯示)流通用于向管道100提供流體。出口 108與流體接受器(未顯示)流通用于從管道100收回流體。入口 106和出口 108也可以 通過(guò)不同的輸入和輸出管道(未顯示，但參見(jiàn)圖17)分別與其他流體提供器或接收器流通。 蓋子覆蓋管道100的頂部以提供外殼。由管道100限定的流體通道的形狀和大小可根據(jù)具體的應(yīng)用(包括要形成的細(xì)胞 培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的形狀和大小)來(lái)選擇。為了形成微型細(xì)胞培養(yǎng)物，管道100內(nèi)的流體通道的寬 度和高度可小于1mm。例如，在一些實(shí)施方式中，管道100通?？删哂懈叨葟募s50微米至約 500微米變化的矩形橫截面。根據(jù)具體的應(yīng)用，管道100可由任何適合的材料形成。例如，底部102和 側(cè)壁104(和頂部)可由玻璃、塑料或聚合物材料或者其組合來(lái)形成。適合的聚合 物可包括聚碳酸酯、聚丙烯酸、厚-光刻膠環(huán)氧樹(shù)脂(例如，由美國(guó)，馬薩諸塞州的 MicroChem公司生產(chǎn)的SU-8系列中的化合物)、聚甲醛、聚酰胺、聚對(duì)苯二酸聚丁二醇酯 (polybutylenter印hthalate)、聚亞苯基醚、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酯薄膜、聚氨基甲 酸酯、聚偏1，1_ 二氟乙烯(PVDF)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、氟聚硅氧烷或其組合物或混 合物。使用適合的可聚合材料可形成所述聚合物，適合的可聚合材料包括單體、構(gòu)成低聚物 的嵌段或任何適合的前體分子。管道100的不同部分可由相同或不同的材料形成。將大致排列成U-型圖形并與側(cè)壁104間隔一定距離的多個(gè)微型柱體110設(shè)置在 管道100內(nèi)。U-型圖形的開(kāi)口端朝向入口 106，而該U-型圖形的部分封閉端朝向出口 108。 相鄰的微型柱體110間的間隙可為約10微米至約50微米?？蛇x擇間隙的大小以提供所需 的通過(guò)該間隙的灌注速度，這將在下文中進(jìn)一步說(shuō)明。微型柱體110可具有任何適合的橫 截面形狀。微型柱體110的寬度可以變化，例如在10微米至50微米的范圍內(nèi)?？筛鶕?jù)要 形成的所需細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)選擇柱體的高度。在一些實(shí)施方式中，例如，柱體高度可從約10微 米至約500微米變化。在一些實(shí)施方式中，柱體可以延伸超過(guò)管道100的全高。微型柱體可由與管道100相同的材料或與其不同的材料形成。微型柱體100構(gòu)成了如圖1和2中由虛線勾畫(huà)出的部分封閉的體積部分或細(xì)胞生 長(zhǎng)區(qū)112。非必須地，柱體100可延伸到管道100的頂蓋?；蛘?，可設(shè)置橫條(未顯示)來(lái)連 接相對(duì)的成對(duì)柱體110的頂端，并且該橫條可與管道100的頂蓋間隔一定距離。
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在一個(gè)實(shí)施方式中，底部102由玻璃制成，而包括側(cè)壁104、柱體110和頂蓋的管道 100的其他部分由相同的聚合物形成。側(cè)壁104、柱體110和頂蓋可作為整體單元形成。在 這種情況下，柱體110從頂蓋向下延伸至玻璃底部102。管道110的聚合物部分可通過(guò)澆鑄 形成。模具可為微細(xì)加工的硅模具。聚合物部分可與玻璃底部102緊密連接以形成封閉的 流體通道。聚合物和玻璃可通過(guò)永久性化學(xué)結(jié)合或使用可移動(dòng)的緊固件(如夾子)來(lái)彼此 附著。在另一實(shí)施方式中，管道100可以作為整體形成完整的單元。該單元可由塑料、聚 合物等形成。流體管道100和微型柱體110可采用任何適合的微細(xì)加工技術(shù)來(lái)加工?？刹捎靡?知的技術(shù)來(lái)處理流體管道100和微型柱體的表面，以提高在特定應(yīng)用中的性能。例如，可采 用如顯微機(jī)械加工、復(fù)制澆鑄(r印lica moulding)、軟刻蝕、反應(yīng)離子刻蝕(RIE)或深反應(yīng) 離子刻蝕(DRIE)等的微細(xì)加工技術(shù)來(lái)加工包括微型柱體110的流體管道100。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)來(lái)形成管道100。首先，通過(guò)深 反應(yīng)離子刻蝕來(lái)形成硅模板。然后，在該硅模板內(nèi)澆鑄PDMS材料。接著可將澆鑄的PDMS結(jié) 構(gòu)在氧等離子體中氧化，例如約1分鐘，以使PDMS結(jié)構(gòu)與如玻璃蓋片的蓋板(未顯示)化 學(xué)結(jié)合。在使用前可將該裝置滅菌。如在圖2和3中更好地說(shuō)明，在使用時(shí)流體114流經(jīng)管道100和細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112。流體114含有細(xì)胞培養(yǎng)基和用于最初連接細(xì)胞以形成細(xì)胞集合體的短期連接體。 短期連接體將僅與細(xì)胞暫時(shí)地粘附并將在相鄰細(xì)胞形成細(xì)胞集合體后與細(xì)胞分離。連接體 可為短期細(xì)胞間聚合物(TIP)連接體。連接體可溶解在流體144中。將用于形成所需細(xì)胞 結(jié)構(gòu)的細(xì)胞116懸浮在流體114中。流體114可包含用于溶解并運(yùn)送在其中的TIP和其他 成分的運(yùn)送溶劑。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合的制備技術(shù)可以制備流體114。所述細(xì)胞培養(yǎng)基可含有用于培養(yǎng)所用特定細(xì)胞的任何適合材料，這是本領(lǐng)域技術(shù) 人員能夠理解的。例如，培養(yǎng)基可包含細(xì)胞生長(zhǎng)和培養(yǎng)需要的或理想的營(yíng)養(yǎng)素。例如，細(xì)胞 培養(yǎng)基可含有達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)、F-IO營(yíng)養(yǎng)素 混合物、F-12營(yíng)養(yǎng)素混合物、由Roswell Park Memorial研究所研制的培養(yǎng)基(RPMI培養(yǎng) 基)、伊思考夫氏改良杜爾貝可培養(yǎng)基(IMDM)、葡萄糖、胎牛血清(FCS)、青霉素/鏈霉素、 CO2、生長(zhǎng)因子或其他物質(zhì)。