專利名稱：樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及位于樹突狀細(xì)胞及其前體，特別是抗原呈遞樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面上 的蛋白質(zhì)鑒定。特別地，本發(fā)明涉及結(jié)合這些蛋白質(zhì)的化合物例如抗體。這些化合物可以 用于檢測和/或富集樹突狀細(xì)胞的子集或其前體。這些化合物還可以用于使抗原靶向樹突 狀細(xì)胞或其前體，以調(diào)節(jié)針對抗原的體液和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或用于將細(xì)胞毒素 劑靶向涉及疾病狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞或其前體。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞是在淋巴樣器官、血液和外周組織中稀疏分布的骨髓衍生的細(xì)胞，其 在免疫應(yīng)答起始和維持中是關(guān)鍵的。DC分享共同性質(zhì)例如抗原(Ag)加工和激活幼稚T細(xì)胞 (nai'veT cell)的能力。然而，DC是異源的，在小鼠中檢測出至少7種不同亞型(Shortman 和 Liu，2002)。DC可以廣泛分成常規(guī)DC (cDC)和類漿細(xì)胞DC前體(pDC)。pDC能夠分泌高水平 的IFNa并且僅在激活后發(fā)育成DC(0' Keeffe等人，2002 ;Hochrein等人，2001)。cDC可 以分成經(jīng)由淋巴從淋巴結(jié)(LN)遷移到外周組織的常規(guī)“遷移”或間質(zhì)DC(例如朗格罕氏 (Langerhans')細(xì)胞)，和不以這種方式遷移而是產(chǎn)生于血液傳播前體的“淋巴樣組織駐 留” DC (在脾、胸腺和LN中發(fā)現(xiàn))。小鼠的淋巴樣組織駐留DC依次可以分成CD4-8- (DN)、OMl (CD4+)和OM、+ (CD8+) cDC子集，其中CD4和DN統(tǒng)稱為CD8—DC。此外，存在由于感染或炎癥而發(fā)展的炎性 DC (Shortman和Naik，2007)。這些DC亞型共享許多功能，特別是將抗原(Ag)攝取、加工和 呈遞給幼稚T細(xì)胞。重要的是，DC還顯示子集特異性作用。不同DC亞型表達(dá)不同模式的Toll樣受體 (TLR)，并且隨后在其對不同感染應(yīng)答的能力方面不同(Proietto等人，2004，Takdea等人， 2003)。盡管趨化因子產(chǎn)生主要由⑶8_DC執(zhí)行，但⑶8+DC是指導(dǎo)Thl T細(xì)胞應(yīng)答的IL-12 的主要生產(chǎn)者。經(jīng)由MHC I類分子交叉呈遞外源Ags的能力是由⑶8+DC子集非常有效執(zhí)行 的活性(Pooley等人，2001 ;den Haan等人，2000)，這允許這些DC成為病毒Ag對CD8+T細(xì) 胞的主要呈遞者(Belz等人，2004 ;Smith等人，2003)。相比之下，⑶8_DC看起來更好地為 起始MHC II類限制應(yīng)答作準(zhǔn)備(Dudziak等人，2007 ；Schnorrer等人，2006)。DC表面上的分子在DC的識別、通訊和激活功能中是重要的。在DC亞型之間不同 的分子是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢灾С衷谶@些亞型之間觀察到的功能差異。此外，在DC類型 之間不同的表面分子是特別有利的，因?yàn)樗鼈兛梢猿洚?dāng)用于將Ag或治療劑選擇性遞送給 DC的信標(biāo)(beacon)，以便處理免疫應(yīng)答。針對DC細(xì)胞表面分子的抗體(Ab)已用于將Ag遞送給DC，并且誘導(dǎo)耐受(Bonifaz 等人，2002 ；Finkelman等人，1996)。對所靶向Ag的免疫也已得到誘導(dǎo)，盡管在大多數(shù)研究 中僅在抗體_抗原復(fù)合物與DC成熟試劑或佐劑共施用時(shí)(Bonifaz等人，2002 ；Carter等 人，2006)。重要的是，使用細(xì)胞表面分子靶向Ag且產(chǎn)生免疫的功效將依賴于幾個(gè)因素(i) 所靶向DC的子集；(ii)與所靶向分子的表達(dá)水平相關(guān)的劑量依賴性效應(yīng)；(iii)所靶向分子在除DC外的細(xì)胞類型上的表達(dá)，這可能限制靶向的有效性或潛在地引入由這些非DC產(chǎn) 生的貢獻(xiàn)；(iv)所靶向分子的功能，這可能影響Ag加工或遞送誘導(dǎo)或損害DC成熟的信號； (ν)所靶向DC子集的TLR譜，特別是在共施用TLR配體時(shí)。所有上述因素將影響在臨床背 景中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。必要時(shí)，在移植給人前，這些細(xì)節(jié)必須首先用實(shí)驗(yàn)動物例如小鼠 確定。因此，對于將Ag靶向DC和有效疫苗接種所需的是在小鼠和人之間保守的DC表面分 子，就分子和功能特征以及限制表達(dá)模式而言。 看起來人包含鼠類DC子集的等價(jià)物。因?yàn)槔矢窈笔霞?xì)胞的存在，所以分成cDC 和PDC是良好確定的。當(dāng)從相同組織來源(胸腺)中提取時(shí)(0' Keeffe等人，2003; Vandenabeele等人，2001)，小鼠和人DC之間的緊密相似性暗示緊密相似性。然而，大多數(shù) 鼠類“淋巴樣器官駐留"DC子集的人等價(jià)物仍是未知的，這是由于缺乏物種之間的保守表面 標(biāo)記物(即⑶8標(biāo)記物在人DC上不表達(dá))和獲得人淋巴樣器官樣品用于分析的困難。促 進(jìn)小鼠生物學(xué)轉(zhuǎn)變成人臨床應(yīng)用所需的是在小鼠、人和其他物種之間保守的DC子集特異 性標(biāo)記物分子的鑒定。此種表面分子可能允許通過利用不同DC亞型的特異性免疫功能修 改免疫應(yīng)答。需要鑒定可以用于將治療例如疫苗靶向樹突狀細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物。發(fā)明概述本發(fā)明人已鑒定了新的表面C型凝集素樣分子，5B6，其由小鼠pDC、⑶8+cDC以及 人DC亞型和樹突狀細(xì)胞前體優(yōu)先表達(dá)。發(fā)現(xiàn)抗原經(jīng)由5B6分子靶向遞送給DC增強(qiáng)針對抗 原的免疫應(yīng)答。即使在不存在另外佐劑的情況下也獲得這點(diǎn)。因此，本發(fā)明人已鑒定了新 的表面標(biāo)記物，其尤其可以用于鑒定小鼠⑶8+DC及其人配對物，并且將抗原遞送給DC或其 前體，以處理免疫應(yīng)答且增強(qiáng)疫苗有效性。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合多肽的化合物，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列；和/或iii) i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物是多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物是抗體或其抗原結(jié)合片段。此種抗體的例子包括 但不限于，單克隆抗體、人源化抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體或四抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其包 括與SEQ ID NO 44至46或49至51中任何一個(gè)至少90%等同的氨基酸序列。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括包含3個(gè)CDR的免疫球 蛋白重鏈或其片段，并且其中i)⑶Rl包括與SEQ ID NO 44至少90%等同的氨基酸序列，ii)⑶R2包括與SEQ ID NO 45至少90%等同的氨基酸序列，和iii)OTR3包括與SEQ ID NO 46至少90%等同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括包含3個(gè)CDR的免疫球蛋白輕 鏈或其片段，并且其中i)⑶Rl包括與SEQ ID NO 49至少90%等同的氨基酸序列，ii)⑶R2包括與SEQ ID NO 50至少90%等同的氨基酸序列，和
iii)CDR3包括與SEQ ID NO 51至少90%等同的氨基酸序列。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括i)包括可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述可變區(qū)包括與SEQ ID NO :43至 少90%等同的氨基酸序列，和/或ii)包括可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述可變區(qū)包括與SEQ ID NO 48至 少90%等同的氨基酸序列。在另外一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括 i)包括可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述可變區(qū)包括與SEQ ID NO :42至 少90%等同的氨基酸序列，和/或ii)包括可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述可變區(qū)包括與SEQ ID NO 47至 少90%等同的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是24/04-10B4(在本文中也稱為10B4)、42/04_42D2 (在 本文中也稱為42D2)、20/05-3A4 (在本文中也稱為3A4)或23/05-4C6 (在本文中也稱 為 4C6)，或包括 24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4 或 23/05-4C6 的至少一個(gè)互補(bǔ) 決定區(qū)的抗體?？贵w24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4和23/05-4C6通過雜交瘤 細(xì)胞系 24/04-10B4-24-8、42/04-42D2-66-4-l、20/05-3A4-26-16、23/05-4C6-29-3 產(chǎn) 生，所述雜交瘤細(xì)胞系于2007年12月11日分別以保藏參考號07121101、07121102、 07121103和07121104保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)。這些雜交瘤的更高抗體分泌亞克隆(24/04-10B4-24-8-FACS9-5、 42/04-42D2-66-4-l-Clone 4、20/05-3A4-26-16_Clone 5、23/05-4C6-29-3_Clone 5)于 2008年4月29日分別以保藏參考號08042901、08041902、08042903和08042904保藏于 ECACC0本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)5B6的可溶性片段能夠與全長膜結(jié)合5B6結(jié)合。因此，在一個(gè) 備選實(shí)施方案中，化合物是多肽的可溶性片段，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，其中可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40、至少約50、至 少約55、或至少約100個(gè)N末端殘基。優(yōu)選地，可溶性片段包括多肽的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可溶性片段包括i)如SEQ ID NO 58至61中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQ ID NO 58至61中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，其中可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40個(gè)N末端殘基， 并且其中可溶性片段能夠結(jié)合包括如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列的 多肽。優(yōu)選地，化合物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，化合物結(jié)合除SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40、至少約50、至少約55、或至少約100個(gè)N末端殘基外的多肽區(qū)域。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了與結(jié)合多肽的抗體競爭性結(jié)合所述多肽的化合物， 其中多肽包括如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4和/或 23/05-4C6。本發(fā)明的化合物可以用于將治療劑遞送給樹突狀細(xì)胞或其前體，特別是抗原呈遞 樹突狀細(xì)胞。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物與治療劑綴合。此種試劑的例子包 括但不限于抗原、細(xì)胞毒素劑、藥物和/或藥理學(xué)試劑?？乖梢允窃趧游镏姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何分子。例子包括但不限于癌抗原、自身 抗原、變應(yīng)原和/或來自致病性和/或傳染性生物體的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自致病性和/或傳染性生物體的抗原可以來自但不限于惡 性皰原蟲(Plasmodium falciparum)或間日皰原蟲(Plasmodium vivax)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物是被可檢測標(biāo)記的。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物是分離和/或重組化合物。還提供的是能夠產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的穩(wěn)定抗體產(chǎn)生細(xì)胞系。此種細(xì)胞系的例子 是于2007年12月11日以保藏參考07121101保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的 24/04-10B4,及其于2008年4月29日以保藏參考08042901保藏于ECACC的更高生產(chǎn)亞克 隆，于2007年12月11日以保藏參考07121102保藏于ECACC的42/04-42D2，及其于2008 年4月29日以保藏參考08041902保藏于ECACC的更高生產(chǎn)亞克隆，于2007年12月11日 以保藏參考07121103保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的20/05-3A4，及其于2008年 4月29日以保藏參考08042903保藏于ECACC的更高生產(chǎn)亞克隆，和于2007年12月11日 在保藏參考07121104保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的23/05-4C6，及其于2008年 4月29日以保藏參考08042904保藏于ECACC的更高生產(chǎn)亞克隆。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的 組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括佐劑在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物封裝在脂質(zhì)體中或暴露于脂質(zhì)體表面上。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給受 試者施用本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞應(yīng)答來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過⑶4+和/或⑶8+T細(xì)胞激活來調(diào)節(jié)免疫應(yīng) 答。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過增強(qiáng)B細(xì)胞抗體產(chǎn)生來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。所 產(chǎn)生抗體的例子包括但不限于IgGl、IgG2b、IgG2c和/或IgG3抗體同種型。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過產(chǎn)生記憶應(yīng)答來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，給受試者施用與抗原綴合的本發(fā)明的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，針對自身抗原或變應(yīng)原的免疫應(yīng)答是減少的。在這個(gè)實(shí)施 方案中，優(yōu)選通過抑制T細(xì)胞應(yīng)答和/或B細(xì)胞抗體應(yīng)答來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的方法，該 方法包括使樹突狀細(xì)胞或其前體在體外暴露于本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的組合物，并 且將所述細(xì)胞施用于受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞已從受試者中分離。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)體液和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)幼稚⑶8+T細(xì)胞激活和/或幼稚⑶4+T細(xì)胞激 活。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，體液應(yīng)答包括IgGl、IgG2b、IgG2c和/或IgG3抗體同種 型的產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，體液應(yīng)答至少包括IgGl抗體同種型的產(chǎn)生。優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞是動物樹突狀細(xì)胞或動物樹突狀細(xì)胞的前體。更優(yōu)選地，樹突 狀細(xì)胞是人樹突狀細(xì)胞。更加優(yōu)選地，人樹突狀細(xì)胞是Necl-2+、HLA DR+和/或BDCA-3+。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病 的方法，該方法包括給受試者施用本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，該方法施用與細(xì)胞毒素劑、藥物和/或藥理學(xué)試劑綴合的化合物。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾 病的方法，該方法包括給受試者施用分離的多核苷酸和/或編碼所述多核苷酸的構(gòu)建體， 當(dāng)其存在于受試者的細(xì)胞中時(shí)，與缺乏所述多核苷酸的細(xì)胞相比較時(shí)，其調(diào)節(jié)細(xì)胞中多肽 的活性水平，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸下調(diào)細(xì)胞中多肽的活性水平。此種多核苷酸的 例子包括但不限于，反義多核苷酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和雙鏈RNA。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，所述多核苷酸上調(diào)多肽的活性水平。例如，多核苷酸編碼 包括如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列的多肽。涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病例子包括但不限于癌癥、感染、自身免疫疾病或 過敏癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫疾病是紅斑狼瘡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，感染是瘧原蟲屬物種(Plasmodium sp.)，例如惡性瘧原蟲 或間日瘧原蟲感染。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的組合物在制造用于 調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了關(guān)于在體外暴露于本發(fā)明的化合物和/或本發(fā) 明的組合物的樹突狀細(xì)胞或其前體在制造用于調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的藥物 中的用途。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的組合物在制造用 于治療和/或預(yù)防受試者中涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的藥物中的用途。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了富集來自樣品的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的 方法，所述方法包括i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與本發(fā)明的化合物接觸，和
