專利名稱：從固定的樣品分離長(zhǎng)片段rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從固定的組織樣品中提取和分離高產(chǎn)率和高質(zhì)量(長(zhǎng)片段)RNA的領(lǐng) 域。本發(fā)明涉及使用這些新型的提取方法以為在固定的或者固定并石蠟包埋的組織中的基 因(例如癌生物標(biāo)記)提供評(píng)估基因表達(dá)水平的方法。本發(fā)明還提供用于測(cè)定基于化療方 案的方法，其是通過(guò)測(cè)量患者腫瘤細(xì)胞中的某一生物標(biāo)記的mRNA水平，并將其與預(yù)先確定 的閾值表達(dá)水平比較而測(cè)定的。
背景技術(shù)：
RNA類物質(zhì)(RNA species)的定量測(cè)量是分子生物學(xué)的現(xiàn)代研究所探討 的核心問(wèn)題。RNA類物質(zhì)也具有非常重要的臨床意義，例如，制備基因表達(dá)譜(gene e鄧ression profile)以表征各種不同組織類型，如侵襲性和非侵襲性腫瘤(1)。近 來(lái)技術(shù)的進(jìn)步，包括高度靈敏的基于熒光的實(shí)時(shí)RT-PCR方法和其它依賴雜交的方法 (hybridization-d印endent methodologies)的開發(fā)，使得現(xiàn)在可以對(duì)非常少量的mRNA進(jìn) 行快速和具體定量，例如從患者的活檢樣本中獲得的那些mRNA。在大多數(shù)定量方法中在為 了最佳結(jié)果而獲取足夠高質(zhì)量的RNA的過(guò)程中出現(xiàn)了問(wèn)題，特別是將RNA定量應(yīng)用至臨床 研究時(shí)。 信使RNA (mRNA)在新鮮/冷凍的組織中是相當(dāng)穩(wěn)定的，并且也相對(duì)容易地以大體 完整的形式分離。然而，除了在少數(shù)研究中作出了特別的努力去收集新鮮-冷凍的組織樣 品外，通常將取自患者的活檢組織樣品進(jìn)行福爾馬林固定并包埋在石蠟中。從在醫(yī)院常規(guī) 治療的患者以及從大多數(shù)臨床試驗(yàn)的參與者得到的組織樣本就是這樣處理的。福爾馬林固 定并石蠟包埋(FFPE)成為最常用的使用方法的主要原因是有助于組織的病理檢查。對(duì)已 經(jīng)進(jìn)行恒冷切片的新鮮_冷凍組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查不是最理想的，因?yàn)槠涫沟梅肿咏M織病 理學(xué)關(guān)聯(lián)困難，還使得通過(guò)顯微切割純化腫瘤或其它組織更加困難。相反地，福爾馬林固定 并石蠟包埋組織樣品保存了形態(tài)，并使得病理檢查更加容易。FFPE被通常使用的次要原因 是存儲(chǔ)新鮮-冷凍組織樣品的難度和成本。關(guān)于獲得和保護(hù)(secure)用于診斷分析和分 子化驗(yàn)的足夠的組織樣品的后勤問(wèn)題(logistical problem)似乎是不能克服的。結(jié)果是， 在全世界即使有，也是非常少的組織庫(kù)包含足夠的適于大范圍遺傳分析的冷凍組織樣品， 或者該組織庫(kù)具有足夠長(zhǎng)期的患者隨訪及其結(jié)果數(shù)據(jù)。在另一方面，F(xiàn)FPE組織仍是用于目 前病理學(xué)實(shí)踐的基礎(chǔ)。具有長(zhǎng)期隨訪的歸檔的FFPE組織可以容易地獲得，并且容易地被臨 床醫(yī)師和研究人員獲得，以及因此代表了用于在臨床環(huán)境中的研究的遺傳物質(zhì)的廣泛來(lái)源 (2)。 遺憾的是，福爾馬林固定方法，雖然更好地保存了組織的形態(tài)，但是對(duì)組織中的 RNA具有不利后果。RNA分子變成片段，也就是被切割成更小的碎片，以及可能被福爾馬林
4交聯(lián)(3-6)。這兩種過(guò)程大大增加了在RNA定量步驟(例如基因表達(dá)譜的產(chǎn)生)中使用來(lái) 自FFPE樣品中的RNA的難度。長(zhǎng)度短的RNA使得更難以得到用于定量實(shí)時(shí)RT-PCR的最佳 的引物_探針組，而交聯(lián)阻止了合成RNA或DNA新鏈的RNA或DNA聚合酶酶類的推進(jìn)，所述 RNA或DNA的新鏈?zhǔn)菍?duì)分離的RNA物質(zhì)進(jìn)行成功的擴(kuò)增所必需的。與使用來(lái)自新鮮冷凍組 織的隨機(jī)片段化RNA相比，使用來(lái)自FFPE組織使擴(kuò)增的RNA的產(chǎn)率顯著降低，而短片段長(zhǎng) 度會(huì)特別地降低后續(xù)雜交步驟的效率和特異性。雜交的特異性在PCR中對(duì)避免假陽(yáng)性結(jié)果 和高背景擴(kuò)增至關(guān)重要?；谏鲜隼碛?，開發(fā)出從FFPE組織中以盡可能高的產(chǎn)率分離盡可 能高質(zhì)量的RNA的方法是很重要的。 從FFPE組織中提取完整的高分子量(長(zhǎng)片段)RNA是困難和前后不一致 (inconsisitent)的過(guò)程。在本領(lǐng)域中已知多種從樣品中提取RNA的技術(shù)(7-17)。這些提 取技術(shù)經(jīng)測(cè)試取得了不同程度的成功。 一些研究已經(jīng)提供了新方法以使從歸檔的FFPE組 織中提取DNA和RNA最優(yōu)化(18-34)，而其它研究已經(jīng)研究了固定時(shí)間對(duì)定量RT-PCR分析 的影響(研究人員通常無(wú)法控制的因素)(10，12，13，26)。到目前為止，研究表明即使可以 將從FFPE中提取的RNA成功地進(jìn)行PCR，仍然存在有關(guān)提取的RNA的分離產(chǎn)率和質(zhì)量(長(zhǎng) 度)的一致性的問(wèn)題。之前對(duì)于擴(kuò)增長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸(nt)的提取的RNA的片段的嘗試 通常是不成功的，通常僅僅對(duì)范圍在60至120nt的片段的擴(kuò)增取得一定程度的成功(any degree of success) (2)。目前為止，大多數(shù)提取方法的研究的重點(diǎn)集中在從FFPE組織中 得到最高產(chǎn)率的RNA，而不必發(fā)現(xiàn)怎樣得到高質(zhì)量的提取RNA，也就是說(shuō)，通過(guò)在提取過(guò)程 中避免進(jìn)一步降解從而保存RNA的片段長(zhǎng)度。通常，這兩個(gè)目標(biāo)并不總是能同時(shí)實(shí)現(xiàn)的獲 得最大產(chǎn)率的RNA可能需要進(jìn)一步降解RNA長(zhǎng)度的條件，導(dǎo)致更多的、長(zhǎng)度卻更短的RNA。
另一個(gè)在大多數(shù)以前的研究中常常沒(méi)有認(rèn)識(shí)到的并且通常沒(méi)有重視的是在DNA 對(duì)RNA制備物的污染。由于DNA是比RNA更穩(wěn)定的分子，F(xiàn)FPE提取物通常包含比RNA更多 的DNA。 RNA和DNA是化學(xué)上非常相似的分子，并且DNA的堿基序列在RNA中被復(fù)制。因此， 在需要雜交技術(shù)的RNA分析中，大量的DNA污染可以導(dǎo)致虛假的結(jié)果，因?yàn)镈NA可能與RNA 分子競(jìng)爭(zhēng)與雜交位點(diǎn)結(jié)合。例如，在PCR過(guò)程中，引物和探針可以與污染DNA和從RNA生成 的cDNA結(jié)合并擴(kuò)增它們。在用于RT-PCR的RNA分離物中，DNA的存在通常是通過(guò)使用所 謂的RNA特異性引物來(lái)處理，也就是說(shuō)，跨越內(nèi)含子_外顯子交界的引物，因此在DNA中應(yīng) 該不能擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列。然而，即使使用RNA特異性引物，DNA中的偽基因也可以被擴(kuò) 增。在樣品制備物中不含可測(cè)量的DNA的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為在進(jìn)行RT-PCR時(shí)不必局限于RNA-特 異性引物，而因此引物結(jié)合位點(diǎn)的選擇大大增加。 因此，需要高產(chǎn)率地分離高質(zhì)量(長(zhǎng)片段)RNA的方法，并且該方法具有可接受的 低DNA共-分離/污染。本發(fā)明可以滿足該要求。 分離RNA以測(cè)定癌組織中多種生物標(biāo)記的表達(dá)水平可用于某些狀況的診斷或者 協(xié)助醫(yī)師確定治療的適當(dāng)療程。例如，已經(jīng)鑒定了可用于診斷癌癥的生物標(biāo)記，以及可用于 預(yù)測(cè)某種化療方案是否有助于治療疾病的生物標(biāo)記。已知許多疾病生物標(biāo)記，包括，例如癌 癥生物標(biāo)記ERCC1、 TS、 DPD、 Her2-neu、 EGFR、 GST-pi、 k-ras和RRMl，這些僅是其中的一部 分。 此外，在本發(fā)明公開的RNA分離的方法可以用于從任意的FFPE組織中分離長(zhǎng)片段 RNA。 一般而言，F(xiàn)FPE組織來(lái)自源于任何癌癥的腫瘤活檢。
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ERCC1 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)(ERCC1)基因在修復(fù)DNA加合物中是關(guān)鍵。人ERCC1基因已 經(jīng)被克隆。Westerveld等，Nature (London) 310 :425 428(1984) ;Tanaka等，Nature 348 : 73 76(1990)。幾種使用在這種基因中存在缺陷的突變的人和倉(cāng)鼠細(xì)胞系的研究以及人腫 瘤組織的研究表明由ERCC1編碼的產(chǎn)物涉及到鉑-DNA加合物的切除修復(fù)。Dabholkar等， J. Natl. Cancer Inst. 84 :15121517 (1992) ;Dijt等，Cancer Res. 48 :6058 6062(1988); Hansson等，NucleicAcids Res. 18 :35 40(1990)。 當(dāng)轉(zhuǎn)染至DNA修復(fù)缺陷的CHO細(xì)胞時(shí)，ERCC1賦予對(duì)順鉑的細(xì)胞抗性以及修復(fù) 鉬-DNA加合物。Hansson等，Nucleic acids Res. 18 :35 40(1990)。目前公認(rèn)的切除修復(fù) 模型顯示損傷識(shí)別/切除步驟是切除修復(fù)過(guò)程的限速步驟。 已經(jīng)檢查了來(lái)自接受基于鉑的療法的癌癥患者的惡性細(xì)胞中切除修復(fù)基因(例 如ERCC1)的相對(duì)表達(dá)水平。Dabholkar等，J. Natl. Cancer Inst. 84 :15121517 (1992)。已 經(jīng)報(bào)道了當(dāng)用順鉑(DDP)/氟尿嘧啶的化療方案治療時(shí)，胃癌患者中ERCC1過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤應(yīng) 答和最終的存活率具有消極影響(Metzger，等，J Clin 0ncoll6 :309， 1998)。最近，有證據(jù) 表明吉西他濱(gemcitabine(Gem))可以調(diào)整ERCC1核苷酸切除修復(fù)(NER)活性。因此， ERCC1表達(dá)的瘤內(nèi)水平可以成為確定DDP和GEM是否有效治療癌癥患者的主要預(yù)后因素。
GST-pi 蛋白質(zhì)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)家族涉及細(xì)胞毒性藥物(cytotoxicdrug) 的解毒作用。通過(guò)用谷胱甘肽催化毒性且致癌的親電子分子的共軛，所述GST酶保護(hù) 細(xì)胞大分子免受損傷(Boyer等，Preparation, characterization andproperties of glutathione S_transferases. In :Zakim D，Vessey D (eds. )Biochemical Pharmacology and Toxicology. New York, N. Y. John Wiley andSons， 1985)。這些蛋白質(zhì)的某種異構(gòu)類 型，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pi (GST-pi，本發(fā)明中也可替換地稱作GSTP1或GST- )在人的上 皮組織中廣泛表達(dá)，并且已經(jīng)顯示在一些腫瘤中過(guò)表達(dá)(Terrier等，Am J Pathol 1990; 137:845 853 ;Moscow等，Cancer Res 1989 ;49 :1422 1428)。盡管確切的機(jī)理仍然不清楚， 在耐藥的腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)增加的GST-pi水平(Tsuchida等，Crit Rev BiochemMol Biol 1992 ;27 :337 384)。之前的研究已經(jīng)表明GST蛋白(非mRNA)的低表達(dá)與對(duì)基于鉑的化 療的應(yīng)答有關(guān)(Nishimura等，Cancer. Clin Cancer Resl996 ;2 :1859 1865 ;Tominaga，等， Am. J. Gastro. 94 :1664 1668， 1999 ;Kase，等，Acta Cytologia. 42 :1397 1402,1998)。然 而，這些研究并沒(méi)有測(cè)量定量基因表達(dá)，而是使用半定量的免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)量蛋 白質(zhì)水平。然而，需要定量的GST-pi基因表達(dá)測(cè)量以實(shí)現(xiàn)非常有效的預(yù)后。
Her2腦/EGFR 肺癌在西方國(guó)家的男性和女性中均為癌癥相關(guān)死亡的罪魁禍?zhǔn)住Ｔ诿绹?guó)，每年診 斷出大約171， 000例的肺癌新增病例，并有160， 000個(gè)體因此疾病而死亡。盡管在過(guò)去20 年，肺癌的檢測(cè)和治療方面已經(jīng)取得了進(jìn)步，但是5年的總生存率仍低于15%。 Ginsberg, 等，In :DeVita， 等，Cancer :Principlesin Practice of Oncology, Ed. 5， pp. 858-910. Philadelphia Lipincott-RavenPublishers， 199。為了進(jìn)一步提高患有非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)的患者生存率，其基于分子改變的預(yù)后分類是至關(guān)重要的。這種分類將提供更精確 和有用的診斷手段，并且最終提供更有效的治療選擇。
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受體酪氨酸激酶(RTKs)在有絲分裂信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中是重要的。RTK為大跨膜蛋白， 該蛋白具有用于生長(zhǎng)因子(例如上皮生長(zhǎng)因子(EGF))的細(xì)胞外配體結(jié)合域和在胞質(zhì)蛋白 (cytosol protein)上起到磷酸化酪氨酸氨基酸殘基的激酶作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的胞內(nèi) 部分。已知多種類型的受體酪氨酸激酶基于與不同的受體酪氨酸激酶結(jié)合的生長(zhǎng)因子家族 (Wilks，Advances in CancerResearch，1993，60，43-73)。 I類激酶(例如受體酪氨酸激酶的EGF-R家族)包括EGF、 HER2-neu、 erbB、 Xmrk、 DER和let23受體。這些受體頻繁出現(xiàn)在普通的人的癌癥中，例如乳腺癌(Sainsbury等， Brit. J. Cancer, 1988， 58， 458 ;Guerin等，OncogeneRes. ， 1988， 3， 21)、月市的鱗狀細(xì)胞癌 (Hendler等，Cancer Cells, 1989， 7， 347)、膀胱癌(Neal等，Lancet, 1985， 366)、食管癌 (Mukaida等，Cancer, 1991， 68， 142)、胃腸癌(例如結(jié)腸、直腸或胃癌)(Bolen等，Oncogene Res. ，1987， 1,149)、白血病(Konaka等，Cell, 1984， 37， 1035)和卵巢、支氣管或胰腺癌(歐 洲專利說(shuō)明書第0400586號(hào))。隨著其它的人腫瘤組織被用于檢測(cè)受體酪氨酸激酶的EFG 家族，預(yù)期其廣泛普遍性將在其它癌癥(例如甲狀腺和子宮癌)中確定。
具體地，很少在正常的細(xì)胞中探測(cè)到EGFR酪氨酸激酶活性，然而在惡性細(xì)胞中可 更頻繁地探測(cè)到(Hunter, Cell, 1987， 50， 823)。最近的研究結(jié)果顯示EGFR在多種的人癌 癥(例如腦、肺鱗狀細(xì)胞、膀胱、胃、乳腺、頭和頸、食管、婦科和甲狀腺腫瘤)中過(guò)表達(dá)(W J Gullick，Brit. Med. Bull. ，1991,47,87)。受體酪氨酸激酶在其它細(xì)胞增殖疾病(例如銀屑 病)中也是重要的。EGFR病癥是具有如下特征的病癥一般不表達(dá)EGFR的細(xì)胞表達(dá)EGFR， 或者增強(qiáng)的EGFR激活導(dǎo)致不需要的細(xì)胞增殖，和/或者不適當(dāng)?shù)腅GFR水平的存在。已知 EGFR被其配體EGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_ a (TGF- a )激活。 Her2-neu蛋白也是I類受體酪氨酸激酶(RTK)家族的成員。Yarden andUllrich， An皿.Rev. Biochem. 57 :443， 1988 ;Ullrich and Schlessinger， Cel161 : 203， 1990。 Her2-neu蛋白與EGFR在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。Carraway，等，Cell 78 :5， 1994 ; Carraway，等，J. Biol. Chem. 269 :14303， 1994。這些受體具有共同的分子結(jié)構(gòu)(molecular architecture)，并在包含兩個(gè)位于其胞漿域內(nèi)的富半胱氨酸區(qū)和位于它們的胞漿域內(nèi)的 結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶區(qū)。 Her2-neu蛋白的依賴配體的激活被認(rèn)為是通過(guò)neu活化因子(neuactivating factor ;NAF)調(diào)節(jié)的，其能夠直接與p165 (Her2-neu)結(jié)合，并剌激酶活性。Dougall等， Oncogene 9 :2109， 1994 ;Samata等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :1711， 1994。 Her2-neu蛋 白的依賴配體的同源二聚體化和產(chǎn)生的受體激活是通過(guò)Her2-neu蛋白的過(guò)表達(dá)促進(jìn)的。 激活的Her2-neu復(fù)合物起到磷酸激酶的作用并磷酸化不同胞質(zhì)蛋白。HER2-neu病癥的特 征在于HER2-neu的不適當(dāng)?shù)幕钚曰蜻^(guò)度活性具有導(dǎo)致不需要的細(xì)胞增殖(例如癌)的提 高的HER2-neu表達(dá)。 受體酪氨酸激酶EGFR和HER2-neu的抑制劑被用作哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性 抑制劑(Yaish等Science, 1988， 242， 933)。例如，制表菌素(erbstatin)， 一種EGF受體 酪氨酸激酶抑制劑，降低了注射至無(wú)胸腺的裸鼠中的表達(dá)EGFR的人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，然 而對(duì)不表達(dá)EGFR的腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有效果。(Toi等，Eur. J. Cancer Clin. Oncol. ， 1990,26， 722.)。苯乙烯的多種衍生物也被宣稱具有酪氨酸激酶抑制性(歐洲專利申請(qǐng)第0211363、 0304493和0322738號(hào))，并將用作抗腫瘤劑。兩種這樣的苯乙烯衍生物為第I類RTK抑
7制劑，其已經(jīng)通過(guò)削弱注射到裸鼠中的人鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)而顯示出有效性(Yoneda等， Cancer Research, 1991,51,4430)。從歐洲專利申請(qǐng)第0520722和0566226號(hào)還得知某些 4-苯胺基喹唑啉(4-anilinoquinazoline)衍生物在用作受體酪氨酸激酶的抑制劑時(shí)十 分有用。這些化合物顯示的非常緊密的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系表明了明確的結(jié)合模式，其中喹唑 啉環(huán)結(jié)合在嘌呤袋(adenin印ocket)中，而苯胺基環(huán)結(jié)合在鄰近的、唯一的親脂袋中。三 種4-苯胺基喹唑啉類似物(4-anilinoquinazoline analogue)(兩種可逆和一種不可逆 抑制劑)已經(jīng)作為抗癌藥物進(jìn)行了臨床評(píng)估。Denny， Farmaco Ja皿ary-February2001 ; 56 (1-2) :51-6。最近，美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用單克隆抗體曲妥珠單抗(trastazumab) (Herc印tin逸)用于治療過(guò)表達(dá)HER2_neu的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。Scheurle，等，Anticancer Res 20 :2091-2096,2000。 由于對(duì)抗腫瘤的有效化療通常需要藥物的組合，確認(rèn)和定量對(duì)每一種藥物的耐藥 性和敏感性的決定因素已經(jīng)成為設(shè)計(jì)個(gè)體組合化療的重要工具。研究曾嘗試尋找來(lái)自癌癥 患者的惡性細(xì)胞中EGFR和/或HER2-neu的表達(dá)的相對(duì)水平與生存率之間可靠的關(guān)聯(lián)性， 結(jié)果以失敗告終。 EGFR的預(yù)后重要性和在NSCLC中EGFR的預(yù)后重要性直至現(xiàn)在仍然具有爭(zhēng)議性。 使用結(jié)合測(cè)定法的研究表明在晚期NSCLC中EGFR表達(dá)的增加與總生存率下降有關(guān)，然而 使用用于測(cè)量EGFR mRNA或蛋白表達(dá)的半定量技術(shù)沒(méi)有顯示與臨床結(jié)果相一致的關(guān)系。 Veale等，Br. J. Caner 68 :162-165， 1993 ;Fujino等，Eur. Cancer 32 :2070-2074， 1996 ; Rusch，等，Cancer Res53 :2379-2385， 1993 ;Pfeiffer，等，Br J Cancer 74:86-91,1996; Pastorino，等，.JClin Oncol 15:2858-2865,1997。使用免疫組織化學(xué)方法對(duì)NSCLC腫 瘤中EGFR表達(dá)的研究已經(jīng)顯示在NSCLC腫瘤中EGFR過(guò)表達(dá)的頻率為32% -47%， Veale 等，Br. J. Caner 55 :513-516， 1987 ;Veale等，Br. J. Caner68 :162-165， 1993 ;Fujino等， Eur.Cancer 32 :2070-2074，1996 ;Rusch，等，CancerRes 53 :2379-2385，1993 ;Pastorino 等，J. Clin. One. 15 :2858-2865， 1997 ;Tateishi， 等，Eur J Cancer 27 :1372-75， 1991 ; Rachwal，等，Br J Cancer72 :56-64， 1995 ;Rusch，等，Cancer Res 15:2379-85,1993; Pfeiffer，等，Br J Cancer78 :96-9， 1998 ;0hsaki，等，Oncol R印7:603-7，2000。此外， 有人報(bào)道在組織學(xué)亞型中EGFR表達(dá)存在顯著的區(qū)別， 一般而言，在SCC中比在AC和LC中 具有更高EGFR表達(dá)。Fujino等，Eur. Cancer 32 :2070-2074， 1996 ;Veale等，Br. J. Caner 55 :513-516， 1987 ;Pastorino等，J. Clin. One. 15 :2858-2865， 1997 ;Pfeiffer，等，Br J Cancer 78 :96-9,1998 ;0hsaki等，Oncol. R印.& :603-7， 2000。然而，這些研究報(bào)道EGFR過(guò) 表達(dá)與肺癌患者生存率沒(méi)有一致的關(guān)聯(lián)性。 在一些非結(jié)論性的研究中對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)與患者生存率降低的假定(purposed)的 相關(guān)性進(jìn)行了觀察。Veale等，1987 ;0hsaki等，2000。然而，Veale等人分析了僅僅只有19 個(gè)NSCLC患者的總體。Ohsaki等人將EGFR蛋白表達(dá)與在具有p53過(guò)表達(dá)的NSCLC患者的 預(yù)后不良關(guān)聯(lián)起來(lái)(P = 0. 024)。 正如EGFR —樣，HER2-neu的預(yù)后重要性和在NSCLC中的HER2_neu的預(yù)后重要 性直至目前仍然存在爭(zhēng)議。在NSCLC(包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌)中已經(jīng)顯示 HER2-neu蛋白過(guò)表達(dá)。Veale等，1987 ;Schneider，等，Cancer Res 49:4968-4971,1989; Kern等，Cancer Res. 50 :5184—5191,1990 ;Weiner， 等，Cancer Res 50 :421425,1990 ;
8Res. 20 :2091-2096， 2000。使用蛋白測(cè)定法的早期研究報(bào)道肺腺 癌(AC)中的HER2-neu蛋白過(guò)表達(dá)與較低的總生存率的相關(guān)性。Kern，等，Cancer Res50 : 5184-5191， 1990 ;Kern等，J Clin Invest 93:516-20,1994。然而，與之相矛盾的研究報(bào) 道肺腺癌(AC)中的HER2-neu蛋白過(guò)表達(dá)與較低的總生存率沒(méi)有相關(guān)性。Pfeiffer等， Br.J. Cancer 74 :86-91，1996。 另一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題是評(píng)估作為癌癥預(yù)后者(prognosticator)的HER2_neu與EGFR 共過(guò)表達(dá)(co-over expression)之間的相互關(guān)系。Tateishi等人(Eur. J. Cancer 27: 1372-75,1991)測(cè)量了 13%進(jìn)行分析的AC中的EGFR和HER2_neu蛋白共-表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)這 兩種基因共_過(guò)表達(dá)與較低的5年生存率存在關(guān)聯(lián)性。然而，就單獨(dú)的HER2-neu過(guò)表達(dá)而 言，HER2-neu和EGFR共過(guò)表達(dá)與肺的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和大細(xì)胞癌(LCC)的生存率之間 相關(guān)性還沒(méi)有報(bào)道。 測(cè)定EGFR和HER2-neu表達(dá)水平的方法學(xué)不一致是測(cè)定這些基因的何種表達(dá)程 度可以用于預(yù)示癌癥患者生存率中存在的問(wèn)題的根本。到目前為止，對(duì)NSCLC中HER2-neu 表達(dá)和EGFR表達(dá)的研究在針對(duì)EGFR和HER2-neu 二者的表達(dá)均得到正分?jǐn)?shù)的NSCLC腫 瘤(NSCLC tumor scoredpositive for both EGFR and HER2-neu expression)的步員率方 面有著巨大變化。通過(guò)使用在光學(xué)顯微鏡載玻片上的石蠟包埋組織和HER2-neu抗血清， 在13-80%腺癌(AC)，2-45X的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)，以及在0-20%的大細(xì)胞癌(LC)中報(bào)告 了通過(guò)正蛋白染色(positive protein staining)所定義的HER2-neu過(guò)表達(dá)。Pfeiffer 等，1996 ;Kern等，1990 ;Kern等，1994 ;Tateishi等，1991 ;Shi，等，Mol Carcing 5 :213-8， 1992 ;Bongiorno， 等，J Thorac Cardiovasc Surgl07 :590_5，1994 ;Harpole， 等，Clin Cancer Res 1 :659-64， 1995 ;Volm等，Anticancer Res 12 :11-20， 1992。此外，最近的報(bào)告 實(shí)例了目前設(shè)計(jì)用來(lái)評(píng)估HER2-neu表達(dá)水平的反感的非特異性。在浸潤(rùn)性乳腺癌中用于 測(cè)量HER2-neu表達(dá)的Herc印Test:⑧顯示具有非常高的假陽(yáng)性。Jacobs等，J ClinOncol 17 :1983-1987，1999。 如果存在用于測(cè)定EGFR和HER2-neu的表達(dá)水平的精密的、準(zhǔn)確的和一致性的方 法，可以確定什么樣的表達(dá)水平與患者的生存率相關(guān)，以及受體酪氨酸激酶靶向性化療是 否合適。在確立用于目前和將來(lái)的受體酪氨酸激酶靶向性化療(例如化療劑、基于抗體的 藥物)的臨床試驗(yàn)中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法連貫一致地證實(shí)NSCLC中的EGFR和/或HER2-neu過(guò) 表達(dá)是理想的，以治療過(guò)表達(dá)這些受體的癌癥。