細(xì)胞116可為通過(guò)短期連接體能夠形成細(xì)胞集合體的細(xì)胞，并可包括一種以上類 型的細(xì)胞。例如，能夠通過(guò)NaIO4修飾的含有唾液酸殘基的細(xì)胞是適合的。在一些實(shí)施方 式中，可使用具有唾液酸較高表達(dá)的細(xì)胞。例如，如HepG2人肝臟細(xì)胞系、A549人肺上皮細(xì) 胞系、HeLa人宮頸細(xì)胞系、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251等的細(xì)胞系是適合的。如大鼠 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和豬的肝細(xì)胞的原代細(xì)胞也是適合的?？梢赃x擇細(xì)胞以使當(dāng)流體114在流經(jīng)管道100時(shí)它們能夠被接種到細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū) 112內(nèi)。細(xì)胞116可以是表面修飾的以使它們通過(guò)短期連接體會(huì)聚集。例如，細(xì)胞116可為 含有醛基或已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾而含有醛基的細(xì)胞。細(xì)胞116可由H印G2細(xì)胞(人肝臟細(xì)胞系)、 原代大鼠骨髓干細(xì)胞(BMSC)、A549人肺上皮細(xì)胞系、HeLa人宮頸細(xì)胞系、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì) 胞系U87和U251、原代豬(pig)肝細(xì)胞或其他類型的細(xì)胞被修飾。為了培養(yǎng)H印G2和BMSC細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基可包含DMEM、10% FCS和葡萄糖。對(duì)于HepG2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量可以較高，例如，約4. 5g/L ；而對(duì)于BMSC細(xì)胞，可以 較低，例如約1.0g/L。在一個(gè)實(shí)施方式中，可能需要防止細(xì)胞與壁表面的牢固粘附，以便可以在管道100 內(nèi)保持所需的流速。通過(guò)選擇不與特定壁表面粘附的細(xì)胞或者通過(guò)調(diào)節(jié)管道100內(nèi)的流體 流速可以避免粘附從而不出現(xiàn)牢固的粘附。所述培養(yǎng)基可以是成骨性的并可由含有IOOnM地塞米松、0. 05mM抗壞血酸2_磷酸 酯和IOmM β-磷酸甘油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)制備。選擇短期連接體以使其能夠最初連接細(xì)胞116以使它們彼此粘附并形成細(xì)胞集 合體122?？蛇x擇連接體以使其能夠在細(xì)胞間建立直接接觸并使細(xì)胞聚集而形成3D細(xì)胞集 合體。連接體分子僅與細(xì)胞116暫時(shí)地結(jié)合并能夠在細(xì)胞已彼此粘附后從粘附細(xì)胞分離。 與細(xì)胞表面粘附的連接體的半衰期可在約1天至約5天的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，半 衰期可為約12小時(shí)或更短。例如，對(duì)于具有表面醛基的細(xì)胞，連接體可含有酰胼末端基團(tuán)，該基團(tuán)可與醛基 反應(yīng)引起細(xì)胞的聚集。在一個(gè)實(shí)施方式中，酰胼基團(tuán)可與如聚乙烯亞胺(PEI)主鏈的聚 合物主鏈共軛或鍵合。在不同的實(shí)施方式中，可以使用其他線性聚合物連接體、樹(shù)形連 接體、兩步連接體(two-step linker)等。例如在下列文獻(xiàn)中披露了一些適合的短期連 ^ {φ :Zhao ^ Α "Dendrimer hydraidesas multivalent transient inter-cellular linkers, " Biomaterials, 29 (2008) 3693-3702 ；禾口 De Bank 等人，"Surface engineering of living myoblasts via selective periodateoxidation,，，Biotechnology and bioengineering, vol. 81,2003, pp.800-808。短期連接體將會(huì)在細(xì)胞形成了集合體后與細(xì)胞分離。合適的是，短期連接體不會(huì) 在細(xì)胞周圍形成永久性屏障。這就允許向細(xì)胞或者從細(xì)胞有效地輸送物質(zhì)。此外，這使得 細(xì)胞建立天然的細(xì)胞_細(xì)胞相互作用，分泌ECM，并建立細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，這可能是3D 細(xì)胞間支撐需要的。連接體可基于無(wú)毒的低分子量PEI。在一個(gè)實(shí)施方式中，連接體的分子量可為約 2000道爾頓至約20000道爾頓。在PEI臂上的伯胺基可被改變來(lái)生成酰胼，酰胼能夠與化 學(xué)修飾的細(xì)胞表面上的醛突起反應(yīng)而聚集細(xì)胞。連接體可以在細(xì)胞表面短期存留，其半衰 期為約2天?？梢赃x擇連接體以使依賴貼壁細(xì)胞(anchorage-d印endent cell)產(chǎn)生它們 自己的用于3D支撐的天然環(huán)境而無(wú)需摻入潛在地阻礙物質(zhì)輸送的外源性生物材料。這樣， 細(xì)胞能夠分泌并積累其自身的用于支撐的ECM。一些細(xì)胞需要由基板支撐或錨著于基板上才能存活、生長(zhǎng)和繁殖，這些細(xì)胞被稱 為依賴貼壁細(xì)胞。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(原代細(xì)胞和細(xì)胞系)就是依賴貼壁的。只要依賴貼 壁細(xì)胞已經(jīng)聚集并局限在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)內(nèi)，就可以在本發(fā)明的實(shí)施方式中方便地使用這些細(xì) 胞，它們通過(guò)相鄰的細(xì)胞來(lái)支撐。