ii)分離與化合物結(jié)合的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了富集來自樣品的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方 法，其包括i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸接觸，所述 第一種多核苷酸與編碼多肽的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和ii)分離可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將從上述2種方法的步驟ii )中獲得的細(xì)胞施用于受試 者。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用細(xì)胞以治療和/或預(yù)防選自癌癥、感染、自身免疫疾病或過敏 癥的疾病。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方 法，其包括；i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與本發(fā)明的化合物接觸，ii)檢測與化合物結(jié)合的細(xì)胞。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方 法，其包括；i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸接觸，所述 第一種多核苷酸與編碼多肽的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和ii)檢測可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測受試者中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方 法，其包括；i)給受試者施用本發(fā)明的化合物，ii)檢測與化合物結(jié)合的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物是可檢測標(biāo)記的。然而，如技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，可以 使用其他操作，例如使用結(jié)合化合物的可檢測標(biāo)記的第二種抗體。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了檢測受試者中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的 方法，其包括；i)給受試者施用可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸，所述第一種多核苷酸與編碼多肽 的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和ii)檢測可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞表達(dá)一種或多種下述標(biāo)記物，⑶8、⑶24、 Necl-2、CDl lc、HLADR 和 BDCA3。優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞是人樹突狀細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種下述標(biāo)記物，Necl-2、 HLADR 禾口 BDCA 3。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞是鼠類樹突狀細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種下述 標(biāo)記物，CD24、Necl-2、CDllc 和 CD8。優(yōu)選地，前體樹突狀細(xì)胞是中期或晚期前體樹突狀細(xì)胞，其能夠在培養(yǎng)中分化成 樹突狀細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)移到受輻射的接受者內(nèi)。優(yōu)選地，受試者是動物。更優(yōu)選地，受試者是哺乳動物例如人、犬、貓、馬、?；蚓d 羊。最優(yōu)選地，受試者是人。本發(fā)明人也已鑒定某些B細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多肽?？梢酝ㄟ^靶向本領(lǐng)域已知的任 何B細(xì)胞標(biāo)記物例如CD19，將此種細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞或其前體區(qū)分和/或分離。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基本上純化和/或重組多肽，其包括 i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列；和/或iii)i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。優(yōu)選地，多肽是樹突狀細(xì)胞或其前體標(biāo)記物。優(yōu)選地，多肽包括至少一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，多肽包括單個(gè)C型凝 集素樣結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。在本文中提供了此種可溶性片段的例 子。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)活性和/或抗原片段是可溶性片段，其包括i)如SEQ ID NO 58至61中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQ ID NO 58至61中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，其中可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40個(gè)N末端殘基， 并且其中可溶性片段能夠結(jié)合包括如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列的 多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包括跨膜結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，多肽可以從樹突狀細(xì)胞或其前體純化。優(yōu)選地，多肽可以從動物或由其而來的細(xì)胞純化。更優(yōu)選地，多肽可以從哺乳動物 例如人、犬、貓、馬、?；蚓d羊純化。最優(yōu)選地，多肽可以從人純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽與至少一種其他多肽融合。至少一種其他多肽可以是 增強(qiáng)本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性的多肽，或幫助純化或檢測融合蛋白的多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的和/或外源的多核苷酸，其包括i)如SEQ ID NO 9至16中任何一個(gè)中提供的核苷酸序列；ii)與SEQ ID NO 9至16中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的核苷酸序列；iii)編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，iv)編碼本發(fā)明的化合物的核苷酸序列；和/或ν)與i)至iv)中任何一個(gè)或多個(gè)或其互補(bǔ)體雜交的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包括在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 9至16中任何一個(gè) 或多個(gè)雜交的核苷酸序列。優(yōu)選地，多核苷酸與能夠指導(dǎo)多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子可操作地連接。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，當(dāng)其存在于受試者的細(xì)胞中 時(shí)，與缺乏所述多核苷酸的細(xì)胞相比較，其調(diào)節(jié)細(xì)胞中本發(fā)明的多肽的活性水平。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸與能夠指導(dǎo)多核苷酸在動物的細(xì)胞中的表達(dá)的啟動 子可操作地連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多核苷酸下調(diào)來自編碼多肽的基因的mRNA水平。此種多 核苷酸的例子包括但不限于，反義多核苷酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和雙 鏈 RNA (dsRNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義多核苷酸在生理?xiàng)l件下與包括如SEQ IDNO 9至16中提 供的任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，催化多核苷酸能夠切割包括如SEQ ID NO 9至16中提供的 任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，dsRNA分子包括寡核苷酸，其包括如SEQ ID NO 9至 16中提供的任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的至少19個(gè)鄰接核苷酸，其中T由U替換，其中其 為雙鏈的分子部分的長度是至少19個(gè)堿基對，并且包括所述寡核苷酸。在另外一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，dsRNA分子從單個(gè)啟動子表達(dá)，其中雙鏈部分的 鏈通過單鏈部分連接。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，多核苷酸上調(diào)來自編碼多肽的基因的mRNA水平。例如， 多核苷酸編碼多肽。還提供的是包括本發(fā)明的至少一種多核苷酸的載體。優(yōu)選地，載體是表達(dá)載體。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的至少一種多核苷酸、和/或本發(fā) 明的至少一種載體的宿主細(xì)胞。細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型，例如但不限于細(xì)菌、酵母、動物、 昆蟲或植物細(xì)胞。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，外源多核苷酸編碼本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼與抗原綴合的本發(fā)明的化合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因非人動物。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的植物和/或本發(fā) 明的動物的提取物，其中提取物包括本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的多核 苷酸。還提供的是用于制備本發(fā)明的化合物或本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括在允許 編碼化合物或多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的載體、本發(fā) 明的植物和/或本發(fā)明的非人動物，并且回收所表達(dá)的化合物或多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的化合物或多肽。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法獲得的樹突狀細(xì)胞和/或其 前體的富集的群體。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了表達(dá)多肽的樹突狀細(xì)胞和/或其前體的富集的 群體，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列；和/或iii)i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞和/或其前體的富集的群體獲得的，擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞群體和/或其前體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載 體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物和/或本發(fā)明的細(xì)胞群體， 和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定與本發(fā)明的多肽結(jié)合的分子的方法，該方法 包括i)使本發(fā)明的多肽與候選化合物接觸，ii)測定化合物是否結(jié)合多肽。 在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了鑒定與本發(fā)明的多肽結(jié)合的分子，該方法包 括a)使本發(fā)明的多肽暴露于結(jié)合所述多肽的結(jié)合配偶體和候選試劑，和b)評估候選試劑與結(jié)合配偶體競爭結(jié)合所述多肽的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體是抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體是多肽 的可溶性片段，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，其中可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40、至少約50、至 少約55個(gè)N末端殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體是可檢測標(biāo)記的。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多肽在細(xì)胞中表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了篩選與本發(fā)明的多肽結(jié)合的化合物的方法，該方法 包括使用多肽晶體的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(coordinate)就其與多肽結(jié)合的能力計(jì)算評估候選化合 物。還提供的是使用本發(fā)明的方法鑒定的化合物。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括 給受試者施用本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，給受試者施用包括多核苷酸的DNA疫苗，所述多核苷酸編碼 與抗原綴合的本發(fā)明的化合物，其中在施用于受試者后產(chǎn)生化合物并且產(chǎn)生針對抗原的免 疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，給受試者經(jīng)口施用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或其提取物。優(yōu)選 地，轉(zhuǎn)基因植物或其提取物包括與抗原綴合的本發(fā)明的化合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法 包括使樹突狀細(xì)胞或其前體在體外暴露于本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載 體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或 本發(fā)明的組合物，并且將所述細(xì)胞施用于受試者。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病 的方法，該方法包括給受試者施用本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā) 明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的組合物。還提供的是本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì) 胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的組合物，在 制造用于調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。還提供的是在體外暴露于本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā) 明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的 組合物的樹突狀細(xì)胞或其前體，在制造用于調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的 用途。還提供的是本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì) 胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的組合物，在 制 造用于治療和/或預(yù)防受試者中涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的藥物中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的化合物的方法，該方法包括給動物施 用本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體和/或本發(fā)明的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括從動物中分離結(jié)合多肽的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使來自動物的細(xì)胞與骨髓瘤腫瘤細(xì)胞融 合，以產(chǎn)生雜交瘤，所述動物產(chǎn)生結(jié)合多肽的抗體。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的 細(xì)胞系、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn) 基因植物、本發(fā)明的提取物、本發(fā)明的細(xì)胞群體和/或本發(fā)明的組合物。如顯而易見的，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性可應(yīng)用于本發(fā)明的許多其他 方面。本說明書自始至終單詞“包括”或其變化“包含”、“含有”應(yīng)理解為暗示包括所述 元素、整數(shù)或步驟，或元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟，或元素、 整數(shù)或步驟的組。本發(fā)明在下文中通過下述非限制性實(shí)施例和參考附圖進(jìn)行描述。附圖簡述

圖1.由小鼠(m)和人(h)5B6基因編碼的基因組結(jié)構(gòu)和預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。編碼 (A)小鼠和⑶人5B6的全長cDNA。(C)由小鼠和人5B6編碼的預(yù)測的蛋白質(zhì)序列的蛋白 質(zhì)序列比對。序列同一性以深灰色突出顯示，相似性以淺灰色顯示。箭頭指示外顯子邊界。
(D)示意性表示通過cDNA分別與C57BL/6J小鼠的基因組序列數(shù)據(jù)庫(2006年2月的UCSC 集合)和人數(shù)據(jù)庫(2006年3月的UCSC集合)比對測定的小鼠和人5B6的基因結(jié)構(gòu)。編 碼5B6基因的編碼區(qū)的外顯子由黑框指示，并且外顯子和內(nèi)含子的大小(bp)在下面顯示。
(E)小鼠和人5B6蛋白質(zhì)的圖示。圖2.小鼠和人5B6(Clec9A)的CTLD與共享序列同源性的蛋白質(zhì)的比對。包括大 鼠甘露糖結(jié)合蛋白A (MBP-A)用于作為常規(guī)C型凝集素結(jié)構(gòu)域比較，所述常規(guī)C型凝集素樣 結(jié)構(gòu)域具有功能性碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域?；疑蛑甘颈Ｊ貧埢?，(+)指示可能涉及蛋白質(zhì) 同二聚化的另外一對半胱氨酸殘基，(*)標(biāo)記預(yù)測形成二硫鍵的保守半胱氨酸殘基。MBP-A 中連接的Ca2+的殘基指定為1和2。圖3.小鼠5B6的基因表達(dá)譜。實(shí)時(shí)RT-PCR用于研究相對于在㈧淋巴樣器官穩(wěn)態(tài)DC包括脾cDC子集；DN、CD4+和CD8+、胸腺cDC子集；CD丨和CD8+、LN cDC子集；CD8\ CD8+、皮膚和朗格罕氏細(xì)胞(LC)中以及在胸腺和脾pDC中的Gapdh的5B6基因表達(dá)譜。(B) 造血細(xì)胞包括胸腺細(xì)胞(thym)、淋巴結(jié)(LN)B和T細(xì)胞、脾(spl)B和T細(xì)胞、NK細(xì)胞、未成 熟巨噬細(xì)胞(im mac)、成熟巨噬細(xì)胞(mat mac)、脾pDC和cDC。(C)從穩(wěn)態(tài)(靜止)小鼠 和在體內(nèi)用LPS和CpG激活3小時(shí)后分離的脾cDC。