DPD 5-氟尿嘧啶(5-FU)是用于治療許多不同類型癌癥的使用非常廣泛的藥物，這 些癌癥包括主要癌癥，例如胃腸道和乳腺的癌癥(Moertel， C. G. NewEngl. J. Med. ， 330 : 1136-1142， 1994) 。 40多年以來(lái)，結(jié)腸直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)的一線療法是單獨(dú)使用5-FU，但是其作 為"護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)"被5-FU和CPT-ll的組合所代替(Saltz等，Irinotecan Study Group. New England Journal of Medicine. 343 :905-14， 2000)。近來(lái)，5-FU和奧沙利鉬(oxaliplatin) 的組合已經(jīng)在結(jié)腸直腸癌中引起高應(yīng)答率(Raymond等，Semin. Oncol. ，25 :4-12,1998)。因 此，5-FU可能將會(huì)多年繼續(xù)用于癌癥治療，因?yàn)槠浔４媪四壳盎煼ǖ闹饕M分。此外，單 劑5-FU療法將會(huì)繼續(xù)用于CPT-ll或奧沙利鉑的聯(lián)合療法對(duì)其很可能具有過(guò)度毒性的患 者。
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5-FU屬于典型的大多數(shù)抗癌藥物，因?yàn)橹挥猩贁?shù)的患者對(duì)該治療體驗(yàn)到有利的 應(yīng)答。大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)顯示患有結(jié)腸直腸癌的患者對(duì)作為單劑的5-FU的腫瘤應(yīng)答率在 15-20%的范圍內(nèi)(Moertel，C. G. New Engl. J. Med. ， 330 :1136-1142， 1994)。結(jié)合前述的其 它化療，對(duì)基于5-FU方案的腫瘤應(yīng)答率增加至幾乎40%。然而，大多數(shù)受治療的患者從接 受基于5-FU的化療中沒(méi)有得到明顯效益，而且經(jīng)受重大的風(fēng)險(xiǎn)、不適和支出。由于在治療 之前，沒(méi)有預(yù)期個(gè)體的腫瘤的應(yīng)答性的可靠的方法，標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)踐使所有的病人接受基 于5-FU的治療，充分認(rèn)識(shí)到大多數(shù)將會(huì)得到不滿意的結(jié)果。 多年來(lái)，已經(jīng)深入地研究了 5-FU的作用機(jī)理和代謝途徑以鑒定對(duì)該藥物的抗腫 瘤活性最重要的生物化學(xué)決定子(determinants最終目標(biāo)是通過(guò)如下幾方面來(lái)改善5-FU 的臨床功效a)調(diào)節(jié)其細(xì)胞內(nèi)代謝和生物化學(xué)；和b)在治療前測(cè)定患者的應(yīng)答決定子以預(yù) 測(cè)最可能對(duì)該藥物產(chǎn)生應(yīng)答(或者無(wú)應(yīng)答)的患者。從這些研究中得到兩種主要的決定子
1)5-FU的靶酶，即胸苷酸合酶(TS)的鑒定和2)5-FU分解代謝酶，即二氫嘧啶脫氫酶(DPD) 的鑒定。 在基于5-FU療法的腫瘤應(yīng)答預(yù)測(cè)領(lǐng)域中最初的研究集中在結(jié)腸直腸癌中的靶酶 TS上。Leichman等(Leichman等，J.Clin Oncol. ，15 :3223-3229,1997)進(jìn)行了前瞻性的 臨床試驗(yàn)以將對(duì)5-FU的腫瘤應(yīng)答與TS基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，所述TS基因表達(dá)是通過(guò)在來(lái)自結(jié) 腸直腸癌的預(yù)處理的活檢中進(jìn)行RT-PCR而測(cè)定的。本研究顯示1)在這些腫瘤中，TS基 因表達(dá)水平在50倍的大范圍內(nèi)；和2)在應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答腫瘤之間的TS基因表達(dá)水平顯著不 同。應(yīng)答組的TS水平的范圍(0.5-4. 1X10—3，相對(duì)于內(nèi)部控制)比無(wú)應(yīng)答組TS水平的范 圍(1.6-23.0X10—3，相對(duì)于內(nèi)部控制)窄。研究者確定了因此得出的TS表達(dá)的"無(wú)應(yīng)答的 截止值(non-response cutoff)"閾值水平，高于該閾值只能是無(wú)應(yīng)答者。因此，TS表達(dá)高 于該"無(wú)應(yīng)答的截止值"閾值的患者可以在治療之前確認(rèn)為無(wú)應(yīng)答者。"無(wú)應(yīng)答"分類包括 具有如下特征的所有的治療應(yīng)答腫瘤縮小< 50%、導(dǎo)致腫瘤增加> 25%的進(jìn)展性生長(zhǎng)， 以及或者縮小< 50%、無(wú)變化或者增加< 25%的非進(jìn)展性腫瘤。這些腫瘤具有最高的TS 水平。因此，高TS表達(dá)鑒定出特別有抗性的腫瘤。高于某一閾值的TS表達(dá)水平鑒定出對(duì) 5-FU無(wú)應(yīng)答的腫瘤亞組，而低于這個(gè)數(shù)值的TS表達(dá)水平預(yù)測(cè)了稍高的應(yīng)答率，但是不能明 確地鑒定應(yīng)答腫瘤。 后續(xù)的研究調(diào)查了 DPD表達(dá)水平作為5-FU治療的腫瘤應(yīng)答決定子與TS表達(dá)水 平一起結(jié)合的有效性。DPD為分解代謝酶，其使5-FU的5，6雙鍵還原，使得其為無(wú)活性 的細(xì)胞毒性劑。之前的研究顯示在正常組織中的DPD水平可以影響5-FU的生物可利用 性(bio-availability)，從而調(diào)節(jié)其藥代動(dòng)力學(xué)和抗腫瘤活性(Harris等，Cancer Res.， 50 :197-201,1990)。此外，證據(jù)表明腫瘤中的DPD水平與對(duì)5_FU的敏感性相關(guān)(Etienne 等，J. Clin. Oncol. ， 13 :1663-1670， 1995 ;Beck等，Eur. J. Cancer, 30 :1517-1522， 1994)。 Salonga等，(Clin Cancer Res. ，6 :1322-1327， 2000)研究了 DPD的基因表達(dá)在已經(jīng)測(cè)定了 TS表達(dá)的一組腫瘤中用于5-FU/亞葉酸鈣治療的腫瘤應(yīng)答決定子。至于TS，與無(wú)應(yīng)答腫瘤 的DPD表達(dá)的范圍(0.2-16X10—3，80倍；相對(duì)于內(nèi)部控制)相比，在應(yīng)答腫瘤中的DPD表 達(dá)的范圍相對(duì)較窄(0.6-2.5X10—3， 4.2倍；相對(duì)于內(nèi)部控制)。不存在DPD表達(dá)高于大約 2. 5X 10—3的閾值水平的應(yīng)答腫瘤。此外，DPD和TS表達(dá)水平之間彼此沒(méi)有顯示相關(guān)性，表 明它們?yōu)楠?dú)立調(diào)節(jié)的基因。在TS和DPD表達(dá)水平同時(shí)低于其各自的"無(wú)應(yīng)答截止值"閾值
10水平的腫瘤組中，92X對(duì)5-FU/LV應(yīng)答。因此，基于DPD和TS的低表達(dá)能夠鑒定應(yīng)答腫瘤。
DPD也是5-FU毒性的重要的標(biāo)志物。觀察到具有非常低的DPD水平的患者(例如 DPD缺乏綜合征中；即，胸腺嘧啶-尿嘧啶尿(uraciluria))在進(jìn)行基于5_FU治療時(shí)遭遇 到威脅生命的毒性(Lyss等，Cancer Invest. ，11 :2390240,1993)。 5-FU與抗病毒化合物 索立夫定之間不利的藥物相互作用導(dǎo)致在日本出現(xiàn)19例死亡案例(Diasio等，Br. J. Clin. Pharmacol. 46， 1-4， 1998)，這確實(shí)戲劇性地示例了 DPD水平在5-FU治療中的重要性。后續(xù) 發(fā)現(xiàn)索立夫定的代謝產(chǎn)物為DPD的有力抑制劑。這種治療導(dǎo)致類似于DPD缺乏綜合征的 降低的DPD水平，其增加5-FU對(duì)患者的毒性(Diasio等，Br. J. Clin. Pharmacol. 46， 1_4， 1998)。 因此，由于a)5-FU在治療癌癥中的廣泛應(yīng)用；b)DPD表達(dá)在預(yù)測(cè)對(duì)5_FU的腫瘤 應(yīng)答的重要作用；和c)患有DPD缺乏綜合征的個(gè)體對(duì)普通的基于5-FU治療的敏感性，可以 清楚地看到在化療之前的精確地測(cè)定DPD表達(dá)水平將為癌癥患者帶來(lái)一個(gè)重要的好處。
測(cè)量DPD酶活性需要大量包含活性酶的新鮮組織。不幸的是，可以獲得的大多數(shù) 預(yù)處理的腫瘤活檢只能作為不包含活性酶的固定石蠟包埋(FPE)組織，特別是福爾馬林 固定的石蠟包埋組織。而且，活檢通常僅僅包含非常少量的非均質(zhì)組織(heterogeneous tissue)。 可以得到RT-PCR引物和探針序列以分析冷凍組織或新鮮組織中的DPD表達(dá)。然 而，這些引物不適合用于通過(guò)RT-PCR對(duì)來(lái)自固定組織的DPDmRNA進(jìn)行的定量。到目前為 止，現(xiàn)存的引物不能得到結(jié)果或得到的結(jié)果不穩(wěn)定。這被認(rèn)為是由于a)DPD RNA的固有 低水平；b)包埋在石蠟中的組織量非常??；和c)石蠟中的RNA降解成< 100bp的短片段。 結(jié)果，其它的研究人員對(duì)于得到允許定量石蠟化組織中DPD表達(dá)的寡核苷酸引物組已經(jīng)做 出了一致的，卻不成功的嘗試。因此，需要定量來(lái)自固定組織的DPD mRNA的方法以提供對(duì) 提議的癌癥療法的早期預(yù)后。因?yàn)橐呀?jīng)顯示DPD酶活性和相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平密切相 關(guān)(Ishikawa等，Clin. Cancer Res. ， 5 :883-889， 1999 ;Johnson等，Analyt. Biochem. 278 : 175-184， 2000)，測(cè)量FPE樣本中的DPD mRNA表達(dá)提供了一種評(píng)估患者的DPD表達(dá)水平狀 態(tài)的方式，而無(wú)需測(cè)定新鮮組織中的酶活性。此外，F(xiàn)PE樣本容易進(jìn)行顯微切割，因而可以 測(cè)定未被間質(zhì)組織污染的腫瘤組織中的DPD基因表達(dá)。
TS 胸苷酸合酶(TS)為在DNA生物合成中的整合酶(integral enzyme)，在生物合成 中其催化脫氧尿苷一磷酸(dUMP)還原性甲基化成為脫氧胸苷一磷酸(dTMP)，并提供在細(xì) 胞內(nèi)重新合成嘧啶核苷酸的唯一途徑(Johnston等，1995)。胸苷酸合酶為化療藥物(最常 見(jiàn)為抗葉酸劑藥物5-氟尿嘧啶(5-FU))的靶。作為治療結(jié)腸癌、頭頸癌和乳腺癌的最有效 的單劑，5-FU的主要作用為抑制TS活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胸腺嘧啶水平的損耗，并隨后導(dǎo)致細(xì) 胞死亡。 已經(jīng)報(bào)道了在來(lái)自原發(fā)性腫瘤(Johnston等，1995 ;Lenz等，1995)和轉(zhuǎn)移灶 (Farrugia等，1997 ;Leichmann等，1997) 二者的臨床腫瘤樣本中TS表達(dá)的可觀變化。 例如，在結(jié)腸直腸癌腫，腫瘤組織相對(duì)于正常胃腸粘膜組織的TS表達(dá)比的范圍為2至 10 (Ardalan and Zang，1996)。 同樣已知胸苷酸合酶在腫瘤抗性的形成中具有臨床重要性，如下述研究所證明的，該研究顯示了在暴露于5-FU后贅生細(xì)胞中TS蛋白的急性誘導(dǎo)和TS酶水平的增加 (Spears等1982 ;Swain等1989)。腫瘤相應(yīng)于細(xì)胞毒性劑(例如5_FU)而急性過(guò)表達(dá) TS的能力在氟尿嘧啶抗性的形成過(guò)程中可能起了某些作用。之前的研究顯示TS蛋白水 平與5-FU療法的有效性直接相關(guān)，即存在蛋白質(zhì)與RNA表達(dá)的直接相關(guān)性(Jackman等， 1985)，還顯示了 TS表達(dá)為結(jié)腸直腸癌和乳腺癌中強(qiáng)有力的預(yù)后標(biāo)志物(Jackman等，1985 ; Horikoshi等，l"2)。 在晚期的轉(zhuǎn)移性疾病中，顯示了由RT-PCR定量的高TS mRNA和高TS蛋白表達(dá)來(lái) 預(yù)測(cè)對(duì)用于結(jié)腸直腸癌(Johnston等，1995， Farrugia等，1997， Leichman等，1997)、胃癌 (Lenz等，1995，Alexander等，1995)和頭頸癌(Johnston等，1997)的基于氟嘧啶的療法的 弱應(yīng)答。應(yīng)答者與無(wú)應(yīng)答者之間的大量的重疊經(jīng)常出現(xiàn)在低TS類型內(nèi)，但是TS水平高于 中位值的患者大多數(shù)為無(wú)應(yīng)答者。如果與其它分子特性(例如二氫嘧啶脫氫酶(DPD)和胸 苷磷酸化酶(TP)表達(dá)水平)、復(fù)制錯(cuò)誤陽(yáng)性(RER+)狀態(tài)(Kitchens and Berger 1997)和 p53狀態(tài)(Lenz等，1997)結(jié)合，可以進(jìn)一步提高TS過(guò)表達(dá)的預(yù)測(cè)值。到目前為止，評(píng)估人 腫瘤中TS表達(dá)的研究表明，基于人腫瘤中的TS表達(dá)預(yù)測(cè)應(yīng)答和結(jié)果的能力可以在未來(lái)提 供選擇最可能受益于TS-指導(dǎo)的治療的機(jī)會(huì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了從固定組織樣本提取RNA的方法。本發(fā)明也提供了從福 爾馬林固定石蠟包埋的組織分離RNA的可靠和可重復(fù)的方法。 本發(fā)明提供了從固定組織樣品分離長(zhǎng)片段RNA的方法，該方法包括加熱在提取溶 液中的固定的組織樣品至大約44至大約62t:的范圍內(nèi)的溫度持續(xù)3小時(shí)以上的時(shí)間，其 中，所述提取溶液包含濃度為大約O. lmM至大約20mM的螯合劑和蛋白酶K(優(yōu)選以大約 g蛋白酶K/400iiL(12.5iig蛋白酶K/mL)的濃度)；和去除DNA污染并從提取溶液分離 所述的RNA。 在某些實(shí)施方式中，可以在范圍在大約45至大約60°C ，從大約48至大約58°C ，從 大約48至大約55°C ，從大約48至大約52t:或者大約50°C的溫度下加熱。特別優(yōu)選的加熱 溫度為大約50-56°C。 在某些實(shí)施方式中，所述時(shí)間大于4小時(shí)，大于8小時(shí)，大于大約12小時(shí)，大于大 約14小時(shí)或大約16小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述時(shí)間為大約16小時(shí)。
所述螯合劑可以為任意螯合劑，例如EDTA、 EGTA、檸檬酸鹽類、檸檬酸類、水楊酸、 水楊酸鹽類、鄰苯二甲酸、2，4-戊二酮類(2，4-pentanedines)、組氨酸類、二鹽酸組氨醇 類、8-羥基喹啉類、8-羥基喹啉、檸檬酸鹽類或鄰羥基醌類。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述螯 合劑為EDTA或檸檬酸鈉。 在某些實(shí)施方式中，所述螯合劑為EDTA或檸檬酸鈉，并且以大約2. 5mM至大約 5. 0mM的濃度存在。在某些實(shí)施方式中，所述EDTA或檸檬酸鈉以大約2. 5mM至大約5. 0mM 的濃度、以大約3. 0mM至大約4. 0mM的濃度，以大約3. 25至大約3. 75mM的濃度存在。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，所述EDTA或檸檬酸鈉以大約0. 6mM至大約3. 6mM的濃度存在。在另一優(yōu) 選的實(shí)施方式中，EDTA或檸檬酸鈉以大約3. 6mM的濃度存在。 通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以去除DNA污染，所述方法例如但不限于苯酚/氯仿/異戊醇(PCI)提取，通過(guò)兩種苯酚/氯仿/異戊醇(isoamyl)(兩種都加入或者沒(méi)有加入 DNA酶)，其中在第一 PCI提取中、或者在第二 PCI提取中或者在兩者中存在離液劑，或者通 過(guò)市售的純化柱(即，具有或者沒(méi)有DNA酶的Qiagen，或者其它產(chǎn)品)(S卩，Ambion Turbo 無(wú)DNA酶的方法)。在一些實(shí)施方式中，可以綜合采用這些方法。 所述離液劑可以為任意已知的離液劑，例如尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉(NaSCN)、 鹽酸胍(Guanidine HC1)、鹽酸胍(guanidinium chloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸鋰 (lithium tetrachloroacetate)、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀或三氟乙酸銫。在某些實(shí) 施方式中，離液劑為異硫氰酸胍。 在某些實(shí)施方式中，固定的福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品為16年或更短 時(shí)間的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組織樣品為5年或更短時(shí)間的，以及在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，所述組織樣品為2年或更短時(shí)間的。 在某些實(shí)施方式中，所述長(zhǎng)片段RNA的長(zhǎng)度長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方式 中，所述長(zhǎng)片段RNA為300個(gè)核苷酸以上。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述長(zhǎng)片段RNA長(zhǎng)度在大 約300至大約400個(gè)核苷酸之間。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和IB顯示了溫度對(duì)長(zhǎng)片段RNA產(chǎn)率的影響。這些數(shù)據(jù)顯示在更低溫度下的 更長(zhǎng)時(shí)間的溫育會(huì)分離出更高產(chǎn)率的更長(zhǎng)片段的RNA。 圖2A和B顯示了加熱時(shí)間對(duì)RNA產(chǎn)率的影B向。該數(shù)據(jù)顯示在更長(zhǎng)的加熱時(shí)間下所 有大小的RNA片段的產(chǎn)率都提高了。 lOObp片段的產(chǎn)率提高超過(guò)lO倍(3.5個(gè)PCR循環(huán))， 而當(dāng)延長(zhǎng)加熱時(shí)間時(shí)，300bp片段的產(chǎn)率提高了幾乎26或者大約600倍。400b片段的產(chǎn)率 也類似地提高。 圖3A和B顯示溫育溫度和提取溶液的EDTA濃度對(duì)來(lái)自FFPE組織的RNA的影響。 這些數(shù)據(jù)表明5(TC為優(yōu)選的加熱溫度，以及3. 6mM為優(yōu)選的EDTA濃度。
圖4顯示在從石蠟基質(zhì)(paraffin matrix)取出RNA的提取步驟中改變蛋白酶K 的量的影響。數(shù)據(jù)顯示就最大RNA產(chǎn)率以及最小DNA污染而言優(yōu)選濃度均為5 g(圖1中 的IX)。 圖5A和5B顯示對(duì)使用五種提取方法的RNA產(chǎn)率和DNA污染的比較結(jié)果1)高溫 離液劑法；2)PK法(本發(fā)明的方法，其包括(蛋白酶K、低溫和長(zhǎng)時(shí)間加熱))；3)使用含有 異硫氰酸胍("GITC")的單次的苯酚提取的PK法；4)在第二次提取中使用含有GITC的兩 次苯酚提取的PK法；5)使用用Tris緩沖液代替GITC的兩次苯酚提取的PK法。例如，在 圖中，標(biāo)記"F4jj00bp"指的是用高溫離液劑法處理的樣品F4 ;F4_2_100bp指的是用PK 法處理的樣品F4 ;F4_3_100bp指的是用使用含有GITC的單次苯酚提取的PK法處理的樣品 F4，等。在圖的靠左邊的5個(gè)柱表示NRT(無(wú)逆轉(zhuǎn)錄作用)，并且表示樣品中的DNA量。
圖6顯示對(duì)命名為B5、D6和F5的從FFPE分離的RNA的量和純度的比較。"PK"表 示使用本發(fā)明的分離方法，("RGI")表示使用高溫分離方法(在美國(guó)專利第6， 248， 535號(hào) 描述)；以及"para"表示使用市售可得的Paradise⑧試劑盒。通過(guò)在280nm處的紫外吸收 測(cè)量RNA的純度。這些數(shù)據(jù)顯示在3個(gè)測(cè)試樣品中本發(fā)明分離出比Paradise⑧試劑盒的 更高產(chǎn)率的RNA和更純(相對(duì)于DNA污染而言)的RNA。這些結(jié)果也顯示PK法產(chǎn)生的RNA 不如RGI法的多，卻提供了更純的RNA樣品。
圖7顯示了對(duì)從FFPE樣品B5、 D6和F5中分離的100、300、400禾P lOOObp的RNA 片段的量的比較，其是通過(guò)PCR擴(kuò)增各樣品中的P-肌動(dòng)蛋白測(cè)量的。"PK"表示使用本發(fā) 明的分離方法，("RGI")表示使用高溫分離方法(在美國(guó)專利第6，248，535號(hào)描述)；以 及"para"表示使用市售可得的Paradise⑧試劑盒。這些數(shù)據(jù)顯示使用PK的優(yōu)選方法得 到各種片段長(zhǎng)度的最佳產(chǎn)率和最少DNA污染。在柱狀圖下面的表格中提供了柱狀圖中表示 的數(shù)據(jù)。 圖8顯示對(duì)通過(guò)各種方法分離的RNA片段的大小分布的比較。在大小排阻柱上分 餾RNA，并通過(guò)在280nm處的UV吸收來(lái)定量。在柱子中更小的片段比更大片段移動(dòng)得更快。 D5 =樣品1 ;F5 =樣品2 ;D6 =樣品3。 "PK"表示使用本發(fā)明的分離方法，("RGI")表示 使用高溫分離方法(在美國(guó)專利第6， 248， 535號(hào)描述)；以及"Paradise"表示使用市售可 得的Paradise⑧試劑盒；且"冷凍"是從相應(yīng)的新鮮冷凍組織中分離的RNA級(jí)分。在第五 行中的單個(gè)點(diǎn)線圖包含分子量標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)圖顯示與其它方法相比，PK法提供更高質(zhì)量更 長(zhǎng)片段的RNA。 圖9顯示了對(duì)使用本發(fā)明的方法從FFPE組織分離的RNA中P -肌動(dòng)蛋白的表達(dá) 水平與使用常規(guī)方法從冷凍新鮮組織分離的RNA中P-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平(通過(guò)PCR測(cè) 定)的比較。這些數(shù)據(jù)顯示使用從FFPE提取的RNA(特別是使用本發(fā)明的方法)得到的 基因表達(dá)分析，與新鮮冷凍組織中的基因表達(dá)相關(guān)并且可靠地反映了新鮮冷凍組織的基因 表達(dá)。例如，新鮮冷凍組織的結(jié)果與FFPE的結(jié)果之間的正相關(guān)性(direct correlation) 會(huì)顯示為一條斜線，并且W值為1。 ^值越接近1，性質(zhì)越相近。因此，對(duì)于PK分離，f值 為.89，其優(yōu)于通過(guò)Paradise試劑盒得到的R2值0. 81或者RGI的R2值0. 84。
圖10圖示了樣品時(shí)間(sample age)對(duì)長(zhǎng)片段RNA類物質(zhì)的產(chǎn)率影響。該數(shù)據(jù)顯 示Ct值隨著樣品時(shí)間的增加而逐漸增加(更低的RNA產(chǎn)率)。因此，隨著樣品時(shí)間的增加， RNA產(chǎn)率和質(zhì)量會(huì)降低(更少的長(zhǎng)片段RNA)。樣品1、2、3、4和5在1991年被固定；樣品2 在2000年被固定，以及樣品D7、D9和F3在2005年被固定。標(biāo)注有"RNA"的柱指的是無(wú)逆 轉(zhuǎn)錄對(duì)照，即，DNA污染的量。 圖11為顯示接受順鉑/吉西他濱治療的患者總生存率對(duì)修正的NSCLC中相對(duì) ERCC1表達(dá)的圖示。修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平低于6. 7X 10—3的閾值的患者對(duì)應(yīng)于顯著 更好的生存率。而修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平高于6. 7X 10—3的閾值的患者對(duì)應(yīng)于顯著更 差的生存率。(P = 0. 009時(shí)序檢驗(yàn)(Log ranktest))。 圖12為圖示怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因(internal control gene)計(jì)算修正的相 對(duì)ERCC1表達(dá)的圖表。該圖表包含用兩種測(cè)試樣品得到的數(shù)據(jù)(未知1和2)，并說(shuō)明了 怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表也說(shuō)明了怎樣通過(guò)使用預(yù)TaqMan⑧技術(shù) (pre-TaqMan technology)測(cè)定的已知相對(duì)ERCC1值使通過(guò)TaqMan⑧'儀器產(chǎn)生的UGE標(biāo) 準(zhǔn)化。這是通過(guò)將UGE乘以修正因子K皿d實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因是P-肌動(dòng)蛋 白，并且校準(zhǔn)物(calibrator)RNA為Human Liver Total RNA(人肝臟總RNA) (Stratagene， Cat. #735017)。 圖13為顯示在研究中的56個(gè)患者的人口統(tǒng)計(jì)詳細(xì)信息(腫瘤期和細(xì)胞類型)的 表格。接受的治療周期的中間數(shù)為3(范圍16)。 14位患者(25%)曾經(jīng)接受過(guò)化療，大部 分(9位患者)用紫杉烷單獨(dú)治療或者與DDP或卡鉑組合治療。56位患者中的3位已經(jīng)接受放射治療，并且5位患者已經(jīng)手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤。 圖14為表格，其顯示與具有在閾值以上的修正ERCC1水平的患者的20.4周(95% C. I. 6. 9， 33. 9周)生存率相比，具有在閾值以下的修正ERCC1表達(dá)水平的患者具有顯著 更長(zhǎng)的61.6周的生存率中值(95% C. 1.42.4,80. 7周)。針對(duì)腫瘤階段進(jìn)行調(diào)整，低或 高ERCC1表達(dá)與總生存率之間相關(guān)性的時(shí)序統(tǒng)計(jì)量(Log rank statistic)為3. 97，以及 P值為0.046。未調(diào)節(jié)的時(shí)序結(jié)果示于圖中。也顯示了與在使用卡普蘭-邁耶生存率曲線 和時(shí)序檢驗(yàn)(log rank test)的單變量分析中的總生存率緊密相關(guān)的因素。這些因素為預(yù) 治療重量損失和ECOG體力狀態(tài)(performance status)的存在?；颊吣挲g(P = 0. 18)、性 別(P = 0. 87)、腫瘤階段(P = 0. 99)、腫瘤細(xì)胞類型(P = 0. 63)，以及胸腔積液(pleural effusion)的存在(P = 0. 71)并不是總生存率的重要的預(yù)后因素。在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模 型多變量分析(Cox proportional hazards regression model multivariable analysis) 中，修正的相對(duì)ERCCl表達(dá)水平、ECOG體力狀態(tài)和體重?fù)p失仍然是生存率的重要的預(yù)后因 素。據(jù)腫瘤階段分層的(stratified) Cox回歸模型的P值對(duì)ERCCl為0. 038，對(duì)體重?fù)p失為 0. 017，以及對(duì)EC0G體力狀態(tài)為0. 02 (PS 0對(duì)1或2)。 圖15是顯示怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因計(jì)算DPD表達(dá)的圖表。該圖表包含用兩種 測(cè)試樣品得到的數(shù)據(jù)(未知l和2)，并顯示怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)UCG。該 圖表也說(shuō)明了怎樣使用先前公布的DPD值使由T叫man儀器產(chǎn)生的UGE標(biāo)準(zhǔn)化。其是通過(guò) 將UGE乘以修正因子K。pD實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因?yàn)镻-肌動(dòng)蛋白，以及校準(zhǔn)物RNA 為Universal PERNA ;來(lái)自Applied Biosystems的Cat #4307281， lot # 3617812014。