因此，無(wú)需將該細(xì)胞固定在如凝膠的外部基質(zhì)支撐物上?？蓪⒘黧w的溫度保持在適于培養(yǎng)特定細(xì)胞的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，溫度可為 約37°C。使用加熱裝置(未顯示)和溫度控制器(未顯示)可以控制管道100內(nèi)的溫度。 在一些實(shí)施方式中，可將加熱器(未顯示)埋置在其上設(shè)置有管道100的流體裝置內(nèi)?？刂屏黧w流經(jīng)管道100的流速以使細(xì)胞116形成通過(guò)TIP連接體最初連接的細(xì)胞 集合體118。為了保持細(xì)胞的成活力(viability)，應(yīng)該選擇流量(每單位面積的流體流動(dòng)速度)來(lái)減少由流體流動(dòng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的沖擊力或使其最小化，同時(shí)保持對(duì)由微型柱體110 俘獲的聚集細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基的充足供應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，如果通過(guò)在由微型柱體110 構(gòu)成的分布式開(kāi)口的下游施加抽吸力來(lái)驅(qū)動(dòng)流體的流動(dòng)就可以減少流動(dòng)沖擊作用。例如， 通過(guò)出口 108可以施加有效的抽吸力，如使用流體泵，而不是在入口 106施加推動(dòng)力。應(yīng)該理解的是，流體在管道100內(nèi)流動(dòng)的局部流量可以是不一致的，并且在通道 內(nèi)的不同區(qū)域中和在不同的時(shí)間時(shí)也可以不同。例如，當(dāng)細(xì)胞集合體在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112內(nèi) 聚集時(shí)，流入細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112或流經(jīng)微型柱體110之間的間隙的流體可能會(huì)隨著時(shí)間減速。 如果保持通過(guò)管道100的總流速恒定，則流出細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112的流體可能會(huì)隨著時(shí)間變快。 然而，在一些實(shí)施方式和應(yīng)用中，仍然可以通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)過(guò)管道100的總流速或流量來(lái)控制 細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112內(nèi)或柱體110間的間隙內(nèi)的物質(zhì)輸送或擴(kuò)散速度。
能夠理解的是，更高的流量可以在生長(zhǎng)區(qū)內(nèi)提供更快的擴(kuò)散，但這也可能增加對(duì) 細(xì)胞的剪切力。因此，可以調(diào)節(jié)并最優(yōu)化總流量來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的平衡?？梢允沽魉倩蛄髁恳约捌渌刹僮鞯膮?shù)最優(yōu)化，以使在原位形成的細(xì)胞集合體 足夠大而被柱體110限制，并且足夠小而防止流體通道的阻塞。通過(guò)流體內(nèi)的細(xì)胞密度 和細(xì)胞間連接體濃度可以調(diào)節(jié)細(xì)胞集合體的大小。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞密度可為約5 百萬(wàn)至約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，而細(xì)胞間連接體濃度可為約6 μ M至約8 μ M。在一個(gè)實(shí)施方式 中，細(xì)胞密度可為約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，而細(xì)胞間連接體濃度可為約6 μ Μ。如果細(xì)胞密度和 連接體濃度太高，則在入口 106可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的堵塞。如果細(xì)胞密度和連接體濃度太低， 則細(xì)胞聚集太慢而難以在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112內(nèi)有效地俘獲細(xì)胞。選擇微型柱體110間的間隙大小以使流體114和單個(gè)細(xì)胞116流過(guò)，但是在細(xì)胞 生長(zhǎng)區(qū)112內(nèi)留住細(xì)胞集合體118。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在約10微米至約50微米范圍內(nèi)的間隙適于
一些細(xì)胞。當(dāng)流體114流經(jīng)管道110并通過(guò)微型柱體110間的間隙時(shí)，細(xì)胞集合體118繼續(xù) 生長(zhǎng)并最終形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)120，該細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有通常由微型柱體110的位置和形狀限制并 與細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)112 —致的形狀和尺寸。能夠理解的是，可將微型柱體110用于限制細(xì)胞集 合體，以形成與其尺寸一致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。根據(jù)具體應(yīng)用，可將細(xì)胞結(jié)構(gòu)120培養(yǎng)所需的一段時(shí)間，例如最多為數(shù)周。在形成 和培養(yǎng)過(guò)程的不同階段可以調(diào)整輸入流體114和細(xì)胞培養(yǎng)基的含量?？梢杂^察或監(jiān)控管道100內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，在培養(yǎng)期間可以拍攝細(xì)胞集合體 或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的圖像。