圖4.m5B6(Clec9A)蛋白質(zhì)在DC和其他造血細(xì)胞上的表面表達(dá)。(A)對DC 進(jìn)行純化且通過4色免疫熒光染色進(jìn)行表面標(biāo)記。DC用針對⑶llc(N418-PeCy7)、 CD45RA(14. 8-APC)、CD8 (53-6. 7_APC_Cy7)禾Π m5B6(10B4_ 生物素)的 mAb 染色。脾 DC 還用 CD4 (GK1. 5-FITC)染色，胸腺 DC 用 Sirp α (p84_FITC)染色，并且皮下 LN DC 用 CD205(NLDC-145-FITC)染色。脾 cDC 分成 CD4+cDC(CDllhiCD45RATD4+CD8)、 DN cDC (CDl lhiCD45RATD4TD8l 禾口 CD8+cDC (CDl lhiCD45RATD8+CD[)；胸腺 cDC 分成 CD8"cDC(Sirp α hiCD8l0)禾口 CD8+cDC (Sirp α loCD8+)；并且 LN cDC 分 成 CD8_cDC(CDllc+CD205_CD8_)、皮膚 cDC(CDllc+CD205intCD8_)、朗格罕氏細(xì)胞 (CDllc+CD205hiCD8l 和 CD8+cDC(CDllc+CD205hiCD8+)，如先前描述的(Lahoud 等人，2006)。 pDC 鑒定為 CDllcintCD45RA+。脾細(xì)胞用針對 CD3(KT3_1. 1-FITC)、CD19 (lD3-PeCy7)、 NKl. l(PK136-PeCy7)、CD49b(Hma 2-APC)的 mAb 染色，并且鑒定了 B 細(xì)胞(CD19+CD3，、T 細(xì) 胞(⑶19—CD3+)和NK細(xì)胞(ΝΚ1. l+CD49b+⑶3_)。脾巨噬細(xì)胞如材料與方法中所示進(jìn)行富集， 并且用CDl lb (Ml/70-Cy5)和F4/80-FITC染色，并且鑒定為CDl lbhiF4/80+。骨髓細(xì)胞和脾細(xì) 胞用針對CDllb(Ml/70-Cy5)和Ly6C (5075-3. 6-FITC)的mAb染色，并且單核細(xì)胞鑒定為側(cè) 面散射lt5LyechiCDl Ibhi。骨髓巨噬細(xì)胞是Ly6CintCDl Ibhi。細(xì)胞群體用SA-PE進(jìn)行復(fù)染色，并 且就m5B6表達(dá)進(jìn)行分析。實(shí)線表示在門控細(xì)胞上的m5B6染色，虛線表示用同種型匹配對照 對門控細(xì)胞的染色。(B)脾DC的富集制備物用針對m5B6(10B4-生物素)、CDllc(N418-量 子點(diǎn) 655)、CD8 a (YTS-169-PercpCy5. 5 和 CD24 (Ml/69-Alexa 633)和 120G8-FITC 的 mAb 染色，隨后用 SA-PE 進(jìn)行復(fù)染色。pDC (CDl 1 cint 120G8+)和 cDC(CDllchi120G8-)就 m5B6 的表 達(dá)進(jìn)行分析。111586表達(dá)與在00(上的^8 0和⑶24表達(dá)相關(guān)。大多數(shù)脾pDC表達(dá)m5B6。 (C)血液DC的富集制備物與脾DC(B)使用相同mAb平行染色，并且使用等同門控策略進(jìn)行 分析。血液DC不表達(dá)⑶8 α，但表達(dá)⑶24。類似于脾DC，表達(dá)⑶24的血液DC還共表達(dá)來 自血液的5B6pDC，如同其脾配對物，表達(dá)m5B6。圖5. 5B6 (CLEC9A)在人和獼猴DC和造血細(xì)胞上的表達(dá)。(A)分離人和獼猴外周血 單核細(xì)胞(PBMC)，并且用針對HLADR、BDCA3、5B6以及包括⑶3 (Τ細(xì)胞)、⑶14 (單核細(xì)胞)、 CD19 (B細(xì)胞)和CD56 (自然殺傷細(xì)胞)的PE綴合譜系混合物(cocktail)的mAb進(jìn)行表 面免疫熒光標(biāo)記。對血液DC進(jìn)行門控為HLADR+譜系(ΡΕΓ，并且就其5B6(人和獼猴)和 BDCA3 (人)的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步分析。(B)人PBMC用針對所需的表面標(biāo)記物和5B6的mAb 進(jìn)行表面免疫熒光標(biāo)記。對單核細(xì)胞(⑶14+)、NK細(xì)胞(NKp46+)、T細(xì)胞(⑶3+)和B細(xì)胞 (CD19+)進(jìn)行門控，并且就其5B6的表達(dá)進(jìn)行分析(實(shí)線)。虛線表示用同種型匹配對照對 所門控的細(xì)胞進(jìn)行染色。(C) 5B6在人血液DC上的表達(dá)。分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)， 并且使用小鼠抗人抗體的混合物(FMC17(CD14)、FMC63和Bl (CD19和CD20)和BC3(CD3)) 耗盡單核細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞，隨后去除抗小鼠磁珠(Biomag)。細(xì)胞的富集制備物用針對 HLADR (L243-APCCy7)、5B6 (10B4-APC 或 4C6-APC)和 BDCA-3 (AD5-14H12-FITC)的 mAb 進(jìn)行表面免疫熒光標(biāo)記。對血液DC進(jìn)行門控為HLADR+，并且就其BDCA3和5B6的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一 步分析。虛線表示門控細(xì)胞的本底染色。圖6.使用抗m5B6 mAb 10B4 (在該圖中稱為抗Clec9A)靶向DC誘導(dǎo)了有效的 體液應(yīng)答。(A, B)小鼠用 2yg(n = 5)、0.4yg(n = 5)、0.08yg(n = 5)或 0· 016 μ g(η =4)抗m5B6mAb (10B4)，或用50 μ g(n = 5)和10 μ g(n = 5)非靶向同種型對照 mAb-1 (eBioscience)，或用 50 μ g(n = 2)內(nèi)部同種型對照 mAb_2 (GLl 17)進(jìn)行 i. v.注射。在 (A)第2周和(B)第4周時(shí)，通過ELISA測量血清抗大鼠反應(yīng)性。描繪了平均滴度+/-SEM。 滴定實(shí)驗(yàn)執(zhí)行2次，并且顯示了一次代表性實(shí)驗(yàn)。10 μ g劑量應(yīng)答表示5次實(shí)驗(yàn)的累積數(shù)據(jù) (第2周；η = 20，第4周；η = 19)。(C)小鼠(η = 5)用10 μ g抗m5B6mAb或非靶向同種 型對照mAb-1 (eBioscience)進(jìn)行i. v.注射。在第2、4和6周時(shí)收集血清樣品，這之后小 鼠用10口8非靶向同種型對照11^-2出1^117)進(jìn)行注射。在第2、4、6、8周時(shí)，通過ELISA測 量血清抗大鼠Ig反應(yīng)性，并且呈現(xiàn)為平均滴度+/-SEM。(D)小鼠用10μ g抗m5B6mAb(n = 7)或非靶向同種型對照mAb-2(GL117 ;n = 4)進(jìn)行i. v.注射。在第4周時(shí)，通過ELISA測 量血清抗大鼠Ig反應(yīng)性的同種型。條形圖描繪了平均滴度+/-SEM。滴定實(shí)驗(yàn)執(zhí)行2次，并 且呈現(xiàn)了代表性數(shù)據(jù)。
圖7.通過使用抗m5B6 mAb 10B4 (在該圖中稱為抗Clec9A)靶向DC誘導(dǎo)的體 液免疫的性質(zhì)。C57BL/6 或(A) C57BL/6TRIF+MyD88+或(B) C57/BL6FcR γ + 或(C)C57/ BL6nu/nu小鼠用10 μ g抗m5B6mAb (10B4)或非靶向同種型對照mAb_2 (GL117)進(jìn)行i. v.注 射。(D) C57BL/6小鼠用10 μ g抗m5B6mAb或非靶向同種型對照mAb_2 (GLl 17)，連同或連同 LPS (IOng)進(jìn)行i. v.注射。(E) IOyg OVA綴合的抗m5B6mAb或OVA綴合的非靶向同種型 對照mAb-2(GL117)或(F)升高劑量的游離OVA i. v.注射到C57BL/6小鼠內(nèi)。在第4周時(shí) 通過ELISA測量血清抗大鼠Ig Ab滴度。每個(gè)圓圈表示個(gè)別小鼠，組的幾何平均值由線描 繪。實(shí)驗(yàn)執(zhí)行2-4次，具有相似結(jié)果，除執(zhí)行1次的(C)和(E)夕卜。圖8.使用m5B6-0VA 10B4 (在該圖中稱為抗Clec9A_0VA)將Ag靶向DC引發(fā)了 CD4 和⑶8T細(xì)胞增強(qiáng)應(yīng)答。將OVA特異性轉(zhuǎn)基因⑶8 (OT-I)或⑶4 (OT-II) T細(xì)胞(106)過繼轉(zhuǎn) 移到首次用于實(shí)驗(yàn)的C57/BL6Ly5. 1小鼠內(nèi)。1天后，小鼠用2. 5 μ g抗m5B6_0VA(η = 3)或 非靶向同種型對照OVA mAb-2 (GLl 17 ；η = 3)進(jìn)行i. v.注射，或不進(jìn)行免疫(η = 2)。mAb 注射后3天，處死小鼠并且收獲脾。細(xì)胞用針對Ly5. 2(S. 450-15. 2-PE)和CD4(GK1. 5-APC) 或⑶8 (YTS169-APC)的mAb染色，并且通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)增殖CFSE標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因T細(xì) 胞，(A) OT-I (Ly5.2+CD8+)或(B) 0Τ-ΙΙ (Ly5. 2+CD4+)。OVA特異性T細(xì)胞的增殖應(yīng)答作為通 過流式細(xì)胞術(shù)的CFSE熒光喪失而可見。如材料與方法中所述計(jì)數(shù)增殖OT-I細(xì)胞和OT-II 細(xì)胞總數(shù)目/脾，并且數(shù)據(jù)呈現(xiàn)+/-SEM。實(shí)驗(yàn)用2. 5 μ g OVA綴合的mAb執(zhí)行2次，并且用 5 μ gOVA綴合的mAb執(zhí)行1次，具有相似結(jié)果。圖9.用抗m5B6-0va (在該圖中稱為10B4) 10B4-0VA綴合物注射小鼠將Ag遞送給 CD8+DC和引發(fā)的OVA特異性⑶8T細(xì)胞。3只小鼠用IOyg OVA綴合的10B4 (抗5B6mAb)或 OVA綴合的同種型對照mAb(GL117)進(jìn)行皮下免疫。1天后，處死小鼠，從脾中分離DC，并且 通過流式細(xì)胞術(shù)分選成⑶8+、⑶4+或⑶4TD8_ (DN) DC子集。使分級劑量的DC與CFSE標(biāo)記 的OT-I細(xì)胞一起溫育，并且培養(yǎng)3天。通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)增殖OT-I細(xì)胞。僅由5B6特 異性mAb靶向的⑶8+DC誘導(dǎo)顯著OT-I細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)是2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
圖10.抗5B6 Ab(10B4)經(jīng)由不同施用途徑和在佐劑的存在或不存在下在抗原遞 送方面高度有效。(A). 10B4抗體經(jīng)由不同施用途徑誘導(dǎo)強(qiáng)體液應(yīng)答。C57/BL6小鼠組(η =5)用10μ g 10B4mAb或同種型對照mAb(GL117)進(jìn)行i. v.、s. c.或i. p.注射。2周收 集血清樣品，并且通過ELISA定量血清抗大鼠Ig反應(yīng)性。(B). 10B4抗體連同或不連同佐劑 誘導(dǎo)強(qiáng)體液應(yīng)答。在不存在或存在LPS(1 μ g)或CpG(10 μ g)下，C57/BL6小鼠組(η = 5) 用2 μ g 10B4mAb或同種型對照mAb (GLl 17)進(jìn)行i. v.注射。陽性對照小鼠用GLl 17和鋁 進(jìn)行i.P.注射。在初始注射后2、4和6周獲得血清樣品。小鼠隨后用IOyg同種型對照 mAb (GLl 17)進(jìn)行加強(qiáng)，并且2周后獲取血清樣品。通過ELISA定量血清抗大鼠Ig反應(yīng)性。圖11. 5B6的可溶性片段與膜結(jié)合5B6結(jié)合。(A).對于小鼠和人5B6產(chǎn)生的可 溶性蛋白質(zhì)的氨基酸序列。對于小鼠5B6和人5B6各自產(chǎn)生2種構(gòu)建體，包括莖和C型凝 集素樣結(jié)構(gòu)域兩者的原始構(gòu)建體，和包括C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域但不包括莖區(qū)的可溶性蛋白 質(zhì)2/3構(gòu)建體。在該圖中，IL3前導(dǎo)序列是斜體且單下劃線的，生物素化共有序列是斜體 且雙下劃線的，F(xiàn)LAG標(biāo)簽是斜體且具有波浪線下劃線的。5B6序列以紅色顯示。(B).可 溶性5B6與在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上的膜結(jié)合5B6結(jié)合。293T細(xì)胞用編碼全長未標(biāo)記 m5B6 (293T-m5B6)、h5B6 (293T-h5B6)或不含DNA(293T)的表達(dá)構(gòu) 建體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，以產(chǎn) 生表達(dá)膜結(jié)合m5B6或h5B6的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞。2天后，收獲細(xì)胞并且使用可溶性FLAG標(biāo)記的 m5B6和h5B6 (具有來自原始構(gòu)建體的莖)和可溶性FLAG標(biāo)記的Cire進(jìn)行表面免疫熒光標(biāo) 記。使用生物素化抗FlagmAb 9H10和鏈霉親和素PE檢測結(jié)合?；罴?xì)胞在前向散射和碘化 丙啶排除上進(jìn)行門控，并且相對于用抗Flag Ab和鏈霉親和素-PE染色的對照(虛線)，就 其可溶性5B6 (實(shí)線)的表面結(jié)合進(jìn)行分析。(C).可溶性5B6與膜結(jié)合5B6的結(jié)合不依賴 于莖。未轉(zhuǎn)染或用編碼全長未標(biāo)記的膜結(jié)合m5B6(CH0-m5B6)的表達(dá)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞，使用生物素化的可溶性FLAG標(biāo)記的m5B6和h5B6 (包括或不包括莖，如指示的)以及 生物素化的可溶性FLAG標(biāo)記的Cire進(jìn)行表面免疫熒光標(biāo)記。使用鏈霉親和素PE檢測結(jié) 合?；罴?xì)胞在前向散射上進(jìn)行門控，并且相對于用鏈霉親和素-PE染色的對照(虛線)，就 其生物素化可溶性5B6(實(shí)線)的表面結(jié)合進(jìn)行分析。圖12.如所述的分離DC前體或Flt3配體產(chǎn)生的DC(FL DC)。多潛能前體 (MPP)鑒定為IinXDl 17+sca-l+CD34+0體外產(chǎn)生的Pre-DC鑒定為來自培養(yǎng)的CFSElow IinXDllc+ 細(xì)胞。FL DC 如下定義；對 pDC 門控為 CDllc+CD45RA+ ；Sirp α +cDC 門控為 CDllc+CD45RA_Sirp α +，并且 Sirp α _cDC 門控為 CDllc+CD45RA_Sirp α _。本底染色水平(由 折線指示)通過用所需抗體染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，以限定細(xì)胞群體。5Β6表達(dá) (由實(shí)線指示)通過用上述抗體以及針對5Β6的抗體(10B4-APC)染色進(jìn)行測定。圖13.使用基因融合產(chǎn)生重組抗Clec9A-0Va (抗5B6-0va)。通過質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到 自由式293F細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生重組抗Clec9A(5B6)AblOB4，所述質(zhì)粒編碼與Ova融合的10B4 κ鏈 和10Β4重鏈。48小時(shí)后，收獲來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的上清液，并且通過用重組Ab(來自293F瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染)免疫熒光標(biāo)記CH0-5B6轉(zhuǎn)染子細(xì)胞和流式細(xì)胞術(shù)分析來檢查抗5B6-0va Ab識別5B6 的能力。穩(wěn)定表達(dá)全長膜結(jié)合5B6的CHO細(xì)胞與轉(zhuǎn)染上清液(包含重組抗ClecQA-OvaAb) 一起溫育，并且使用生物素化的抗ova Ab和鏈霉親和素-PE(上圖)或抗大鼠Ig PE(下 圖)檢測結(jié)合。實(shí)線指示用重組抗Clec9A-0va Ab (轉(zhuǎn)染上清液)染色的CH0-5B6細(xì)胞，虛 線指示用次級Ab (抗Ova-生物素和鏈霉親和素-PE用于上圖，和抗大鼠Ig PE用于下圖)染色的CH0-5B6細(xì)胞。序列表的索引SEQ ID NO :1-人 5B6。SEQ ID NO :2_ 鼠類 5B6。SEQ ID N0:3-黑猩猩 5B6。SEQ ID N0:4-恒河猴 5B6。SEQ ID NO :5_ 犬 5B6。SEQ ID NO :6_ 牛 5B6。SEQ ID NO :7-馬 5B6。SEQ ID NO :8_ 大鼠 5B6。SEQ ID NO :9_編碼人5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :10_編碼鼠類5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :11_編碼黑猩猩5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO 12~編碼恒河猴5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :13_編碼犬5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :14_編碼牛5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :15_編碼馬5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO :16_編碼大鼠5B6的開放閱讀框。SEQ ID NO 17至28-寡核苷酸引物。SEQ ID NO 29~鼠類5B6的抗原片段。SEQ ID NO :30_ 人 5B6 的抗原片段。SEQ ID NO :31_生物素化共有序列。SEQ ID NO :32_ 小鼠 Clecl2a 的部分序列。SEQ ID NO :33_ 小鼠 Dectin-I 的部分序列。SEQ ID NO :34_ 小鼠 Clec8a 的部分序列。SEQ ID NO :35_ 小鼠 NKG2D 的部分序列。SEQ ID NO :36_ 人 NKG2D 的部分序列。SEQ ID NO 37~ 大鼠 MBP-A 的部分序列。SEQ ID NO :38_包括莖的可溶性flag標(biāo)記的小鼠5B6。SEQ ID NO :39_包括莖的可溶性flag標(biāo)記的人5B6。SEQ ID NO :40_不包括莖的可溶性flag標(biāo)記的小鼠5B6。SEQ ID NO :41_不包括莖的可溶性flag標(biāo)記的人5B6。SEQ ID NO :42_10B4抗5B6抗體的重鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO :43_10B4抗5B6抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO :44_10B4抗5B6抗體的重鏈CDRl的氨基酸序列。SEQ ID NO :45_10B4抗5B6抗體的重鏈CDR2的氨基酸序列。SEQ ID NO :46_10B4抗5B6抗體的重鏈CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NO :47_10B4抗5B6抗體的輕鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO :48_10B4抗5B6抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列 。
SEQ ID NO :49_10B4抗5B6抗體的輕鏈CDRl的氨基酸序列。SEQ ID NO :50_10B4抗5B6抗體的輕鏈CDR2的氨基酸序列。SEQ ID NO :51_10B4抗5B6抗體的輕鏈CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NO 52至57-寡核苷酸引物。SEQ ID NO :58_包括 莖的可溶性小鼠5B6。SEQ ID NO :59_包括莖的可溶性人5B6。SEQ ID NO :60_不包括莖的可溶性小鼠5B6。SEQ ID NO :61_不包括莖的可溶性人5B6。發(fā)明詳述一般技術(shù)和定義除非另有具體定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)理解為具有與本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常理解相同的含義(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、樹突狀細(xì)胞 生物學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)。除非另有說明，在本發(fā)明中利用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本 領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)操作。此種技術(shù)在資源中的參考文獻(xiàn)自始至終描述且 說明，例如，J.Perbal，A Practical Guideto Molecular Cloning, John Wiley 禾口 Sons (1984), J. Sambrook ^A Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory Press (1989), T. A. Brown (編輯)，Essential MolecularBiology :A Practical Approach,第 1 和 2 卷，IRL Press (1991)，D. Μ. Glover 和 B. D. Hames (編輯)， DNA Cloning :A PracticalApproach,第 1-4 卷，IRL Press (1995 和 1996)，和 F. M. Ausubel 等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今的所有更新)，Ed Harlow 和 David Lane (編 輯)Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),禾口 J. Ε· Coligan 等人(編輯)Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括 迄今的所有更新)。如本文所使用的，術(shù)語“5B6”指包括如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)中提 供的氨基酸序列的多肽，來自其他物種的其直向同源物，其功能變體或突變體，以及其生物 學(xué)活性和/或抗原片段。術(shù)語“5B6”和“CLEC9A”在本文中可互換使用。如本文所使用的，術(shù)語“C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域”或“CTLD”指如下蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)域家族，其在從許多動物物種中分離的許多蛋白質(zhì)中已得到鑒定，參見例如，由 Drickamer (1999)的綜述。最初，CTLD結(jié)構(gòu)域鑒定為對所謂的C型凝集素(鈣依賴性碳水 化合物結(jié)合蛋白質(zhì))共有的結(jié)構(gòu)域且命名為“碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域”(“CRD”)。最近， 已變得顯而易見的是，這個(gè)結(jié)構(gòu)域在許多真核生物蛋白質(zhì)中共享，其中數(shù)種不結(jié)合糖部分， 并且因此經(jīng)典結(jié)構(gòu)域已命名為CTLD。已報(bào)告CTLD結(jié)合廣泛多樣的化合物，包括碳水化合 物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。CTLD由約120個(gè)氨基酸殘基組成，并且特有地包含2個(gè)或3個(gè)鏈內(nèi)二硫 橋。盡管在來自不同蛋白質(zhì)的CTLD之間的氨基酸序列水平上的相似性相對很低，但已發(fā)現(xiàn) 許多CTLD的3D結(jié)構(gòu)是高度保守的，其中結(jié)構(gòu)變異性基本上限制于所謂的環(huán)區(qū)域，通常由多 至5個(gè)環(huán)限定。本發(fā)明多肽的CTLD的例子在圖IC中突出顯示。如本文所使用的，術(shù)語“治療”或“處理”包括施用治療有效量的本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸等，其足以減少或消除指定病狀的至少一個(gè)癥狀。如本文所使用的，術(shù)語“預(yù)防”包括施用治療有效量的本發(fā)明的化合物、本發(fā)明的 多肽、本發(fā)明的多核苷酸等，其足以阻止或阻礙指定病狀的至少一個(gè)癥狀的發(fā)展。如本文所使用的，“樣品”可以是懷疑包括樹突狀細(xì)胞或其前體的任何生物材料。 例子包括但不限于，血液，例如全部外周血、臍帶血、胎兒血，骨髓，血漿，血清，尿，培養(yǎng)細(xì) 胞，唾液或尿道拭子，淋巴樣組織，例如扁桃體、派伊爾斑、盲腸、胸腺、脾和淋巴結(jié)。樣品可 以直接進(jìn)行測試或在測試前可能需要某些形式的處理。例如，活組織檢查樣品在測試前可 能需要均質(zhì)化，以產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液。