圖16顯示各種組織學(xué)類型的樣本的相對(duì)修正的DPD表達(dá)水平的框線圖。這些框 顯示25和75百分位數(shù)(四分位距(interquartile))范圍。在各個(gè)框中以水平線顯示了 中位值。伸出的線(whisker)顯示在25和75百分位數(shù)之外的水平，其顯示在框上面，但是 排除那些遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離的值。 圖17為顯示接受5-FU和奧沙利鉑治療方案的具有高(高于大約7.5X10—3倍 P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n = 7)和低(低于大約7.5X10—3倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n = 43)的修正TS表達(dá)水平的攜帶結(jié)腸直腸腺癌腫瘤的患者生存率的預(yù)期概率和生存的時(shí)間 (月)的圖。 圖18為顯示接受5-FU和奧沙利鉑治療方案的具有高(高于大約4.9X10—3倍 P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n = 10)和低(低于大約4.9X10—3倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n = 40)的修正ERCC1表達(dá)水平的攜帶結(jié)腸直腸腺癌腫瘤的患者生存率的預(yù)期概率和生存的時(shí) 間(月)圖。 圖19為顯示接受5-FU和奧沙利鉑治療方案的具有高(TS表達(dá)高于大約7. 5X10—3 倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)，并且ERCC1高于大約4.9X10—3倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n =14)和低(TS表達(dá)低于大約7. 5X10—3倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)，并且ERCC1低于大約 4.9X10—3倍P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)；n = 36)的修正TS和ERCC1表達(dá)水平的攜帶結(jié)腸直腸 腺癌腫瘤的患者生存率的預(yù)期可能性和生存的時(shí)間(月)圖。 圖20為顯示用奧沙利鉑/5-FU治療的結(jié)腸直腸癌患者生存率相對(duì)于紫外分析的 ERCC1和TS表達(dá)的表。 圖21為顯示用奧沙利鉑/5-FU治療的結(jié)腸直腸癌患者生存率相對(duì)于分層分析的ERCC1和TS表達(dá)的表。 圖22為顯示用5-FU和奧沙利鉑化療方案治療的攜帶結(jié)腸直腸腺癌腫瘤的患者的 應(yīng)答的圖?；颊叻譃檫M(jìn)行性疾病(PD)、部分應(yīng)答(PR)和穩(wěn)定的疾病(SD)。同時(shí)具有低水 平的TS和ERCC1表達(dá)的患者具有最佳的應(yīng)答。 圖23為說(shuō)明怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因計(jì)算ERCC1表達(dá)的圖表。該圖表包括用兩 種測(cè)試樣品(未知1和2)得到的數(shù)據(jù)，并說(shuō)明怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該 圖表也說(shuō)明了怎樣用已知的通過(guò)預(yù)-TaqMan逸技術(shù)測(cè)定的ERCC1值使通過(guò)TaqMan逸'儀器 產(chǎn)生的UGE標(biāo)準(zhǔn)化。其是通過(guò)將UGE乘以修正因子K皿d實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因 是P -肌動(dòng)蛋白，以及校準(zhǔn)物RNA為人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)。
圖24為說(shuō)明怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因計(jì)算TS表達(dá)的圖表。該圖表包括用兩種測(cè) 試樣品(未知1和2)得到的數(shù)據(jù)，并說(shuō)明怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表 也說(shuō)明了怎樣用先前公開的TS值使通過(guò)TaqMan .⑩儀器產(chǎn)生的UGE標(biāo)準(zhǔn)化。其是通過(guò)將 UGE乘以修正因子I^實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因是P-肌動(dòng)蛋白，以及校準(zhǔn)物RNA為 來(lái)自Applied Biosystems的Universal PE RNA ;Cat #4307281， lot #3617812014。
圖25為說(shuō)明怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因計(jì)算EGFR表達(dá)的圖表。該圖表包括用兩種 測(cè)試樣品(未知1和2)得到的數(shù)據(jù)，并說(shuō)明怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖 表也說(shuō)明了怎樣用已知的通過(guò)預(yù)-TaqMan逸技術(shù)測(cè)定的相對(duì)EGFR值使通過(guò)TaqMar虛儀器 產(chǎn)生的UGE標(biāo)準(zhǔn)化。其是通過(guò)將UGE乘以修正因子K，K實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因是 P -肌動(dòng)蛋白，以及校準(zhǔn)物RNA為人肝臟總RNA(Stratagene， Cat #735017)。
圖26為說(shuō)明怎樣相對(duì)于內(nèi)部控制基因計(jì)算HER2-neu表達(dá)的圖表。該圖表包括用 兩種測(cè)試樣品(未知1和2)得到的數(shù)據(jù)，并說(shuō)明怎樣測(cè)定未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。 該圖表也說(shuō)明了怎樣用之前公布的HER2-neu值使通過(guò)TaqMan⑧儀器產(chǎn)生的UGE標(biāo)準(zhǔn)化。 其是通過(guò)將UGE乘以修正因子KH，—，實(shí)現(xiàn)的。在圖中的內(nèi)部控制基因是P-肌動(dòng)蛋白，以 及校準(zhǔn)物RNA為人肝臟總RNA(Stratagene， Cat #735017)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了從固定組織樣品分離長(zhǎng)片段RNA的方法。本發(fā)明的方法適于包含多 種核酸的生物樣品。本發(fā)明的方法在從固定的腫瘤組織樣本分離RNA時(shí)特別有用。生物樣 品通常用固定劑固定，例如福爾馬林(甲醛)(包括Bouin固定劑)和戊二醛。使用其它固 定技術(shù)(例如醇浸沒(méi)(Battifora andKopinski， J. Histochem. Cytochem. (1986)34:1095)) 固定組織樣品也是合適的。所述組織樣品也可以包埋在石蠟中。最常見(jiàn)地。組織樣品被保 存為福爾馬林固定-石蠟包埋(FFPE)樣品。 在本發(fā)明中長(zhǎng)片段RNA定義為長(zhǎng)于100nt的RNA。優(yōu)選地，RNA長(zhǎng)度為大約150nt 以上，更優(yōu)選為長(zhǎng)度大約200nt以上，以及最優(yōu)選為長(zhǎng)度300nt以上。在某些實(shí)施方式中， 長(zhǎng)片段RNA為大約400nt以上。長(zhǎng)片段RNA也可以包括lOOOnt以上的RNA片段。
—般而言，持續(xù)某段指定時(shí)間以提高的溫度進(jìn)行溫育對(duì)于從FFPE樣本提取大分 子(例如RNA)是必要的。實(shí)現(xiàn)從石蠟回收RNA存在兩種通用的方法或者在離液劑(例如 胍鹽)的存在下溫育FFPE樣品，或者在蛋白酶K的存在下溫育，蛋白酶K為降解蛋白質(zhì)并 可能協(xié)助從蛋白質(zhì)基質(zhì)中釋放RNA的酶。已知這些基本方法的多種變化形式。然而，到目 前為止沒(méi)有專門針對(duì)從FFPE樣品提取更長(zhǎng)的RNA片段的研究或方法。通常的概念認(rèn)為RNA
16分子隨著溫度的升高和暴露在高溫下的時(shí)間的增加而降解。然而，溫度/時(shí)間與從FFPE提 取的高質(zhì)量/長(zhǎng)片段RNA物質(zhì)的最大產(chǎn)率之間的定量關(guān)系還是未知的或者沒(méi)有受到廣泛的 關(guān)注。此外，還不知道是否存在閾值溫度，在該閾值溫度下，RNA不會(huì)僅僅因?yàn)闊嵝?yīng)而出 現(xiàn)可觀的降解。 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)測(cè)定了溫度和時(shí)間都對(duì)RNA質(zhì)量有影響，但是溫度和時(shí)間對(duì) 短片段RNA(100nt以下)的影響與溫度和時(shí)間對(duì)長(zhǎng)片段RNA(片段長(zhǎng)度大于100nt，例如 300nt長(zhǎng)度的片段)的影響沒(méi)有必然的相關(guān)性。圖1A和1B提供了其中FFPE樣品在不同的 溫度(92、82、72和62")下溫育不同時(shí)間(0. 5、 1、2和8小時(shí))的結(jié)果。Y軸為Ct值。Ct 值與PCR產(chǎn)物的量相關(guān)，因此與存在于PCR反應(yīng)中的靶的原始量相關(guān)。所述相關(guān)性是反比關(guān) 系，即，更大的Ct值表示更少的原始存在的靶RNA。在圖1中示出的結(jié)果確認(rèn)了 300ntRNA 為溫度敏感性的，因?yàn)榧词乖谧疃痰臅r(shí)間點(diǎn)(30分鐘)上，在92t:的產(chǎn)率低于在更低溫度下 的產(chǎn)率。然而，對(duì)于100nt RNA，在30分鐘和1小時(shí)的溫育時(shí)間，最低的產(chǎn)率出現(xiàn)在62°C， 而非92°C 。即使溫育較短時(shí)間，300nt長(zhǎng)度的類型遠(yuǎn)少于100nt的類型(大約6Ct循環(huán)；26 =64倍)。此外，在82t:下從0.5小時(shí)至2小時(shí)的條件下300nt的類型(Ct循環(huán)增加6(產(chǎn) 率降低至1/64 (26 = 64-fold decrease)))與相同條件下的lOOnt RNA增加的2循環(huán)(降 低至原來(lái)的1/4(22 = 4))相比對(duì)熱更敏感。在所有的溫育時(shí)間段均是在62t:時(shí)產(chǎn)率的變 化最小，表明閾值溫度的存在，在該閾值溫度以下，RNA相對(duì)穩(wěn)定，并且表明在更低的溫度下 溫育更長(zhǎng)時(shí)間將會(huì)更高產(chǎn)率地更好地分離更高分子量的RNA。高于62°C的溫度引起RNA隨 著時(shí)間的更可觀的降解，而在較高溫度下RNA的總產(chǎn)率可能會(huì)有所增加，而長(zhǎng)片段RNA的產(chǎn) 率降低。 圖2A和2B表明在5(TC下加熱時(shí)間對(duì)回收各種長(zhǎng)度的RNA類型的RNA量(產(chǎn)率) 的影響。這些圖顯示當(dāng)溫育更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，所有大小的RNA的產(chǎn)率都提高。如圖2所示，在 5(TC下，在蛋白酶K的存在下加熱腫瘤組織的FFPE樣品從0. 5小時(shí)至16小時(shí)不等的一段 時(shí)間。例如，F(xiàn)4—0. 5—1X 100BP的標(biāo)記表示將樣品F4加熱0. 5小時(shí)，以及其為100nt長(zhǎng)度 片段。隨著溫育時(shí)間的增加所有大小的RNA片段的產(chǎn)率都增加。在從短溫育時(shí)間增加至長(zhǎng) 溫育時(shí)間時(shí)，100nt片段的產(chǎn)率增加超過(guò)10倍(約3. 5個(gè)PCR循環(huán))，而300nt片段增加 幾乎26(對(duì)應(yīng)于減少6個(gè)PCR循環(huán))或者大約60倍。對(duì)于400nt片段也發(fā)現(xiàn)類似的情況。 觀察到1000nt片段的產(chǎn)率的增加相對(duì)較少(大約10倍)，其可能表明在長(zhǎng)溫育時(shí)間時(shí)，提 取物的增加可能被對(duì)這種大小的降解所平衡。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明從石蠟基質(zhì)提取RNA具有相當(dāng) 大的時(shí)間依賴性，也指出在這些條件下在5(TC下所有RNA片段長(zhǎng)度的穩(wěn)定性(與圖1所示 的82t:的情況相反)。顯而易見(jiàn)的是更低的溫育溫度實(shí)質(zhì)提高了 300nt以及更大的RNA類 型的產(chǎn)率，不僅僅在絕對(duì)水平上，還在相對(duì)水平上(即，在16小時(shí)的溫育時(shí)間時(shí)，100bp與 300bp類型的Ct差異僅為2倍)。 因此，同時(shí)參照?qǐng)D1和2，數(shù)據(jù)顯示在92°CT RNA為熱不穩(wěn)定的，并且升高溫度對(duì) 長(zhǎng)片段RNA特別不利。這些圖也顯示升高的溫度、更長(zhǎng)的溫育時(shí)間比在較低的溫度下更多 地降解RNA。然而，如圖2所示，當(dāng)溫度降至更適中的溫度時(shí)，不存在仍然期望看到的時(shí)間依 賴的降解。 因此，本發(fā)明提供了從固定組織樣品(例如FFPE組織)分離長(zhǎng)片段RNA的方法， 其中，在大約45至大約62t:范圍內(nèi)的溫度下加熱組織樣品持續(xù)3小時(shí)以上的時(shí)間。在其它
17實(shí)施方式中，在大約44至大約6(TC的范圍內(nèi)的溫度下加熱固定組織樣品，在更優(yōu)選的實(shí)施 方式中，從大約48至大約58t:，在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，從大約48至大約55t:，在其它 優(yōu)選的實(shí)施方式中，從48至52°C，以及在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，從大約5(TC至大約56°C。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解術(shù)語(yǔ)"大約"是用來(lái)包括在熱浴、加熱塊和PCR機(jī)器中可能發(fā)生 的小的、非實(shí)質(zhì)性的溫度變化，并且這些設(shè)備與設(shè)備或者實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室之間小的變化可 能不具有不利的影響或凈正效應(yīng)(net positiveeffect)，并且這些包括在權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解術(shù)語(yǔ)"大約"指的是將接近所述溫度范圍的溫度變化包含 在權(quán)利要求的范圍內(nèi)，只要這些方法可用于它們預(yù)期的用途(即，分離長(zhǎng)片段RNA)。
在上述溫度下加熱組織樣品一段時(shí)間，這段時(shí)間是從2小時(shí)至多達(dá)20小時(shí)(以及 之間的任何時(shí)間)長(zhǎng)的任何一段時(shí)間。例如，所述時(shí)間端可以落入2小時(shí)和多達(dá)20小時(shí)之 間的任意時(shí)間，以及落入所述范圍的任何時(shí)間段。例如，本發(fā)明提供了以大約4小時(shí)至大 約19小時(shí)、大約5小時(shí)至大約17小時(shí)、從大約6小時(shí)至大約17小時(shí)、從大約7小時(shí)至大約 16. 5小時(shí)，大約8小時(shí)至大約16. 5小時(shí)、從大約9小時(shí)至大約16. 5小時(shí)，大約10小時(shí)至大 約16. 25小時(shí)等的時(shí)間段加熱。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述時(shí)間段為大約12小時(shí)至17小 時(shí)，以及在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述時(shí)間段為大約14至大約16小時(shí)。在最優(yōu)選的實(shí)施方 式中，所述時(shí)間段為大約16小時(shí)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解術(shù)語(yǔ)"大約"指的是將接近所 述小時(shí)數(shù)的時(shí)間變化包含在權(quán)利要求的范圍內(nèi)，只要該方法可用于它們預(yù)期的用途(艮卩， 分離長(zhǎng)片段RNA)。 本發(fā)明特別優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式包括在大約5(TC下加熱固定的組織樣品(例如 FFPE)大約16小時(shí)，其使長(zhǎng)片段RNA(特別是300nt以上的RNA)的產(chǎn)率最大化。如上所述 和如圖1和2所示，在這種溫度下RNA長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定，因?yàn)閺氖炛刑崛〈蠓肿右灿袝r(shí)間依賴 性，為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段RNA的最大產(chǎn)率大約16小時(shí)的溫育時(shí)間是理想的(且在該溫度下是可 能的)。 本發(fā)明還包括在蛋白酶K的存在下加熱固定的組織樣品。如上所述，蛋白酶K可用 于提取最大量的RNA。然而，如果在分離過(guò)程中使用過(guò)量的蛋白酶K，其也將從基質(zhì)中釋放 更多的DNA，導(dǎo)致RNA制備物的更高的DNA污染。圖4顯示在從石蠟基質(zhì)取出RNA的溫育步驟 中蛋白酶K的量的變化的效果。例如標(biāo)記F4_16_lX_100bp的樣品，其代表樣品F4，加熱16 小時(shí)，使用1X(5ii g)量的蛋白酶K， ttF4_16_2X_100bp(2X= 10 ii g)和F4_16_4X_100bp (4X =20 ii g)樣品具有更低CT值。在300bp和400bp大小的RNA(參見(jiàn)對(duì)于那種大小的RNA 具有最低CT閾值的樣品F4_16_lX_300bp和F4_16_lX_400bp)中也觀察到類似的情形。因 此，優(yōu)選5iig蛋白酶K/400iiL(12. 5iig蛋白酶K/mL)的濃度。然而，如實(shí)施例19所示， 其它量的蛋白酶K可以成功地使用(即，0.5x、lx、2x、4x)。也可以使用蛋白酶K的替代物 (alternatives)，包括但不限于，Qiagen⑧蛋白酶、brofasin(從Bromelia fastiasa中提 取的植物蛋白酶)和從Carica candamarcensis中分離的半胱氨酸蛋白酶。
通常加入用于螯合二價(jià)以上的金屬離子的EDTA(乙二酸四乙酸)作為提取緩沖液 組分。然而，對(duì)在提取緩沖液中使用EDTA的已知方法的研究表明在FFPE提取操作中的EDTA 濃度范圍較寬，其表明其他人并沒(méi)有認(rèn)識(shí)到存在EDTA的某個(gè)特定濃度或防止二價(jià)金屬離 子對(duì)RNA分子的影響所必需的某個(gè)特定濃度。圖3顯示溫育時(shí)間和EDTA濃度的影響。除了 在蛋白酶K的存在下溫育16小時(shí)的過(guò)程中將樣品暴露于不同的溫度(50、60和70°C )，根
18據(jù)在實(shí)施例1中描述的方法處理FFPE組織樣品。此外，在提取溶液中使用四種不同的EDTA 濃度(0. 1、0. 5、3. 6和20mM)。圖3A顯示3. 6mM的EDTA濃度得到更高產(chǎn)率的長(zhǎng)片段RNA，通 常產(chǎn)率增加到2倍以上。圖3也說(shuō)明了在5(TC的溫育溫度下得到了所有大小的RNA的最高 產(chǎn)率(比在6(TC時(shí)高大約25^，并且比在7(TC高大約4倍)。低濃度的EDTA(O. ImM)降低 RNA的產(chǎn)率達(dá)2-3倍，與使用3. 6mM相比，當(dāng)使用20mM的高水平時(shí)，產(chǎn)率降低了大約25%。
因此，本發(fā)明的方法進(jìn)一步提供了螯合劑(例如EDTA)在提取溶液中的用途。螯合 劑為廣為人知的能夠形成多價(jià)金屬離子絡(luò)合物的有機(jī)化合物。同樣地，除了 EDTA外的其它 螯合劑也可以用于本發(fā)明的方法中。所述螯合劑可以選自那些常用的螯合劑。例如，EDTA 類、EGTA類、檸檬酸鹽(檸檬酸鈉)類、檸檬酸類、水楊酸類、水楊酸鹽類、鄰苯二甲酸類、2， 4_戊二酮類、組氨酸類、二鹽酸組氨醇類、8-羥基喹啉類、8-羥基喹啉類、檸檬酸鹽類和鄰 羥基醌類為本領(lǐng)域內(nèi)已知的代表螯合劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用EDTA或檸檬酸鈉。參 見(jiàn)實(shí)施例15。 所述螯合劑可以以大約O. lmM至大約15mM的濃度，以及在該范圍內(nèi)的任意濃度或 濃度范圍存在。優(yōu)選的實(shí)施方式包括大約2.5mM至大約5.0mM濃度的螯合劑。優(yōu)選的實(shí)施 方式包括大約3. OmM至大約4. OmM濃度的螯合劑。更優(yōu)選的實(shí)施方式包括大約3. 25至大 約3. 75mM濃度的螯合劑。最優(yōu)選地，所述螯合劑以大約3. 6mM的濃度存在，以及在最優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述螯合劑為EDTA或檸檬酸鈉，并且以大約0. 6mM至大約3. 6mM存在，或者 以大約3.6mM存在。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解術(shù)語(yǔ)"大約"指的是將接近所述mM量的變 化包含在權(quán)利要求的范圍內(nèi)，只要這些方法可用于它們預(yù)期的用途(即，分離長(zhǎng)片段RNA)。
長(zhǎng)溫育時(shí)間(例如在本發(fā)明中所使用的)的缺點(diǎn)(與在較高溫度下使用離液劑的 短溫育時(shí)間相對(duì))為可觀量的DNA能夠與RNA —起被共提取，導(dǎo)致在技術(shù)背景部分中描述 的有關(guān)RNA分析的潛在困難。通常在操作的提取后階段通過(guò)用脫氧核糖核酸酶(DNA酶) 處理樣品從而處理DNA污染。而這種試劑可以有效地降低DNA的量，其也可以使分離的RNA 量減少4-8倍，其可以給本來(lái)組織含量不充裕的樣本分析造成嚴(yán)重的損失。因此，本發(fā)明也 提供了一種分離方法，該分離方法不需要使用DNA酶，并且取而代之地在蛋白酶K步驟之后 使用兩次苯酚/氯仿提取法(double phenol/chloroformextraction method)。所述兩次 苯酚/氯仿提取法涉及使用特異性去除大多數(shù)DNA而保持RNA的產(chǎn)率的離液劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用離液劑的兩次苯酚/氯仿提取法共分離少于10%的 DNA。 所述兩次苯酚/氯仿提取步驟包括進(jìn)行至少一次第一和第二苯酚/氯仿提取， 其中所述第二苯酚/氯仿提取包含離液劑。可以使用任意的離液劑。離液劑通過(guò)抑制核 酸酶活性而使核酸穩(wěn)定。例如，已知的離液劑包括，但不限于尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉 (NaSCN)、鹽酸胍(Guanidine HC1)、鹽酸胍(guanidinium chloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸 鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫等。 也可以采用去除DNA污染的其它方法(只要它們不顯著地破壞長(zhǎng)片段RNA即可)， 包括，但不限于使用市售產(chǎn)品(例如Qiagen的純化柱(使用或者不使用DNA酶)和Ambion Turbo無(wú)DNA酶的方法。 在去除DNA污染之后，使用已知的方法(例如醇或異丙醇沉淀)分離RNA。
人們似乎通常認(rèn)為一旦被福爾馬林固定并包埋在石蠟基質(zhì)中RNA分子將會(huì)無(wú)限期地保持穩(wěn)定，因而存檔樣品的時(shí)間不再是問(wèn)題。然而，總RNA(所有大小和片段)確實(shí)隨 著時(shí)間減少，只是非常緩慢，本發(fā)明人已經(jīng)測(cè)定更長(zhǎng)片段的RNA并不是這樣。在時(shí)間更久的 FFPE樣本中，300nt以上的RNA片段的豐度顯著減少。圖10顯示在1991年固定的樣品(樣 品1、2、3、4和5)比在2005年固定的樣品(D7、D9和F3)得到更低產(chǎn)率和更低質(zhì)量的RNA。 因此，對(duì)于其中長(zhǎng)片段RNA是重要的應(yīng)用，F(xiàn)FPE組織樣品應(yīng)該為5年時(shí)間或更短的。然而， 仍然在16年的樣品中得到了長(zhǎng)片段RNA(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式 中，固定樣品的時(shí)間少于5年。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品的時(shí)間少于3年，并且在最優(yōu) 選的實(shí)施方式中，樣品的時(shí)間少于2年。 通過(guò)本發(fā)明的方法分離的RNA適于多種目的和分子生物學(xué)流程，包括，但不限于 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;在基因芯片、寡核苷酸微陣列等上產(chǎn)生放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或以其它方 式標(biāo)記的cDNA用于分析；通過(guò)丙烯酰胺的電泳或瓊脂糖凝膠電泳；通過(guò)色譜法純化(例 如，離子交換、硅膠、反相或大小排阻色譜)；與核酸探針雜交；和通過(guò)機(jī)械、聲波或其他手 段片段化。 通常在癌癥領(lǐng)域，生物標(biāo)志物的表達(dá)是診斷的關(guān)鍵，也是確定治療方案的關(guān)鍵。本 發(fā)明的方法可以用于分離用于任何期望的生物標(biāo)志物的RNA。實(shí)例包括但不限于，Kras、 匪R1 、 ERCC1 、 DPD、 Gst-pi 、 EGFR、 TS和Her2-腦。 因此，本發(fā)明不僅提供了分離長(zhǎng)片段RNA的方法，也提供了由本發(fā)明公開的方法 分離的RNA。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了通過(guò)復(fù)制本發(fā)明的分離的RNA制備的cDNA。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解cDNA可以容易地由分離并純化的RNA制備。此外，本發(fā)明的另一 方面提供了使用分離的RNA或由分離的RNA制備的cDNA制備微陣列或基因芯片。本發(fā)明也 提供了本發(fā)明的分離的RNA在為了治療或診斷目的分析基因表達(dá)或基因拷貝數(shù)中的用途， 正如在癌癥的檢測(cè)/診斷中經(jīng)常出現(xiàn)的，以及在基于基因表達(dá)水平或基因拷貝數(shù)確定適當(dāng) 的化療方案的領(lǐng)域中。使用適當(dāng)?shù)腜CR引物，任意信使RNA的表達(dá)水平可以通過(guò)本發(fā)明的 方法測(cè)定。定量RT-PCR技術(shù)使得可以比較在石蠟包埋的蛋白表達(dá)水平(通過(guò)免疫組織化 學(xué))與相同樣品的基因表達(dá)水平(使用RT-PCR)。
ERCC1 本發(fā)明的某些實(shí)施方式部分歸屬于如下發(fā)現(xiàn)，即發(fā)現(xiàn)腫瘤中的ERCClmRNA的量與 用DNA鉑劑(platinating agent)治療的患者的生存率相關(guān)。腫瘤表達(dá)高水平ERCC1 mRNA 的患者被認(rèn)為很有可能對(duì)基于鉑的化療具有抗性，因此具有較低水平的生存率。相反地，那 些腫瘤表達(dá)少量ERCC1 mRNA的患者很可能對(duì)基于鉑的化療敏感，并具有更高水平的生存 率?；颊叩哪[瘤ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)是通過(guò)將其與預(yù)先確定的閾值表達(dá)水平比較來(lái)判斷 的。 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了相對(duì)于內(nèi)部控制的基因表達(dá)定量在固定并石 蠟包埋(FPE)組織中ERCCl長(zhǎng)片段mRNA表達(dá)量的方法。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了寡核苷酸引 物，其可以精確評(píng)估已經(jīng)固定并包埋的組織中的ERCC1表達(dá)。本發(fā)明提供了寡核苷酸引物 ERCC1-504F(SEQ ID NO :1) 、ERCC1-574R(SEQ ID NO :2)或基本與之相同的寡核苷酸引物的 用途，優(yōu)選與從固定并石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取的長(zhǎng)片段RNA—起使用(優(yōu)選使 用本發(fā)明的提取方法)。那么，ERCCl基因表達(dá)的這種測(cè)量可以用于基于鉑的化療的預(yù)后。 參見(jiàn)實(shí)例，美國(guó)專利第6， 573， 052號(hào)，在此通過(guò)題述并入。