為此目的，管道100的至少一側(cè)可以是透明的。細(xì)胞的圖像可采用任 何適合的技術(shù)來(lái)獲得，例如共聚焦成像、透射光成像、SEM等。為了成像、標(biāo)記或其他目的，可將細(xì)胞染色，例如通過(guò)絲狀肌動(dòng)蛋白染色、上皮細(xì) 胞鈣粘蛋白的免疫染色、馮庫(kù)薩染色等。通過(guò)改變輸入流體114的內(nèi)含物，包括向輸入流體 114加入適當(dāng)?shù)娜旧牧希梢栽谠贿M(jìn)行染色。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基可非必須地再循環(huán)?？梢栽O(shè)置閉路循環(huán)系統(tǒng) (未顯示)并且可使用多通道振動(dòng)泵來(lái)循環(huán)運(yùn)送細(xì)胞培養(yǎng)基的流體。根據(jù)上述步驟形成的有代表性的細(xì)胞集合體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的圖像和試驗(yàn)結(jié)果顯示 在圖4至16中，并在下文中進(jìn)一步描述。能夠理解的是，可以方便地利用微型柱體110間的開(kāi)口或間隙來(lái)通過(guò)細(xì)胞結(jié)構(gòu)
9120內(nèi)的不同區(qū)域灌注培養(yǎng)基，從而增加向該結(jié)構(gòu)及在該結(jié)構(gòu)內(nèi)的物質(zhì)輸送。有效的是，微型柱體110在流體管道100內(nèi)形成柵欄用于留住在流體114內(nèi)形成 的聚集細(xì)胞118。在其他實(shí)施方式中，可以形成不同的用于留住聚集細(xì)胞的柵欄。例如，柵欄可由柱 體、條、線等或其組合來(lái)形成。柵欄可以具有一個(gè)以上的開(kāi)口側(cè)。在任何情況下，體積部分 都是被柵欄部分圍繞的。該體積部分將基本上限定由留住的細(xì)胞形成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形狀。 柵欄應(yīng)該限定分布式開(kāi)口以允許流體流經(jīng)，并有利于通過(guò)該體積部分灌注物質(zhì)。然而，從柵 欄收回流體經(jīng)過(guò)的開(kāi)口的大小至少應(yīng)該能留住聚集細(xì)胞。分布式開(kāi)口應(yīng)該設(shè)置在柵欄的兩 個(gè)以上的側(cè)面。設(shè)置柵欄的形狀以使其圍繞的體積部分具有所需的形狀。在一些實(shí)施方式 中，如圖1所示，柵欄可以具有開(kāi)口側(cè)。在其他實(shí)施方式中，柵欄可以是在所有側(cè)面都至少 被部分封閉的。柵欄的一個(gè)以上的側(cè)面可以完全封閉(參見(jiàn)，例如圖1中管道100的底部 102)。能夠理解的是，可以通過(guò)部分封閉側(cè)面的分布式開(kāi)口或通過(guò)柵欄的開(kāi)口側(cè)向圍出的 體積部分提供細(xì)胞、短期連接體和細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)在柵欄底部或 頂部的開(kāi)口向體積部分提供輸入流體。在一些實(shí)施方式中，柵欄可由剛性材料形成。在其他實(shí)施方式中，部分柵欄可由柔 性材料形成。例如，柵欄的一側(cè)可由如網(wǎng)或膜的柔性材料形成。在一些應(yīng)用中，當(dāng)受到流體 流動(dòng)和保留在柵欄內(nèi)的聚集細(xì)胞的擠壓時(shí)，所述網(wǎng)或膜可具有預(yù)先確定的輪廓。柵欄可具有完全或部分封閉的頂部。柵欄可以在管道內(nèi)形成或設(shè)置在管道內(nèi)。管道可具有通道或腔室等的形狀。具有 分布式開(kāi)口的柵欄的側(cè)面可以與管道的壁間隔一定距離以允許流體通過(guò)開(kāi)口有效交通。柵 欄可以完全或部分浸入運(yùn)送細(xì)胞培養(yǎng)基的流體內(nèi)?，F(xiàn)在能夠理解的是，可以改進(jìn)在圖1至3中顯示的排列而仍能實(shí)現(xiàn)在本申請(qǐng)?zhí)峒?的一些益處或優(yōu)點(diǎn)。例如，圖17顯示了流體管道200，其具有底部202、側(cè)壁204、入口 106、出口 208和 柱體210。如同前面描述的流體管道100，流體214也流經(jīng)管道200。這樣細(xì)胞218形成細(xì) 胞集合體218并最終形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)220。入口 206與3個(gè)輸入管道相連，即中間的管道222 和兩側(cè)的管道224。類似地，出口 208與3個(gè)輸出管道相連，即中間的管道226和兩側(cè)的管 道 228。在一個(gè)實(shí)施方式中，管道200的長(zhǎng)度可為約10mm，寬度為約0.6mm，且高度為約 0. 1mm。每個(gè)微型柱體210可具有顯示的橢圓形橫截面，其長(zhǎng)軸為約0. 5mm而短軸為約 0.03mm。相鄰柱體間的間隙可為約0. 02mm寬。U-型圖形的封閉端與開(kāi)放端間的距離可為 約0. 2mm。對(duì)于這樣的排列，根據(jù)細(xì)胞的大小，接種流體內(nèi)的細(xì)胞密度可為約一百五十萬(wàn)至 約一千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL。細(xì)胞越大，最佳的細(xì)胞密度可以越低。橢圓形柱體在一些應(yīng)用中可能具有優(yōu)勢(shì)。然而，在不同的應(yīng)用或?qū)嵤┓绞街?，柱體 可以具有其他的橫截面形狀。在使用中，中間的管道222可以與細(xì)胞收集器(未顯示)連接，用于向管道200提 供細(xì)胞216。側(cè)面的管道224可與培養(yǎng)基來(lái)源連接，用于向管道200提供培養(yǎng)基。短期連接 體可溶解在培養(yǎng)基中?？稍谌肟?206設(shè)置4向閥(未顯示)，用于控制流體流動(dòng)并向管道 200輸送不同的物質(zhì)。例如，最初可以開(kāi)放與中間的管道222連接的閥，然后在已經(jīng)向管道200提供了足夠的細(xì)胞后將其關(guān)閉。當(dāng)向管道200提供細(xì)胞時(shí)，可以通過(guò)側(cè)面的管道228，例如使用注射器泵(未顯 示)，從管道200抽取流體214。在培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)220的過(guò)程中，可以從所有的管道226和 228抽取流體214。