此外，至生物樣品并非液體形式(例如，它可以是固體、 半固體或脫水液體樣品)的程度，它可能需要添加試劑例如緩沖劑以使樣品移動。移動試 劑可以在使樣品與例如本發(fā)明的化合物接觸前與樣品相混合。如本文所使用的，術(shù)語“免疫應(yīng)答”指受試者的免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原的反應(yīng)性中的變 化，并且可能涉及抗體產(chǎn)生、細(xì)胞介導(dǎo)免疫的誘導(dǎo)、補(bǔ)體激活和/或免疫耐受的發(fā)展。 如本文所使用的，術(shù)語“綴合”、“綴合的，，或其變化廣泛用于指本發(fā)明的化合物和 治療劑之間任何形式的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，或使本發(fā)明的化合物和治療劑置于彼此緊密接 近例如在脂質(zhì)體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合化合物通過表達(dá)多核苷酸來產(chǎn)生，所 述多核苷酸包括編碼綴合化合物的單個(gè)開放閱讀框，例如編碼在C和/或N末端與抗原融 合的抗體的重鏈或輕鏈的單個(gè)開放閱讀框。如本文所使用的，術(shù)語“提取物”指本發(fā)明的宿主細(xì)胞、植物或非人轉(zhuǎn)基因動物的 任何部分。部分可以是完整實(shí)體例如植物種子，或通過至少部分均質(zhì)化和/或純化而獲得。 這個(gè)術(shù)語包括由宿主細(xì)胞分泌的部分，并且因此包含培養(yǎng)上清液?；衔锉景l(fā)明人目前已首次顯示5B6(在本領(lǐng)域中也稱為CLEC9A和HEEE9341)在樹突狀 細(xì)胞子集和或其前體中表達(dá)。這使得結(jié)合5B6的化合物能夠在廣泛多樣的診斷和治療操作 中使用。例如，抗體-抗原綴合物可以用于將抗原遞送給樹突狀細(xì)胞和/或其前體，以誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答。在另一個(gè)例子中，可檢測標(biāo)記的化合物可以用于檢測樣品中的樹突狀細(xì)胞或其 前體。在一個(gè)進(jìn)一步的例子中，抗體-細(xì)胞毒素劑綴合物可以用于靶向有害樹突狀細(xì)胞或 其前體。本發(fā)明的化合物可以是任何類型的分子，所述分子結(jié)合優(yōu)選特異性結(jié)合5B6?；?物可以是例如純化的和/或重組的天然存在的配體或合成配體?；衔锖?B6之間的結(jié)合 可以由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或者共價(jià)和非共價(jià)相互作用的組合來介導(dǎo)。當(dāng)化合物和5B6 的相互作用產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物時(shí)，發(fā)生的結(jié)合一般是靜電、氫鍵合、或親水/疏水相互 作用的結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物是純化的和/或重組的多肽。特別優(yōu)選的5B6 結(jié)合化合物是純化的和/或重組的抗5B6抗體或其抗原結(jié)合片段。盡管不是必需的，但化合物可以與5B6特異性結(jié)合。短語“特異性結(jié)合”意指在特 定條件下，化合物結(jié)合5B6且不與顯著量的其他例如蛋白質(zhì)或碳水化合物結(jié)合。優(yōu)選地，化 合物特異性結(jié)合得自受試者的樣品中的5B6而不是其他分子，所述樣品包括樹突狀細(xì)胞或 其前體。在此種條件下與5B6的特異性結(jié)合可能需要就其特異性選擇的抗體。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，當(dāng)與另一種蛋白質(zhì)特別是包括CTLD的蛋白質(zhì)相比較時(shí)，如果在化合物與5B6的 結(jié)合之間存在超過10倍差異，并且優(yōu)選25、50或100倍更大的差異，那么該化合物視為與5B6 “特異性結(jié)合”?？贵w 術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”指由2對多肽鏈組成的一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的糖蛋白， 一對輕(L)低分子量鏈和一對重(H)鏈，所有4條鏈通過二硫鍵互聯(lián)。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 已得到充分表征，參見例如Fundamental Immunology第7章(Paul，W.，編輯，第2版Raven Press,N. Y. (1989))。簡言之，每條重鏈一般包括重鏈可變區(qū)(本文縮寫為Vh)和重鏈恒定 區(qū)(本文縮寫為Ch)。重鏈恒定區(qū)一般包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，011、012和013。每條輕鏈一般包括 輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為V和輕鏈恒定區(qū)(本文縮寫為CJ。輕鏈恒定區(qū)一般包括1個(gè) 結(jié)構(gòu)域，Q。Vh和\區(qū)可以進(jìn)一步再分成高變異性區(qū)域(或在序列和/或結(jié)構(gòu)上限定環(huán)形 式中可以是高變的高變區(qū))，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，由稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域 點(diǎn)綴。每個(gè)Vh和\ 一般由3個(gè)⑶R和4個(gè)FR組成，從氨基末端到羧基末端以下述 次序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(還參見 Chothia 禾Π Lesk, 1987)。一 般地，這個(gè)區(qū)域中的氨基酸殘基編號通過Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)中描述的方法來執(zhí)行(短語例如如Kabat中或根據(jù)Kabat 的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號在本文中指用于重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的這種編號系 統(tǒng))。使用這種編號系統(tǒng)，肽的實(shí)際線性氨基酸序列可以包含與可變結(jié)構(gòu)域的FR或CDR的 縮短或插入片段相對應(yīng)的較少或另外氨基酸。如本文所使用的，術(shù)語“人源化抗體”在本文中指衍生自非人抗體一般是鼠類的抗 體，其保留或基本上保留親本抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)但在人中更少免疫原性。如本文所使用的，術(shù)語互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)指一起限定免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的可變 片段(Fv)區(qū)的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。如本文所使用的，術(shù)語構(gòu)架區(qū)(FR)指在⑶R之間插入的氨基酸序列。這些抗體部 分作用于使CDR保持在合適定向中(允許CDR結(jié)合抗原)。輕或重的可變區(qū)包括構(gòu)架和一 般3個(gè)CDR。如本文所使用的，術(shù)語恒定區(qū)(CR)指賦予效應(yīng)子功能的抗體分子的部分。主題人 源化抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可以選自5種同種型中的任何α、 δ、ε、γ或μ。此外，各個(gè)亞類的重鏈(例如重鏈的IgG亞類)負(fù)責(zé)不同效應(yīng)子功能，并 且因此通過選擇所需重鏈恒定區(qū)，可以產(chǎn)生具有所需效應(yīng)子功能的抗體。優(yōu)選的重鏈恒定 區(qū)是 Y I(IgGl), y2(IgG2), y3(IgG3)和 Y4(IgG4)，更優(yōu)選 y4(IgG4)0 輕鏈恒定區(qū)可以 是K或λ類型，優(yōu)選κ類型?？贵w可以作為完整免疫球蛋白，或各種形式中的修飾存在，包括例如但不限于，包 括VH或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域抗體，重鏈可變區(qū)的二聚體(VHH，如對于駱駝科動物描述的)、 輕鏈可變區(qū)的二聚體(VLL)，僅包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段，或包含重鏈可變區(qū)和CHl 結(jié)構(gòu)域的Fd片段。由連接在一起以形成單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的ScFV(Bird 等人，1988 ；Huston等人，1988)和scFvs的寡聚物例如雙抗體和三抗體也包括術(shù)語“抗體” 內(nèi)。還包括的是包含可變區(qū)和部分恒定區(qū)的抗體片段，例如Fab、(Fab' )2和FabFc2片段。 還包括了⑶R移植抗體片段和抗體片段的寡聚物。Fv的重鏈和輕鏈組分可以衍生自相同抗體或不同抗體，從而產(chǎn)生嵌合Fv區(qū)?？贵w可以是動物(例如小鼠、兔或大鼠)或人起源或 可以是嵌合的(Morrison等人，1984)或人源化的(Jones等人，1986)和UK 8707252)。如 本文所使用的，術(shù)語“抗體”包括這些各種形式。使用本文提供的指導(dǎo)以及在上文引用的參 考文獻(xiàn)和此種出版物如Harlow & Lane (同上)中描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的那些 方法，可以容易地制備用于在本發(fā)明的方法中使用的抗體。不是來自天然來源的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段，例如人源化抗體，優(yōu)選保 留親本抗體例如24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4和/或23/05-4C6的顯著比例的結(jié)合 性質(zhì)。特別地，本發(fā)明的此種抗體或片段保留特異性結(jié)合由親本抗體識別的抗原的能力， 所述親本抗體用于產(chǎn)生抗體或片段例如人源化抗體。優(yōu)選地，抗體或片段顯示與親本抗體 相同或基本上相同的抗原結(jié)合親和力和親合性。理想地，抗體或片段的親和力將不小于親 本抗體親和力的10%，更優(yōu)選地不小于約30%，并且最優(yōu)選地親和力將不小于親本抗體的 50%。用于測定抗原結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括半最大結(jié)合測定法、 競爭測定法和Scatchard分析。各種免疫測定法形式可以用于選擇與5B6特異性免疫反應(yīng)的抗體或片段。例如， 表面標(biāo)記物和流式細(xì)胞術(shù)分析或固相ELISA免疫測定法常規(guī)上用于選擇與蛋白質(zhì)或碳水 化合物特異性免疫 反應(yīng)的抗體。關(guān)于可以用于測定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定法形式和 條件的描述，參見Harlow & Lane (同上)。5B6結(jié)合抗體可以是包括可變輕和可變重(Vh)鏈的Fv區(qū)。輕鏈和重鏈可以 直接連接或通過接頭進(jìn)行連接。如本文所使用的，接頭指與輕鏈和重鏈共價(jià)連接的分子，并 且在2條鏈之間提供足夠間隔和彈性，從而使得它們能夠?qū)崿F(xiàn)其中它們能夠特異性結(jié)合它 們所導(dǎo)向的表位的構(gòu)象。蛋白質(zhì)接頭是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢员硎緸槿诤隙嚯牡腎g部 分的固有組分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用重組產(chǎn)生的單鏈scFv抗體，優(yōu)選人 源化scFv。單克隆抗體針對5B6表位的單克隆抗體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地產(chǎn)生。使用5B6表位 RWLWQDGSSPSPGLLPAERSQSANQVC-OH) (SEQ ID NO :30)用于產(chǎn)生此種抗體的方法的例子在實(shí) 施例部分中提供。用于通過雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是眾所周知的。永生的抗體產(chǎn)生細(xì)胞 系可以通過細(xì)胞融合來產(chǎn)生，并且還通過其他技術(shù)例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或 用EB病毒轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。針對5B6表位產(chǎn)生的單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)對象組可以就各種性質(zhì)；即 就同種型和表位親和力進(jìn)行篩選。動物衍生的單克隆抗體可以用于直接體內(nèi)和體外免疫療法。然而，已觀察到當(dāng)例 如小鼠衍生的單克隆抗體在人中用作治療劑時(shí)，患者產(chǎn)生人抗小鼠抗體。因此，動物衍生的 單克隆抗體不優(yōu)選用于治療，特別是用于長期使用。然而，用已建立的基因工程技術(shù)可以產(chǎn) 生嵌合或人源化抗體，其具有動物衍生和人衍生的部分。動物可以是例如小鼠或其他嚙齒 類動物例如大鼠。如果嵌合抗體的可變區(qū)是例如小鼠衍生的，而恒定區(qū)是人衍生的，那么嵌合抗體 一般將比“純”小鼠衍生的單克隆抗體具有更少免疫原性。這些嵌合抗體將可能更適合于治療用途，結(jié)果是“純”小鼠衍生的抗體是不合適的。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法可應(yīng)用于本領(lǐng)域的那些。例如，使用例如在分開質(zhì)粒中 的免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈可以分開表達(dá)輕鏈和重鏈。這些隨后可以在體外純化 并裝配成完全抗體；用于實(shí)現(xiàn)此種裝配的方法已得到描述(參見例如，Sim等人，1986)。此 種DNA構(gòu)建體可以包括與編碼人恒定區(qū)的DNA連接的DNA，其編碼關(guān)于抗5B6抗體的輕鏈或 重鏈的可變區(qū)的功能上重排基因。用關(guān)于輕鏈和重鏈的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的淋巴樣細(xì)胞例如 骨髓瘤或雜交瘤，可以表達(dá)并裝配抗體鏈。
用于從還原分離的輕鏈和重鏈形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)也已得到描述。輕鏈 和重鏈在相同細(xì)胞中共表達(dá)以實(shí)現(xiàn)重鏈和輕鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和連接而成為完全H2L2 IgG 抗體也是可能的。此種共表達(dá)可以使用相同或不同質(zhì)粒在相同宿主細(xì)胞中完成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗5B6抗體是人源化的，即通過分子建模技 術(shù)產(chǎn)生的抗體，其中抗體的人內(nèi)容物達(dá)到最大，同時(shí)引起可歸于例如親本大鼠、兔或鼠類抗 體可變區(qū)的結(jié)合親和力的很少喪失或無喪失。下文描述的方法可應(yīng)用于抗5B6抗體的人源化。存在在決定人源化過程中使用何種人抗體序列中考慮的數(shù)種因素。輕鏈和重鏈的 人源化視為不依賴于彼此，但原因?qū)τ诟髯允腔旧舷嗨频摹＿@種選擇過程基于下述原理給定抗體的抗原特異性和親和力主要由可變區(qū)⑶R 的氨基酸序列決定?？勺兘Y(jié)構(gòu)域構(gòu)架殘基具有很少貢獻(xiàn)或無直接貢獻(xiàn)。構(gòu)架區(qū)的主要功能 是使⑶R保持在其合適空間定向中，以識別抗原。因此，如果人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架與它們所起 源的動物可變結(jié)構(gòu)域高度同源，那么動物例如嚙齒類動物CDR置換到人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架內(nèi) 最可能導(dǎo)致其正確空間定向的保留。因此應(yīng)優(yōu)選選擇與一個(gè)或多個(gè)動物可變結(jié)構(gòu)域高度同 源的人可變結(jié)構(gòu)域。合適的人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列可以如下選擇。步驟1。使用計(jì)算機(jī)程序，就與動物衍生的抗體可變結(jié)構(gòu)域最同源的那些人抗體可 變結(jié)構(gòu)域序列搜索所有可獲得的蛋白質(zhì)(和DNA)數(shù)據(jù)庫。合適程序的輸出是與動物衍生抗 體最同源的序列、與每種序列的同源性百分比、和每種序列與動物衍生序列的比對的列表。 這不依賴于重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列而完成。如果僅包括人免疫球蛋白序列，那么上述 分析更容易完成。步驟2。列出人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列且就同源性進(jìn)行比較。主要地，比較在⑶R 長度上執(zhí)行，除非常可變的重鏈的CDR3外。人重鏈以及κ和λ輕鏈分成亞組；重鏈3個(gè) 亞組、κ鏈4個(gè)亞組、λ鏈6個(gè)亞組。在每個(gè)亞組內(nèi)的⑶R大小是相似的，但在亞組之間 不同。通?？梢允箘游镅苌目贵w⑶R與人亞組之一匹配作為同源性的第一近似值。具有 相似長度CDR的抗體隨后就特別在CDR內(nèi)以及在周圍構(gòu)架區(qū)中的氨基酸序列同源性進(jìn)行比 較。選擇最同源的人可變結(jié)構(gòu)域作為用于人源化的構(gòu)架。實(shí)際人源化方法/技術(shù)根據(jù)ΕΡ-Α-0239400，通過將所需⑶R移植到人構(gòu)架上可以使抗體人源化。編碼所 需重構(gòu)抗體的DNA序列因此可以從希望重構(gòu)其CDR的人DNA開始進(jìn)行制備。將包含所需CDR 的動物衍生的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與所選擇的人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列的那種相比較。標(biāo) 記出需要改變成動物中的相對應(yīng)殘基的人可變結(jié)構(gòu)域中的殘基，已制備摻入動物衍生CDR 的人可變區(qū)。人序列中還可以存在需要置換、添加或缺失的殘基。
合成可以用于使人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架誘變以包含所需殘基的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以具有任何方便的大小。長度通常僅通過已獲得的具體合成儀的能力限制。寡核苷酸 指導(dǎo)的體外誘變的方法是眾所周知的。備選地，可以使用WO 92/07075的重組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法來達(dá)到人源化。使 用這種方法，⑶R可以在人抗體的構(gòu)架區(qū)之間進(jìn)行剪接。一般而言，WO 92/07075的技術(shù)可 以使用包括2個(gè)人構(gòu)架區(qū)的模板AB和CD以及在它們之間被供體CDR替換的CDR來執(zhí)行。 引物A和B用于擴(kuò)增構(gòu)架區(qū)AB，并且引物C和D用于擴(kuò)增構(gòu)架區(qū)⑶。然而，引物B和C在 其5'末端處各自還包含另外序列，所述另外序列與全部或至少部分供體CDR序列相對應(yīng)。 引物B和C重疊的長度足以允許其5'末端在允許執(zhí)行PCR的條件下彼此退火。因此，擴(kuò)增 區(qū)域AB和⑶可以通過重疊延伸經(jīng)歷基因剪接，以在單反應(yīng)中產(chǎn)生人源化產(chǎn)物。在重構(gòu)抗體的誘變反應(yīng)后，誘變的DNA可以與編碼輕鏈或重鏈恒定區(qū)的合適DNA 連接，克隆到表達(dá)載體內(nèi)，并且轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞內(nèi)。這些步驟可以以常規(guī) 方式執(zhí)行。重構(gòu)抗體因此可以通過如下過程進(jìn)行制備，所述過程包括(a)制備包括與DNA序列可操作地連接的合適啟動子的第一種可復(fù)制表達(dá)載體， 所述DNA序列至少編碼Ig重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域包括來自人抗體的構(gòu) 架區(qū)和本發(fā)明的人源化抗體所需的CDR ；(b)制備包括與DNA序列可操作地連接的合適啟動子的第二種可復(fù)制表達(dá)載體， 所述DNA序列分別至少編碼互補(bǔ)Ig重鏈或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域；(c)用第一種或兩種制備的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；和(d)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系以產(chǎn)生所述改變的抗體。優(yōu)選地，步驟(a)中的DNA序列編碼人抗體鏈的可變結(jié)構(gòu)域和每個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。可 以使用任何合適的重組表達(dá)系統(tǒng)制備人源化抗體。進(jìn)行轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生改變的抗體的細(xì)胞系可 以是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系或永生化哺乳動物細(xì)胞系，其有利地具有淋巴樣起源，例 如骨髓瘤、雜交瘤、三源雜交瘤或四源雜交瘤細(xì)胞系。細(xì)胞系還可以包括正常淋巴樣細(xì)胞， 例如B細(xì)胞，其已通過用病毒例如EB病毒轉(zhuǎn)化而被永生化。最優(yōu)選地，永生化細(xì)胞系是骨 髓瘤細(xì)胞系或其衍生物。用于表達(dá)抗體的CHO細(xì)胞可以是二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷的，并且因此依賴 于胸苷和次黃嘌呤用于生長。親本dhfr—CHO細(xì)胞系用編碼抗體和dhfr基因的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn) 染，這使得能夠選擇dhfr陽性表型的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。通過在缺乏胸苷和次黃嘌呤的培養(yǎng) 基上培養(yǎng)集落來執(zhí)行選擇，胸苷和次黃嘌呤的不存在阻止未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長，并且阻止轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞再挽救(resalvaging)葉酸途徑且因此繞過選擇系統(tǒng)。