照這樣，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括首先，從FPE樣品提取長(zhǎng)片段RNA，和其 次，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物，優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì)ERCC1-504F(SEQ ID NO :1)和 ERCC1-574R(SEQ ID NO :2)，或者與其基本相同的寡核苷酸，測(cè)定樣品中的ERCC1 mRNA的含 量以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。優(yōu)選地，通過(guò)本發(fā)明中披露的任何方法從FPE細(xì)胞提 取RNA。 本發(fā)明方法可以應(yīng)用于來(lái)自患者的任何類型的組織。為了檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織的抗性， 優(yōu)選檢查腫瘤組織。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，也檢驗(yàn)從其中獲得腫瘤的患者的正常組織的部 分。預(yù)期其正常組織對(duì)基于鉑的化療的化合物具有抗性，即，顯示高水平的ERCC1基因表 達(dá)，但是預(yù)期其腫瘤對(duì)這種化合物敏感，即，顯示低水平的ERCC1基因表達(dá)的患者，則可以 用更大量所述化療組合物處理。 顯示低于閾值水平的ERCCl基因表達(dá)水平的患者可以用更大量的化療組合物處 理，因?yàn)樗麄冾A(yù)期比具有表達(dá)高于閾值水平的ERCCl基因表達(dá)水平的腫瘤的患者具有更大 的生存率?；蛘?，臨床醫(yī)師可以決定假定他們的預(yù)期生存率低，腫瘤的ERCCl基因表達(dá)水 平高于閾值水平的患者可能不會(huì)從化療中獲得顯著的益處。 本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于廣泛范圍的腫瘤類型。這使得可以制備個(gè)體的"腫瘤表 達(dá)譜"，由此測(cè)定個(gè)體患者樣品中的ERCCl的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的應(yīng)答。優(yōu)選地， 將關(guān)于ERCCl的本發(fā)明的方法應(yīng)用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選地，應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫 瘤。為了將本發(fā)明的一些實(shí)施方式應(yīng)用于特定腫瘤類型，優(yōu)選通過(guò)編譯數(shù)據(jù)組確認(rèn)ERCCl 基因表達(dá)水平與生存率之間的關(guān)系，所述數(shù)據(jù)組能夠使特定ERCCl表達(dá)與臨床對(duì)基于鉑的 化療的抗性相關(guān)聯(lián)。 在本發(fā)明中所定義的"預(yù)先確定的閾值水平"，如果其涉及ERCCl，為修正的相對(duì) ERCCl腫瘤表達(dá)水平，在該水平之上時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤很可能對(duì)基于鉑的化療方案有抗性。在所 述閾值水平以下的腫瘤表達(dá)水平，很可能存在于對(duì)基于鉑的化療方案敏感的腫瘤中。修正 的ERCCl的相對(duì)表達(dá)的范圍，表示為ERCCl : 13 -肌動(dòng)蛋白的比率，在對(duì)基于鉑的化療方案有 應(yīng)答的腫瘤中低于大約6. 7X 10—3。對(duì)基于鉑的化療方案沒(méi)有應(yīng)答的腫瘤的ERCCl : 13 -肌 動(dòng)蛋白的相對(duì)表達(dá)比率高于大約6. 7X 10—3。參見(jiàn)實(shí)施例7。"預(yù)先確定的閾值水平"進(jìn)一步定義為如涉及ERCCl時(shí)，作為腫瘤修正相對(duì)ERCCl 表達(dá)水平，在該水平之上接受基于鉑的化療方案的患者很可能具有低生存率。接受基于鉑 的化療方案的患者中腫瘤修正相對(duì)ERCCl表達(dá)水平低于該閾值水平對(duì)應(yīng)于高的患者生存 率。閾值修正相對(duì)ERCC1表達(dá)，表示為ERCC1 :P-肌動(dòng)蛋白的比率，為大約6.7X10—3。參 見(jiàn)圖11，實(shí)施例7。然而，本發(fā)明并不限于將P-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部控制基因。
如在本發(fā)明中所討論的通過(guò)本發(fā)明的任意的方法從FPE組織提取RNA。在本發(fā)明 中描述的固定并石蠟包埋的(FPE)組織樣品指的是可存儲(chǔ)或歸檔的組織樣品。可以從歸檔 病理樣品或活檢樣品(首先去石蠟)分離RNA。例如，示例性的去石蠟的方法包括用有機(jī)溶 劑(例如二甲苯)清洗涂有石蠟的樣品。用低級(jí)醇的水溶液可以使去石蠟樣品再水合。例 如，合適的低級(jí)醇包括，甲醇、乙醇、丙醇類和丁醇類。連續(xù)用濃度依次降低的低級(jí)醇溶液清 洗可以使去石蠟樣品再水合?；蛘?，使樣品同時(shí)去石蠟和再水合。然后，從樣品中提取RNA。
例如，使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，優(yōu)選對(duì)來(lái)自新 鮮、冷凍或固定的樣品的純化總mRNA中的ERCCl mRNA進(jìn)行定量。定量ERCCl mRNA的其它方法包括，例如，使用分子信標(biāo)和在多重PCR中有用的其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明設(shè)想 通過(guò)使用采用例如類似于Invader' Assay (Third Wave Technologies, Inc.)的熒光標(biāo) 記探針的無(wú)PCR體系(PCR-free system)來(lái)定量ERCC1 mRNA。最優(yōu)選地，使用基于熒光的 實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan . ] ， Applied Biosystems， Foster City， Calif.)或者如Heid等人(Genome Res 1996 ;6 :986 994)禾口 Gibson等人(Genome Res 1996 ;6 :995 1001)所述的類似體系完成ERCC1 cDNA和內(nèi)部控 制或管家基因(例如，P-肌動(dòng)蛋白)的定量。ABI 7700 (TaqMan . Instrument)的輸出表 示為Ct' s或"循環(huán)閾值"。使用T叫Man逸系統(tǒng)，在樣品中具有更大量靶分子的高表達(dá)基 因比具有更少的靶分子(更高的Ct)的較低相對(duì)表達(dá)的基因需要更少的PCR循環(huán)(更低的 Ct)來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。 如在本發(fā)明中所使用，"管家"基因或"內(nèi)部控制"意味著包括任意組成型表達(dá)或 全局表達(dá)的基因，它的存在使得能夠評(píng)估靶mRNA水平(例如，但不限于ERCC1、 TS、 DPD、 Her2-neu、 Gst-pi、 RRMl、 Kras等)。這種評(píng)估包括對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的全部組成性水平的測(cè)定 和RNA回收時(shí)的變化的對(duì)照。"管家"基因或"內(nèi)部控制"可以包括，但不限于親環(huán)蛋白基 因、P-肌動(dòng)蛋白基因、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因、GAPDH基因等。最優(yōu)選地，所述內(nèi)部控制基因?yàn)?Eadset al. ， Cancer Research 1999 ;59 :2302 2306所述的P-肌動(dòng)蛋白基因。
在RNA回收時(shí)的變化的對(duì)照需要使用"校準(zhǔn)物RNA"。該"校準(zhǔn)物RNA"指的是任意 可得的精確預(yù)定量的對(duì)照RNA的來(lái)源。優(yōu)選使用人肝臟總RNA(Stratagene，Cat. #735017)。
在本發(fā)明中所使用的"未修正的基因表達(dá)(UGE)"指的是耙基因表達(dá)相對(duì)于通過(guò) TaqMan⑧儀器產(chǎn)生的內(nèi)部控制基因的數(shù)值輸出。用于測(cè)定ERCC1的UGE的方程示于實(shí)施例 6中，并用圖12中的樣品計(jì)算進(jìn)行說(shuō)明。 本發(fā)明的另一方面提供了使通過(guò)TaqMan⑧儀器使用來(lái)自非-TaqMan⑩技術(shù)的"已 知的相對(duì)基因表達(dá)"值得到的未修正基因表達(dá)(UGE)值標(biāo)準(zhǔn)化的方法。優(yōu)選地，將已知的非 TaqMan⑧產(chǎn)生的ERCC1 : P -肌動(dòng)蛋白表達(dá)值用來(lái)自組織樣品的由TaqMan⑧產(chǎn)生的ERCC1 UGE值標(biāo)準(zhǔn)化。 在本發(fā)明中使用的"修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)"指的是標(biāo)準(zhǔn)化的ERCC1表達(dá)，其中將 UGE乘以ERCC1特異性修正因子(KEKra)，得到可以相對(duì)于內(nèi)部控制基因與已知范圍的ERCC1 表達(dá)水平的相比較的值。實(shí)施例6和圖12具體地闡明了這些計(jì)算。這些數(shù)值使得可以確 定具體樣品的"修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)"是否落在"預(yù)先確定的閾值"水平之上或之下。對(duì) 于P -肌動(dòng)蛋白水平的修正相對(duì)ERCC1表達(dá)的預(yù)先確定閾值水平為大約6. 7X 10—3。對(duì)于 ERCC1、內(nèi)部控制P-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)的特定 K匿丄為1.54X10-3。"已知相對(duì)基因表達(dá)"源自之前分析的組織樣品，并且是以靶基因的RT-PCR信號(hào) 與組成型表達(dá)的內(nèi)部控制基因(例如，P-肌動(dòng)蛋白，GAPDH等)的比率為基礎(chǔ)的。優(yōu)選 地，這些組織樣品為福爾馬林固定并且石蠟包埋(FPE)樣品，以及RNA是根據(jù)本發(fā)明中所述 的方法從其中提取的。為了使基因表達(dá)相對(duì)于內(nèi)部控制定量，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)定量 RT-PCR技術(shù)。進(jìn)行固定循環(huán)次數(shù)(即，30次)的預(yù)-TaqMan逸.技術(shù)PCR反應(yīng)，并報(bào)告各樣 品的端點(diǎn)值。然后，將這些值作為ERCC1表達(dá)與P-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比率報(bào)告。參見(jiàn)美國(guó) 專利第5， 705， 336號(hào)(Reed等)。
可以測(cè)定除13 _肌動(dòng)蛋白外的內(nèi)部控制基因和/或不同于人肝臟總 RNA(Stratagene，Cat. #735017)的校準(zhǔn)物RNA的KEKCC1。為了進(jìn)行這樣的測(cè)定，必須同時(shí)將內(nèi) 部控制基因和校準(zhǔn)物RNA對(duì)于組織樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)于該組織樣品，相對(duì)于特定的內(nèi)部控 制基因的ERCCl表達(dá)水平已經(jīng)被測(cè)定(即，"已知的相對(duì)基因表達(dá)")。優(yōu)選地，這些組織樣 品為福爾馬林固定并且石蠟包埋(FPE)的樣品，并且使用在本發(fā)明中公開的方法提取RNA。 可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)-TaqMan l⑧、定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。通過(guò)這樣的 測(cè)定，這些樣品具有ERCCl的"已知的相對(duì)基因表達(dá)"水平，其可用于在測(cè)定如實(shí)施例6中 所述的對(duì)新內(nèi)部控制和/或校準(zhǔn)物RNA特異性的新KEKCC1。 —般而言，位于ERCCl基因側(cè)翼區(qū)域的任意的寡核苷酸對(duì)可以用于實(shí)施本發(fā)明的 方法。在嚴(yán)緊條件下與用于本發(fā)明的ERCCl基因的區(qū)域雜交的引物將會(huì)擴(kuò)增20-1000堿基 對(duì)，優(yōu)選100-400堿基對(duì)，最優(yōu)選大約200-400堿基對(duì)的產(chǎn)物。 本發(fā)明提供了特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本相同的寡核苷酸引物，其使得 可以特別精確地評(píng)估FPE組織中的ERCCl表達(dá)。優(yōu)選的寡核苷酸引物包括，ERCC1-504F (SEQ ID NO :1)和ERCC1-574R(SEQ ID NO :2)，(在本說(shuō)明說(shuō)中也稱作寡核苷酸引物對(duì)ERCCl) 和與其基本相同的寡核苷酸引物。在嚴(yán)緊條件下，所述寡核苷酸引物ERCC1-504F(SEQ ID NO :1)和ERCC1-574R， (SEQ ID NO :2)雜交至ERCCl基因，并顯示對(duì)于使用RNA測(cè)量ERCCl mRNA水平特別有效，所述RNA是通過(guò)任意分離mRNA的方法，特別是通過(guò)本發(fā)明公開的方法， 從FPE細(xì)胞提取的。 如在本發(fā)明中所使用的在核酸環(huán)境中的"基本相同"指的是在嚴(yán)緊條件下雜交至 耙，并且也指核酸區(qū)段，或者其互補(bǔ)鏈，進(jìn)行比較時(shí)，當(dāng)帶有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牒蛣h除進(jìn)行 恰當(dāng)比對(duì)時(shí)，至少大約60%的核苷酸，典型地，至少大約70% ，更典型地，至少大約80% ，通 常，至少大約90 % ，以及更通常為大約95 %至98 %的核苷酸相同。當(dāng)雜交比完全缺乏特異 性更具選擇性時(shí)，存在選擇性雜交。參見(jiàn)Kanehisa， Nucleics Res. ， 12 :203 213(1984)。
本發(fā)明包括基本相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)緊條件下(如在說(shuō)明書中所定)雜交至 ERCC1-504F(SEQ ID NO :1)、其補(bǔ)體或ERCC1_574R(SEQ ID NO :2)、或其補(bǔ)體的寡核苷酸引 物序列的全部或部分。 在嚴(yán)緊雜交條件下，僅僅高度互補(bǔ)，即，基本相似的核酸序列雜交。優(yōu)選地，這些條 件防止在20個(gè)連續(xù)核苷酸中具有4個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配的核酸，更優(yōu)選為在20個(gè)連續(xù)核苷酸 中具有2個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配的核酸，最優(yōu)選為在20個(gè)連續(xù)核苷酸中具有1個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的核 酸雜交。 所述核酸的雜交部分長(zhǎng)度通常為至少IO(例如15)個(gè)核苷酸。雜交核酸的雜交部 分與本發(fā)明中提供的寡核苷酸引物的部分或全部的序列或它們的補(bǔ)體為至少大約80%，優(yōu) 選至少大約95%，或者最優(yōu)選大約至少98%相同的。 在嚴(yán)緊條件下寡核苷酸弓I物雜交至核酸樣品的定義如下。核酸雙鏈體或雜交體穩(wěn) 定性表示為解鏈溫度(Tm)，其是探針從靶DNA中離解的溫度。該解鏈溫度用于定義所需的 嚴(yán)緊條件。如果待鑒定的序列與探針基本相同，而非完全相同，那么要使其有用，首先要確 立最低溫度，在該最低溫度下在特定的鹽(例如SSC或SSPE)濃度下僅僅發(fā)生同源雜交。然
后假設(shè)1^的錯(cuò)配導(dǎo)致Tm下降rc，雜交反應(yīng)中的最終清洗溫度也相應(yīng)降低(例如，如果尋
求與探針具有>95%的同一性的序列，那么最終的清洗溫度降低51:)。在實(shí)踐中，Tm變化為每1%錯(cuò)配0. 5°C 1. 5°C。 嚴(yán)緊條件包括在68t:，5XSSC/5XDenhart' s溶液/1. 0% SDS中雜交，以及在室 溫下在O. 2XSSC/0. 1% SDS中清洗。中等嚴(yán)緊條件包括在42t:下在3XSSC中清洗。改 變鹽濃度和溫度的參數(shù)以實(shí)現(xiàn)引物與靶核酸之間的最佳同一度水平。關(guān)于這些條件的另外 的手冊(cè)在本領(lǐng)域易于獲得，例如，Sambrook， Fischer and Maniatis， Molecular Cloning, a laboratory manual,(2nd ed. )，ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York,(1989) and F. M. Ausubel等eds. ， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(1994)。 在本發(fā)明中公開的寡核苷酸引物能夠允許精確地評(píng)估在固定或固定并石蠟包埋 的組織中，以及冷凍或新鮮組織中的ERCC1基因表達(dá)。盡管相對(duì)于從新鮮或冷凍的組織中 得到的RNA，從FPE樣品得到的RNA更碎。因此，本發(fā)明的方法適于在測(cè)定FPE組織中的 ERCC1表達(dá)水平時(shí)使用，而以前沒(méi)有辦法使用固定組織測(cè)定ERCC1基因表達(dá)。
從測(cè)量在腫瘤中表達(dá)的ERCC1 mRNA的量中，熟練的開業(yè)醫(yī)生可以做出關(guān)于腫瘤對(duì) 特定基因毒素(genotoxin)的臨床抗性或接受特定基因毒素的患者的生存率的預(yù)后。示例 性的基于鉑的化療或誘導(dǎo)類型相似的DNA損傷的化療為基因毒素。 基于鉑的化療導(dǎo)致DNA的"大加合物(bulky adduct)"，其中主要效果是使雙螺 旋的三維構(gòu)象扭曲。這種化合物應(yīng)該單獨(dú)使用，或者與其他化療(例如吉西他濱(Gem)或 5-氟尿嘧啶(5-FU)) —起使用。 基于鉑的基因毒物(genotoxic agents)的化療包括重金屬配位化合物，其 形成共價(jià)DNA加合物。 一般而言，這些重金屬化合物與DNA共價(jià)結(jié)合以在相關(guān)的部位 形成順式-l，2-鏈內(nèi)二核苷酸加合物。 一般而言，這類的代表為順式二氯二氨合鉑 (II)(順鉑)，并包括順式-二氨-(l，l-環(huán)丁烷二甲酸)鉬(II) (cis-diammine-(l， 1-cyclobutanedicarboxylato) platinum(II))(卡鉑)、順式_ 二氨_ (1 ， 2_環(huán)己基)二氯鉑 (II) (cis-diammino-(l，2-cyclohexyl)dichloroplati皿m(n))禾口順式_(1，2_乙二氨)二 氯鉬(II) (cis-(l，2-ethylenediammine)dichloroplati皿m(n))。鉬首選的藥劑(first agents)包括前述代表性化合物的同型物或衍生物。 目前容易被鉑配位化合物控制的腫瘤包括睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、胃的、鱗 狀細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌和小細(xì)胞肺癌，以及成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。反式-二氯 二氨合鉑(II)(反式-DDP)由于其DNA加合物的快速修復(fù)，通常被認(rèn)為是無(wú)用的。在此使 用反式-DDP作為化療劑可能將會(huì)提供這樣的化合物，其在未選擇的細(xì)胞中具有低毒性，而 在選擇的細(xì)胞中具有高相對(duì)毒性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述鉑化合物為順鉑。
許多化合物通常與基于鉑的化療劑一起提供。例如，BEP(博來(lái)霉素(bleomycin)、 依托泊苷(etoposide)、順鉑(cisplatin))用于睪丸癌，MVAC(甲氨蝶呤(methotrexate)、 長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、多柔比星(doxorubicin)、順鉑)用于膀胱癌，MVP(絲裂霉 素C(mitomycin C)、長(zhǎng)春花堿、順鉑)用于非小細(xì)胞肺癌治療。大量研究已經(jīng)證實(shí)含鉑 藥劑之間的相互作用。例如，已經(jīng)報(bào)道潛在地包括在基于鉑的化療中的許多藥物具有治 療藥物的協(xié)同作用。關(guān)于這些報(bào)道的一個(gè)非常簡(jiǎn)短的近期參考文獻(xiàn)清單如下0kamoto 等，Urology 2001;57 :188-192. ;Tanaka等，Anticancer Research 2001 ;21 :313-315 ; Sl咖on等，Seminars in Oncology 2001 ;28 :13-19山idor等，Journal of ClinicalInvestigation1993 ;92 :2440-2447 ;Leopold等，NCI Monographs 1987 ;99-104 ;Ohta等， Cancer Letters 2001 ;162 :39_48 svan Moorsel等，British Journal of Cancer 1999 j 80 :981-990。 其它遺傳毒物為形成永久基因組損傷的那些，以及在癌癥的臨床管控中優(yōu)選用作 化療劑?；蚨舅卣T導(dǎo)的DNA損傷的細(xì)胞修復(fù)速率、以及通過(guò)細(xì)胞分裂周期的細(xì)胞生長(zhǎng)速 率，影響基因毒素治療的結(jié)果。細(xì)胞基因組中的未修復(fù)的損傷會(huì)妨礙DNA復(fù)制，削弱新合成 的DNA的復(fù)制保真度或妨礙細(xì)胞存活需要的基因表達(dá)。因此，基因毒物細(xì)胞毒性的一個(gè)決 定因素(傾向促成細(xì)胞死亡)是其中形成的基因組損傷對(duì)細(xì)胞修復(fù)的抗性。形成永久基因 損傷(例如，保持在基因組中至少直至細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的損傷)的基因毒物，通常比形成 暫時(shí)的、容易修復(fù)的基因組損傷的藥劑是更有效的細(xì)胞毒素。 用于治療許多癌癥以及受ERCCl表達(dá)水平影響的基因毒性化合物的一般類型為 DNA烷化劑和DNA插入試劑(intercalating agent)。補(bǔ)骨脂素(psoralen)為已知的在 皮膚病(cutaneous disease)(例如銀屑病(psoriasis)、白癜風(fēng)(vitiligo)、真菌感染和 皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma))的光化療處理中有用的基因毒性化合 物。Harrison' s Principles of Internal Medicine,Part 2 Cardinal Manifestations of Disease, Ch.60(12th ed. 1991)。基因毒性化合物的另一普通的類型，可以烷基化或插 入DNA中的基因毒性化合物成員，包括合成和天然來(lái)源的抗生素。本發(fā)明中特別感興趣的 為抗腫瘤抗生素，其包括但不限于如下化合物代表的化合物種類安吖啶(amsacrine);放 線菌素(actinomycin)A， C， D(或者稱為更生霉素(dactinomycin))或F(或者稱為KS4); 重氮絲氨酸(azaserine);博萊霉素(bleomycin);洋紅霉素(carminomycin)(卡柔比星 (carubicin))、道諾霉素(da皿omycin)柔紅霉素(da皿orubicin))或14_羥基道諾霉素 (14-hydroxyda皿omycin)(阿霉素(adri咖ycin)或多柔比星(doxorubicin));絲裂霉 素(mitomycin)A、 B或C ;米托惠酉昆(mitoxantrone);普卡毒素(plicamycin)(光神毒素 (mithr咖ycin));等。 常用的且烷基化DNA的基因毒物的又一類型為包括鹵代乙基亞硝基脲類，特別是 氯乙基亞硝基脲類的基因毒物。這一大類的代表性的成員包括卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀 (nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)和鏈唑霉素(str印tozotocin)。卣代乙基亞石肖基脲 類首選藥劑可以為任意的前述代表性化合物的類似物或衍生物。 其中的成員可使DNA烷基化的基因毒物的另一常見(jiàn)類型包括硫和氮芥。這 些化合物主要通過(guò)在鳥嘌呤的N7原子上形成共價(jià)的加合物損害DNA。這一大類的 代表性的成員包括苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異 環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、雙氯乙基甲胺(mechloroethamine)、 新氮芥(novembicin)、曲磷胺(trofosfmide)等。如果期望選擇 一 個(gè)或多個(gè)預(yù)定 義的基因組靶作為基因組損傷的基因座，那么在選擇的細(xì)胞的基因組中與特定的 序列共價(jià)或非共價(jià)地相互作用的寡核苷酸或其類似物也可以用作基因毒物。其中 成員使DNA烷基化的另一類藥物包括氮丙啶類(ethylenimines)和甲基三聚氰胺 類(methylmelamines)。例如，這些種類包括六甲蜜胺(altretamine)(六甲蜜胺 (hexamethylmelamine))、三亞乙基憐酉先胺(triethylen印hosphoramide) (TEPA)、三亞乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide) (ThioTEPA)和三亞乙基三聚氰酰胺(triethylenemelamine)。 DNA烷化劑的另 一 種類包括烷基磺酸鹽類，代表為白消安(busulfan);azinidines類，代表為苯佐替派(benzod印a);和其它，代表有例如，米托胍腙(mitoguazone)、米托惠酉昆(mitoxantrone)禾口丙卡巴月井(procarbazine)。這些類型包f舌各代表性化合物的類似物和衍生物。
DPD 本發(fā)明人公開了寡核苷酸引物和與其基本相同的寡核苷酸引物，其允許精確地評(píng)估組織中的DPD表達(dá)。當(dāng)將這些寡核苷酸引物，DPD3a-51F(SEQID NO :5)和DPD3a-134R(SEQID NO :6)(在本發(fā)明中也稱作寡核苷酸引物對(duì)DPD3A)和寡核苷酸引物DPD3b_65IF(SEQ IDNO :7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO :8)(在本發(fā)明中也稱作寡核苷酸引物對(duì)DPD3B)(參見(jiàn)美國(guó)專利第7， 005， 278號(hào)，在此通過(guò)提述并入)用于測(cè)量在固定的石蠟包埋的(FPE)腫瘤樣本中的DPD基因表達(dá)時(shí)特別有效。 本發(fā)明包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)緊條件(如在本發(fā)明中所限定)下與全部或部分寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ ID NO :5)、其補(bǔ)體、DPD3A-134R(SEQ IDNO :6)或其補(bǔ)體雜交。此外，本發(fā)明還包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)緊條件(如在本發(fā)明中所限定)下與全部或部分寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID N0:7)，其補(bǔ)體，DPD3b-736R(SEQ ID NO :8)，或其補(bǔ)體雜交。 所述核酸的雜交部分的長(zhǎng)度通常為至少10個(gè)(例如15個(gè))核苷酸。所述雜交的核酸的雜交部分與部分或全部的寡核苷酸引物DPD3A-51F(SEQ IDNO :5)，其補(bǔ)體，DPD3A-134R(SEQ ID NO :6)或其補(bǔ)體的序列至少大約80% ，優(yōu)選至少大約95% ，或者最優(yōu)選大約至少98%相同。此外，所述雜交的核酸的雜交部分與部分或全部的寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID N0:7)，其補(bǔ)體，DPD3b-736R(SEQ ID NO :8)或其補(bǔ)體的序列至少大約80%，優(yōu)選至少大約95%，或最優(yōu)選大約至少98%相同。 本發(fā)明的這方面包括使用本發(fā)明中所述的方法從FPE樣本中使用可靠的提取RNA的方法，然后，通過(guò)使用寡核苷酸引物寡核苷酸引物對(duì)DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO :5)和DPD3a-134R(SEQ ID NO :6))或與其基本相同的寡核苷酸，或者DPD3B (DPD3b-65 IF(SEQ IDNO :7)和DPD3b-736R(SEQID NO :8))或與其基本相同的寡核苷酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)測(cè)定樣本中的DPD mRNA的含量。參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)第09/469， 338號(hào)，于1999年12月20日提交，在此通過(guò)提述并入。 DPD mRNA的表達(dá)與對(duì)基于5_FU的化療的臨床抗性相關(guān)。具體而言，DPD mRNA的高水平表達(dá)與對(duì)基于5-FU的化療的臨床抗性相關(guān)。 本發(fā)明的方法應(yīng)用于大范圍的腫瘤類型。這將允許制備個(gè)體的"腫瘤表達(dá)譜"，這就是為何在個(gè)體患者樣品中可以測(cè)定DPD的表達(dá)水平，并可以預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的反應(yīng)。最優(yōu)選地，將本發(fā)明的方法用于支氣管肺泡(bronchalveolar)、小腸或結(jié)腸腫瘤。為了將本發(fā)明的一些實(shí)施方式應(yīng)用于特定的腫瘤類型，優(yōu)選確認(rèn)測(cè)量值與臨床抗性的關(guān)系，其通過(guò)編譯一份有關(guān)測(cè)得的特定DPD表達(dá)參數(shù)與對(duì)基于5-FU化療的臨床抗性之間的相關(guān)性的數(shù)據(jù)集來(lái)進(jìn)行。 本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任何類型的組織。例如，為了檢查腫瘤組織的抗性，希望