在圖1中顯示的實(shí)施方式的其他變化中，微型柱體110可被限定部分封閉的體積 部分和分布式開(kāi)口的柵欄結(jié)構(gòu)代替。例如，如圖18中所示，可以設(shè)置其內(nèi)帶有間隔的狹槽 或開(kāi)口的柵欄壁而不是柱體。圖18中顯示的流體管道300與圖1的流體管道100類似，流體管道300具有底部 302、側(cè)壁304、入口 306和出口 308。設(shè)置柵欄壁310來(lái)代替柱體110用于留住聚集細(xì)胞。 在壁310內(nèi)設(shè)置分布式開(kāi)口 312以使培養(yǎng)基流過(guò)。在另一實(shí)施方式中，柵欄結(jié)構(gòu)可包括圍欄樣的篩子或其他類型的過(guò)濾裝置，用于 在允許流體通過(guò)篩子或過(guò)濾裝置被收回的同時(shí)留住聚集細(xì)胞。也可以用從管道的底壁延伸的其他突起物來(lái)代替微型柱體。例如，可以將在WO 2006/052223 (Yu 等人，題目為 “Cell Culture Device”，2006 年 5 月 18 日公開(kāi))中披露的 用于制作微型流體裝置的微型柱體排列和技術(shù)改良并應(yīng)用于形成在本發(fā)明的實(shí)施方式中 使用的適合的裝置中。將與制作流體裝置相關(guān)的WO 2006/052223的內(nèi)容通過(guò)引用方式并 入本申請(qǐng)。其中放置柵欄的管道或通道在不同的實(shí)施方式中可具有不同的形狀和大小。例 如，側(cè)壁104并非必須是平行的。在一些實(shí)施方式中，管道可以具有腔室的形狀。該腔室通?？删哂芯匦?、圓柱形或 球形的形狀。也可以將管道的形狀或大小設(shè)置成能容納除保留柵欄外的其他流體部件或裝 置。可以在腔室內(nèi)的任意所需位置設(shè)置管道的入口和出口。還可以在例如底壁、側(cè)壁或頂 壁的壁上設(shè)置流體進(jìn)出口來(lái)為流體交通提供可選擇的或另外的入口/出口。為了促進(jìn)使用短期連接體來(lái)形成細(xì)胞集合體，細(xì)胞可以在細(xì)胞表面上具有或 經(jīng)修飾而具有反應(yīng)突起。短期連接體可具有用于與反應(yīng)突起反應(yīng)的相應(yīng)的末端基團(tuán) 來(lái)將細(xì)胞“粘”在一起。細(xì)胞表面可通過(guò)酶處理被遺傳性修飾或被化學(xué)修飾而生成反 應(yīng)突起。例如在下列文獻(xiàn)中披露了用于修飾細(xì)胞表面的示例性技術(shù)B. Kellam等人， “Chemical modification of mammalian cellsurfaces, "Chem. Soc. Rev. ,2003, vol. 32, pp. 327-337 ；E. Saxon 等 A ；"Chemical and biological strategies for engineering cell surface glycosylation, " Annu. Rev. cell. Dev. Biol. , 2001, vol. 17, pp. 1-23 ；S-M. Ong 等人，“Transient inter-cellular polymeric linker,，，Biomaterials, 2007, vol. 28, pp. 3656-3667 (以下稱作‘‘Ong”)，將這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本申請(qǐng)。在Ong中披露了用于形成TIP連接體的適合技術(shù)。也可以使用其他TIP連接體或 用于形成TIP連接體的技術(shù)。在此討論的實(shí)施方式和改進(jìn)僅為了說(shuō)明目的而沒(méi)有窮盡。其他的改進(jìn)也是可以 的。在此描述的示例性實(shí)施方式能夠有利地用在多種應(yīng)用中。例如，當(dāng)結(jié)合使用短期連接體和微型柱體排列時(shí)，可以快速形成3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如 在約5分鐘內(nèi))，并具有精確的形狀和尺寸。能夠相對(duì)容易地實(shí)施形成步驟。
因?yàn)闆](méi)有使用永久性的細(xì)胞外基質(zhì)或大塊材料來(lái)支撐細(xì)胞，所以可以通過(guò)細(xì)胞結(jié) 構(gòu)內(nèi)的不同區(qū)域充分并有效地輸送物質(zhì)。由于流體通過(guò)柱體間的間隙交通，因此在形成細(xì) 胞結(jié)構(gòu)期間或之后都可以通過(guò)該細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)灌注。由于沒(méi)有永久性的外部支撐(例如包 被細(xì)胞的水凝膠基質(zhì))，而流體流動(dòng)又是連續(xù)的，因此使得能夠?qū)⑷缪鯕夂蜖I(yíng)養(yǎng)質(zhì)的物質(zhì)輸 送到細(xì)胞并從細(xì)胞輸送走如代謝廢物的物質(zhì)。在如藥物試驗(yàn)或生物學(xué)研究的特定應(yīng)用中，改善的物質(zhì)輸送對(duì)于向細(xì)胞構(gòu)造遞送 生物學(xué)制劑可能是有用的。通過(guò)使細(xì)胞分泌并積聚其自己的ECM從而產(chǎn)生天然的微環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)高水平的 仿生學(xué)，而無(wú)需加入外源性生物材料也無(wú)需利用模擬體內(nèi)血管形成的灌注培養(yǎng)。潛在地，更 高級(jí)的仿生學(xué)能夠有助于從體內(nèi)細(xì)胞反應(yīng)(例如在藥物試驗(yàn)或生物學(xué)研究中)采集更多預(yù) 判性結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的微型3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)與大型細(xì)胞結(jié)構(gòu)相比能夠顯示出 許多優(yōu)勢(shì)。例如，微型3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小更緊密，可具有更高的可處理性，能夠提供更快且相 關(guān)的分析，并且能夠減少許多應(yīng)用中需要的試劑體積。本申請(qǐng)的實(shí)施方式可以使用用于藥物試驗(yàn)應(yīng)用的仿生微芯片。