由于目的轉(zhuǎn)染DNA和編碼 dhfr的DNA的共整合，這些轉(zhuǎn)化體通常表達(dá)低水平的目的DNA。編碼抗體的DNA的表達(dá)水 平可以通過使用氨甲蝶呤(MTX)的擴(kuò)增得到增加。這種藥物是酶dhfr的直接抑制劑，并且 允許分離抗性集落，所述抗性集落擴(kuò)增足以在這些條件下存活的其dhfr基因拷貝數(shù)。因?yàn)?編碼dhfr和抗體的DNA序列在原始轉(zhuǎn)化體中緊密連接，所以通常存在伴隨擴(kuò)增，并且因此 增加所需抗體的表達(dá)。用于與CHO或骨髓瘤細(xì)胞一起使用的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是在W087/04462中描 述的谷氨酰胺合成酶(GS)擴(kuò)增系統(tǒng)。這種系統(tǒng)涉及用編碼酶GS的DNA和編碼所需抗體的 DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨后選擇在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長，并且因此可以假定為已整合編碼GS的DNA的細(xì)胞。隨后使用甲硫氨酸砜亞胺(Msx)對這些所選擇的克隆實(shí)施酶GS的抑制。 為了存活，細(xì)胞將擴(kuò)增編碼GS的DNA并且伴隨擴(kuò)增編碼抗體的DNA。盡管用于產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞系優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞系，但可以備選使用任何 其他合適的細(xì)胞系，例如細(xì)菌細(xì)胞系或酵母細(xì)胞系。特別地，設(shè)想可以使用大腸桿菌衍生的 細(xì)菌菌株。所獲得的抗體就功能性進(jìn)行檢查。如果喪失功能性，那么必須返回步驟(2)并 且改變抗體的構(gòu)架。表達(dá)后，根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)操作，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析法、凝膠電泳等 (一般參見，Scopes, R.，ProteinPurification, Springer-Verlag, N. Y. (1982))，可以回 收且純化完整抗體、其二聚體、個(gè)別輕鏈和重鏈、或其他免疫球蛋白形式。對于醫(yī)學(xué)用途， 至少約90至95%同質(zhì)性的基本上純的免疫球蛋白是優(yōu)選的，并且98至99%或更多同質(zhì) 性是最優(yōu)選的。純化后，部分或需要時(shí)同質(zhì)性，人源化抗體隨后可以在治療上使用或在開 發(fā)且執(zhí)行測定法操作、免疫熒光染色等中使用(一般參見，Lefkovits和Pernis (編輯)， Immunological Methods，第 I 和 II 卷，Academic Press, (1979 和 1981))。 由Greenwood等人(1993)執(zhí)行的研究已證實(shí)抗體的Fc區(qū)被人效應(yīng)子細(xì)胞的識別 可以通過改造免疫球蛋白分子的恒定區(qū)得到最佳化。這可以通過使具有所需特異性的抗體 的可變區(qū)基因與編碼免疫球蛋白同種型的人恒定區(qū)基因融合來達(dá)到，已證實(shí)所述免疫球蛋 白同種型在人受試者中的有效抗原依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)，例如IgGl和IgG3同種型 (Greenwood 禾口 Clark，Protein Engineering of AntibodyMolecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Mike Clark(編輯)，Academic Titles，部分 II， 第85-113頁，(1993))。所得到的針對5B6的嵌合或人源化抗體應(yīng)在調(diào)節(jié)體液免疫和/或 T細(xì)胞介導(dǎo)免疫方面特別有效。還可以通過給轉(zhuǎn)基因動物施用抗原制備針對5B6的具有完全人可變區(qū)的抗體，所 述轉(zhuǎn)基因動物已改良以響應(yīng)抗原攻擊產(chǎn)生此種抗體，但其內(nèi)源基因座已喪失功能?？梢詧?zhí) 行各種后續(xù)操作，以獲得抗體本身或其類似物(參見例如，US 6，075，181)。編碼抗體或其片段的基因的制備編碼抗體的基因，輕鏈和重鏈基因或其部分，例如單鏈Fv區(qū)，可以由雜交瘤細(xì)胞 系進(jìn)行克隆。它們可以全部使用相同的一般策略例如RACE使用商購可得試劑盒進(jìn)行克隆， 所述試劑盒例如如由Clontech生產(chǎn)的。一般地，例如，使用隨機(jī)六聚體作為引物逆轉(zhuǎn)錄從 雜交瘤細(xì)胞中提取的聚(A)+mRNA。對于Fv區(qū)，通過2種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別擴(kuò)增Vh 和八結(jié)構(gòu)域。使用5'末端引物和3'末端引物可以擴(kuò)增重鏈序列，所述5'末端引物根據(jù) 抗5B6重鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，所述3'末端引物根據(jù)共有免疫球蛋白恒定 區(qū)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)(Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第 5 版 U. S. Department of Health and Human Services, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。使用 5'末端引物與引物 C-κ 相組合擴(kuò) 增輕鏈Fv區(qū)，所述5'末端引物根據(jù)抗5Β6輕鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到可以采用許多合適引物以獲得Fv區(qū)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到合適的克隆載體內(nèi)。通過DNA限制鑒定包含正確大小插入 片段的克隆。使用與克隆位點(diǎn)相鄰的測序引物，隨后可以由雙鏈質(zhì)粒DNA測定重鏈或輕 鏈編碼區(qū)的核苷酸序列。商購可得的試劑盒(例如，Sequenase 試劑盒，United StatesBiochemical Corp. , Cleveland, Ohio,USA)可以用于促進(jìn)DNA測序。可以通過任何合適方 法制備編碼Fv區(qū)的DNA，包括例如擴(kuò)增技術(shù)例如PCR和LCR?；瘜W(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可以通過與互補(bǔ)序列雜交，或通過使用單鏈作為 模板用DNA聚合酶進(jìn)行聚合而轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。盡管可以化學(xué)合成整個(gè)單鏈Fv區(qū)，但優(yōu)選 合成許多較短序列(約100至150個(gè)堿基)，隨后連接在一起。備選地，可以克隆亞序列，并且使用合 適的限制性酶切割合適的亞序列。隨后可以 連接片段以產(chǎn)生所需DNA序列。獲得Fv可變輕鏈和重鏈DNA后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，將序列直 接連接在一起或通過編碼肽接頭的DNA序列連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈 區(qū)域通過彈性肽接頭(例如(Gly4Ser)3)連接，所述彈性肽接頭在重鏈Fv結(jié)構(gòu)域的羧基末 處開始并在輕鏈Fv結(jié)構(gòu)域的氨基末端處結(jié)束。整個(gè)序列編碼以單鏈抗原結(jié)合蛋白質(zhì)形式 的Fv結(jié)構(gòu)域。治療劑結(jié)合5B6的本發(fā)明的化合物可以用于遞送治療劑。治療劑的例子包括但不限于， 抗原、細(xì)胞毒素劑、藥物和/或藥理學(xué)試劑。在某些實(shí)施方案中，治療劑可以是與結(jié)合5B6的化合物融合的多肽。包括結(jié)合5B6 的化合物的融合多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行制備。例如，使編碼Fv區(qū)的 基因與編碼治療劑的基因融合。任選地，使Fv基因與編碼肽連接體的區(qū)段連接。肽連接體 可以存在，僅僅以提供結(jié)合5B6的化合物和治療劑之間的間隔，或促進(jìn)這些區(qū)域之間的移 動以使得它們各自能夠達(dá)到其最佳構(gòu)象。包括連接體的DNA序列還可以提供序列(例如引 物位點(diǎn)或限制位點(diǎn))以促進(jìn)克隆，或可以保留編碼結(jié)合部分的序列與編碼治療劑的序列之 間的閱讀框。此種連接體肽的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般地產(chǎn)生融合多肽涉及例如，分開制備Fv輕鏈和重鏈以及編碼它們與之融合 的任何其他蛋白質(zhì)的DNA，并且在質(zhì)粒或其他載體中重組DNA序列，以形成編碼特別需要的 融合多肽的構(gòu)建體。然而，更簡單的方法涉及將編碼特定Fv區(qū)的DNA插入已編碼所需第二 種多肽的構(gòu)建體內(nèi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，將編碼Fv區(qū)的DNA序列插入構(gòu) 建體內(nèi)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可獲得的任何方法，可以使結(jié)合5B6或其片段的化 合物例如Ab重組單鏈抗體的重鏈與治療劑融合或以其他方式結(jié)合。2種組分可以通過各 種眾所周知的化學(xué)操作中的任何而化學(xué)鍵合在一起。例如，連接可以經(jīng)由異雙功能交聯(lián) 齊U，例如SPDP、碳化二亞胺、戊二醛等。各種免疫毒素的產(chǎn)生以及化學(xué)綴合方法是本領(lǐng)域 眾所周知的(參見例如，‘‘Monoclonal Antibody-ToxinConjugates :Aiming the Magic Bullet, " Thorpe等人,MonoclonalAntibodies in Clinical Medicine,Academic Press, 第 168-190 頁(1982) ；Waldmann, 1991 ；Vitetta 等人，1987 ；Pastan 等人，1986 ；和 Thorpe 等人，1987)。藥物和/或藥理學(xué)試劑的例子包括但不限于促進(jìn)DC激活的試劑(例如TLR配體)、 抑制DC激活或功能的試劑(例如DC信號傳導(dǎo)分子的特異性抑制劑或啟動子例如激酶和磷 酸酶)、和調(diào)節(jié)DC死亡的試劑(例如凋亡啟動子或抑制子)。此種藥物和/或藥理學(xué)試劑 是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解存在許多細(xì)菌或植物多肽毒素，其適合于在本發(fā)明的方法中用 作細(xì)胞毒素劑。這些多肽包括但不限于，多肽例如天然或修飾的假單胞菌外毒素、白喉毒 素、蓖麻蛋白、相思豆毒素、白樹毒素、木鱉子苷II、細(xì)菌RIP例如志賀和志賀樣毒素鏈、 絲瓜素、天花粉素(atrichosanthin)、木鱉子苷I、紫茉莉?qū)倏共《镜鞍踪|(zhì)、美洲商陸抗病 毒蛋白質(zhì)、byodin 2(U.S.5，597，569)、gap0rin、及其基因工程變體。天然假單胞菌外毒素 和白喉毒素是高毒性的化合物，其一般通過肝毒性造成死亡。優(yōu)選地，假單胞菌外毒素和白 喉毒素經(jīng)修飾成去除毒素的天然靶向組分的形式，所述組分例如假單胞菌外毒素的結(jié)構(gòu)域 Ia和白喉毒素的B鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于具體細(xì)胞毒素劑。在本發(fā)明中使用的其他合適的細(xì)胞毒素劑包括但不限于，試劑例如細(xì)菌或植物毒 素、藥物例如環(huán)磷酰胺(CTX ；癌得星)、苯丁酸氮芥(CHL ；瘤可寧)、順鉬(CisP ；CDDP ；順 氯氨鉬)、白消安(馬利蘭)、美法侖、卡莫司汀(BCNU)、鏈脲霉素、三乙撐蜜胺(TEM)、絲裂 霉素C和其他烷化劑；氨甲蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP-16;凡畢士)、6_巰基嘌呤(6MP)、 6-硫鳥嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、2-氯脫氧腺苷 (2-CdA)、及其他抗代謝藥；抗生素包括放線菌素D、多柔比星(DXR ；阿霉素)、柔紅霉素(道 諾霉素)、博來霉素、光輝霉素以及其他抗生素；生物堿例如長春花新堿(VCR )、長春堿等； 以及其他抗癌劑包括細(xì)胞生長抑制劑糖皮質(zhì)激素例如氟美松(DEX ；地塞米松)和皮質(zhì)類固 醇例如潑尼松、核苷酸酶抑制劑例如羥基脲等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到存在眾多其他放射性同位素和化學(xué)細(xì)胞毒素劑，其可以 通過眾所周知的技術(shù)與結(jié)合5B6的化合物偶聯(lián)，并且遞送給特異性破壞樹突狀細(xì)胞或其前 體(參見例如U. S. 4，542，225)。光激活毒素的例子包括二氫吡啶和Ω -芋螺毒素?？梢允?用的細(xì)胞毒素劑的例子包括125I、131I、mIn、123I、99mTC和32Ρ。抗體可以使用本領(lǐng)域已知的技 術(shù)由此種試劑進(jìn)行標(biāo)記。例如，關(guān)于涉及抗體放射性標(biāo)記物的技術(shù)，參見Wenzel和Meares， Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy,Elsevier,N. Y. (1983)(還參見 Colcher 等 人，1986 ； 〃 Order,Analysis,Results and Future Prospective ofthe Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy" , Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy，Baldwin 等人(編輯)，Academic Press，第 303—16 頁，(1985))。在一個(gè)例子中，通過穩(wěn)定硫脲共價(jià)鍵使接頭_螯合劑tiuexutan與結(jié)合5B6的化 合物綴合，以提供關(guān)于銦-111或釔-90的高親和力螯合位點(diǎn)。抗原術(shù)語“抗原”進(jìn)一步意欲包括已知的或野生型抗原例如上文描述那些的肽或蛋白 質(zhì)類似物。類似物可以比野生型抗原更可溶或更穩(wěn)定，并且還可以包含使得抗原更多免疫 學(xué)活性的突變或修飾。在本發(fā)明中還有用的是如下肽或蛋白質(zhì)，其具有與所需抗原的氨基 酸序列同源的氨基酸序列，其中同源抗原誘導(dǎo)針對分別腫瘤或生物體的免疫應(yīng)答。如本文所使用的，“癌抗原”是與腫瘤或癌細(xì)胞相關(guān)的分子或化合物(例如，蛋白 質(zhì)、肽、多肽、脂質(zhì)、糖脂、碳水化合物和/或DNA)，并且當(dāng)在MHC分子背景中在抗原呈遞細(xì)胞 表面上表達(dá)時(shí)，其能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。癌抗原包括自身抗原以及其他抗原，所述其他抗原可 能并不與癌癥特異地相關(guān)，然而當(dāng)施用于動物時(shí)，誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)針對腫瘤或癌細(xì)胞的免 疫應(yīng)答和/或減少腫瘤或癌細(xì)胞的生長。如本文所使用的，“來自致病性和/或傳染性生物體的抗原”是任何生物體的抗原，并且可以包括但不限于，傳染性病毒、傳染性細(xì)菌、傳染性寄生蟲包括原生動物(例如瘧原 蟲屬物種)和蠕蟲以及傳染性真菌。一般地，對于在本發(fā)明中的使用，抗原是來自生物體的 蛋白質(zhì)或其抗原片段，或與天然存在的抗原等同或相似的合成化合物，其誘導(dǎo)對于相對應(yīng) 生物體特異的免疫應(yīng)答。與天然存在的生物體抗原相似的化合物或抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的。與天然存在的生物體抗原相似的化合物的非限制性例子是多糖抗原的肽模擬 物。
癌抗原的特定實(shí)施方案包括例如誘變的抗原例如Ras p21原癌基因、腫瘤抑制基 因p53和HER-2/neu以及BCR-abl癌基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及⑶K4、MUM1、半胱天冬酶8和 β連環(huán)蛋白；過表達(dá)抗原例如半乳凝素4、半乳凝素9、碳酸酐酶、醛縮酶A、PRAME、Her2/ neu、ErbB-2和KSA，癌胚抗原(oncofetal antigen)例如甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺 激素(hCG)；自身抗原例如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和黑色素細(xì)胞分化 抗原例如Martl/Melan A、gpl00、gp75、酪氨酸酶、TRPl和TRP2 ；前列腺相關(guān)抗原例如PSA、 PAP、PSMA、PSM-Pl 禾口 PSM-P2 ；再活化胚胎基因產(chǎn)物例如 MAGE UMAGE 3、MAGE 4、GAGE 1、 GAGE 2、BAGE、RAGE，以及其他癌睪丸抗原例如NY_ES01、SSX2和SCPl ；粘蛋白例如Muc-I和 Muc-2 ；神經(jīng)節(jié)苷脂例如GM2、GD2和⑶3，中性糖脂和糖蛋白例如Lewis (y)和globo-H ；禾口 糖蛋白例如 TruThompson-Freidenreich 抗原(TF)和 sTn。癌抗原及其分別的腫瘤細(xì)胞靶包括例如細(xì)胞角蛋白，特別是細(xì)胞角蛋白8、18和 19，作為關(guān)于癌的抗原。上皮膜抗原(EMA)、人胚胎抗原(HEA-125)、人乳脂肪球、MBrl、 MBr8、Ber-EP4、17_1A、C26和T16也是已知的癌抗原。結(jié)蛋白和肌特異性肌動蛋白是肌性 肉瘤的抗原。胎盤堿性磷酸酶、人絨毛膜促性腺激素和甲胎蛋白是滋養(yǎng)層和生殖細(xì)胞 腫瘤的抗原。前列腺特異性抗原是前列腺癌的抗原、結(jié)腸腺癌的癌胚抗原。ΗΜΒ-45是黑素 瘤的抗原。在宮頸癌中，有用的抗原可以由人乳頭狀瘤病毒編碼。嗜鉻粒蛋白-A和突觸囊 泡蛋白是神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)外胚瘤的抗原。特別有利的是形成具有壞死區(qū)域的實(shí)體瘤團(tuán)塊 的侵襲性腫瘤。衍生自已知誘發(fā)特定癌癥的病原體的抗原也可以在本發(fā)明中有利地使用。對于在 本文提供的癌癥疫苗中使用特別有利的病原體包括乙型肝炎病毒(肝細(xì)胞癌)，丙型肝炎 病毒(肝瘤(h印tomaS))，EB病毒(EBV)(伯基特淋巴瘤，鼻咽癌，免疫抑制個(gè)體中的PTLD)， HTLVL(成人T細(xì)胞性白血病)，致癌人乳頭狀瘤病毒16、18、33、45型(成人宮頸癌)，以及 細(xì)菌幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) (B細(xì)胞胃淋巴瘤)?？梢栽诓溉閯游锴腋貏e在 人中充當(dāng)抗原的其他醫(yī)學(xué)相關(guān)微生物在參考文獻(xiàn)中廣泛描述，例如C. G. A Thomas,Medical Microbiology, Bailliere Tindall, (1983)。示例性病毒病原體包括但不限于感染哺乳動物且更特別是人的傳染性病毒。傳 染性病毒的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病 毒，例如HIV-I (也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-111/LAV或HIV-III ；及其他分離物，例 如HIV-LP ；細(xì)小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒； 腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯狀病毒科(Calciviridae)(例如，引起 胃腸炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科 (Flaviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒)；冠狀病毒科(Coronoviridae) (例如，冠狀病毒例如SARS冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviradae)(例如，水皰性口炎病毒、狂犬病病毒)；纖絲病毒科(Rhabdoviradae)(例如，埃波拉病毒)；副粘液病毒科 (Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病 毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例如，漢坦 病毒、布尼亞(bunga)病毒、白齡病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血 熱病毒)；呼腸病毒科(Reoviridae)(例如，呼腸病毒、環(huán)狀病毒(orbiviurses)和輪狀病 毒)；雙RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細(xì) 小病毒科(Parvovirida)(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭狀瘤病毒、 多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae) 單純皰疹病毒(HSV) 1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒；痘病毒科 (Poxyiridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲 豬瘟病毒)；和未分類病毒(例如，海綿樣腦病的病原學(xué)因子、丁型肝炎的因子(盡管認(rèn)為 是乙型肝炎病毒的缺陷衛(wèi)星)、非甲型、非乙型肝炎的因子(1類=內(nèi)部傳播的；2類=腸胃 外傳播的(即丙型肝炎)；諾瓦克和相關(guān)病毒、和星狀病毒屬)。此外，革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌可以通過主題組合物和方法在脊椎動物中被靶 向。此種革蘭氏陽性菌包括但不限于巴斯德氏菌屬物種(Pasteurella sp.)、葡萄球菌屬 物種(Staphylococci sp.)和鏈霉菌屬物種(Streptococcus sp.)。革蘭氏陰性菌包括 但不限于大腸埃希桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)和沙 門菌屬物種(Salmonella sp.)。