26檢查腫瘤組織。優(yōu)選地，希望也檢查從其身上獲得腫瘤的患者的部分的正常組織。其正常組織對(duì)基于5-FU的化療化合物有抗性，而預(yù)期其腫瘤對(duì)這種化合物敏感的患者則可以用更大量的化療組合物處理。 本發(fā)明的方法包括從患者腫瘤得到細(xì)胞樣品的步驟。從患者身上外科手術(shù)切下實(shí)體瘤或淋巴瘤，或其部分。如果不能在其切除之后不久從組織樣品提取RNA，那么可以固定或冷凍該樣品。其然后將用于得到RNA。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的任意方法(例如，Sambrook，F(xiàn)ischer and Maniatis， Molecular Cloning, a laboratory ma皿al， (2nd ed. ) ， ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)從切除組織的冷凍或新鮮樣品提取或分離RNA。優(yōu)選地，注意在提取過(guò)程中避免RNA的降解。 或者，例如，可以將從患者身上得到的組織固定，優(yōu)選通過(guò)福爾馬林(甲醛)或戊二醛處理。本發(fā)明中也考慮了用醇浸沒(méi)固定生物樣品。通常將固定的生物樣品脫水并包埋在石蠟或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它固體支持物上。這種固體支持物預(yù)期能夠用有機(jī)溶劑去除，使得可以進(jìn)行保存組織的后續(xù)的再水合。在本發(fā)明中所述的固定并且石蠟包埋(FPE)的組織樣本是指可存儲(chǔ)或歸檔的組織樣品。通過(guò)本發(fā)明所述的任意方法從FPE細(xì)胞提取RNA。 例如，優(yōu)選使用本領(lǐng)域常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法進(jìn)行從新鮮、冷凍或固定樣品純化的總mRNA定量DPD mRNA。定量DPDmRNA的其它方法包括，例如，使用分子信標(biāo)和在多重PCR中有用的其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明設(shè)想通過(guò)使用無(wú)PCR體系(PCR-free system)來(lái)定量DPD mRNA，所述無(wú)PCR體系采用類似于Invader Assay (ThirdWaveTechnologies，Inc.)的熒光標(biāo)記探針。最優(yōu)選地，使用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan.⑧']，AppliedBiosystems， FosterCity, Calif.)或者由Heid等，(Genome Res 1996 ;6 :986-994)和Gibson等(Genome Res1996 ;6 :995-1001)所述的類似體系進(jìn)行DPD cDNA和內(nèi)部控制或管家基因(例如P -肌動(dòng)蛋白)的定量。ABI 7700 (TaqMan. Instrument)的輸出表示為Ct' s或"循環(huán)閾值"。使用TaqMan⑧體系，在樣品中具有更多靶分子的高表達(dá)基因產(chǎn)生信號(hào)所用的PCR循環(huán)與具有更少靶分子的低相對(duì)表達(dá)的基因(較高Ct)相比更少(較低Ct)。 本發(fā)明的一個(gè)方面部分歸功于發(fā)現(xiàn)DPD mRNA的相對(duì)量與對(duì)化療劑5-FU的抗性相關(guān)。在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)高水平DPD mRNA的腫瘤很可能對(duì)5-FU有抗性。相反地，表達(dá)少量DPD mRNA的那些腫瘤很可能對(duì)5_FU敏感。通過(guò)將患者腫瘤的DPD mRNA的表達(dá)與DPD預(yù)先確定的閾值表達(dá)水平比較來(lái)對(duì)其進(jìn)行評(píng)判。 在本發(fā)明中所使用的"未修正的基因表達(dá)(UGE)"如涉及DPD是指相對(duì)于由TaqMan衝儀器產(chǎn)生的內(nèi)部控制基因的DPD表達(dá)的數(shù)值輸出。用于測(cè)定UGE的方程示于實(shí)施例8中，并用圖15的樣品計(jì)算來(lái)示例。 本發(fā)明的另一方面提供了標(biāo)準(zhǔn)化未修正的基因表達(dá)(UGE)值的方法，該未修正的基因表達(dá)值是使用從非-T叫Man⑧技術(shù)中得到的先前公開的相對(duì)基因表達(dá)值從TaqMan必'儀器得到的。優(yōu)選地，用從組織樣品得到的DPD UGE標(biāo)準(zhǔn)化由非-TaqMan⑧.得到的相對(duì)DPD :P-肌動(dòng)蛋白表達(dá)值，其由Salonga等人先前公開，Clinical Cancer Research, 6:1322-1327， 2000，在此全部通過(guò)提述并入。 在本發(fā)明中使用的"未修正的相對(duì)DPD表達(dá)"指的是標(biāo)準(zhǔn)化的DPD表達(dá)，其中將UGE乘以DPD特異性修正因子(K。pD)，所得的值可以與先前公開的數(shù)值范圍比較。圖15詳細(xì)地示例了這些計(jì)算。"先前公開的"相對(duì)基因表達(dá)結(jié)果以靶基因的RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)基因
(e-Actin)的比率為基礎(chǔ)。在預(yù)-T叫Man⑩技術(shù)研究中，進(jìn)行固定次數(shù)的(即，30次)循
環(huán)的PCR反應(yīng)，并報(bào)告各樣品的端點(diǎn)值。然后，這些值作為DPD表達(dá)與P-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比率報(bào)告。Salonga，等，Clinical Cancer Research, 6 :1322-1327， 2000，在此全部通過(guò)提述并入。 如在本發(fā)明中所定義的相對(duì)DPD表達(dá)的"預(yù)先確定的閾值"水平為DPD表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在該水平之上時(shí)腫瘤很可能對(duì)5-FU有抗性。該閾值水平以下的表達(dá)水平很可能存在于對(duì)5-FU敏感的腫瘤中。在對(duì)基于5-FU化療方案應(yīng)答的腫瘤中，相對(duì)DPD表達(dá)的范圍為小于大約0. 6X 10—3至大約2. 5X 10—3(大約4. 2倍的范圍)。對(duì)基于5-FU的化療方案無(wú)應(yīng)答的腫瘤具有大約0.2X10—3至大約16X10—3(大約80倍的范圍)的相對(duì)DPD表達(dá)。如果相對(duì)DPD表達(dá)大于大約2. OX 10—3，優(yōu)選大于大約2. 5X 10—3，那么腫瘤通常對(duì)5-FU的治療無(wú)應(yīng)答。這些數(shù)值使得可以測(cè)定特定樣品的"修正的相對(duì)DPD表達(dá)"是否落入"預(yù)先確定的閾值"水平之上或之下。修正的相對(duì)DPD表達(dá)水平的閾值水平為大約2.0X10—3至大約2. 5X10—3。 本發(fā)明的方法可適用于寬范圍的組織和腫瘤類型，因而可以用于評(píng)估患者的治療，以及作為包括乳腺癌、頭頸癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌和其它癌癥的一系列癌癥的診斷或預(yù)后手段。優(yōu)選地，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于支氣管肺泡癌、小腸癌或結(jié)腸癌的預(yù)后。
基于測(cè)量腫瘤中表達(dá)的DPD mRNA的量，熟練的開業(yè)醫(yī)師可以做出關(guān)于腫瘤對(duì)基于5-FU化療的臨床抗性的預(yù)后。"基于5-FU的化療"包括單獨(dú)或與其他化療劑(例如亞葉酸鈣) 一起施用5-FU、其衍生物，或者與DPD抑制劑(例如尿嘧啶、5-乙炔尿嘧啶、溴代乙烯尿嘧啶、胸腺嘧啶、苯甲氧基苯甲基尿嘧啶(benzyloxybenzyluracil) (BBU)或5-氯-2，4-二羥基嘧啶) 一起施用。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與5-FU或其衍生和DPD抑制劑5-乙炔尿嘧啶的組合相比，共施用式(I)的5'-脫氧-胞苷衍生物與5-FU或其衍生物顯著地改善了化療劑向腫瘤組織的選擇性遞送，并且在人癌癥異種移植模型中顯示出顯著改善的抗腫瘤活性。
ERCC1/TS 本發(fā)明部分依賴于發(fā)現(xiàn)TS和ERCC1 mRNA的量分別與對(duì)5-FU和奧沙利鉑藥物的抗性相關(guān)。表達(dá)高水平的TS和ERCC1 mRNA的腫瘤被認(rèn)為很有可能對(duì)基于鉑的化療有抗性。相反地，那些表達(dá)少量的TS和ERCC1 mRNA的腫瘤很有可能對(duì)基于鉑的化療敏感。通過(guò)將患者的腫瘤的TS和ERCClmRNA表達(dá)狀態(tài)與預(yù)先確定的閾值表達(dá)水平比較來(lái)對(duì)其進(jìn)行評(píng)判。
本發(fā)明提供了相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的基因表達(dá)定量固定或固定并石蠟包埋(FPE)的組織中TS和ERCC1 mRNA表達(dá)量的方法。除了上述討論的ERRCC1引物外，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了允許準(zhǔn)確評(píng)估在已經(jīng)固定或固定并包埋的組織中TS基因表達(dá)的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供了寡核苷酸引物，TS-763F(SEQ ID NO :9) 、 TS-825R(SEQ ID NO:10)，或者與其基本上相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從固定并石蠟包埋的(FPE)腫瘤樣品中提取的RNA —起使用。參見(jiàn)美國(guó)專利第7，049，059號(hào)，在此通過(guò)提述并入。然后這種對(duì)TS和ERCC1基因表達(dá)的測(cè)量可以用于對(duì)基于鉑的化療的預(yù)后。 本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式包括，首先，如在本發(fā)明中所述的從FPE樣品可靠地提取RNA的方法，以及其次，通過(guò)使用上述的ERCC1和TS寡核苷酸引物對(duì)或者與其基本相同的寡 核苷酸用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)測(cè)定樣品中的TS和ERCC1 mRNA的含量。
本發(fā)明可以應(yīng)用于來(lái)自患者的任意類型的組織。為了檢查腫瘤組織的抗性，優(yōu)選 檢查腫瘤組織。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，也對(duì)來(lái)自從其身上獲得腫瘤的患者的部分的正常組 織進(jìn)行檢查。其正常組織預(yù)期對(duì)基于鉑的化療化合物有抗性(即，顯示高水平的TS和ERCC1 基因表達(dá))，而其腫瘤預(yù)期對(duì)這種化合物敏感(即，顯示低水平的TS和ERCC1基因表達(dá))的 患者，那么可以使用更高量的化療組合物治療。 本發(fā)明的方法可以用于大范圍的腫瘤類型。這將允許制備個(gè)體的"腫瘤表達(dá)譜"， 由此可以測(cè)定個(gè)體患者樣品中的TS和/或ERCC1的表達(dá)水平，并可以預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的應(yīng) 答。優(yōu)選地，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選地用于結(jié)腸直腸腺癌腫瘤。
如在本發(fā)明中定義的涉及TS的"預(yù)先確定的閾值水平"為如下TS表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) 高于該表達(dá)水平腫瘤很可能對(duì)基于5-FU和基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案有抗性。在所 述閾值水平以下的表達(dá)水平很可能存在于對(duì)基于5-FU或基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案 敏感的腫瘤中。在對(duì)基于5-FU或基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案有應(yīng)答的腫瘤中，表示 為TS : 13 -肌動(dòng)蛋白的比率的TS相對(duì)表達(dá)的范圍為小于大約7. 5X10—3。對(duì)基于5-FU或基 于5-FU和奧沙利鉑的化療方案無(wú)應(yīng)答的腫瘤具有高于大約7. 5X 10—3的TS : 13 -肌動(dòng)蛋白 比率的相對(duì)表達(dá)。 在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，測(cè)定患者的腫瘤樣品中的ERCC1表達(dá)水平和TS表達(dá)水平 以預(yù)測(cè)基于5-FU和奧沙利鉑的化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者腫瘤 樣品中的TS表達(dá)水平以預(yù)測(cè)基于5-FU的化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定 患者腫瘤樣品中的ERCC1表達(dá)水平以預(yù)測(cè)基于奧沙利鉑的化療反感的效力?；蛘?，僅僅測(cè) 定患者腫瘤樣品中TS表達(dá)水平的表達(dá)水平以預(yù)測(cè)基于5-FU和奧沙利鉑的聯(lián)合化療方案的 效力。 在實(shí)施本發(fā)明這種實(shí)施方式的方法時(shí)，優(yōu)選從患者身上分離腫瘤細(xì)胞。從患者 身上通過(guò)外科手術(shù)切下實(shí)體瘤或者淋巴瘤或其部分，或者通過(guò)常規(guī)活檢得到。通過(guò)本領(lǐng) 域內(nèi)任意的典型方法(例如，Sambrook， Fischer and Maniatis， Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed. )， Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, (1989))從細(xì)胞提取分離自冷凍或新鮮樣品的RNA。優(yōu)選地，注意在提取過(guò)程中避免RNA的 降解。 通過(guò)如上所述的任意的方法從FPE細(xì)胞提取RNA。例如，優(yōu)選使用本領(lǐng)域內(nèi)常用的 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法進(jìn)行對(duì)來(lái)自純化的總mRNA中TS和ERCCl mRNA的 定量，所述純化的總mRNA來(lái)自新鮮、冷凍或固定樣品。定量TS或ERCC1 mRNA的其它方法 包括，例如，使用分子信標(biāo)和在多重PCR中有用的其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明設(shè)想通過(guò)使 用采用例如類似于Invader Assay (Third Wave Technologies, Inc.)的熒光標(biāo)記探針的 無(wú)PCR體系定量TS和/或ERCC1 mRNA。最優(yōu)選地，使用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABI PRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan :⑧]，Applied Biosystems， Foster City, Calif.)或者如Heid等人(Genome Res 1996 ;6 :986 994)和Gibson等人(Genome Res 1996 ;6 :995 1001)所述的類似體系完成TS和/或ERCC1 cRNA和內(nèi)部控制或管家基 因(例如，P-肌動(dòng)蛋白)的定量。ABI 7700 (TaqMan Instrument)的輸出表示為Ct' s
29或"循環(huán)閾值"。使用TaqMan⑧系統(tǒng)，在樣品中具有更多靶分子的高表達(dá)基因產(chǎn)生信號(hào)使用 的循環(huán)比具有較少的靶分子(較高Ct)的較低相對(duì)表達(dá)的基因少(較低Ct)。
在本發(fā)明中所使用的"未修正的基因表達(dá)(UGE)"指的是TS和/或ERCC1表達(dá)相 對(duì)于通過(guò)T叫Man⑧儀器產(chǎn)生的內(nèi)部控制基因的數(shù)值輸出。用于測(cè)定UGE的方程示于實(shí)施 例10和11中，并用在圖23和24示例了樣品計(jì)算。 如在本發(fā)明中使用的"修正的相對(duì)TS表達(dá)"指的是標(biāo)準(zhǔn)化的TS表達(dá)，其中將UGE 乘以TS特異性修正因子(KTS)，得到可以相對(duì)于內(nèi)部控制基因與已知范圍的TS表達(dá)水平相 比較的值。實(shí)施例10和圖24詳細(xì)地示例了這些計(jì)算。這些數(shù)值允許測(cè)定特定樣品的"修正 的相對(duì)TS表達(dá)"是否落在"預(yù)先確定的閾值"水平之上或之下。修正的相對(duì)TS表達(dá)與P-肌 動(dòng)蛋白水平之比的預(yù)先確定的閾值水平為大約7. 5X10—3。 TS、內(nèi)部控制P-肌動(dòng)蛋白和校 準(zhǔn)物Universal PE RNA ; (Cat #4307281，lot #3617812014，來(lái)自Applied Biosystems)的 KTS為12. 6X10—3。 可以測(cè)定除13 _肌動(dòng)蛋白之外的內(nèi)部控制基因和/或不同于Universal PERNA(Cat #4307281， lot #3617812014，來(lái)自Applied Biosystems)的校準(zhǔn)物RNA的KTS。 為了進(jìn)行這樣的測(cè)定，必須同時(shí)將內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA對(duì)于組織樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì) 于該組織樣品，相對(duì)于特定的內(nèi)部控制基因的TS表達(dá)水平已經(jīng)被測(cè)定(即，"已知的相對(duì)基 因表達(dá)"或"之前已公開")。優(yōu)選地，這些組織樣品為福爾馬林固定并石蠟包埋(FPE)的樣 品，并且根據(jù)本發(fā)明中的反感從它們提取RNA?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)-T叫Man 、定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。通過(guò)這樣的測(cè)定，這些樣品具有TS的"已知的相對(duì)基因 表達(dá)"水平，其可用于測(cè)定對(duì)新的內(nèi)部控制和/或校準(zhǔn)物RNA特異性的新K^，如實(shí)施例10 中所述。"先前公開"的相對(duì)基因表達(dá)結(jié)果為基于靶基因RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)基因 (e-肌動(dòng)蛋白)的比率。在預(yù)-T叫Man必技術(shù)研究中，進(jìn)行固定循環(huán)次數(shù)(即，30次)的 PCR反應(yīng)，并報(bào)告各樣品的端點(diǎn)值。然后將這些值報(bào)道為ERCC1或TS表達(dá)與P-肌動(dòng)蛋白 表達(dá)的比率。Salonga，等，Clinical Cancer Research, 6 :1322 1327， 2000，在此通過(guò)提述 以其整體并入。 本發(fā)明的方法可應(yīng)用于大范圍的組織和腫瘤類型，所以可以用于評(píng)估患者的臨床 治療，并作為包括乳腺癌、頭頸癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌和其它癌癥的一系列癌癥的診 斷或預(yù)后手段。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法應(yīng)用于結(jié)腸直腸腺癌的預(yù)后。
預(yù)-化療治療腫瘤活檢通常只能作為固定石蠟包埋(FPE)組織獲得，通常僅含非 常少量的非均質(zhì)組織。這種FPE樣品易于進(jìn)行顯微切割，從而可以在沒(méi)有被間質(zhì)組織污染 的腫瘤組織中測(cè)定TS和ERCC1基因表達(dá)。此外，在活檢組織樣品內(nèi)對(duì)間質(zhì)和腫瘤組織進(jìn)行 比較，因?yàn)檫@些樣品通常同時(shí)包含這兩種類型的組織。 位于TS基因區(qū)側(cè)翼的任意寡核苷酸對(duì)可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法。在嚴(yán)緊條件 下與本發(fā)明中使用的TS基因區(qū)雜交的引物將擴(kuò)增20-1000堿基對(duì)，優(yōu)選100-400堿基對(duì)， 最優(yōu)選地為200-400堿基對(duì)的產(chǎn)物。
HER2-neu/EGFR 表達(dá)高水平HER2-neu和/或EGFR mRNA的腫瘤被認(rèn)為很可能對(duì)受體酪氨酸激酶 耙向性化療敏感。相反地，表達(dá)少量HER2-neu和EGFR mRNA的那些腫瘤不太可能對(duì)受體酪氨酸激酶耙向性化療敏感。患者的差異性HER2-neu和EGFR mRNA的表達(dá)狀態(tài)是通過(guò)將其 與預(yù)先確定的閾值表達(dá)水平進(jìn)行比較來(lái)判斷的。 本發(fā)明提供了相對(duì)于內(nèi)部控制的基因表達(dá)對(duì)在新鮮、冷凍、固定或固定并石蠟包 埋(FPE)的組織中的HER2-neu和/或EGFR mRNA表達(dá)量進(jìn)行定量的方法。本發(fā)明人開發(fā) 了允許精確評(píng)估新鮮、冷凍、固定或固定并包埋的組織中HER2-neu和EGFR基因表達(dá)的寡核 苷酸引物。所述寡核苷酸引物，EGFR-1753F(SEQ ID NO :11) 、EGFR-1823R(SEQ ID NO :12)， 或者與其基本上相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從新鮮、冷凍、固定或固定并石蠟包埋(FPE) 的腫瘤樣品中提取的RNA—起使用。本發(fā)明也提供了寡核苷酸引物，HER2-neu 2671F(SEQ ID NO :13) 、 HER2-neu 2699R(SEQ ID NO :14)(參見(jiàn)美國(guó)專利第6， 582， 919號(hào)，在此通過(guò)提 述并入)，或者與其基本上相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從新鮮、冷凍、固定或固定并石蠟包 埋(FPE)的腫瘤樣品提取的RNA—起使用。然后可以將HER2-neu和/或EGFR基因表達(dá)的 這種測(cè)量用于受體酪氨酸激酶靶向性化療的預(yù)后。 本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式包括從新鮮、冷凍、固定或FPE樣品中可靠地提取RNA 的方法，和使用本發(fā)明中所述的方法并通過(guò)使用寡核苷酸引物對(duì)，優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì) EGFR-1753F(SEQ ID NO :11)和EGFR-1823R(SEQ IDNO :12)，或與其基本上相同的寡核苷酸 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)測(cè)量樣品中的EGFR mRNA含量。 本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括從新鮮、冷凍、固定或FPE樣品可靠地提取RNA的 方法，和使用本發(fā)明中所述的方法并通過(guò)使用寡核苷酸引物對(duì)，優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì) HER2-neu 2671F(SEQ ID NO : 13) 、HER2-neu 2699R(SEQID NO :14)，或者與其基本上相同的 寡核苷酸引物對(duì)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)測(cè)量樣品中的HER2-neu mRNA含量。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于大范圍的腫瘤類型。這使得可以制備個(gè)體的"腫瘤表達(dá) 譜"，由此測(cè)定個(gè)體患者樣品中HER2-neu和/或EGFR的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的應(yīng) 答。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選地NSCLC腫瘤。 在本發(fā)明中所定義的"差異性表達(dá)水平(differential expression level)"指的 是在腫瘤中或者EGFR或者HER2-neu的表達(dá)水平分別相對(duì)于在匹配的非惡性組織樣品中的 或者EGFR或者HER2-neu表達(dá)水平的差異。通過(guò)將來(lái)自腫瘤樣品的特定基因的UGE除以來(lái) 自匹配的非惡性組織樣品的相同基因的UGE來(lái)測(cè)定差異性表達(dá)水平。 如在本發(fā)明中定義的涉及EGFR表達(dá)的"預(yù)先確定的閾值水平"為這樣的差異性 EGFR表達(dá)水平，高于該差異性EGFR表達(dá)水平(即，高)時(shí)，腫瘤很可能對(duì)受體酪氨酸激酶 靶向性化療方案敏感。高差異性EGFR表達(dá)水平是較低的患者生存率的預(yù)后。具有低于這 種閾值水平的表達(dá)水平的腫瘤不太可能受到受體酪氨酸激酶靶向性化療方案的影響。低 的差異性EGFR表達(dá)水平為較高患者生存率的預(yù)后。通過(guò)Mafune等人(Clin Cancer Res 5 :4073-4078， 1999)使用的方法測(cè)定差異性表達(dá)是否高于或低于"預(yù)先確定的閾值水平"， Maf皿e等人計(jì)算了在從患有食管鱗狀上皮細(xì)胞癌的患者得到的匹配的非惡性組織中個(gè)體 的差異性腫瘤/正常(T/N)表達(dá)比。Mafune等，Clin Cancer Res5 :4073-4078， 1999?；?于獲得自匹配的非惡性組織的個(gè)體背景表達(dá)，該分析方法產(chǎn)生針對(duì)各患者的精確表達(dá)值。 如果在腫瘤樣品中的EGFR : 13 -肌動(dòng)蛋白的UGE除以在匹配的非惡性組織樣品中的EGFR : P -肌動(dòng)蛋白的UGE高于大約1. 8的預(yù)先確定的閾值，則EGFR的差異性表達(dá)被認(rèn)為是"高" 的，并且指示低的生存率。如果在腫瘤樣品中的EGFR:P-肌動(dòng)蛋白的UGE除以在匹配的非惡性組織樣品中的EGFR : 13 -肌動(dòng)蛋白的UGE低于大約1. 8的預(yù)先確定的閾值，則EGFR的 差異性表達(dá)被認(rèn)為是"低"的，并且指示高的生存率。 如在本發(fā)明中定義的設(shè)計(jì)差異性HER2-neu表達(dá)的"預(yù)先確定的閾值水平"為這 樣的HER2-neu表達(dá)水平，高于該水平(即，高)，腫瘤很可能對(duì)受體酪氨酸激酶靶向性化療 方案敏感。高的差異性HER2-neu表達(dá)水平為較低的患者生存率的預(yù)后。具有低于該閾值 水平的表達(dá)水平的腫瘤不太可能受到受體酪氨酸激酶靶向性化療方案的影響。低差異性 HER2-neu表達(dá)水平為較高的患者生存率的預(yù)后。如果在腫瘤樣品中的HER2-neu : P -肌 動(dòng)蛋白的UGE除以在匹配的非惡性組織樣品中的HER2-neu : P -肌動(dòng)蛋白的UGE高于大約 1. 8的預(yù)先確定的閾值，則HER2-neu的差異性表達(dá)被認(rèn)為是"高"的，并且指示低的生存 率。如果在腫瘤樣品中的HER2-neu : P -肌動(dòng)蛋白的UGE除以在相應(yīng)的非惡性組織樣品中 的HER2-neu : P -肌動(dòng)蛋白的UGE低于大約1. 8的預(yù)先確定的閾值，則HER2-neu的差異性 表達(dá)被認(rèn)為是"低"的，并且指示高的生存率。 使用如下的結(jié)果和方法測(cè)定HER2-neu的閾值水平。表示為HER2-neu與P _肌 動(dòng)蛋白PCR產(chǎn)物的比率的修正的HER2-neu mRNA表達(dá)，在正常的肺中為4.17X10—3(范圍 0. 28-23. 86X 103)，而在腫瘤組織中為4. 35X10—3(范圍0. 21-68. 11X10—3) (P = 0. 019 Wilcoxon檢驗(yàn))。由Miller和Siegmund(Miller等，Biometrics 38 :1011—1016， 1982) 禾口 Halpern (Biometrics 38:1017-1023,1982)的最大的卡方法(maximal chi-square method)測(cè)定了 1.8的閾值將患者分為低和高差異性HER2-neu表達(dá)者。依照該標(biāo)準(zhǔn)，29位 (34. 9% )患者具有高差異性HER2-neu表達(dá)，54位(65. 1% )具有低差異性HER2-neu表達(dá)。