通過(guò)在微通道內(nèi)聚 集一種或多種細(xì)胞類型可以形成多種組織。使用短期細(xì)胞間連接體代替用于細(xì)胞支撐的永 久性水凝膠能使細(xì)胞分泌并聚集用于支撐的天然ECM，而不是依賴外源性生物材料。因此該 細(xì)胞結(jié)構(gòu)更好地模擬體內(nèi)的細(xì)胞行為。例如在藥物試驗(yàn)中，可以設(shè)置多個(gè)流體通道來(lái)提供高通過(guò)量。微通道可以與梯度 產(chǎn)生器連接從而能夠?qū)Σ煌⑼ǖ纼?nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)同時(shí)進(jìn)行一個(gè)濃度范圍的藥物測(cè)試?？蓪?梯度產(chǎn)生器設(shè)計(jì)成線型、反曲型(sigmoidal)或指數(shù)型，因此根據(jù)使用者的需要提供多功 能性。這樣的多元性可能對(duì)于改進(jìn)現(xiàn)有的集成流體回路是有益的，從而為藥物試驗(yàn)應(yīng)用的 高通過(guò)量提供有效的處理?？梢皂樞蜻B接多種流體芯片來(lái)進(jìn)行本申請(qǐng)描述的方法。不同的芯片可用于培養(yǎng)代 表不同組織類似物的不同細(xì)胞類型?；蛘?，可以在一種芯片上在由微型流體通道連接的不 同腔室內(nèi)培養(yǎng)不同的細(xì)胞類型。治療劑可以通過(guò)組織類似物循環(huán)并且能夠在系統(tǒng)水平上檢 測(cè)它們的作用。這樣的排列對(duì)基于系統(tǒng)反應(yīng)評(píng)測(cè)候選治療劑是有潛在的益處的，系統(tǒng)反應(yīng) 的等級(jí)高于組織反應(yīng)。潛在地，這種排列可用在許多不同的微型流體裝置中。用透明的管道材料(例如玻璃底部)，在微通道內(nèi)形成的微米級(jí)3D細(xì)胞培養(yǎng)物能 夠用現(xiàn)有的成像形式以高分辨率容易地成像。例如，細(xì)胞培養(yǎng)物可以使用相位對(duì)比度顯微 鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡或雙光子激光顯微鏡來(lái)成像。這使在生理性3D微環(huán)境(例如，用 于多種動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程的研究，如上皮細(xì)胞極化、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、胞吞作用、跨細(xì)胞作用、增殖、 凋亡等)中培養(yǎng)的細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像成為可能。具體而言，它使在用于包括藥物試驗(yàn)的多種 應(yīng)用的3D微環(huán)境中的一種細(xì)胞的高內(nèi)涵篩選(high-content screening)成為可能。本發(fā) 明的實(shí)施方式能夠使在控制圍繞細(xì)胞的微環(huán)境流體流動(dòng)的同時(shí)以3D培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物的成 像成為可能。本發(fā)明的實(shí)施方式也可以用于多種疾病的體外模型的建立，例如，癌癥形成、肝和 肺纖維化或病毒感染。通過(guò)引入不同的細(xì)胞類型或致病因素，能夠建立代表疾病預(yù)后的不 同階段的一系列模型。這樣的模型對(duì)研究疾病形成的潛在機(jī)制和測(cè)試用于疾病治療的潛在治療劑是有用的。實(shí)施例實(shí)施例I通過(guò)向試管中的細(xì)胞懸液加入NaIO4并將得到的混合物溫育15分鐘，用NaIO4修 飾!fepG2細(xì)胞(人肝臟細(xì)胞系)的細(xì)胞表面而在細(xì)胞表面上生成醛的突起。將修飾的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。細(xì)胞密度為約5百萬(wàn)至6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL。該培 養(yǎng)基包含DMEM、葡萄糖、FCS和青霉素/鏈霉素。將TIP連接體也溶解在培養(yǎng)基中。該TIP連接體為與聚乙烯亞胺(PEI)主鏈連接 的多個(gè)酰胼形成的聚合物分子。連接體濃度為約6 μ M至約8 μ M。在室溫下，使含有細(xì)胞和TIP連接體的培養(yǎng)基溶液通過(guò)圖17中顯示的微通道。微 型流體通道的大小為Icm (長(zhǎng)度)X0. 6mm (寬度)X0. Imm (高度)。該微型流體通道具有兩 個(gè)入口和一個(gè)出口。一列間隙為0. 02mm的0. 03mmX0. 05mm的橢圓形微型柱體位于微型流 體通道的中心部，其構(gòu)成了寬度為0. 2mm的細(xì)胞駐留間隔(生長(zhǎng)區(qū))。溶液以不同的流速通過(guò)通道。通過(guò)在微通道的出口端抽吸流體來(lái)驅(qū)動(dòng)流體流動(dòng)。觀察到在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)內(nèi)形成的細(xì)胞集合體。在圖4中顯示了代表性的細(xì)胞集合體 的共聚焦圖像。為了顯示細(xì)胞表面上的連接體的存在，使用與熒光染料結(jié)合的連接體。在 圖4中的連接體顯示為圍繞細(xì)胞的白色圓形區(qū)域。如圖4中所示，許多細(xì)胞被連接體分子 包被并且這些包被細(xì)胞中的一些彼此接觸，這表明連接體影響了三維細(xì)胞間的支撐。在圖5中顯示了細(xì)胞集合體的SEM圖像，其中存在短期連接體，但肉眼看不到。約5分鐘后，在由微型柱體限定的細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)內(nèi)形成了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在圖6中顯示 了在約0. 03mL/h的流速下在微通道內(nèi)形成的代表性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透射光圖像。在已經(jīng)完成接種后，使不含有TIP連接體和細(xì)胞的培養(yǎng)基流過(guò)流體通道。形成了 橫截面通常為矩形的條形細(xì)胞結(jié)構(gòu)。實(shí)施例II除了聚集條件不同外，與實(shí)施例1相同地形成對(duì)比細(xì)胞結(jié)構(gòu)。