傳染性細(xì)菌的具體例子包括但不限于幽門螺桿菌、伯氏 疏螺方 體(Borella burgdorferi)、嗜月市軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬 物種(Mycobacteriasp.)(例如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、鳥分枝桿菌(M. avium)、 細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、戈登分枝桿菌 (M. gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (Listeriamonocytogenes)、酉良膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (Α 組鏈球菌)、無乳鏈 球菌(Streptococcus agalactiae) (B組鏈球菌)、鏈球菌屬(Streptococcus)(草綠色組)、 糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌屬(厭氧 物種)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性彎曲桿菌屬物種(Campylobacter sp·)、腸球菌屬物禾中(Enterococcus sp.)、流感嗜血桿菌(Haemophilus infuenzae)、炭 Ι ^ If lif (Bacillusantracis) > 白喉(Corynebacterium diphtheriae,)、 棒狀桿菌屬物禾中(Corynebacterium sp·)、丹毒！flif (Erysipelothrixrhusiopathiae) > 產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridium perfringers)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣 腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺性 巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、擬桿菌屬物種(Bacteroidessp.)、具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobaci 1 Ius moniliformis) > ^ [=| 密螺旋體(Tr印onemapallidium)、細(xì)弱密螺旋體(Ti^ponema pertenue)、鉤端螺旋體屬 (Leptospira)、立克次氏體屬(Rickettsia)禾口 Actinomycesisraelli (疑為 Actinomyces israeli，以色列放線菌)?？梢栽谥黝}組合物中用作抗原來源的細(xì)菌病原體的多肽包括但不限于鐵調(diào)節(jié)外 膜蛋白質(zhì)(“IR0MP”)、外膜蛋白質(zhì)(“0MP”)、和引起癤病的殺鮭氣單胞菌(Aeromonissalmonicida)的A-蛋白質(zhì)、引起細(xì)菌性腎病(“BKD，，)的鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum)的p57蛋白質(zhì)、主要表面相關(guān)抗原(“msa”)、表面表達(dá)的細(xì)胞毒素(“mpr”)、 表面表達(dá)的溶血素(“ish”)和耶爾森菌病的鞭毛抗原；細(xì)胞外蛋白質(zhì)(“ECP”)、鐵調(diào)節(jié) 外膜蛋白質(zhì)(“IR0MP”)、和巴斯德氏菌病的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)；鰻弧菌(Vibrosis anguillarum) 和奧氏弧菌(V. ordalii)的OMP和鞭毛蛋白質(zhì)；鲇魚愛德華氏菌(Edwardsiellosis ictaluri)和遲鈍愛德華氏菌(E. tarda)的鞭毛蛋白質(zhì)、OMP蛋白質(zhì)、aroA和purA ；和小瓜 蟲屬(Ichthyophthirius)的表面抗原；和柱狀嗜纖維菌(Cytophaga columnari)的結(jié)構(gòu)和 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)；以及立克次氏體屬的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。此種抗原可以重組或通過本領(lǐng)域已 知的其他方法進(jìn)行分離或制備。
病原體的例子進(jìn)一步包括但不限于，感染哺乳動物且更特別是人的傳染性真菌和 寄生蟲。傳染性真菌的例子包括但不限于新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢 膜組織胞菜菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽 生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)禾口白色念珠菌 (Candida albicans)。寄生蟲的例子包括細(xì)胞內(nèi)寄生蟲和專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。寄生蟲的例子包括但不 限于惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、 間日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、分歧 EL貝 Ji (Babesia divergens)、胃Jil (Trypanosoma cruzi) > W^H^^k (Toxoplasma gondii)、旋毛線蟲(Trichinella spiralis)、碩大禾Ij 什曼原蟲(Leishmania major)、杜氏 禾[|什曼原蟲(Leishmaniadonovani)、巴西禾Ij什曼原蟲(Leishmania braziliensis)、熱帶 利什曼原蟲(Leishmania tropica)、R比亞錐蟲(Trypanosomagambiense)、羅德西亞錐蟲 (Trypanosoma rhodesiense)、|1 王氏 線蟲(ffuchereria bancrofti)、馬絲蟲(Brugia malayi)、帝漢布魯絲蟲(Brugia timori)、人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、旋盤尾絲蟲 (Onchocerca volvulus)禾口曼森血吸蟲(Schistosomamansoni)。在哺乳動物且更特別是人中充當(dāng)抗原的其他醫(yī)學(xué)相關(guān)微生物在參考文獻(xiàn)中廣泛 描述，例如參見C. G. A Thomas,MedicalMicrobiology,Bailliere Tindall, (1983)。除傳染 性人疾病和人病原體的治療外，本發(fā)明的組合物和方法用于治療非人哺乳動物的感染。示 例性非人病原體包括但不限于小鼠乳房腫瘤病毒(“MMTV”)、勞斯肉瘤病毒(“RSV”)、禽白 血病病毒(“ALV”)、禽成髓細(xì)胞瘤病毒(“AMV”)、鼠白血病病毒(“MLV”)、貓白血病病毒 (“FeLV”)、鼠肉瘤病毒(“MSV”)、長臂猿白血病病毒(“GALV”)、脾壞死病毒(“SNV”)、 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(“RV”)、猿猴肉瘤病毒(“SSV”)、梅森-菲舍(Mason-Pfizer) 猴病毒(“MPMV”)、猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒1型(“3欣-1”)、慢病毒例如!11￥-1、!11￥-2、31￥、維斯 那病毒、貓免疫缺陷病毒(“FIV”)、和馬傳染性貧血病毒(“EIAV”)、T細(xì)胞白血病病毒例 如HTLV-1、HTLV-II、猿猴T細(xì)胞白血病病毒(“STLV”)、和牛白血病病毒(“BLV”)、和泡 沫病毒例如人泡沫病毒(“HFV”)、猿猴泡沫病毒(“SFV”)和牛泡沫病毒(“BFV”)?？蓹z測標(biāo)記物結(jié)合5B6的化合物可以在一系列檢測系統(tǒng)中采用。例如，化合物可以在用于使受 試者的內(nèi)部區(qū)域成像和/或診斷受試者中疾病的存在或不存在的方法中使用。例如，結(jié)合 5B6的化合物可以用于診斷其中5B6表達(dá)細(xì)胞起作用的疾病。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的診斷或預(yù)測方法涉及定量程度，以 測定患者樣品中存在的5B6水平或5B6表達(dá)細(xì)胞水平。此種定量通過包括合適對照樣品容 易地提供。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中包括內(nèi)部對照。優(yōu)選內(nèi)部對照是取自一個(gè)或多個(gè)健康 個(gè)體的一種或多種樣品。當(dāng)在診斷上使用時(shí)，結(jié)合5B6的化合物可以與診斷劑 例如可檢測標(biāo)記連接，以允 許容易地檢測在體外或在體內(nèi)的結(jié)合事件。合適的標(biāo)記包括放射性同位素或非放射性標(biāo) 記，例如生物素、酶、化學(xué)發(fā)光分子、熒光團(tuán)、染料標(biāo)記物或其他顯像劑，用于檢測和/或定 位靶分子。備選地，結(jié)合化合物的第二種標(biāo)記的抗體或抗生物素蛋白(例如)可以用于檢 測。在酶免疫測定法的情況下，酶可以與第二種抗體綴合，一般借助于戊二醛或高碘 酸鹽。然而，如容易認(rèn)識到的，存在技術(shù)人員容易獲得的廣泛多樣的不同綴合技術(shù)。常用酶 尤其包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β “半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。在通過相對應(yīng)酶 水解后，一般選擇與特定酶一起使用的底物，用于產(chǎn)生可檢測的顏色改變。合適酶的例子包 括堿性磷酸酶和過氧化物酶。還可以采用熒光底物，其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上文指出的生 色底物。在另一個(gè)例子中，熒光化合物例如但不限于尤其是熒光素和羅丹明，可以與例如 抗體化學(xué)偶聯(lián)而不改變其結(jié)合能力。當(dāng)通過用特定波長的光照射而被激活時(shí)，熒色染料標(biāo) 記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)在分子中應(yīng)激性的狀態(tài)，隨后發(fā)出用光學(xué)顯微鏡可視覺檢測的特 征性顏色下的光。作為進(jìn)一步的非限制性例子，與顯像劑偶聯(lián)的、結(jié)合5Β6的化合物可以用于檢測 在組織化學(xué)組織切片中的5Β6表達(dá)?；衔锟梢耘c合適的超磁性、順磁、電子密度、發(fā)生回 波、放射性或非放射性標(biāo)記例如生物素或抗生物素蛋白共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)。標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞或其前體檢測和分離如本文所使用的，術(shù)語“富集”和“富集的”以其最廣泛含義使用，以包括樹突狀細(xì) 胞或其前體的分離，從而使得在處理樣品中樹突狀細(xì)胞或其前體與非樹突狀細(xì)胞或其前體 的相對濃度大于可比較的未處理樣品。優(yōu)選地，富集的樹突狀細(xì)胞和/或其前體與得自原 始樣品的樣品中的至少10 %、更優(yōu)選至少20 %、更優(yōu)選至少30 %、更優(yōu)選至少40 %、更優(yōu)選 至少50 %、更優(yōu)選至少60 %、更優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少75 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選 至少90%、更優(yōu)選至少95%、且更加優(yōu)選至少99%的非樹突狀細(xì)胞或其前體分開。最優(yōu)選 地，富集細(xì)胞群體不包含非樹突狀細(xì)胞或其前體(即，純的)。術(shù)語“富集”及其變化在本文 中與術(shù)語“分離”及其變化可互換使用。此外，使用本發(fā)明的方法富集的細(xì)胞群體可以僅包 括單個(gè)樹突狀細(xì)胞或其前體。此外，本發(fā)明的富集方法可以用于分離單個(gè)樹突狀細(xì)胞或其 前體。樹突狀細(xì)胞或其前體可以通過本領(lǐng)域眾所周知的各種技術(shù)從樣品中富集，所述技 術(shù)包括細(xì)胞分選，特別是熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，通過使用與底物(例如，塑料表面，如 在淘選中)結(jié)合的親和試劑，或通過使用與固相顆粒結(jié)合的親和試劑，所述固相顆粒可以 基于珠(例如，有色膠乳珠或磁性顆粒)的性質(zhì)進(jìn)行分離。天然地，用于富集樹突狀細(xì)胞和 /或其前體的操作將依賴于細(xì)胞如何進(jìn)行標(biāo)記。
在一個(gè)例子中，可以使用具有用于細(xì)胞分選器的合適特征的任何可檢測物質(zhì)(例 如，在熒光染料的情況下，可以由分選器的光源激發(fā)的染料、和可以由細(xì)胞分選器的檢測器 檢測出的發(fā)射譜)。在流式細(xì)胞術(shù)中，通過包含細(xì)胞的液流或其他顆粒投射激光束，當(dāng)被聚 焦光撞擊時(shí)，所述液流或其他顆粒發(fā)出由檢測器選出的信號。這些信號隨后經(jīng)轉(zhuǎn)變用于計(jì) 算機(jī)存儲和數(shù)據(jù)分析，并且可以提供關(guān)于各種細(xì)胞性質(zhì)的信息。用合適染料標(biāo)記的細(xì)胞通 過激光束激發(fā)，并且在特征性波長下發(fā)光。這種發(fā)射的光由檢測器選出，并且這些模擬信號 轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號，允許其存儲、分析和顯示。許多更大型的流式細(xì)胞儀也是“細(xì)胞分選器”，例如熒光激活細(xì)胞分選器(FACS)， 并且是具有將來自特定群體的細(xì)胞選擇性沉積到管或其他收集容器內(nèi)的能力的儀器。在 一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞使用FACS進(jìn)行分離。這種操作是本領(lǐng)域眾所周知的， 并且通過例如 Melamed 等人，F(xiàn)low Cytometry and Sorting, ffiley-Liss, Inc. , (1990)； Shapiro, Practical Flow Cytometry,第 4 版，Wiley-Liss, Inc. , (2003)；禾口 Robinson 等 人’ Handbook of Flow CytometryMethods, ffiley-Liss, Inc. (1993)描述。為了分選細(xì)胞，該儀器電子解釋對于每種細(xì)胞收集的信號，因?yàn)樗ㄟ^激光束詢 問并且將信號與計(jì)算機(jī)上的分選標(biāo)準(zhǔn)組進(jìn)行比較。如果細(xì)胞符合所需標(biāo)準(zhǔn)，那么將電子電 荷應(yīng)用于液流，所述液流精確地分裂成包含細(xì)胞的小滴。在目的細(xì)胞將從流中脫落的那個(gè) 時(shí)刻，將這種電荷應(yīng)用于流，隨后當(dāng)荷電小滴已從流中脫落時(shí)去除。當(dāng)小滴落下時(shí)，它們經(jīng) 過帶強(qiáng)正或負(fù)電的2塊金屬板之間。荷電小滴被拉向相反極性的金屬板，并且沉積在收集 容器中，或顯微鏡載玻片上，用于進(jìn)一步檢查。細(xì)胞可以作為單種細(xì)胞或多種細(xì)胞自動沉積在收集容器中，例如使用激光器例如 氬激光器(488nm)和例如用于配備Autoclone單元的流式細(xì)胞儀(Coulter EPICS Altra, Beckman-Coulter，Miami, Fla.，USA)。用于本發(fā)明的方法的合適FACS機(jī)器的其他例子 包括但不限于，MoFlo 高速細(xì)胞分選器(Dako-Cytomation ltd)、FACSAria (Becton Dickinson)、FACS Diva (Becton Dickinson) > ALTRA Hyper sort (Beckman Coulter)禾口 CyFlow 分選系統(tǒng)(PartecGmbH)。使用固相顆粒從樣品中富集樹突狀細(xì)胞和/或其前體，可以利用具有所需性質(zhì)的 任何顆粒。例如，大顆粒(例如，直徑大于約90-100 μ m)可以用于促進(jìn)沉淀。優(yōu)選地，顆粒 是“磁性顆粒”(即可以使用磁場進(jìn)行收集的顆粒)。標(biāo)記的細(xì)胞保留在柱(由磁場保持) 中，而未標(biāo)記的細(xì)胞直接通過并且在另一個(gè)末端處洗脫。磁性顆粒目前通?？蓮母鱾€(gè)制造 商獲得，包括 Dynal Biotech (Oslo, Norway)和 MilteniBiotech GmbH (Germany)。磁性細(xì) 胞分選(MACS)的例子由Al-Mufti等人(1999)提供。激光捕獲顯微切割也可以使用本發(fā)明的方法用于在載玻片上選擇性富集標(biāo)記 的樹突狀細(xì)胞或其前體。使用激光捕獲顯微切割的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如， U. S. 20030227611 和 Bauer 等人，2002)。在富集后，細(xì)胞可以立即使用，或使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)在體外培養(yǎng)以擴(kuò)增樹突 狀細(xì)胞和/或其前體數(shù)目。此外，可以培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞前體，以產(chǎn)生成熟樹突狀細(xì)胞。結(jié)合5B6的化合物的鑒定描述了篩選測試化合物的方法，其可以鑒定與5B6結(jié)合且因此用作例如用于與治 療劑結(jié)合的靶向試劑的化合物，和/或與5B6直接結(jié)合且抑制或拮抗5B6的生物學(xué)活性的化合物。通過求助于測定法和技術(shù)篩選5B6活性的抑制劑，所述測定法和技術(shù)用于鑒定能 夠與5B6多肽結(jié)合且因此抑制其在樹突狀細(xì)胞或其前體的生物學(xué)活性的藥物。此種測定法 包括使用哺乳動物細(xì)胞系(例如，CHO細(xì)胞或293T細(xì)胞)用于噬菌體展示用于表達(dá)5B6多 肽，且使用原代細(xì)胞或親本細(xì)胞系或轉(zhuǎn)染哺乳動物或大腸桿菌或其他微生物的培養(yǎng)物，以 產(chǎn)生用于潛在結(jié)合化合物的結(jié)合研究的蛋白質(zhì)。采用使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)、抗體或多核苷酸序列的其他常規(guī)藥物篩選技術(shù)。作為 一個(gè)例子，用于鑒定與本發(fā)明的5B6多肽特異性結(jié)合的化合物的方法可以簡單地包括下述 步驟使所選擇的表達(dá)5B6的細(xì)胞與測試化合物接觸，以允許測試化合物與5B6的結(jié)合，并 且測定與5B6結(jié)合的測試化合物(如果存在)的量。此種方法涉及測試化合物與固定在固 體載體上的5B6多肽的溫育。一般地，允許包含固定的化合物的表面與包含蛋白質(zhì)的溶液 接觸，并且使用合適的檢測系統(tǒng)測量結(jié)合。合適的檢測系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，其中某些在本 文中描述。用于產(chǎn)生結(jié)合5B6的抗體或其片段的方法在上文描述。計(jì)算機(jī)建模和搜索技術(shù)允許鑒定可以結(jié)合本發(fā)明的多肽的化合物。可以測定5B6 或其活性位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)。這可以通過已知方法完成，所述方法包括可以測定完整分 子結(jié)構(gòu)的X射線晶體學(xué)。基于計(jì)算機(jī)的數(shù)字建模方法可以用于完成結(jié)構(gòu)(例如，在其中測定不完整或不夠 精確的結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案中)或改善其精確度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公認(rèn)的任何方法，包括但不 限于，對特定生物聚合物例如蛋白質(zhì)或核酸特異的參數(shù)化模型，基于計(jì)算分子運(yùn)動的分子 動力學(xué)模型，基于熱總體的統(tǒng)計(jì)力學(xué)模型，或組合模型。通過使用計(jì)算機(jī)建模，使用對接程序例如GRAM、D0CK或AUT0D0CK (Dunbrack等人， 1997), 5B6的三維結(jié)構(gòu)可以用于鑒定拮抗劑或激動劑。計(jì)算機(jī)程序也可以用于評估候選化 合物與多肽的吸引、排斥和立體阻礙。一般地，擬合越緊密(例如，更低的立體阻礙、和/或 更大的吸引力)，潛在激動劑或拮抗劑將更有效，因?yàn)檫@些性質(zhì)與更緊密的結(jié)合常數(shù)一致。 此外，在潛在激動劑或拮抗劑的設(shè)計(jì)中越特異，它將越不可能干擾其他蛋白質(zhì)。最初，例如使用本發(fā)明的方法可以獲得潛在化合物，例如通過篩選由重組噬菌體 產(chǎn)生的隨機(jī)肽文庫或化學(xué)文庫。隨后可以通過計(jì)算機(jī)建模程序系統(tǒng)性修飾以這種方式選擇 的化合物，直至鑒定一種或多種有希望的潛在化合物。此種計(jì)算機(jī)建模允許選擇有限數(shù)目的合理化學(xué)修飾，與可以制備并且其中任何一 種都可能產(chǎn)生有用激動劑或拮抗劑的無限數(shù)目的基本上隨機(jī)的化學(xué)修飾相對比。每種化學(xué) 修飾需要另外的化學(xué)步驟，這對于合成有限數(shù)目的化合物雖然是合理的，但如果需要合成 所有可能修飾，很快變得勢不可擋的。因此通過使用三維結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)建模，在計(jì)算機(jī)監(jiān)視 屏上可以快速篩選大量這些化合物，并且可以確定少數(shù)可能候選物而無需費(fèi)力合成無數(shù)數(shù) 目的化合物。對于大多數(shù)類型的模型，代表組成成分原子和基團(tuán)之間的力的標(biāo)準(zhǔn)分子力場是必 需的，并且可以選自物理化學(xué)中已知的力場。本領(lǐng)域已知且可以在此種方法中使用的示例 性力場包括但不限于，恒定價(jià)力場(CVFF)、AMBER力場和CHARM力場。不完整或較不精確的 實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)可以充當(dāng)關(guān)于由這些建模方法計(jì)算的完整和更精確結(jié)構(gòu)的約束。