使用下面的結(jié)果和方法測(cè)定的EGFR的"閾水平"。中位數(shù)的修正EGFRmRNA表達(dá)， 在正常的肺中為8. 17X10—3(范圍0. 31-46. 26X 10—3)，而在腫瘤組織中為7. 22X10—3(范 圍0. 27-97. 49X 10—3) (P = n. s.)。由最大卡方法(Miller (1982) ;Halpern(1982))測(cè)定 了 1. 8的閾值將患者分為低和高差異性EGFR表達(dá)者。依照該標(biāo)準(zhǔn)，28位(33. 7% )患者具 有高差異性EGFR表達(dá)，和55位(66. 3% )具有低差異性EGFR表達(dá)。 在實(shí)施本發(fā)明的方法的過(guò)程中，測(cè)定患者的或者差異性EGFR表達(dá)水平或者差異 性HER2-neu表達(dá)水平以預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶靶向性化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方 法中，測(cè)定患者的差異性HER2-neu表達(dá)水平以預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶靶向性治療方案的效 力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者的差異性EGFR表達(dá)水平以預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶靶 向性治療方案的效率?；蛘撸瑫r(shí)測(cè)定患者的差異EGFR表達(dá)水平和差異性HER2-neu表達(dá) 水平以預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶靶向治療性方案的效力。 在本發(fā)明中定義的"匹配的非惡性樣品"指的是源自與用于差異性EGFR和/或差 異性HER2-neu表達(dá)分析的腫瘤樣品相同的個(gè)體的非癌組織的樣品。優(yōu)選地，匹配的非惡性 樣品與腫瘤樣品源自相同的器官。最優(yōu)選地，所述匹配的非惡性腫瘤樣品與腫瘤樣品來(lái)自 相同的器官組織層次。此外，優(yōu)選在取匹配的非惡性組織樣品的同時(shí)進(jìn)行腫瘤樣品的活檢。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析來(lái)自下面的兩個(gè)位置的組織肺腫瘤和取自距離腫瘤盡可能地 最遠(yuǎn)的非惡性肺組織，或者結(jié)腸腫瘤和在該情形下距離腫瘤盡可能地最遠(yuǎn)的非惡性結(jié)腸組 織。 在實(shí)施本發(fā)明這種實(shí)施方式的方法中，優(yōu)選從患者分離腫瘤細(xì)胞。從患者身上外 科手術(shù)切下或者通過(guò)常規(guī)的活檢得到實(shí)體瘤或淋巴瘤或其部分。通過(guò)本領(lǐng)域任意典型的方法(例如，Sambrook， Fischer and Maniatis， MolecularCloning， a laboratory ma皿al， (2nd ed. )，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989))從細(xì)胞提取從冷 凍或新鮮腫瘤樣品中分離的RNA。優(yōu)選地，在提取過(guò)程中，注意避免RNA的降解。
然而，通常將活檢后從患者身上得到的組織固定，例如通常被福爾馬林(甲醛) 或戊二醛，或者通過(guò)醇浸沒(méi)固定。固定的生物學(xué)樣品通常被脫水并包埋在石蠟或本領(lǐng)域的 技術(shù)人員已知的其它固體支持物上。參見(jiàn)Plenat等，AnnPathol January 2001 ;21(1): 29-47。未包埋的、固定組織和固定并包埋的組織也可用于本發(fā)明的方法。例如，設(shè)想用于 包埋固定的組織的固體支持物可以用有機(jī)溶劑去除，使得可以對(duì)保存的組織進(jìn)行后續(xù)的再 水合。 RNA通過(guò)本發(fā)明中所述的任意方法從石蠟包埋(FPE)的組織細(xì)胞提取。例如， 優(yōu)選使用本領(lǐng)域常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法對(duì)來(lái)自純化的總mRNA的 HER2-neu或EGFR mRNA進(jìn)行定量，所述純化的總mRNA來(lái)自新鮮、冷凍或固定的組織。定量 HER2-neu或EGFR mRNA的其它方法包括，例如，使用分子信標(biāo)和在多重PCR中有用的其它標(biāo) 記探針。此外，本發(fā)明設(shè)想通過(guò)使用無(wú)PCR系統(tǒng)來(lái)定量HER2-neu和/或EGFR mRNA，所述 無(wú)PCR系統(tǒng)采用，例如，類似于Invader Assay (Third Wave Technologies, Inc.)的熒光 標(biāo)記的探針。最優(yōu)選地，使用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence Detection System[TaqMan ] ， AppliedBiosystems， Foster City， Calif.)或由Heid等， (Genome Res 1996 ;6 :986-994)和Gibson等(Genome Res 1996 ;6 :995-1001)所述的類似 系統(tǒng)進(jìn)行HER2-neu和/或EGFR cDNA和內(nèi)部控制或管家基因(例如，P _肌動(dòng)蛋白)的定 量。ABI 7700 (TaqMan Instrument)的輸出表示為Ct' s或"循環(huán)閾值"。使用TaqMan 系統(tǒng)，在樣品中具有更多的靶分子的高表達(dá)基因產(chǎn)生信號(hào)所用的PCR循環(huán)比具有較少的靶 分子(較高Ct)的較低相對(duì)表達(dá)的基因少(較低Ct)。 如在本發(fā)明中使用的"未修正基因表達(dá)(UGE)"指的是HER2-neu和/或EGFR表達(dá) 相對(duì)于由TaqMan像儀器產(chǎn)生的內(nèi)部控制基因的數(shù)值輸出。用于測(cè)定UGE的方程示于實(shí)施 例12和13中，并用在圖25和26中實(shí)例了樣品計(jì)算。 這些數(shù)值允許測(cè)定差異性基因表達(dá)(即，"UGE"或者特定腫瘤樣品"UGE"除以匹 配的非腫瘤樣品的"UGE")是否落在所述"預(yù)先確定的閾值"水平之上或之下。EGFR和 HER2-neu的預(yù)先確定的閾值水平為大約1. 8。 該本發(fā)明的另一方面提供了標(biāo)準(zhǔn)化未修正的基因表達(dá)(UGE)值的方法，該值是使 用自非-TaqMan逸技術(shù)得到的"已知的相對(duì)基因表達(dá)"值從TaqMan .⑧儀器得到的。優(yōu)選地， 將通過(guò)TaqMan⑧從組織樣品得到HER2-neu和/或EGFRUGE值相對(duì)于樣品用從非TaqMan. . 得到的相對(duì)HER2-neu和/或EGFR : P -肌動(dòng)蛋白表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化。 在本發(fā)明使用的"修正相對(duì)EGFR表達(dá)"指的是標(biāo)準(zhǔn)化的EGFR表達(dá)，其中將UGE乘 以EGFR特異性修正因子(KEeFK)，得到可以相對(duì)于內(nèi)部控制基因與已知范圍的EGFR表達(dá)相 比的值。實(shí)施例12和圖25示例了這些計(jì)算的細(xì)節(jié)。對(duì)于EGFR、內(nèi)部控制P-肌動(dòng)蛋白和 校準(zhǔn)物人肝臟總RNA(Stratagene， Cat #735017)特異性的KEGFK為26. 95X 10—3。這些數(shù)值 也允許測(cè)定特定腫瘤樣品的"修正的相對(duì)表達(dá)"除以匹配的非腫瘤樣品的"修正的相對(duì)表 達(dá)"(即，差異性表達(dá))是否落在"預(yù)先確定的閾值"水平之上或之下。HER2-neu或EGFR的 預(yù)先確定的閾值水平為大約1. 8。在測(cè)定腫瘤樣品中的或者EGFR或者HER2-neu的差異性表達(dá)是否大于匹配的非腫瘤樣品的1. 8倍，將容易認(rèn)識(shí)到可以使用或者UGE值或者修正的 相對(duì)表達(dá)值。例如，如果將腫瘤的修正的相對(duì)表達(dá)水平除以匹配的非腫瘤樣品，那么K-因 子相互抵消并得到的與使用UGE值相同的比率。 從先前分析的組織樣品得到"已知相對(duì)基因表達(dá)"值，并且該值是基于靶基因的 RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)內(nèi)部控制基因(例如，P-肌動(dòng)蛋白，GAPDH等)的比率。優(yōu)選地， 這些組織樣品為被福爾馬林固定并石蠟包埋(FPE)樣品，并且根據(jù)在本發(fā)明的方案從其中 提取RNA。為了定量相對(duì)于內(nèi)部控制的基因表達(dá)，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)定量RT-PCR技術(shù)。 進(jìn)行固定次數(shù)循環(huán)(即，30)的預(yù)-T叫Man逸技術(shù)PCR反應(yīng)，并報(bào)道各樣品的端點(diǎn)值。然后 將這些值作為EGFR表達(dá)與13 -肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比率報(bào)告。 可以測(cè)定除P-肌動(dòng)蛋白之外的內(nèi)部控制基因和/或不同于人肝臟總 RNA(Stratagene，Cat #735017)的校準(zhǔn)物RNA的KEeFK。為了進(jìn)行這種測(cè)定，必須同時(shí)相對(duì)于 組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA，對(duì)于該組織樣品，已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部控 制基因的EGFR表達(dá)水平(即，"已知的基因表達(dá)")。優(yōu)選地，這些組織樣品為被福爾馬林固 定并石蠟包埋(FPE)樣品，并且根據(jù)在實(shí)施例1中描述的方案從其中提取RNA。使用本領(lǐng)域 公知的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)-TaqMan⑧定量RT-PCR技術(shù)可以進(jìn)行這種測(cè)定。通過(guò)這種測(cè)定，這些樣品具 有EGFR的"已知相對(duì)基因表達(dá)"水平，其可用于測(cè)定對(duì)新的內(nèi)部控制和/或校準(zhǔn)物RNA特 異性的新K，K，如實(shí)施例12中所述。 如在本發(fā)明中使用的"修正相對(duì)HER2-neu表達(dá)"指的是標(biāo)準(zhǔn)化的HER2-neu表達(dá)， 其中UGE乘以HER2-neu特異性修正因子(KHEK2—neu)，得到可以相對(duì)于內(nèi)部控制基因與已知范 圍的HER2-neu表達(dá)水平比較的值。實(shí)施例13和圖26詳細(xì)地說(shuō)明了這些計(jì)算。對(duì)HER2-neu、 內(nèi)部控制P-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物人肝臟總RNA(Stratagene，Cat #735017)特異性的1(皿2—MU 為13. 3X10—3。 可以測(cè)定除P-肌動(dòng)蛋白之外的內(nèi)部控制基因和/或不同于人肝臟總 RNA(Stratagene， Cat #735017)的校準(zhǔn)物RNA的KHEK2—neu。為了進(jìn)行這樣的測(cè)定，必須同時(shí) 相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA，對(duì)于該組織樣品，已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于具體 內(nèi)部控制基因的HER2-neu表達(dá)水平(即，"已知的基因表達(dá)")。優(yōu)選地，這些組織樣品為福 爾馬林固定并石蠟包埋(FPE)樣品，并且根據(jù)本發(fā)明描述的方案從其中提取RNA。例如，使 用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)-TaqMan . ，定量RT-PCR技術(shù)可以進(jìn)行這種測(cè)定。通過(guò)這種測(cè)定， 這些樣品具有HER2-neu的"已知相對(duì)基因表達(dá)"水平，其可用于測(cè)定對(duì)新的內(nèi)部控制和/或 校準(zhǔn)物RNA特異性的KHEK2—nw，如實(shí)施例13中所述。 本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于大范圍的組織和腫瘤類型，因而可以用于評(píng)估患者的臨 床治療，并且作為一系列的癌癥(包括乳腺癌、頭頸癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌和其它癌 癥)的診斷或預(yù)后手段。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明應(yīng)用于NSCLC腫瘤的預(yù)后。
預(yù)-化療治療腫瘤活檢通常僅可作為固定石蠟包埋(FPE)樣品獲得，其通常僅含 非常少量的非均質(zhì)組織。這種FPE樣品容易進(jìn)行顯微切割，因此可以在未被非惡性間質(zhì)組 織污染的腫瘤組織中測(cè)定HER2-neu和/或EGFR基因表達(dá)。此外，可以在活檢組織樣品中 對(duì)非惡性間質(zhì)和腫瘤組織進(jìn)行比較，因?yàn)檫@些樣品通常同時(shí)包含所述兩種類型組織。
—般而言，位于EGFR基因區(qū)側(cè)翼的任意寡核苷酸對(duì)，如SEQ ID N0:10中所示，可 以用于實(shí)施本發(fā)明的方法。在嚴(yán)禁條件下與EGFR基因區(qū)雜交的引物將擴(kuò)增大約20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選100-400個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選200-400堿基對(duì)的產(chǎn)物。 而且，在HER2-neu基因區(qū)側(cè)翼的任意寡核苷酸對(duì)可以用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在 嚴(yán)緊條件下與HER2-neu基因區(qū)雜交的引物可以擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選100-400個(gè)堿 基對(duì)，最優(yōu)選200-400個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。 HER2-neu的過(guò)度活性指的是與細(xì)胞增殖病癥相關(guān)的編碼HER2-neu的基因的擴(kuò)增 或HER2-neu活性水平的產(chǎn)生(即，隨著HER2-neu水平的增加，細(xì)胞增殖病癥的一種或多種 癥狀的嚴(yán)重度增加)。 通過(guò)下面提供的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例示例本發(fā)明的做法，從而描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的從業(yè) 人員將會(huì)理解的是在所述示例性的實(shí)施例中使用的材料和方法可以以多種方式修改。這些 修改被認(rèn)為是落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 :長(zhǎng)片段RNA的提取步驟
I.組織制備 使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)流程在沒(méi)有蓋玻片的載玻片上封固包含F(xiàn)FPE組織的10微米截面 的石蠟塊。為了去石蠟并進(jìn)行核堅(jiān)牢紅(nuclear fast red) (NFR)染色，將載玻片如下處
理 將載玻片用二甲苯清洗兩次，每次5分鐘，接著用乙醇("EtoH")清洗。使用標(biāo)準(zhǔn) 的實(shí)驗(yàn)流程用NFR染色所述載玻片。 用手工或用激光捕獲顯微切割器(laser c即ture microdissector)(取決于切去
的面積大小)切下目標(biāo)區(qū)域(例如，腫瘤組織或間質(zhì)組織)。
II.RNA提取 制備包含Tris/HCL、 EDTA、 SDS和水的提取溶液。向離心管中的提取溶液加入腫 瘤組織和蛋白酶K。然后為得到最大產(chǎn)率的長(zhǎng)片段RNA，在適當(dāng)?shù)臏囟认录訜針悠愤m當(dāng)?shù)?時(shí)間，例如，在5(TC下加熱大約16小時(shí)。在加熱步驟后，將樣品轉(zhuǎn)移至更大的試管中，并加 入2M乙酸鈉(NaOAC)。進(jìn)行苯酚/氯仿/異戊醇(PCI)提取。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的干 凈的試管中，并加入糖原。用異丙醇(iPrOH)沉淀RNA。將沉淀的RNA (pelleted RNA)與 離液劑(例如0.5%的肌氨酸-胍-異硫氰酸鹽(GITC))混合。還向試管中加入二硫蘇糖 醇(DTT)。加入5mM Tris并混合。然后，加入2M Na0Ac和PCI，渦旋震蕩，并在冰上溫育試 管。旋轉(zhuǎn)離心(spin)試管，并將上層水相轉(zhuǎn)移至包含糖原的新試管中。再次沉淀RNA(使 用iPrOH)，并用乙醇清洗。將RNA懸浮在5mMTris中。
III.PCR定量 使用通過(guò)本發(fā)明的方法得到的提取RNA，按照前人所述(36，37)進(jìn)行cDNA制備 (35)和實(shí)時(shí)RT-PCR定量(36，37)。對(duì)于每個(gè)提取物進(jìn)行一式三份PCR。將該數(shù)據(jù)作為P -肌 動(dòng)蛋白基因的Ct值報(bào)告。該Ct值表明PCR產(chǎn)物的量，而因此涉及存在于PCR反應(yīng)中的靶 的原始量。所述關(guān)系為反比關(guān)系，即，Ct數(shù)越大表明原始存在的靶cDNA越少。各PCR循環(huán) 表明在數(shù)量上的兩倍差異，因而，例如，兩次PCR反應(yīng)之間4-循環(huán)Ct差異意味著在cDNA含 量上的16倍差異(24= 16)。 實(shí)施例2 :測(cè)定分離的RNA的長(zhǎng)度分布的方法 為了測(cè)定從FFPE組織中分離的各種RNA片段長(zhǎng)度的相對(duì)量，使用如下的策略。使用寡聚dT引物將使用本發(fā)明和其它已知的提取方法從FFPE樣本中分離的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。這意味著只有包含3'-寡聚A尾的mRNA片段將會(huì)被延伸并轉(zhuǎn)化為cDNA，從而為測(cè)量片段長(zhǎng)度提供起點(diǎn)。P-肌動(dòng)蛋白mRNA的PCR擴(kuò)增用來(lái)表示總mRNA群體。選擇引物以擴(kuò)增代表距mRNA的3'-端100、300、400和lOOObp位置的P -肌動(dòng)蛋白基因的大約100_120bp的區(qū)段(圖2)。使用這種策略，會(huì)使擴(kuò)增的長(zhǎng)度依賴性效力上的任何差異最小化，而非實(shí)際嘗試擴(kuò)增100、300、400和lOOObp片段。因此，各引物組的PCR產(chǎn)物的Ct應(yīng)該幾乎代表了各片段大小的量的真實(shí)比率。 表1 :用于測(cè)定RNA片段的長(zhǎng)度的策略，該RNA片段是通過(guò)擴(kuò)增定位于距編碼區(qū)
3' _端大約100-300、400和lOOObp的P -肌動(dòng)蛋白區(qū)段而從FFPE組織分離的。
擴(kuò)增
lOObp距離3'端21-105
300bp距離3，端206-293
400bp距離3，端322-407
lOOObp距離3'端1050-1110 實(shí)施例3 :蛋白酶K的效果 本實(shí)施例示例蛋白酶K濃度對(duì)RNA產(chǎn)率和DNA污染的效果。在50°C，在0. 5、2、3和16小時(shí)的溫育時(shí)間下，在4倍范圍內(nèi)(5-20iig，如在圖中表示的lX-4X)改變蛋白酶K濃度。如圖4所示，lX(5iig)的蛋白酶K得到更大的量好大約2倍(lCt)的RNA產(chǎn)率，然而更重要的是，大于1X的蛋白酶K的量得到可見(jiàn)的較高的DNA污染(2-3Ct循環(huán))。該實(shí)驗(yàn)也示例了溫育時(shí)間對(duì)提取的DNA量的影B向，16小時(shí)溫育時(shí)間比較短的溫育時(shí)間好3至7個(gè)Ct循環(huán)。在沒(méi)有首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA("無(wú)逆轉(zhuǎn)錄或NRT對(duì)照")的情況下通過(guò)實(shí)施PCR檢測(cè)提取物中的DNA。這樣，僅僅發(fā)生對(duì)共提取的DNA的PCR擴(kuò)增，如果其太高則可能在RNA的PCR定量中有高背景值，因而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不可信。
實(shí)施例4 :DNA共提取的最小化 本實(shí)施例示例從FFPE提取物選擇性地去除DNA而使RNA的損失最小的流程。在去除更多DNA的嘗試中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)試包含離液劑，GITC的第二苯酚/氯仿提取步驟的效率。比較下面的提取方法的RNA產(chǎn)率和DNA污染 1.在92t:下溫育FFPE組織30分鐘，并用苯酚/氯仿/異戊醇("PCI")提取("RGI"法)，或者也稱作"高溫離液劑法"。其為快速短溫育高溫法，其之前開發(fā)用來(lái)從FFPE中提取RNA用于進(jìn)行基因表達(dá)的高通量RT-PCR定量。在美國(guó)專利第6， 248， 535號(hào)中描述了在此用于比較目的的這種方法，并且其包括用PCI的一次提取，接著用異丙醇("iPrOH")沉淀并用乙醇("EtOH")清洗。將本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式與RGI法比較，并將該方法稱作"PK"。 2.PK(50。C，16小時(shí)，使用蛋白酶K)+PCI+iPrOH+EtOH(即，單次的苯酚/氯仿提
36取)； 3. PK+GITC和PCI+iPrOH+EtOH(在單次苯酚/氯仿提取步驟中加入GITC);
4. PK+PCI+iPrOH+EtOH+GITC+PCI+iPrOH+EtOH(使用兩次苯酚/氯仿提取，并在第二苯酚/氯仿提取中包括GITC); 5. PK+PCI+iPrOH+EtOH+加入Tris+PCI+iPrOH+EtOH(使用兩次苯酚/氯仿提取，并在第二苯酚/氯仿提取中用Tris代替GITC)。 圖5顯示這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。高溫(RGI)法產(chǎn)生最少的DNA污染，因?yàn)闇赜龝r(shí)間短，但是RNA的產(chǎn)率也低(各系列的第一條柱子)。長(zhǎng)溫育PK法產(chǎn)生更多的RNA，但是具有高DNA污染(第二條柱子)。在第一提取步驟中加入GITC的效果導(dǎo)致DNA更少，但是也導(dǎo)致RNA產(chǎn)率的降低(第三條柱子)。在第二苯酚/氯仿提取步驟中使用GITC的效果為僅比單次苯酚/氯仿提取的RNA產(chǎn)率稍低(大約lCt循環(huán))(第四條柱子)。然而，與單次苯酚/氯仿提取相比，DNA也減少了 7Ct循環(huán)(NRT系列的第四條柱子)。當(dāng)使用Tris代替第二苯酚/氯仿提取中的GITC時(shí)，RNA的產(chǎn)率保持不變，但是DNA僅僅減少3Ct循環(huán)(第五條柱子)，說(shuō)明在第二苯酚/氯仿提取步驟中離液劑是理想的。從上面的結(jié)果可以得出結(jié)論包含離液劑GITC的第二苯酚/氯仿提取步驟就RNA產(chǎn)率和最低DNA污染而言是最有效的。
實(shí)施例5 :通過(guò)PK提取法提取的RNA與通過(guò)兩種其它提取法提取的RNA的比較
根據(jù)幾種不同的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)施例評(píng)估通過(guò)本發(fā)明的方法("PK"法)提取的RNA。
圖6顯示對(duì)通過(guò)PK法、RGI法(如上所述)和Paradise試劑盒(Arcturus， Co.，Mountain View，CA)從腫瘤樣品B5、D6和F5分離的RNA總量進(jìn)行的分光光度計(jì)定量，所述Paradise試劑盒為使用柱純化步驟從FFPE樣品分離RNA的市售可得的方法。如較高的UV吸收所表明的，在測(cè)試的3種樣品中PK法得到比Paradise試劑盒更高產(chǎn)率的總RNA，但是卻不如RGI法的總RNA產(chǎn)率高。對(duì)于2/3的通過(guò)PK法分離的樣品，表明RNA純度的260/280吸光度比接近于1. 8 (純RNA的該比值為1. 8)。 圖7比較了在腫瘤樣品F5、D5和D6中通過(guò)PK法、RGI法和Paradise試劑盒分離的100、300、400和lOOObp RNA片段的量。通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)定了各片段的定量的量。數(shù)據(jù)顯示PK法就RNA產(chǎn)率和DNA污染而言給出了最佳結(jié)果。通過(guò)圖7中較高的UV吸收表明的RGI法明顯較高的RNA產(chǎn)率與在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)PCR表明的較低產(chǎn)率之間存在明顯矛盾，這可能是因?yàn)楦邷胤椒óa(chǎn)生很多非常短的片段，其促成了在260nm處的總體光吸收，但是由于它們較短的長(zhǎng)度而不能被PCR的引物-探針組擴(kuò)增。 圖8比較了通過(guò)PK法、RGI法和Paradise試劑盒分離的RNA片段的大小分布。在Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Palo Alto，CA)上根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用RNA 6000 Nano Assay并使用Agilent 2100Bioanalyzer軟件分析通過(guò)所述三種方法提取的RNA。該分析儀通過(guò)在大小排阻柱上的洗脫時(shí)間分離寡核苷酸，長(zhǎng)度越短的RNA流出更快，并因此在點(diǎn)線圖中更接近y軸。RGI法主要得到短片段，而通過(guò)本發(fā)明的方法(PK法)分離的RNA給出了一系列片段大小，其中較長(zhǎng)片段的產(chǎn)率比Paradise法更高。
圖9顯示使用本發(fā)明的方法(PK法)從FFPE組織分離的RNA中P-肌動(dòng)蛋白的基因表達(dá)與使用常規(guī)酸性硫氰酸胍苯酚氯仿(AGPC)法(Chomczynskiand Saachi， AnalBiochem(1987) 162 :156-159)從匹配的新鮮冷凍組織組分離的RNA中P-肌動(dòng)蛋白的基因表達(dá)的比較。用分離自新鮮-冷凍和FFPE匹配樣本組的RNA獲得了相關(guān)性優(yōu)異的P-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)(R = 0. 89)。 實(shí)施例6 :測(cè)定ERCCl的未修正的基因表達(dá)(UGE) 進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)，即，"測(cè)試"反應(yīng)和"校準(zhǔn)"反應(yīng)。ERCCl擴(kuò)增反應(yīng)和13 -肌動(dòng)
蛋白內(nèi)部控制擴(kuò)增反應(yīng)為測(cè)試反應(yīng)。在校準(zhǔn)物RNA模板上進(jìn)行單獨(dú)的ERCCl和P-肌動(dòng)蛋
白的擴(kuò)增反應(yīng)，并稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。所述T叫Man逸儀器將會(huì)得到四個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值
從測(cè)試反應(yīng)中得到的CtE腿和Cte —肌動(dòng)蛋白和從校準(zhǔn)反應(yīng)中得到的CtE腿and Cte —肌動(dòng)蛋白。根
據(jù)下面的方程測(cè)定兩種反應(yīng)的Ct值的差異 A Ct測(cè)試二 CtEKCC1_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng)) A Ct校準(zhǔn)物二 CtEKra_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"校準(zhǔn)反應(yīng)") 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)以下方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。
2—AGt測(cè)試(來(lái)自"測(cè)試反應(yīng)")
2—"、準(zhǔn)物(來(lái)自"校準(zhǔn)反應(yīng)") 為了從T叫Man .⑧.儀器得到ERCCl的未修正的基因表達(dá)，進(jìn)行下面的計(jì)算。
ERCCl的未修正基因表達(dá)(UGE) = 2—"%則試/—"t校準(zhǔn)物
使用已知的相對(duì)ERCCl表達(dá)水平使UGE標(biāo)準(zhǔn)化 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算需要用UGE乘以對(duì)ERCCl和具體的校準(zhǔn)物RNA特異性的修正因子(KEKra)。也可以測(cè)定任何內(nèi)部控制基因和任何精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA的修正因子KEKra。優(yōu)選地，使用內(nèi)部控制基因P-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)-定量的校準(zhǔn)物RNA人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)。設(shè)定這些反應(yīng)物的修正因子KEKCC1等于1. 54X 10—3。