具體而言，對(duì)于給定 的細(xì)胞密度和TIP連接體濃度而言，該流速相對(duì)較慢。圖7顯示了這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透射光 圖像。能夠看到的是，在這些條件下，柱體間的間隙被細(xì)胞集合體堵塞。結(jié)果，形成的結(jié)構(gòu) 不具有界限清楚的形狀和尺寸。實(shí)施例III除了改變流速以確定用于特定裝置和細(xì)胞測(cè)試樣品的最佳灌注流速外，與實(shí)施例 1相同地形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)。用1天時(shí)間使細(xì)胞培養(yǎng)基以選自0. 01,0. 03,0. 06或0. 22mL/hr的流速流動(dòng)形成 各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)。用熒光活性染色(fluorescence viability staining)評(píng)價(jià)得到的結(jié)構(gòu)?；罴?xì)胞 被鈣黃綠素AM染色。死細(xì)胞被碘化丙啶(propidium iodide)染色。圖8、9、10和11顯示了分別在0. 01,0. 03,0. 06和0. 22mL/hr的流速下形成的代 表性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的共聚焦圖像。圖12中顯示了在不同流速下細(xì)胞的成活力。能夠看出，對(duì)于這種特定的排列和這 些細(xì)胞，在0.03mL/hr的流速下成活力最高(約80%)。在其他流速下，成活力約為50%。
不局限于任何特定的理論，可以預(yù)期的是在過(guò)高的流速下，施加在細(xì)胞上的高剪 切力或壓力能夠造成成活力的降低；而在過(guò)低的流速下，物質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)素)輸送的不足能夠引 起成活力的降低。實(shí)施例IV以與實(shí)施例I中描述的類似步驟使用依賴貼壁細(xì)胞(HepG2和大鼠骨干細(xì)胞)來(lái) 形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中流速為0. 03mL/hr,并培養(yǎng)3或14天。觀察到用最多為2周的時(shí)間在微 通道內(nèi)形成了被充分支撐的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)。使用熒光活性染色來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的成活力。使用絲狀肌動(dòng)蛋白染色評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)的3D 形態(tài)的保持。在分別培養(yǎng)3或14天后，結(jié)果顯示了優(yōu)異的細(xì)胞成活力和3D形態(tài)的保持。圖13為在培養(yǎng)3天后!fepG2細(xì)胞形成的代表性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的共聚焦圖像。圖14為 在微通道內(nèi)的相同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖15為在培養(yǎng)14天后原代大鼠BMSC細(xì)胞形成的代表性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的共聚焦圖像。 圖16為在微通道內(nèi)的相同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的SEM圖像。樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)的肌動(dòng)蛋白染色的共聚焦圖像(未顯示)還顯示了在樣品結(jié)構(gòu)中的 皮層肌動(dòng)蛋白的分布為典型的3-D形態(tài)。本領(lǐng)域技術(shù)人員從本說(shuō)明書(shū)和附圖能夠理解在上文中未提及的本申請(qǐng)描述的實(shí) 施方式的其他特征、益處和優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然，上述實(shí)施方式僅是為了解釋說(shuō)明絕不是為了限制。所述的實(shí)施方式容易進(jìn) 行形成、部件排列、細(xì)節(jié)和操作順序的許多改變。本發(fā)明意欲在由權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)涵 蓋所有這樣的改變。
權(quán)利要求
一種形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法，其包括向被柵欄部分圍繞的體積部分提供細(xì)胞和短期連接體，所述連接體有利于相鄰細(xì)胞的最初粘附，以形成細(xì)胞集合體，所述柵欄構(gòu)成了其大小能留住所述細(xì)胞集合體的分布式開(kāi)口；向所述體積部分提供包含細(xì)胞培養(yǎng)基的流體；通過(guò)所述開(kāi)口從所述體積部分收回所述流體；以及培養(yǎng)在所述體積部分內(nèi)留住的聚集細(xì)胞，以形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，在向所述體積部分提供所述流體前，將所述細(xì)胞懸浮 在所述流體中并將所述連接體溶解在所述流體中。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其包括使通過(guò)所述體積部分的所述流體保持流動(dòng)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述流體中的所述細(xì)胞的密度為約5百萬(wàn)至約6 百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，并且在所述流體中的所述短期連接體的濃度為約6 μ M至約8 μ M。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述開(kāi)口為分布式，以有利于通過(guò)所述 細(xì)胞結(jié)構(gòu)灌注所述細(xì)胞培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述柵欄設(shè)置在管道內(nèi)，并且所述流 體流經(jīng)所述管道。