分子建模系統(tǒng)的進(jìn)一步例子是CHARMm和QUANTA程序(PoIygenCorporation， Waltham, MA)。CHARMm執(zhí)行能量最低化和分子動力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、 圖形建模和分析。QUANTA允許分子相互的交互構(gòu)建、修飾、顯現(xiàn)和行為分析。微牛物保藏細(xì)節(jié)雜交瘤20/05-3A4-26-16-Clone 5 和雜交瘤 23/05-4C6-29-3_Clone 5 是分泌針 對人C型凝集素克隆5B6的單克隆Ab的雜交瘤。雜交瘤24/04-10B4-24-8-FACS 9_5 和雜交瘤 42/04-42D2-66-4-l_Clone 4 是分 泌針對小鼠C型凝集素克隆5B6的單克隆Ab的雜交瘤。雜交瘤24//04-10B4-24-8-FACS 9-5也分泌針對人C型凝集素克隆5B6的單克隆抗體。抗體24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4 和 23/05-4C6 通過雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn) 生，所述雜交瘤細(xì)胞系于2007年12月11日分別以保藏參考號07121101、07121102、 07121103和07121104保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC) 24/04-10B4-24-8、 42/04-42D2-66-4-1、20/05-3A4-26-16、23/05-4C6-29-3。上述雜交瘤的更高抗體分泌亞克隆(24/04-10B4-24-8-FACS 9_5、 42/04-42D2-66-4-l-Clone 4、20/05-3A4-26-16_Clone 5、23/05-4C6-29-3_Clone 5)于 2008年4月29日保藏于ECACC，并且指定下述編號；·雜交瘤 24/04-10B4-24-8-FACS 9-5-登記號 08042901·雜交瘤 42/04-42D2-66-4-1CL0NE 4_ 登記號 08041902·雜交瘤 20/05-3A4-26-16-CL0NE 5_ 登記號 08042903，和·雜交瘤 23/05-4C6-29-3-CL0NE 5_ 登記號 08042904。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序以及其實(shí)施細(xì)則的微生物保藏布達(dá)佩斯條約進(jìn)行這 些保藏。這確?；钆囵B(yǎng)物從保藏日期起維持30年。生物體將通過ECACC根據(jù)布達(dá)佩斯條 約可獲得。本申請的受讓人已同意，如果在合適條件下培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物保藏死亡或丟失或破 壞，它將在通知后立即用相同培養(yǎng)物的活樣本替換。保藏菌株的可用性不應(yīng)解釋為違背根 據(jù)任何政府當(dāng)局依照其專利法授予的權(quán)利實(shí)踐本發(fā)明的許可。^lt“基本上純化的”或“純化的”意指已與它在其天然狀態(tài)下與之結(jié)合的一種或多種 脂質(zhì)、核酸、其他多肽或其他污染分子分離的多肽。優(yōu)選基本上純化的多肽是至少60%不 含、更優(yōu)選至少75%不含、且更優(yōu)選至少90%不含它與之天然結(jié)合的其他組分。在多肽的背景中，術(shù)語“重組”指當(dāng)通過細(xì)胞或在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)，與其 天然狀態(tài)相比較，以改變的量或以改變的速率的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是并非天然 產(chǎn)生多肽的細(xì)胞。然而，細(xì)胞可以是包括非內(nèi)源基因的細(xì)胞，所述非內(nèi)源基因引起改變的， 優(yōu)選增加量的待生產(chǎn)多肽。本發(fā)明的重組多肽包括未與它在其中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì) 胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其他組分分開的多肽，以及在此種細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的基本 上純化掉至少某些其他組分的多肽。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”一般可互換使用并且指單條多肽鏈，其可以通過添加非氨 基酸基團(tuán)進(jìn)行修飾或不修飾。應(yīng)當(dāng)理解此種多肽鏈可以與其他多肽或蛋白質(zhì)或其他分子例 如輔因子結(jié)合。如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”還包括本文描述的多肽的變體、
39突變體、生物學(xué)活性片段、修飾、類似物和/或衍生物。多肽的同一性％通過GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)進(jìn)行測定， 其中缺口產(chǎn)生罰分=5，并且缺口延長罰分=0.3。查詢序列的長度是至少25個(gè)氨基酸，并 且GAP分析在至少25個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對2個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列的長度是至少 50個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對2個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序 列的長度是至少100個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域上比對2個(gè)序列。 更加優(yōu)選地，查詢序列的長度是至少200個(gè)氨基酸，并且GAP分析在至少200個(gè)氨基酸的區(qū) 域上比對2個(gè)序列。更加優(yōu)選地，GAP分析在其完整長度上比對2個(gè)序列。如本文所使用的，“生物學(xué)活性片段”是如本文所描述的多肽的部分，其維持全長 多肽的所定義活性。生物學(xué)活性片段可以是任何尺寸，只要它們維持所定義的活性。優(yōu)選 地，生物學(xué)活性片段長度是至少100個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物學(xué)活性片段能 夠與由細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞表達(dá)的全長5B6蛋白質(zhì)結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中， 生物學(xué)活性片段是能夠與由細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞表達(dá)的全長5B6蛋白質(zhì)結(jié)合的可溶性片 段。此種可溶性生物學(xué)活性片段的例子包括如下所述的這些，其包括5B6的CTLD區(qū)域，但 缺乏SEQ ID NOl至8中任何一個(gè)的至少約40、至少約50、至少約55、或至少約100個(gè)N末 端殘基。此外，本發(fā)明多肽的可溶性生物學(xué)活性片段的例子作為SEQ ID NO 58至61提供。 此外，包括本發(fā)明多肽的可溶性生物學(xué)活性片段的融合蛋白的例子在圖IlA中提供(SEQ ID NO 38 至 41)。如本文所使用的，“抗原片段”是如本文所描述的多肽的蛋白質(zhì)，其可以施用于動 物例如小鼠、兔或人，以誘導(dǎo)將結(jié)合全長天然多肽的抗體產(chǎn)生。如本文所使用的，“抗原結(jié)合片段”指如本文限定的抗體的部分，其能夠結(jié)合與全 長分子相同的抗原。就所限定的多肽而言，應(yīng)當(dāng)理解高于上文提供那些的同一性％數(shù)字將包括優(yōu)選實(shí) 施方案。因此，當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，根據(jù)最小同一性％數(shù)字，優(yōu)選多肽包含這樣的氨基酸序列，其與 相關(guān)提名的SEQ ID NO至少50%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更 優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少75 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少85 %、更優(yōu)選至少90 %、更 優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更 優(yōu)選至少96 %、更優(yōu)選至少97 %、更優(yōu)選至少98 %、更優(yōu)選至少99 %、更優(yōu)選至少99. 1 %、 更優(yōu)選至少99. 2 %、更優(yōu)選至少99. 3 %、更優(yōu)選至少99. 4 %、更優(yōu)選至少99. 5 %、更優(yōu)選至 少99. 6%、更優(yōu)選至少99. 7%、更優(yōu)選至少99. 8%、且更加優(yōu)選至少99. 9%等同。本發(fā)明的多肽包括5B6及其片段和變體，以及結(jié)合5B6的多肽例如抗體、天然或重 組配體/結(jié)合配偶體，其可以與可檢測標(biāo)記或其他多肽例如抗原或蛋白質(zhì)毒素綴合/融合 或不綴合/融合。本文描述的多肽的氨基酸序列突變體可以通過下述進(jìn)行制備將合適的核苷酸改 變引入本文限定的核酸內(nèi)，或通過所需多肽的體外合成。此種突變體包括例如在氨基酸序 列內(nèi)的殘基缺失、插入或置換?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和置換的組合以取得最終構(gòu)建體，條件 是最終多肽產(chǎn)物具有所需特征。突變體(改變的)多肽可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行制備。例如，可以對 本文描述的多核苷酸實(shí)施體外誘變。此種體外誘變技術(shù)可以包括將多核苷酸亞克隆到合適載體內(nèi)，將載體轉(zhuǎn)化到“誘變”株例如大腸桿菌XL-I紅色(Stratagene)內(nèi)，并且使轉(zhuǎn)化的 細(xì)菌繁殖合適數(shù)目的代。在另一個(gè)例子中，對本發(fā)明的多核苷酸實(shí)施如由Harayama(1998) 廣泛描述的DNA改組技術(shù)。衍生自誘變的/改變的DNA的產(chǎn)物可以使用本文描述的技術(shù)容 易地篩選，以測定它們是否能夠賦予所需表型。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體中，突變位點(diǎn)的定位和突變的性質(zhì)將依賴于待修飾的一 種或多種特征。用于突變的位點(diǎn)可以個(gè)別地或系列地進(jìn)行修飾，例如通過(1)首先用保守 氨基酸選擇進(jìn)行置換，隨后依賴于達(dá)到的結(jié)果用更激烈的選擇進(jìn)行置換，(2)缺失靶殘基， 或(3)插入與定位位點(diǎn)相鄰的其他殘基。氨基酸序列缺失一般范圍為約1至15個(gè)殘基，更優(yōu)選約1至10個(gè)殘基并且一般 是約1至5個(gè)鄰接殘基。置換突變體具有在多肽分子中去除的至少一個(gè)氨基酸殘基，以及在其位置中插入 的不同殘基。對于置換誘變最有利的位點(diǎn)包括鑒定為對于功能重要的位點(diǎn)。其他有利位點(diǎn) 是其中得自各種菌株或物種的特定殘基是等同的那些(參見例如，圖1)，和/或其中得自相 關(guān)蛋白質(zhì)的特定殘基是等同的那些(參見例如，圖2)。這些位置對于生物學(xué)活性可能是重 要的。這些位點(diǎn)特別是包括在至少3個(gè)其他等同保守位點(diǎn)序列內(nèi)的那些，優(yōu)選以相對保守 方式進(jìn)行置換。此種保守置換顯示于表1中。表I-示例性置換。
權(quán)利要求
結(jié)合多肽的化合物，所述多肽包括i)如SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50％等同的氨基酸序列；和/或iii)i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。
2.權(quán)利要求1的化合物，其結(jié)合包括氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少90%等同。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其是多肽。
4.權(quán)利要求3的化合物，其是抗體或其抗原結(jié)合片段。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中所述抗體是單克隆抗體、人源化抗體、單鏈抗體、雙抗體、 三抗體或四抗體。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的化合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括至少一個(gè) 互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，所述至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)包括與SEQ ID NO 44至46或49至51中任何 一個(gè)至少90%等同的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的化合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括包含 3個(gè)CDR的免疫球蛋白重鏈或其片段，并且其中i)⑶Rl包括與SEQID NO 44至少90%等同的氨基酸序列，ii)⑶R2包括與SEQID NO :45至少90%等同的氨基酸序列，和iii)CDR3包括與SEQID NO :46至少90%等同的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)的化合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括包含 3個(gè)CDR的免疫球蛋白輕鏈或其片段，并且其中i)⑶Rl包括與SEQID NO 49至少90%等同的氨基酸序列，ii)⑶R2包括與SEQID NO :50至少90%等同的氨基酸序列，和iii)⑶R3包括與SEQID NO :51至少90%等同的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)的化合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括i)包括包含如下氨基酸序列的可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述氨基酸序列與 SEQ ID N0:43至少90%等同，和/或ii)包括包含如下氨基酸序列的可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述氨基酸序列 與SEQ ID NO 48至少90%等同。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9中任一項(xiàng)的化合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括i)包括如下氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈或其片段，所述氨基酸序列與SEQID NO 42 至少90%等同，和/或ii)包括如下氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈或其片段，所述氨基酸序列與SEQID NO 47至少90%等同。
11.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的化合物，其中所述抗體是24/04-10B4、42/04-42D2、 20/05-3A4 或 23/05-4C6，或包括 24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4 或 23/05-4C6 的至少 一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的抗體。
12.權(quán)利要求3的化合物，其是多肽的可溶性片段，所述多肽包括i)如SEQID NO 1至8和58至61中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQID NO 1至8和58至61中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，其中所述可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40個(gè)N末端殘基。
13.與結(jié)合多肽的抗體競爭性結(jié)合所述多肽的化合物，其中所述多肽包括如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中所述抗體是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4和/ 或 23/05-4C6。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的化合物，其與治療劑綴合。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中所述治療劑是抗原。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中所述抗原是癌抗原、自身抗原、變應(yīng)原和/或來自致病 性和/或傳染性生物體的抗原。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中所述致病性和/或傳染性生物體是惡性瘧原蟲或間日 瘧原蟲。
19.權(quán)利要求15的化合物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素劑。
20.權(quán)利要求15的化合物，其中所述治療劑是藥物和/或藥理學(xué)試劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的化合物，其是可檢測標(biāo)記的。
22.穩(wěn)定的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，其能夠產(chǎn)生權(quán)利要求4的抗體。
23.權(quán)利要求22的細(xì)胞系，其是于2008年4月29日以保藏參考08042901保藏于歐 洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的24/04-10B4，于2008年4月29日以保藏參考08041902 保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的42/04-42D2，于2008年4月29日以保藏參考 08042903保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的20/05-3A4，或于2008年4月29日以 保藏參考08042904保藏于歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的23/05-4C6。
24.組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
25.權(quán)利要求24的組合物，其進(jìn)一步包括佐劑。
26.權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的組合物，其中所述化合物封裝在脂質(zhì)體中或暴露于脂 質(zhì)體表面上。
27.調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求 1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的組合物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答。
29.權(quán)利要求28的方法，其中給所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的化 合物。
30.權(quán)利要求27的方法，其中減少針對自身抗原或變應(yīng)原的免疫應(yīng)答。
31.調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括使樹突狀細(xì)胞或其前體 在體外暴露于根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至26中任 一項(xiàng)的組合物，并且將所述細(xì)胞施用于所述受試者。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞已從所述受試者中分離。
33.根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)的方法，其包括調(diào)節(jié)體液和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
34.權(quán)利要求33的方法，其包括調(diào)節(jié)幼稚CD8+T細(xì)胞激活和/或幼稚CD4+T細(xì)胞激活。
35.治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的方法，所述方法包括給所述受 試者施用根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的組合物。
36.權(quán)利要求35的方法，其包括施用權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的化合物。
37.治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的方法，所述方法包括給所述受 試者施用分離的多核苷酸和/或編碼所述多核苷酸的構(gòu)建體，當(dāng)其存在于所述受試者的細(xì) 胞中時(shí)，與缺乏所述多核苷酸的細(xì)胞相比較時(shí)，其調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中多肽的活性水平，所述多 肽包括i)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或ii)與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述多核苷酸下調(diào)所述細(xì)胞中所述多肽的活性水平，并 且其中所述多核苷酸選自反義多核苷酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和雙鏈 RNA。
39.根據(jù)權(quán)利要求35至38中任一項(xiàng)的方法，其中涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的所述疾病 是癌癥、感染、自身免疫疾病或過敏癥。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述自身免疫疾病是紅斑狼瘡。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述感染是瘧原蟲屬物種感染。
42.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的 組合物，在制造用于調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
43.在體外暴露于根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至 26中任一項(xiàng)的組合物的樹突狀細(xì)胞或其前體，在制造用于調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng) 答的藥物中的用途。