使用由TaqMan⑧的制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在上文描述的ACt法的修正形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了實(shí)施該過(guò)程，使用前面所述的T叫Man⑧方法針對(duì)ERCCl表達(dá)分析了 6種不同測(cè)試組織的UGE。使用內(nèi)部控制基因13 _肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物RNA人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)。將各樣品AG221、AG222、AG252、成人肺、PC3、AdCo1的已知相對(duì)ERCCl表達(dá)水平除以其相應(yīng)的由T叫Man逸.得到的UGE以得到未被平均的修正因子K。
K未被平均=已知的值/UGE 接下來(lái)，平均所有的K值以測(cè)定對(duì)ERCC1、校準(zhǔn)物RNA人肝臟總RNA (Stratagene，Cat. #735017)和P -肌動(dòng)蛋白特異性的單一 KEKCC1修正因子。 因此，為了在與預(yù)-T叫Man逸ERCCl表達(dá)研究相一致的規(guī)格內(nèi)測(cè)定未知組織樣品中的修正的相對(duì)ERCCl表達(dá)，假定使用相同的內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA，只需要將來(lái)自T叫Man⑧儀器的未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KEKra特異性相關(guān)因子。
修正的相對(duì)ERCCl表達(dá)=UGE X KEKCC1 可以使用任何精確預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA或內(nèi)部控制基因測(cè)定KEKCC1?？梢詫⑵渌鼇?lái)源的(future sources of)精確的預(yù)_定量的RNA相對(duì)于具有已知相對(duì)ERCCl表達(dá)水平的樣品如前述方法所述進(jìn)行校準(zhǔn)，或者現(xiàn)在可以針對(duì)之前校準(zhǔn)的校準(zhǔn)物RNA，例如上述的人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)進(jìn)行校準(zhǔn)。 例如，如果針對(duì)不同的內(nèi)部控制基因和/或不同的校準(zhǔn)物RNA測(cè)定后續(xù)KEKCC1，就必須同時(shí)將所述內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA針對(duì)組織樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)于所述組織樣品，已經(jīng)相對(duì)于這特定內(nèi)部控制基因測(cè)定了 ERCCl表達(dá)水平?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)-T叫Man⑧、定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。這些樣品的已知的表達(dá)水平將除以其相應(yīng)的UGE水平以測(cè)定樣品的K值。然后，根據(jù)已知樣品的數(shù)目使K值平均化以測(cè)定對(duì)不同的內(nèi)部控制基因和/或校準(zhǔn)物RNA特異性的新KEKCC1。
實(shí)施例7 所有的患者登記在預(yù)測(cè)性多中心三組隨機(jī)試驗(yàn)(prospective multicenterthreearm randomized trial) (GEPC/98-02,在晚期NSCLC中關(guān)于順鉬/吉西他濱(CG)對(duì)順鉬/吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱(Vinorelbine) (CGV)對(duì)順序成對(duì)的吉西他濱/長(zhǎng)春瑞濱繼之以異環(huán)磷酰胺/長(zhǎng)春瑞濱(GV/IV)的西班牙肺癌組III期試驗(yàn))的順鉑/吉西他濱組(arm)中。所有患者每三周在第1日、第8日接受Gem 1250mg/m2，并在第1日接受CDDP lOOmg/m2。 GEPC/98-02的合格標(biāo)準(zhǔn)為可測(cè)量的階段IV (符合條件的腦部轉(zhuǎn)移，如果沒(méi)有癥狀)或者階段IIIB(惡性胸膜和/或心包積液和/或鎖骨上腺病(supraclavicular adenopathy))NSCLC和EasternCooperative Group (ECOG)體力分值02。在參與研究之前，對(duì)所有的患者進(jìn)行胸部X-射線和對(duì)胸部和上腹部的計(jì)算機(jī)層析X射線照相術(shù)(CT)掃描，并至少每6周進(jìn)行重復(fù)評(píng)估。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤應(yīng)答評(píng)定為完全應(yīng)答、部分應(yīng)答、穩(wěn)定疾病和進(jìn)展性疾病。在治療期間使用相同的成像方法再評(píng)估腫瘤以建立腫瘤測(cè)量的基線。
從顯微切割的FPE預(yù)處理腫瘤樣品分離了總mRNA，并使用定量RT-PCR測(cè)量了修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)。本發(fā)明和在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/469， 338中(于1999年12月20日提交，將其在此通過(guò)提述并入)描述了從這些樣品分離mRNA的一種方法。
統(tǒng)計(jì)分析 使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)連續(xù)檢驗(yàn)變量(continuous test variable)修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)與兩分法變量(患者性別、年齡低于和高于中位年齡、是否存在體重?fù)p失、是否存在胸腔積液、腫瘤階段)之間的顯著關(guān)聯(lián)。使用克魯斯卡爾-瓦利斯二氏檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)在多個(gè)組(ECOG體力狀態(tài)、組織病理學(xué))中檢驗(yàn)修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的顯著差異。Fisher氏精確檢驗(yàn)(Fisher' s exact test)用于分析分類的臨床病理學(xué)(categorical clinicopathological)值，其包括應(yīng)答和二分的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)值。 從開始研究追蹤所有的患者直至死亡或至數(shù)據(jù)被刪失(censor)。使用卡普蘭-邁耳牲存曲線(K即lan-Meier survival curves)禾口時(shí)序檢驗(yàn)(log rank test)來(lái)分析生存率禾口無(wú)疾病生存率(disease—free survival)的單變量分布。>|f Miller禾口 Siegmund的最大的卡方法(maximal chi-square method) (Biometrics 1982 ;38 :1011-1016 andHalpern (Biometrics 1982 ;38 :1017-1023)適用于測(cè)定將患者分為差和好預(yù)后亞類(根據(jù)生存的可能性)的最佳表達(dá)值，將時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)作為統(tǒng)計(jì)方法用來(lái)測(cè)量分組的強(qiáng)度。為了基于最大卡方分析測(cè)定被解釋為關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度量度的P值，使用1000次類自舉模擬(boot-str即-likesimulation)評(píng)估在假設(shè)沒(méi)有關(guān)聯(lián)的情況下最大的卡方統(tǒng)計(jì)的分布。(Biometrics1982 ;38 :1017-1023)對(duì)在單變量分析中重要的因素進(jìn)行Cox' s比例風(fēng)險(xiǎn)建模(Cox' s proportional hazards modeling)以鑒定哪些因素可能對(duì)生存率有顯著影響。使用SPSS版本10. 0. 5軟件(SPSS Inc. ， Chicago 111.)進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。所有的P值均為雙向的(two-sided)。
修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平
39
在所有的56個(gè)分析的樣品中都可檢測(cè)到ERCClmRNA表達(dá)。相對(duì)于內(nèi)部控制管家基因P -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的中位數(shù)為6. 7X 10—3(范圍0. 8X 10—3至24. 6X 10—3)。修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平與如下的任意因素沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)，這些因素為年齡(P = 0. 66)、性別(P = 0. 18)、在隨機(jī)取樣之前六個(gè)月內(nèi)是否存在體重?fù)p失(P =0. 74)、腫瘤階段(IIIB相對(duì)于IV，P = 0. 39)或者是否存在胸腔積液(P = 0. 25，均為曼-惠特尼U檢驗(yàn))。具有不同的體力狀態(tài)級(jí)別。=0.48，克魯斯卡爾-瓦利斯二氏檢驗(yàn))或者不同的腫瘤細(xì)胞類型(所有的四種腫瘤類型，P二O. 10，克魯斯卡爾-瓦利斯二氏檢驗(yàn))的患者之間的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平也沒(méi)有顯著性差異，但是SCC腫瘤中的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平(中位數(shù)8.6X10—3)明顯比腺癌的高(中位數(shù)5. 2X10— P二0.015，曼-惠特尼U檢驗(yàn))。
對(duì)化療的應(yīng)答 47個(gè)可評(píng)價(jià)的患者的總應(yīng)答率為44. 7% 。完全應(yīng)答和部分應(yīng)答，即，"應(yīng)答"腫瘤中的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平(中位數(shù)4. 3X10—3，范圍:1.2X10—3至24. 6X10—3)與穩(wěn)定的疾病和進(jìn)展性疾病，即，"無(wú)應(yīng)答"腫瘤中的水平(中位數(shù)7.85X10—3，范圍0.8X10—3至24.3X10—3， P = 0.31曼-惠特尼U檢驗(yàn))沒(méi)有顯著差異。修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)值高于和低于任何ERCC1水平的應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答腫瘤的比率之間也沒(méi)有顯著差異(所有均為Fisher' s精確檢驗(yàn))。具有低于閾值的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的腫瘤中的應(yīng)答率("低"表達(dá)，52%應(yīng)答者)高于具有高于閾值的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)的腫瘤("高"表達(dá)，36.4%應(yīng)答者，F(xiàn)isher' s精確檢驗(yàn)，P = 0. 38)。 患者總體生存率與修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián) 中位數(shù)總生存率為36.6周(范圍0-113.4周)，而中位數(shù)進(jìn)展時(shí)間(timetoprogression)為24. 4周(范圍0-102. 9周)。使用時(shí)序檢驗(yàn)和最大卡方統(tǒng)計(jì)鑒定修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的閾值，該閾值可以將患者分為差和好的預(yù)后亞類，其顯示包含中位數(shù)的差別值的范圍，因此將其用作生存率分析的閾值。因此，用于NSCLC的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)值的閾值測(cè)定為6.7X10—3。圖l顯示患者的卡普蘭-邁耶生存曲線，所述患者具有高于和低于修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的閾值的瘤內(nèi)的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平。如圖14所示，與具有高于閾值的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的患者具有20. 4周的生存中值(95% C. I. 6. 9，33. 9周)相比，具有低于閾值的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的患者具有61. 6周的顯著的更長(zhǎng)的生存中值(95% C. I. 42. 4，80. 7周)。針對(duì)腫瘤階段進(jìn)行調(diào)整，在低或高的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)與總生存率之間的相關(guān)性的時(shí)序統(tǒng)計(jì)為3. 97，P值為0. 046。未調(diào)整的時(shí)序結(jié)果示于圖14中。 檢驗(yàn)5. 8X10—3的單獨(dú)的(s印arate)修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)閾值，因?yàn)橹暗难芯恐酗@示該值與患有胃癌的患者的總生存率相關(guān)(Metzger等，J ClinOncol 1998 ;16 :309316)。盡管更高的6. 7X 10—3的修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)閾值水平是更有效的鑒別標(biāo)準(zhǔn)(more powerful discriminator)，但是與ERCC1水平低于5. 8X 10—3的患者相比，在所述研究中修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平低于5. 8X 10—3的NSCLC患者組的總生存率明顯更高(時(shí)序統(tǒng)計(jì)6. 37， P = 0. 011)。 在使用卡普蘭-邁耶生存曲線和時(shí)序檢驗(yàn)的單變量分析中與總生存率顯著相關(guān)的其它因素為預(yù)處理的體重?fù)p失的存在和ECOG體力狀態(tài)?；颊吣挲g(P = 0. 1S)、性別(P
40=0. 87)、腫瘤階段(P = 0. 99)、腫瘤細(xì)胞類型(P = 0. 63)和胸腔積液的存在(P = 0. 71)對(duì)于總體生存率不是顯著的預(yù)后因素。修正的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平、ECOG體力狀態(tài)和重量損失仍然為Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多變量分析中的重要的預(yù)后因素(圖14)。按腫瘤階段來(lái)分層的Cox回歸模型的P值，其對(duì)于ERCC1為0. 038，對(duì)于體重?fù)p失的為0. 017，而對(duì)于ECOG體力狀態(tài)為0. 02 (PS 0對(duì)1或2)。 此研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)于患有癌癥的患者而言較低的ERCC1 mRNA表達(dá)水平與用基于鉑
的化療處理之后的生存率改善相關(guān)。 實(shí)施例8 :測(cè)定DPD的未修正的基因表達(dá)(UGE) 進(jìn)行了兩對(duì)平行反應(yīng)。"測(cè)試"反應(yīng)和"校準(zhǔn)"反應(yīng)。DPD擴(kuò)增反應(yīng)和13 -肌動(dòng)蛋白內(nèi)部控制擴(kuò)增反應(yīng)為測(cè)試反應(yīng)。對(duì)校準(zhǔn)物RNA模板進(jìn)行單獨(dú)的P-肌動(dòng)蛋白和DPD擴(kuò)增反應(yīng)，并稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan儀器將會(huì)得到四個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值從測(cè)試反應(yīng)中得到的CtDPD和Cte —肌動(dòng)蛋自和從校準(zhǔn)反應(yīng)中得到的CtDPD和Cte
-肌動(dòng)蛋白。 根據(jù)下面的方程測(cè)定兩種反應(yīng)的Ct值的差異
A Ct測(cè)試二 CtDPD_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
ACt校準(zhǔn)物二 CtDPD_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)以下方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。
2—ACt測(cè)試(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
2—AGt校準(zhǔn)物(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 為了得到來(lái)自T叫man儀器的DPD的未修正的基因表達(dá)，進(jìn)行下面的運(yùn)算
DPD的未修正的基因表達(dá)(UGE) = 2—"%則試/2—"t校準(zhǔn)物
用之前公開的值標(biāo)準(zhǔn)化UGE 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)DPD和特定校準(zhǔn)物RNA特異性的修正因子(KDPD)。可以使用任意內(nèi)部控制基因和任意精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA測(cè)定修正因子KDPD。優(yōu)選使用內(nèi)部控制基因P-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA，來(lái)自Applied Biosystems的Universal PE RNA ;Cat #4307281， lot #3617812014。 使用由Taqman制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前述部分描述的ACt方法的修改形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了實(shí)施該過(guò)程，使用前面所述的Taqman法針對(duì)DPD表達(dá)分析之前公開的6種不同測(cè)試組織的UGE。使用內(nèi)部控制基因P-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物RNA，即Universal PE RNA (來(lái)自Applied Biosystems的Cat #4307281， lot#3617812014)。 用Salonga等(在此全部通過(guò)提述并入)先前描述的各樣品L7、L91、L121、L150、L220和L164的相對(duì)DPD表達(dá)水平(PV)除以其對(duì)應(yīng)的來(lái)自Taqman的UGE以得到未平均的修正因子K。 K來(lái)平均二 PV/UGE 接下來(lái)，平均所有的K值以測(cè)定對(duì)DPD、 Universal PE RNA ;Cat#4307281， lot#3617812014的校準(zhǔn)物RNA和P -肌動(dòng)蛋白特異性的單一 KDPD修正因子。
因此，為了測(cè)定與之前公開的預(yù)-Taqman DPD表達(dá)的研究的規(guī)模相一致的未知組織樣品的修正的相對(duì)DPD表達(dá)，在假設(shè)使用相同的內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA的情況下，只需將從Taqman設(shè)備中得到的未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KDPD特異性修正因子。
41
修正的相對(duì)DPD表達(dá)=UGE X KDPD 可以使用任何精確的預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA測(cè)定KDPD?？梢詫⑵渌鼇?lái)源的精確預(yù)_定量的RNA相對(duì)于公開樣品如上述方法中所述進(jìn)行校準(zhǔn)，或者現(xiàn)在可以針對(duì)之前校準(zhǔn)的校準(zhǔn)物RNA進(jìn)行校準(zhǔn)，所述校準(zhǔn)物RNA例如如上所述的Universal PE RNA ;Cat#4307281， lot #3617812014。 實(shí)施例9 :FPE結(jié)腸直腸腫瘤樣品中的DPD表達(dá) 使用上述方法分析來(lái)自患有晚期結(jié)腸直腸癌的34個(gè)患者的34份腫瘤樣品。作為預(yù)測(cè)性多中心歐洲5-FU/CPTll交叉試驗(yàn)V239(prospectivemulticenter European 5-FU/CPT11 crossover trial V239)的一部分，用靜脈內(nèi)5-FU/LV聯(lián)合方案處理所有的患者。將所有患者用連續(xù)5天由歷時(shí)15分鐘的輸注提供的靜脈內(nèi)5-FU 425mg/m2，以及也通過(guò)輸注在連續(xù)5天內(nèi)提供的亞葉酸鈣20mg/m2進(jìn)行處理。將該治療方案提供作為一線或二線姑息治療。 9位患者(25. 5% )對(duì)5-FU/LV有應(yīng)答，將應(yīng)答定義為任意的應(yīng)答，包括完全應(yīng)答、部分應(yīng)答和最低限度應(yīng)答。將患有進(jìn)展性疾病或穩(wěn)定疾病的患者歸為無(wú)應(yīng)答者(25位患者，73. 5% )。如上所述，從顯微切割的FPE預(yù)處理腫瘤樣品分離總mRNA，并使用定量PCR測(cè)量DPD/ P -肌動(dòng)蛋白的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。 應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答患者組的平均修正的DPD : 13 -肌動(dòng)蛋白水平分別為O. 87X 10—3和2. 04X10—3。將比較兩個(gè)獨(dú)立樣品組內(nèi)值的等級(jí)的曼_惠特尼U檢驗(yàn)用于比較應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組中修正的相對(duì)DPD表達(dá)水平。應(yīng)答者組中的相0對(duì)DPD水平明顯著低于無(wú)應(yīng)答者組(P = 0. 02)。這些患者中DPD mRNA表達(dá)與對(duì)5-FU/LV的應(yīng)答之間的相關(guān)性示于圖16中。這些數(shù)據(jù)顯示DPD表達(dá)為對(duì)基于5-FU的化療的應(yīng)答的預(yù)后因素。
實(shí)施例10 :測(cè)定TS的未修正的基因表達(dá)(UGE) 進(jìn)行了兩對(duì)平行反應(yīng)。"測(cè)試"反應(yīng)和"校準(zhǔn)"反應(yīng)。參見(jiàn)圖24。 TS擴(kuò)增反應(yīng)和P-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部控制擴(kuò)增反應(yīng)為測(cè)試反應(yīng)。對(duì)校準(zhǔn)物RNA模板進(jìn)行單獨(dú)的TS和P-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)，并稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan,⑧'儀器將會(huì)得到四個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值從測(cè)試反應(yīng)中得到的CtTS和Cte —肌動(dòng)蛋白和從校準(zhǔn)反應(yīng)中得到的CtTS和Cte —肌動(dòng)蛋白。根據(jù)下面的方程測(cè)定兩種反應(yīng)的Ct值的差異 A Ct測(cè)定二 CtTS_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
ACt校準(zhǔn)物二 CtTS_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)以下方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。[O302] 2—ACt測(cè)試(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))[O303] 2—"、準(zhǔn)物(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 然后，為了得到來(lái)自TaqMan. .儀器的TS的未修正的基因表達(dá)，進(jìn)行下面的運(yùn)算TS的未修正的基因表達(dá)(UGE) = 2—Act測(cè)試/2—Act校準(zhǔn)物
用已知的相對(duì)TS表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)TS和特定校準(zhǔn)物RNA特異性的修正因子(KTS)?？梢葬槍?duì)任意內(nèi)部控制基因和任意精確預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA測(cè)定修正因子KTS。優(yōu)選使用內(nèi)部控制基因P _肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA，即Universal PE RNA(來(lái)自A卯liedBiosystems的Cat #4307281， lot#3617812014)。設(shè)定這些反應(yīng)物的修正因子KTS等于12. 6X10—3。 使用由Taqman制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前述部分描述的ACt方法的修改形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了實(shí)施該過(guò)程，使用前面所述的T叫man⑧.法針對(duì)TS表達(dá)分析之前公開的6種不同測(cè)試組織的UGE。這些組織樣品記載在Salonga，等，Clinical Cancer Research, 6 :1322 1327， 2000中，在此將其全部通過(guò)提述并入。使用內(nèi)部控制基因P-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物RNA，即Universal PE RNA(來(lái)自Applied Biosystems的Cat#4307281， lot#3617812014)。將之前公開的L7、 L91、 L121、 L150、 L220、 L164各樣品的相對(duì)TS表達(dá)水平除以其相應(yīng)的來(lái)自TaqMam⑧的UGE得到未平均的修正因子K。 Salonga，等，Clinical CancerResearch, 6 :1322 1327， 2000，在此將其全部通過(guò)提述并入。
K未平均二已知值/UGE 接下來(lái)，平均所有的K值以測(cè)定對(duì)TS、Applied Biosystems Universal PERNA(Cat#4307281、 lot #3617812014)的校準(zhǔn)物RNA和P _肌動(dòng)蛋白特異性的單一 KEKra修正因子。
因此，為了測(cè)定與預(yù)-T叫man . TS表達(dá)研究的規(guī)模相一致的未知組織樣品的修正的相對(duì)TS表達(dá)，在假設(shè)使用相同的內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA的情況下，只需將從Taqman .設(shè)備中得到的未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KTS特異性修正因子。
修正的相對(duì)TS表達(dá)=UGEXKTS 可以使用任意的精確預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA或內(nèi)部控制基因測(cè)定KTS?？梢詫⑵?br> 它來(lái)源的精確預(yù)_定量的RNA相對(duì)于具有已知的相對(duì)ERCC1表達(dá)水平的樣品如上述方法中
所述進(jìn)行校準(zhǔn)，或者現(xiàn)在可以針對(duì)之前校準(zhǔn)的校準(zhǔn)物RNA，例如上述Universal PE RNA(來(lái)
自Applied Biosystems的Cat#4307281， lot #3617812014)，進(jìn)行校準(zhǔn)。 例如，如果測(cè)定不同的內(nèi)部控制基因和/或不同的校準(zhǔn)物RNA的后續(xù)KTS，必須將內(nèi)
部控制基因和校準(zhǔn)物RNA 二者針對(duì)組織樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)于該組織樣品，相對(duì)于特定的內(nèi)
部控制基因的TS表達(dá)水平已經(jīng)被測(cè)定或公開?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)-T叫Man. .