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述管道包括底部和從所述底部延伸的相對(duì)的側(cè)壁。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述柵欄包括從所述底部延伸并在所述側(cè)壁之間的 多個(gè)突起物。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述突起物包括微型柱體。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，將所述微型柱體大致排列成U-型圖形。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，兩個(gè)相鄰的所述微型柱體間的間隙為約10微米至 約50微米。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述連接體包含聚乙烯亞胺主鏈和與 所述主鏈鍵合的酰胼基團(tuán)。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述連接體的分子量為約2000道爾頓至約20000 道爾頓。
14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞包含醛基。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述細(xì)胞包括已經(jīng)過(guò)修飾而在所述修飾細(xì)胞的表 面上形成醛基的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞包括HepG2細(xì)胞或大鼠骨髓 干細(xì)胞。
17.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過(guò)在所述分布式開(kāi)口的下游施加抽 吸力來(lái)驅(qū)使所述流體的所述流動(dòng)。
18.一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其包括管道；在所述管道內(nèi)流動(dòng)的流體，所述流體包含細(xì)胞、短期連接體和細(xì)胞培養(yǎng)基，所述連接體 有利于相鄰細(xì)胞的最初粘附，以形成細(xì)胞集合體；以及在所述管道內(nèi)的柵欄，所述柵欄用于留住在所述流體內(nèi)形成的聚集細(xì)胞，所述柵欄構(gòu) 成了允許所述流體流經(jīng)的分布式開(kāi)口。
19.權(quán)利要求18所述的裝置，其中，所述柵欄包括大致排列成U-型圖形的多個(gè)突起物。
20.權(quán)利要求19所述的裝置，其中，所述突起物包括微型柱體。
21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的裝置，其中，所述管道具有底部和從所述底部延 伸的相對(duì)的側(cè)壁，所述突起物從所述底部延伸。
22.權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，在所述流體中的所述細(xì)胞的密度為 約5百萬(wàn)至約6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL，并且在所述流體中的所述短期連接體的濃度為約6 μ M至 約 8 μ M0
23.權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，將所述細(xì)胞懸浮在所述流體中。
24.權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，將所述連接體溶解在所述流體中。
25.權(quán)利要求18至24中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述連接體包含聚乙烯亞胺主鏈和 與所述主鏈鍵合的酰胼基團(tuán)。
26.權(quán)利要求25所述的裝置，其中，所述連接體的分子量為約2000道爾頓至約20000 道爾頓。
27.權(quán)利要求18至26中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述細(xì)胞包含醛基。
28.權(quán)利要求27所述的裝置，其中，所述細(xì)胞包括已經(jīng)過(guò)修飾而在所述修飾細(xì)胞的表 面上形成醛基的細(xì)胞。
29.權(quán)利要求18至28中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，所述細(xì)胞包括H印G2細(xì)胞或大鼠骨 髓干細(xì)胞。
30.權(quán)利要求18至29中任一項(xiàng)所述的裝置，其中，通過(guò)在所述分布式開(kāi)口的下游施加 抽吸力來(lái)驅(qū)動(dòng)所述流體。
全文摘要
在形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法中，向被柵欄部分圍繞的體積部分提供細(xì)胞和短期連接體。所述連接體有利于相鄰細(xì)胞的最初粘附，以形成細(xì)胞集合體。所述柵欄構(gòu)成了其大小能留住所述細(xì)胞集合體的分布式開(kāi)口。向所述體積部分提供包含細(xì)胞培養(yǎng)基的流體。通過(guò)開(kāi)口從所述體積部分收回流體。培養(yǎng)在所述體積部分內(nèi)留住的聚集細(xì)胞，以形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)。提供一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其包括管道和管道內(nèi)的柵欄。流體在所述管道內(nèi)流動(dòng)。所述流體包含細(xì)胞、短期連接體和細(xì)胞培養(yǎng)基。所述柵欄留住了在所述流體內(nèi)形成的聚集細(xì)胞，并構(gòu)成了允許所述流體流經(jīng)的分布式開(kāi)口。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101883842SQ200880118648
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者王兆民, 郁昂里 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局