44.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物和/或根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的 組合物，在制造用于治療和/或預(yù)防受試者中涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的藥物中的 用途。
45.富集來自樣品的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，所述方法包括；i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至18、20或21中任一項(xiàng)的化 合物接觸，和 )分離與所述化合物結(jié)合的細(xì)胞。
46.富集來自樣品的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，其包括i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸接觸，所述第一 種多核苷酸與編碼多肽的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和 )分離所述可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。
47.權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的方法，其中將得自步驟ii)的所述細(xì)胞施用于受試者ο
48.權(quán)利要求47的方法，其中施用所述細(xì)胞以治療和/或預(yù)防選自癌癥、感染、自身免 疫疾病或過敏癥的疾病。
49.檢測樣品中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，其包括；i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至18、20或21中任一項(xiàng)的化合物接觸，ii)檢測與所述化合物結(jié)合的細(xì)胞。
50.檢測樣品中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，其包括；i)使包括樹突狀細(xì)胞或其前體的樣品與可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸接觸，所述第一 種多核苷酸與編碼多肽的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和ii)檢測所述可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。
51.檢測受試者中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，其包括；i)給所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1至18、20或21中任一項(xiàng)的化合物，ii)檢測與所述化合物結(jié)合的細(xì)胞。
52.權(quán)利要求49或權(quán)利要求51的方法，其中所述化合物是可檢測標(biāo)記的。
53.檢測受試者中的樹突狀細(xì)胞或其子集或前體的方法，其包括；i)給所述受試者施用可檢測標(biāo)記的第一種多核苷酸，所述第一種多核苷酸與編碼多肽 的第二種多核苷酸雜交，所述多肽包括a)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；和/或b)與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列，和ii)檢測所述可檢測標(biāo)記物的細(xì)胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求45至53中任一項(xiàng)的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞表達(dá)一種或多種下述 標(biāo)記物，CD8、CD24、Necl-2、CDllc、HLADR 和 BDCA3。
55.基本上純化的和/或重組的多肽，其包括i)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQI D NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列；和/或iii)i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。
56.權(quán)利要求55的多肽，其是樹突狀細(xì)胞或其前體標(biāo)記物。
57.權(quán)利要求55或權(quán)利要求56的多肽，其包括與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè) 至少90%等同的氨基酸序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項(xiàng)的多肽，其包括至少一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。
59.根據(jù)權(quán)利要求55至58中任一項(xiàng)的多肽，其缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。
60.根據(jù)權(quán)利要求55至59中任一項(xiàng)的多肽，其中所述生物學(xué)活性和/或抗原片段是可 溶性片段，其包括i)如SEQID NO 58至61中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；或ii)與SEQID NO 58至61中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列， 其中所述可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一個(gè)的至少約40個(gè)N末端殘基，并且其中所述可溶性片段能夠結(jié)合包括如SEQ IDNO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序 列的多肽。
61.根據(jù)權(quán)利要求55至58中任一項(xiàng)的多肽，其包括跨膜結(jié)構(gòu)域。
62.根據(jù)權(quán)利要求55至61中任一項(xiàng)的多肽，其與至少一種其他多肽融合。
63.分離的和/或外源多核苷酸，其包括i)如SEQID NO 9至16中任何一個(gè)中提供的核苷酸序列；ii)與SEQID NO 9至16中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的核苷酸序列；iii)編碼根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，iv)編碼權(quán)利要求3至21中任一項(xiàng)的化合物的核苷酸序列；和/或v)與i)至iv)中任何一個(gè)或多個(gè)或其互補(bǔ)體雜交的序列核苷酸。
64.權(quán)利要求63的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括與SEQID N09至16中任何一個(gè) 或多個(gè)至少90%等同的核苷酸序列。
65.權(quán)利要求63的多核苷酸，其包括在嚴(yán)格條件下與SEQID N09至16中任何一個(gè)或 多個(gè)雜交的核苷酸序列。
66.根據(jù)權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)的多核苷酸，其與能夠指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞中 的表達(dá)的啟動子可操作地連接。
67.分離的多核苷酸，當(dāng)其存在于受試者的細(xì)胞中時(shí)，與缺乏所述多核苷酸的細(xì)胞相比 較時(shí)，其調(diào)節(jié)所述細(xì)胞中根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽的活性水平。
68.權(quán)利要求67的多核苷酸，其與能夠指導(dǎo)所述多核苷酸在動物的細(xì)胞中的表達(dá)的啟 動子可操作地連接。
69.權(quán)利要求67或權(quán)利要求68的多核苷酸，其下調(diào)來自編碼所述多肽的基因的mRNA 水平。
70.根據(jù)權(quán)利要求67至69中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自反義多核苷 酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和雙鏈RNA(dsRNA)。
71.權(quán)利要求70的多核苷酸，其為在生理?xiàng)l件下與包括如SEQIDNO 9至16中提供的 任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸雜交的反義多核苷酸。
72.權(quán)利要求70的多核苷酸，其為能夠切割包括如SEQID NO 9至16中提供的任何一 個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的多核苷酸的催化多核苷酸。
73.權(quán)利要求70的多核苷酸，其為包括這樣的寡核苷酸的dsRNA分子，所述寡核苷酸 包括如SEQ ID NO 9至16中提供的任何一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的至少19個(gè)鄰接核苷酸， 其中T由U替換，其中其為雙鏈的分子的部分的長度是至少19個(gè)堿基對，并且包括所述寡 核苷酸。
74.權(quán)利要求73的多核苷酸，其從單個(gè)啟動子表達(dá)，其中所述雙鏈部分的鏈通過單鏈 部分連接。
75.載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸。
76.權(quán)利要求75的載體，其是表達(dá)載體。
77.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的至少一種多核苷酸和/或權(quán)利要求 75或權(quán)利要求76的至少一種載體。
78.權(quán)利要求77的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌、酵母、動物、昆蟲或植物細(xì)胞。
79.轉(zhuǎn)基因植物，其包括權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的外源多核苷酸。
80.權(quán)利要求79的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一 項(xiàng)的化合物。
81.轉(zhuǎn)基因非人動物，其包括權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的外源多核苷酸。
82.權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的植物和/或權(quán)利要求81的動物的提取物，其中所述提取物包括根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合 物、根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽和/或根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多核苷酸。
83.用于制備根據(jù)權(quán)利要求3至21中任一項(xiàng)的化合物或根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一 項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括在允許編碼所述化合物或多肽的所述多核苷酸表達(dá)的條件 下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、 權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的植物和/或權(quán)利要求81的非人動物，并且回收所述所表達(dá)的 化合物或多肽。
84.化合物或多肽，其使用83的方法產(chǎn)生。
85.樹突狀細(xì)胞和/或其前體的富集的群體，其通過根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)的方法獲得。
86.表達(dá)多肽的樹突狀細(xì)胞和/或其前體的富集的群體，所述多肽包括i)如SEQID NO 1至8中任何一個(gè)中提供的氨基酸序列；ii)與SEQID NO 1至8中任何一個(gè)或多個(gè)至少50%等同的氨基酸序列；和/或iii)i)或ii)的生物學(xué)活性和/或抗原片段。
87.擴(kuò)增的樹突狀細(xì)胞群體和/或其前體，其通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求85或權(quán)利要求86 的樹突狀細(xì)胞和/或其前體的富集的群體獲得。
88.組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中 任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主 細(xì)胞、權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物和/或根據(jù)權(quán)利要 求85至87中任一項(xiàng)的細(xì)胞群體，和藥學(xué)上可接受的載體。
89.鑒定與根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合的分子的方法，所述方法包括i)使根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽與候選化合物接觸，ii)測定所述化合物是否結(jié)合所述多肽。
90.鑒定與權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合的分子的方法，所述方法包括a)使權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽暴露于結(jié)合所述多肽的結(jié)合配偶體和候選試 劑，和b)評估所述候選試劑與所述結(jié)合配偶體競爭結(jié)合所述多肽的能力。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述結(jié)合配偶體是抗體。
92.權(quán)利要求90或權(quán)利要求91的方法，其中所述結(jié)合配偶體是可檢測標(biāo)記的。
93.根據(jù)權(quán)利要求89至92中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽在細(xì)胞中表達(dá)。
94.篩選與根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括 使用所述多肽晶體的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)就其與所述多肽結(jié)合的能力計(jì)算評估候選化合物。
95.化合物，其使用根據(jù)權(quán)利要求89至94中任一項(xiàng)的方法進(jìn)行鑒定。
96.調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求 55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利 要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn) 基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中任一項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利 要求88的組合物。
97.權(quán)利要求96的方法，其中給所述受試者施用包括多核苷酸的DNA疫苗，所述多核苷 酸編碼根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的化合物，其中在施用于所述受試者后產(chǎn)生所述化 合物并且產(chǎn)生針對所述抗原的免疫應(yīng)答。
98.權(quán)利要求96的方法，其中給所述受試者經(jīng)口施用權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn) 基因植物或其提取物。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或其提取物包括根據(jù)權(quán)利要求16至18 中任一項(xiàng)的化合物。
100.調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括使樹突狀細(xì)胞或其前體 在體外暴露于根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的 多核苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán) 利要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中 任一項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求88的組合物，并且將所述細(xì)胞施用于所述受試者。
101.治療和/或預(yù)防涉及樹突狀細(xì)胞或其前體的疾病的方法，所述方法包括給所述受 試者施用根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多核 苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要 求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中任一 項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求88的組合物。
102.根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多核 苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要 求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中任一 項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求88的組合物，在制造用于調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中 的用途。
103.在體外暴露于根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中 任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主 細(xì)胞、權(quán)利要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85 至87中任一項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求88的組合物的樹突狀細(xì)胞或其前體，在制造用 于調(diào)節(jié)受試者中針對抗原的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
104.根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多核 苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利要 求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中任一 項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求88的組合物，在制造用于治療和/或預(yù)防受試者中涉及樹突 狀細(xì)胞或其前體的疾病的藥物中的用途。
105.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)的化合物的方法，所述方法包括給動物施用 根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74的多核苷酸、或權(quán)利要求75 或權(quán)利要求76的載體和/或權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞。
106.權(quán)利要求105的方法，其進(jìn)一步包括從所述動物中分離結(jié)合所述多肽的抗體。
107.權(quán)利要求105的方法，其進(jìn)一步包括使來自所述動物的細(xì)胞與骨髓瘤腫瘤細(xì)胞融 合，以產(chǎn)生雜交瘤，所述動物產(chǎn)生結(jié)合所述多肽的抗體。
108.試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的化合物、權(quán)利要求22或權(quán)利要求823的細(xì)胞系、根據(jù)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的多肽、根據(jù)權(quán)利要求63至74中任一項(xiàng)的多 核苷酸、權(quán)利要求75或權(quán)利要求76的載體、權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的宿主細(xì)胞、權(quán)利 要求79或權(quán)利要求80的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求82的提取物、根據(jù)權(quán)利要求85至87中任 一項(xiàng)的細(xì)胞群體和/或權(quán)利要求24至26或88中任一項(xiàng)的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及位于樹突狀細(xì)胞及其前體，特別是抗原呈遞樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)鑒定。特別地，本發(fā)明涉及結(jié)合這些蛋白質(zhì)的化合物例如抗體。這些化合物可以用于檢測和/或富集樹突狀細(xì)胞的子集或其前體。這些化合物還可以用于使抗原靶向樹突狀細(xì)胞或其前體，以調(diào)節(jié)針對抗原的體液和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或用于將細(xì)胞毒素劑靶向涉及疾病狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞或其前體。
文檔編號C12N5/22GK101970491SQ200880110659
公開日2011年2月9日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者A·I·普羅耶托, A·M·盧, I·卡明斯基, K·肖特曼, L·吳, M·D·賴特, M·H·拉霍德 申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院;伯內(nèi)特研究所