定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。這些樣品的已知的表達(dá)水平將除以其相應(yīng)的UGE水平以
測(cè)定該樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)平均K值以測(cè)定對(duì)不同的內(nèi)部控制基因和/或校
準(zhǔn)物RNA特異性的新K『 實(shí)施例11 :患者的選擇和化療方案 所有的患者都登記在1998-2000年的南加州大學(xué)醫(yī)療中心(UniversityofSouthern California Medical Center) 的 慈 善 協(xié) 議 (compassionateprotocol) 3C-98-3中，這些患者接受了如下的奧沙利鉑/5-FU聯(lián)合治療方案130mg/m2的奧沙利鉑加上連續(xù)輸注的5-FU。所有的病人在此之前用5-FU的治療均告失敗，且60%(30/50)用伊立替康(CPT-11)進(jìn)行額外的二線治療失敗。在登入?yún)f(xié)議(protocol entry)時(shí)所有的患者均顯示出IV期結(jié)腸直腸癌的活動(dòng)性疾病。
臨床評(píng)估和應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn) 在化療期間，記錄關(guān)于體力狀態(tài)、重量、腹痛、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清肌酸酐和血液尿素氮水平的每周評(píng)估。使用計(jì)算機(jī)層析X射線照相術(shù)(CT)測(cè)量腫瘤的負(fù)荷(Tumorburden)。在登入?yún)f(xié)議時(shí)要求在二維上可以測(cè)量的腫瘤量。在至少6周腫瘤負(fù)荷減少了 50%
43或以上的患者歸為對(duì)治療的應(yīng)答者。無(wú)應(yīng)答者包括患有穩(wěn)定的疾病或具有癌癥進(jìn)展的患者。生存率計(jì)算如下從用5-FU/奧沙利鉑的化療開始至任何原因?qū)е滤劳鰰r(shí)的天數(shù)。將在最后的隨訪評(píng)估時(shí)仍然存活的患者在當(dāng)時(shí)刪失。
統(tǒng)計(jì)分析 T叫Man⑧分析得到表示為兩種絕對(duì)測(cè)量值之間的比率的水平(目的基因內(nèi)部參考基因(internal reference gene))。使用曼_惠特尼檢驗(yàn)和克魯斯卡爾_瓦利斯二氏檢驗(yàn)評(píng)估TS和ERCC1表達(dá)(作為連續(xù)變量)與患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)之間的相關(guān)性。分別見(jiàn)Zar， Biostatistical Analysis. Prentice_Hall， IncEnglewood Cliffs, N.J. (1974)，109-114和139-142頁(yè)。修改適用Miller和Sigmund (Biometrics 38:1011-1016,1982)和Halpern(Biometrics 38 :1017-1023,1982)的最大卡方法測(cè)定最佳地將患者二分為低和高TS和ERCC1表達(dá)亞組的截止閾值水平。使用Pearson卡方檢驗(yàn)評(píng)定二分分子標(biāo)記與對(duì)化療的應(yīng)答之間的相關(guān)性，Zar， Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, IncEnglewoodCliffs, N.J. (1974)， pp. 59-68。使用風(fēng)險(xiǎn)比(Hazard ratio)計(jì)算死亡的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。Schulman， Infection Control & Hospital Epidemiology, 18 :65-73， 1997。這些計(jì)算基于Pike估計(jì)(Pike estimate)，其中利用在時(shí)序檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)中計(jì)算出的事件的觀察值和期望值(Pike，J R Stat Soc Series A 135 :201-203,1972)。為了測(cè)定基于最大卡方法分析將會(huì)被解釋為關(guān)聯(lián)強(qiáng)度的量度的p值，使用1000次類自舉模擬估算在假設(shè)沒(méi)有關(guān)聯(lián)的情況下的最大卡方統(tǒng)計(jì)分布。(Halpern， Biometrics 38:1017 1023,1982)。顯著水平設(shè)定為p< 0. 05。 可用于應(yīng)答和生存率評(píng)估的人口統(tǒng)計(jì)和患者 在本研究中一共評(píng)估了年齡中值為59(最小值34，最大值83)的50位患者，其由14位(28% )女性和36位(72% )男性組成。該組的種族背景包括39位高加索人(Caucasians) 、6位西班牙人(Hispanics) 、3位亞洲人(Asians)和2位非裔美國(guó)人(African-Americans)。所有的50位患者可以進(jìn)行TS表達(dá)和ERCC1表達(dá)水平與生存率之間相關(guān)性的評(píng)估。按照前面所述的標(biāo)準(zhǔn)，45位(90%)可以進(jìn)行檢驗(yàn)該分子參數(shù)與應(yīng)答之間的相關(guān)性的評(píng)估。 TS表達(dá)水平和ERCC1表達(dá)水平 從顯微切割的FPE預(yù)處理腫瘤樣品分離了總mRNA，并使用定量RT-PCR測(cè)量ERCC1 :P-肌動(dòng)蛋白和/或TS :P-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。在本發(fā)明中和在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)第09/469， 338號(hào)(于1999年12月20日提交，在此全部通過(guò)提述并入)中描述了從這些樣品分離mRNA的方法。如先前所述，使用基于逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT/PCR)的測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定ERCC1和P-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平。如上所述測(cè)定修正的相對(duì)ERCC1和/或TS表達(dá)。 在所有分析的50個(gè)樣品中可檢測(cè)到TS基因表達(dá)。相對(duì)于管家基因P-肌動(dòng)蛋白，修正的TS表達(dá)的中位值為3. 4X10—3(最小值0. 18X10—3 ;最大值11.5X10—3)。在47個(gè)(94% )分析的樣品中可檢測(cè)到修正的ERCC1基因表達(dá)。該修正的ERCC1表達(dá)的中位值為2. 53X10—3 (最小值:0. 00 ;最大值14. 61X10-3)。當(dāng)按照性別、年齡和種族血統(tǒng)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在修正的TS和ERCC1 mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著的差異。
與TS表達(dá)相關(guān)的生存率
在本研究中，隨訪期中位值為10. 5個(gè)月(95% C.I. :1.8,21.2)的50位患者，生存率中位值為8.4個(gè)月(95% C.I. :6.4,12.3)。使用7. 5X 10—3的TS閾值，43位(86% )患者具有低的修正的TS表達(dá)水平，7位(14%)患者具有高的修正的TS表達(dá)水平。使用時(shí)序檢驗(yàn)評(píng)估修正的TS基因表達(dá)與生存率之間的相關(guān)性。圖17呈現(xiàn)了各自的生存率曲線，并顯示在低的修正的TS表達(dá)者組中生存率中位值為10.2個(gè)月(95% C. I. :7.4,15. l)，且在高的修正的TS表達(dá)組中生存率中位值為1.5個(gè)月(95% C. I. :1. 1，2. 1) (P<0.001 ;時(shí)序檢驗(yàn))。與高表達(dá)組的O.OO相比，修正的TS表達(dá)大于等于(.ltoreq.)7.5X10—3的患者6個(gè)月的生存機(jī)率為0. 77。在單變量分析中，與TS水平大于等于7. 5X 10—3的患者相比，修正的TS水平〉7. 5X10—3的患者死亡的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)增加了8. 4倍(95% CI :2.63,27. 13) ， (p
< 0. 001，圖17)。 與ERCC1表達(dá)相關(guān)的生存率 當(dāng)使用4. 9X10—M乍為閾值，40位(80%)具有低的修正的ERCC1表達(dá)而10位(20% )具有高的修正的ERCC1表達(dá)。圖22顯示了估計(jì)的生存機(jī)率對(duì)修正的ERCC1表達(dá)水平的卡普蘭-邁耶曲線，并顯示低表達(dá)者組的生存率中位值為10.2個(gè)月(95% C.I. :7.8，15. l)，高表達(dá)者組的為1.9個(gè)月(95% C. I. :1. 1，4.9) (P < 0.001 ;時(shí)序檢驗(yàn))。修正的ERCC1表達(dá)> 4. 9X10—3的患者的6個(gè)月生存機(jī)率為0. 16，與其相比，修正的ERCC1表達(dá)大于等于4. 9X 10—3的患者的6個(gè)月生存機(jī)率為0. 76。在單變量分析中，與修正的ERCC1水平> 4. 9X 10—3的患者相比，修正的ERCC1水平> 4. 9X 10—3的患者死亡的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)增加了4. 8倍(95% CI :2. 09， 15. 88) ， (p < 0. 001 ;圖20)。
與ERCC1和TS聯(lián)合表達(dá)相關(guān)的生存率 在36位患者(72% )中檢測(cè)到低的修正的TS和ERCC1表達(dá)水平，14位(28% )患者具有高的修正的TS和/或ERCC1表達(dá)水平。這兩種基因的表達(dá)水平都低的患者具有顯著更高的生存率。低的修正的TS和ERCC1表達(dá)者的生存率中位值為11. l個(gè)月(95%C. I. :8. 4,17.5)，而高的修正的TS和/或ERCC1表達(dá)者的為1.9個(gè)月(95% C. I. :1.1，4.9) (P < 0.001，時(shí)序檢驗(yàn)；圖19)。至少一種基因(TS或ERCC1)的修正的表達(dá)水平高的患者的6個(gè)月的生存機(jī)率為0. IO，與其相比，兩種基因的修正的表達(dá)水平都低的患者的6個(gè)月的生存機(jī)率為0. 85。與腫瘤中兩種基因都顯示低表達(dá)水平的患者相比，至少一種基因(TS或ERCC1)的修正的表達(dá)增加的患者的死亡相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)為7. 12(95% CI :2. 60， 19. 52) (P
< 0. 001 ;圖20)。如由分層分析(圖24)所顯示，TS和ERCClmRNA表達(dá)是相互獨(dú)立的。
應(yīng)答與TS和ERCC1基因表達(dá)水平的相關(guān)性 45位可測(cè)量的患者的修正的TS表達(dá)水平的中位值為3. 4X 10—3 (最小值0. 18X10—3 ;最大值11. 50X10—3)，這與整個(gè)50位患者群組(patient-cohort)是一致的。當(dāng)通過(guò)將腫瘤分為低-和高TS表達(dá)者對(duì)應(yīng)答進(jìn)行分析時(shí)，四分之三(75%)的部分應(yīng)答者，27位疾病穩(wěn)定的患者中的26位(96%)，以及14位患有進(jìn)展性疾病的患者中的9位(64%)具有低的修正TS表達(dá)(P = 0. 02 ;Fisher氏精確檢驗(yàn))。 45位可測(cè)量的患者的修正的ERCC1表達(dá)水平的中位值為2. 7X10—3(最小值0. 00 :最大值14.61X10—3)，并且與整個(gè)50位患者群組沒(méi)有顯著區(qū)別。然而，ERCC1表達(dá)水平與對(duì)化療的應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性不顯著(P = 0. 29， Fisher氏精確檢驗(yàn))。
實(shí)施例12 :測(cè)定EGFR的未修正的基因表達(dá)(UGE)
進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)。"測(cè)試"反應(yīng)和"校準(zhǔn)"反應(yīng)。圖29。 EGFR擴(kuò)增反應(yīng)和P -肌動(dòng)蛋白內(nèi)部控制擴(kuò)增反應(yīng)為測(cè)試反應(yīng)。對(duì)校準(zhǔn)物RNA模板進(jìn)行單獨(dú)的EGFR和P -肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)，并稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan .⑧儀器將會(huì)得到四個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值從測(cè)試反應(yīng)中得到的CtEGFK和Cte —肌動(dòng)蛋白和從校準(zhǔn)反應(yīng)中得到的CtEGFK和Cte —肌動(dòng)蛋白。根據(jù)下面的方程測(cè)定兩種反應(yīng)的Ct值的差異 A Ct測(cè)試二 CtEGFK-Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
A Ct校準(zhǔn)物二 CtEGFK-Cte —肌鵬白(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)下面的方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。
2—ACt測(cè)試(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
2—"、準(zhǔn)物(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 然后為了從TaqMan⑧儀器獲得EGFR的未修正的基因表達(dá)，進(jìn)行如下計(jì)算
EGFR的未修正的基因表達(dá)(UGE) = 2—"%則試/2—"t校準(zhǔn)物
使用已知的相對(duì)EGFR表達(dá)水平使UGE標(biāo)準(zhǔn)化 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)EGFR和特定校準(zhǔn)物RNA特異性的修正因子(KEeFK)。也可以測(cè)定任意的內(nèi)部控制基因和任意的精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA的修正因子IW『優(yōu)選使用內(nèi)部控制基因P -肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA，即人肝臟總RNA(Stratagene，Cat #735017)。假定這些反應(yīng)物的修正因子KECFK等于1. 54。 使用由TaqMan⑧制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在上文描述的ACt法的修正形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了實(shí)施該過(guò)程，使用前面所述的TaqMan 方法針對(duì)EGFR表達(dá)分析了6種不同測(cè)試組織的UGE。使用內(nèi)部控制基因P-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物RNA，人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)。將AG221、 AG222、 AG252、成人肺、PC3、 AdCol各樣品的已知的相對(duì)EGFR表達(dá)水平除以其相應(yīng)的來(lái)自TaqMan⑧的UGE得到未平均的修正因子K。
K未平均二已知值/UGE 接著，平均所有的K值以測(cè)定對(duì)EGFR、來(lái)自Stratgene人肝臟總RNA(Stratagene，Cat #735017)的校準(zhǔn)物RNA和P _肌動(dòng)蛋白特異性的單一 KEeFK修正因子。
因此，為了測(cè)定與預(yù)-T叫man . . EGFR表達(dá)的研究的規(guī)模相一致的未知組織樣品中修正的相對(duì)EGFR表達(dá)，在假設(shè)使用相同的內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA的情況下，只需將從T叫man⑧.設(shè)備中得到的未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KEeFK特異性修正因子。[O352] 修正的相對(duì)EGFR表達(dá)=UGE X KEGFK 可以使用任意的精確預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA或內(nèi)部控制基因測(cè)定KEeFK?？梢詫⑵渌鼇?lái)源的預(yù)_定量的RNA相對(duì)于相對(duì)EGFR表達(dá)水平已知的樣品如上述方法中所述進(jìn)行校準(zhǔn)，或者現(xiàn)在可以針對(duì)之前校準(zhǔn)的校準(zhǔn)物RNA，例如上述的人肝臟總RNA(Stratagene， Cat#735017)進(jìn)行校準(zhǔn)。 例如，如果測(cè)定不同的內(nèi)部控制基因和/或不同的校準(zhǔn)物RNA的后續(xù)KEeFK，必須將內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA二者相對(duì)于組織樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)于該組織樣品，相對(duì)于特定的內(nèi)部控制基因的EGFR表達(dá)水平已經(jīng)被測(cè)定。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)-TaqMan. 定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。這些樣品的已知的表達(dá)水平將除以其相應(yīng)的UGE水平以測(cè)定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，平均K值以測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部控制基因和/或校準(zhǔn)
46物RNA特異性的新K^『 實(shí)施例13 :測(cè)定HER2-neu的未修正的基因表達(dá)(UGE) 進(jìn)行了兩對(duì)平行反應(yīng)。"測(cè)試"反應(yīng)和"校準(zhǔn)"反應(yīng)。圖26。 HER2-neu擴(kuò)增反應(yīng)和P -肌動(dòng)蛋白內(nèi)部控制擴(kuò)增反應(yīng)為測(cè)試反應(yīng)。對(duì)校準(zhǔn)物RNA模板進(jìn)行單獨(dú)的HER2-neu和P-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)，并稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。T叫Man⑩儀器將會(huì)得到四個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)
值從測(cè)試反應(yīng)中得到的Ct臓—咖和Cte —肌動(dòng)蛋白和從校準(zhǔn)反應(yīng)中得到的Ct臓—鵬和Cte—肌動(dòng)蛋
自。根據(jù)下面的方程測(cè)定兩種反應(yīng)的ct值的差異 A Ct測(cè)試二 CtHer2—neu_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
A Ct校準(zhǔn)物CtHer2—neu_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)下面的方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。
A Ct測(cè)試二 CtHer2—neu_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
A Ct校準(zhǔn)物CtHer2—neu_Cte —肌動(dòng)蛋白(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 接下來(lái)的步驟包括根據(jù)下面的方程進(jìn)行以2為底數(shù)的_ ACt次方的冪運(yùn)算。[O363] 2—ACt測(cè)試(來(lái)自"測(cè)試"反應(yīng))
2—"、準(zhǔn)物(來(lái)自"校準(zhǔn)"反應(yīng)) 然后為了從T叫Man⑧儀器獲得HER2-neu的未修正的基因表達(dá)，進(jìn)行如下計(jì)算
Herf-neu的未修正的基因表達(dá)(UGE) = 2—ACtTO/2—ACts lft
使用已知的相對(duì)HER2-neu表達(dá)水平使UGE標(biāo)準(zhǔn)化 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)HER2-neu和特定校準(zhǔn)物RNA特異性的修正因子(KHEK2—MU)。也可以測(cè)定任意的內(nèi)部控制基因和任意的精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA的修正因子KHEK2-MU。優(yōu)選使用內(nèi)部控制基因和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)物RNA，即人肝臟總RNA(Stratagene，Cat #735017)。使用P -肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)-定量的校準(zhǔn)物RNA，人肝臟總RNA(Stratagene，Cat #735017)時(shí)，修正因子KHEK2—neu等于12. 6 X 10—3。 使用由TaqMan⑧制造商Applied Biosystems在User Bulletin #2中描述并在前面部分描述的ACt法的修改形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了實(shí)施該過(guò)程，使用前面所述的TaqMan⑧方法針對(duì)HER2-neu表達(dá)分析了 6種不同的FPE測(cè)試組織的UGE。使用內(nèi)部控制基因P _肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)物RNA，即人肝臟總RNA(Stratagene， Cat. #735017)。將AG221、 AG222、 AG252、成人肺、PC3、 AdCol各樣品的已知的相對(duì)HER2-neu表達(dá)水平除以其相應(yīng)的來(lái)自T叫Man逸的UGE得到未平均的修正因子K。
K未平均二已知值/UGE 接下來(lái)，平均所有的K值以測(cè)定對(duì)HER2-neu 、人肝臟總RNA (Stratagene ， Cat#735017)校準(zhǔn)物和e-肌動(dòng)蛋白特異性的單一K，K修正因子。 因此，為了測(cè)定與預(yù)-T叫man逾.HER2-neu表達(dá)研究的規(guī)模相一致的未知組織樣品的修正的相對(duì)HER2-neu表達(dá)，在假設(shè)使用相同的內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA的情況下，只需將從T叫man.⑧.設(shè)備得到的未修正的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KHEK2—neu特異性修正因子。 修正的相對(duì)EGFR表達(dá)=UGE X KEGFK 可以使用任意的精確預(yù)_定量的校準(zhǔn)物RNA或內(nèi)部控制基因測(cè)定KHEK2—nw?？梢詫⑵渌鼇?lái)源的精確地預(yù)_定量的RNA相對(duì)于相對(duì)EGFR表達(dá)水平已知的樣品進(jìn)行校準(zhǔn)，或者現(xiàn)在可以針對(duì)之前校準(zhǔn)的校準(zhǔn)物RNA，例如上述的人肝臟總RNA(Stratagene， Cat #735017) 進(jìn)行校準(zhǔn)。 例如，如果測(cè)定不同的內(nèi)部控制基因和/或不同的校準(zhǔn)物RNA的后續(xù)KHEK2—nw，必 須將內(nèi)部控制基因和校準(zhǔn)物RNA 二者相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)，對(duì)于該組織樣品，相對(duì)于特定 內(nèi)部控制基因的HER2-neu表達(dá)水平已經(jīng)被測(cè)定或公開?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)-T叫Man⑩定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行這種測(cè)定。這些樣品的已知的表達(dá)水平將除以其相應(yīng) 的UGE水平以測(cè)定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品的數(shù)目，平均K值以測(cè)定對(duì)不同的內(nèi)部 控制基因和/或校準(zhǔn)物RNA為特異性的新KHEK2—MU。
實(shí)施例14 :測(cè)試不同濃度的EDTA和不同的溫育溫度 在提取溶液中使用四種不同濃度的EDTA(O. lrnM、0. 6mM、3. 6mM和20mM)并使用四 種不同的溫育溫度(44、50、56和62°C )來(lái)實(shí)施實(shí)施例1所述的流程。用兩種不同的FFPE 樣品評(píng)估這些變量。使用四種不同的引物組-100、300、400和1000bp引物(指的是所述引 物距離RNA的3'(多聚A)端100、300、400或l，OOObp)。施用寡聚dT逆轉(zhuǎn)錄酶。在不同 的溫度下，提取過(guò)程使用Tris/EDTA/PK緩沖液(如上所述)16小時(shí)。進(jìn)行一次苯酚/氯仿 /異戊醇(PCI)提取以去除DNA污染。將分離的RNA再懸浮在50 y 1 Tris中。
數(shù)據(jù)顯示盡管所有的溫育溫度和不同的EDTA濃度都起作用，但是得到長(zhǎng)片段RNA 的優(yōu)選的參數(shù)為使用3. 6mm EDTA和50-56。C范圍的溫度(參見(jiàn)最低Cts)。參見(jiàn)下面的表 2。表2 EDTA濃度/溫度 Ml lOObp 44oC 50oC56oC62oC Ml
50oC56oC 62oC 0. ImM23.1101 22.196
26. 4604 24. 9523 25. 0977 25. 2382
0.6mM23.3616 22.3673
26.5112 24.8636 25.1074 24.9243
EDTA3. 6mM22.7179 22.2331 25.8619 24.9501 24.5143 24.6931
20mM 23. 095222. 1579
26. 7892 25. 3186 25. 0386 25. 3433
Ml 400bp 44oC50oC 56oC 50oC56oC 62oC 0. ImM28. 065427. 0076
29. 9852 27. 9539 27. 8691 27. 3389
0.6mM28.1851 26.8109
30.3583 27.8463 28.1046 27.3479
EDTA3. 6mM27.3316 26.4201 29.6949 28.4397 27.9215 27.5779
20mM 30.2612 28.8745 28.6416 28.5171
22.3712 22.9834
22.5973 22.6378
300bp 44oC
0. ImM
0. 6mM
21.878321.9587EDTA3. 6mM
21.8366 21.9461
62oC
Ml
27.3271 27.6107
27.0736 26.9763
20mM
lOOObp 44oC
0. ImM
0. 6mM
26.2641 26.8206EDTA3. 6mM
20mM
48
50oC
23. 9609
23. 9403
24. 5158
24. 3286
50oC
30.0974
29.7021
28.7475
27. 7993

50oC
56oC
62oC
M2
300bp 44oC
21.4504 21.6834
21.1044 21.47
0. ImM
0. 6mM
20.997220.7812EDTA3. 6mM
21.0027 21.2553
62oC
M2
25.9314 26.5978
25. 638626. 0809
20mM
lOOObp 44oC
0. ImM
0. 6mM
M2 lOObp 44oC 56oC 62oC
0. ImM21.4018 21.4633 23.8571 23.9106 24.3064
0. 6mM21.4292 21.0563 23. 4637 23. 7906 24. 2977 EDTA3. 6mM21.6286 20.9075 23. 5704 23. 7666 23. 7389
20mM 21.027 21.0579 23. 9254 24. 2174 24. 5737 M2 400bp 44oC50oC 56oC 56oC 62oC
0. ImM26. 526825. 8475 27. 9908 27. 5454 27. 673
0.6mM25.854 25.1882 27. 7281 27. 5899 27. 2548 EDTA3. 6mM26. 193624. 9937 27. 6364 27. 2434 26. 9735
20mM25. 7346 25. 183 28.078 27.9715 實(shí)施例15 :使用檸檬酸鈉或EGTA代替EDTA作為螯合劑
在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了三種不同的螯合劑EDTA、 EGTA和檸檬酸鈉。測(cè)試與3. 6mM EDTA —起的0. 1、0. 6、3. 6和20mM的EGTA和檸檬酸鈉。在50。C下溫育樣品16小時(shí)。使用 單次苯酚/氯仿步驟去除污染DNA。將分離的RNA再懸浮在50 ill Tris中。結(jié)果顯示0. 6 和3. 6mM的檸檬酸鈉為良好的螯合劑，其甚至在高達(dá)20mM的濃度下仍然起作用。參見(jiàn)下面 的表3.
表3
lOObp
Ml 0. 6 3. 6 EGTA 26.09962 26.25091
25.165225.3845EDTA3. 6mM
20mM
28.582
300bp
0. 1 0. 6
20
22.05584 21.91483 25. 07969
3. 6
20
Ml
22.14477 21.32523 EGTA
0. 1
26.4581 擰檬酸鈉 21. 2692520. 75951 22.69152 22.93418 23.24895
EDTA 23. 95666 M2 0. 1 0. 6
0.6 3.6 20EGTA 20.95042 21.02856
20.68721 20.97618 擰檬酸鈉 24. 72144
3. 6
20.97683
20
M2
EDTA
0. 1
21.50124 20.75807 EGTA
25. 16278
4925.05163 25.61697 24.87095擰檬酸鈉 20.43178 20.03613 20.35514 20.25602 擰檬酸鈉 24.38187
22. 76978 22. 86453 22. 9773 EDTA 20.01918 EDTA
23. 09989 400bp lOOObp Ml 0.1 0.6 3.6 20 Ml 0.1
0. 6 3. 620EGTA 28.26457 27.55415 28.0468 26.84575 EGTA 29.19289
29.04155 29.78311 28.69869 擰檬酸鈉 26.77297 25.08387 25.27766 25.49137 擰檬酸鈉 27.47323 25. 47567 25. 64558 25. 9896EDTA 26.43221 EDTA
26.5681 M2 0.1 0.6 3.6 20 M2 0.1
0.6 3.6 20EGTA 27.03514 26.65384 27.32611 26.27913 EGTA 28.37434
28.50888 29.09281 27.69427 擰檬酸鈉 25.89327 24.67949 24.87163 25.08208 擰檬酸鈉 27. 28292 25. 09847 25. 18052 25. 41669EDTA 25.00621 EDTA
25. 68557 實(shí)施例16 :PK濃度和溫育時(shí)間 除了提取溶液包含O. 5X，1X，2X和4XPK濃度的Tris/EDTA/PK緩沖液之外，如 前所述進(jìn)行RNA提取。IXPK濃度二 500ii g/ml。評(píng)估3、6、 12、 16和20小時(shí)的溫育時(shí)間， 并進(jìn)行單次苯酚/氯仿/異戊醇(PCI)提取。將RNA再懸浮在50 1 Tris中。施用寡聚 dT逆轉(zhuǎn)錄酶。結(jié)果顯示在5(TC下優(yōu)選的溫育時(shí)間為16小時(shí)。不同濃度的PK都起作用，并 且似乎1X與更高的濃度起的作用一樣好。參見(jiàn)表4。表4樣品M3100bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 528.3186126.5824125. 4608224. 7409124. 36967128.7351226.2854724. 9791624. 4425125. 0303228.0361425. 9790225. 0481724. 5185224. 82751429.5396926.8696225. 8252824. 6490626.06563300bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 531. 9150430.7928529.3440228.8628528.53668132. 0250230.6295529.2922428.6176428.96055
50
230.0177530.2335428.3763828.2050328.61338433. 1973331. 1370129.421828.0566329.63655400bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 532. 8742432. 4113730.8962130.7013730.3052133. 2802632. 2042331. 0027828.6186630.58809232. 4580631. 6176830.2025129.8741730.30267434. 4282632. 3559531. 0463929.1567131. 086821000bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 533. 1169232. 7605230.5848231. 2806930.60988133. 1039732. 0809230.7432631. 2296230.76994231. 6377431. 4873430.3736630.0182430.33966434. 1137232. 502230.4321529.499731. 24582樣CIM4100bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 527. 5061826.3320524. 9016224. 1118824. 08716127. 468226.73324. 7045124. 2087924. 15328227. 2304226.3945924. 5105124. 3499724. 89759427. 8752427. 0625225. 1528524. 3465324. 96841300bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 531. 9702530.6785428.6679427. 4628627. 86116131. 5124530.9185928.2158127. 5288127. 74868231. 2955230.2491428.0728227. 5416227. 36115431. 5342730.6024728.6705527. 5948427. 97908400bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 533. 4384632. 3463130.3380829.7459130.02667133. 1072232. 6296530.3840829.8663929.84286232. 7248432. 1775830.177629.8603529.58862432. 8146632. 1559730.6418929.7417230.085391000bp3hrs6hrs12hrs16hrs20hrs0. 533. 6978532. 72830.4411130.2449630.44284133. 3816632. 9997430.435830.2077630.32836233. 3378632. 3902330.480230.1699730.18674
433.47508 32. 55459 30. 54346 30. 12733 29.94782 實(shí)施例17 :從FFPE胰腺導(dǎo)管腺癌(PDA)組織分離mRNA和gDNA 使用本發(fā)明的方法，從FFPE胰腺導(dǎo)管癌(PDA)組織樣品分離RNA。從單顯微切割
的樣本獲得全局mRNA表達(dá)和gDNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)，并與來(lái)自在相似平臺(tái)上分開處理的組織的
數(shù)據(jù)相比較。發(fā)現(xiàn)mRNA和gDNA數(shù)據(jù)可以與高質(zhì)量的冷凍的、非顯微切割的腫瘤組織相當(dāng)，
如重疊探針(overla卯ingprobes)(對(duì)于gDNA)和有力的拷貝數(shù)/mRNA表達(dá)的一致性所證明的。 很大程度上由于難以從這種腹膜后器官獲得組織且獲得的核酸質(zhì)量低劣，關(guān)于胰 腺導(dǎo)管腺癌(PDA)原發(fā)性腫瘤的表達(dá)和拷貝數(shù)模式知之甚少。另外，嚴(yán)重的結(jié)締組織增生 導(dǎo)致間質(zhì)的污染(Chu， G. C.，等，Stromal biology ofpancreatic cancer. J Cell Biochem， 2007.101(4) :p. 887-907)，而器官的極端的自消化性質(zhì)(autodigestive properties)經(jīng) 常導(dǎo)致核酸質(zhì)量的降低。 使用手工或激光切割技術(shù)進(jìn)行腫瘤組織的顯微切割。顯微切割后，使用Response Genetics(Los Angeles, CA)中專有的提取程序分離gDNA。使用本發(fā)明的方法分離總 RNA。如前所述進(jìn)行兩輪RNA擴(kuò)增和cDNA制備。(Lord, R. V.，等，Telomerase reverse transcriptase expression is increased early in theBarrett ' s met即lasia， dysplasia, adenocarcinoma sequence. J Gastrointest Surg，2000. 4(2) :p.135-42)。 合成cRNA并雜交到Affymetrix Hul33Plus2芯片上。如(Wang， Y.，等，Analysis of molecular inversion probe performance for allelecopy number determination. Genome Biol ， 2007. 8 (11) :p. R246)所述對(duì)共_提取的gDNA(70ng)在分子倒置探針 (molecularinversion probe) (PIM)平臺(tái)上進(jìn)行基因組范圍的等位基因特異性拷貝數(shù)分 析。 發(fā)現(xiàn)基因組DNA和mRNA能夠從PDA中的單顯微切割FFPE樣品中成功且連貫地 共-分離并且分析在基因組范圍對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和等位基因特異性拷貝數(shù)分析。FFPE MIP數(shù) 據(jù)比非-顯微切割、冷凍腫瘤組織樣本有利?；虮磉_(dá)反映了單獨(dú)提取的樣品中的拷貝數(shù)。 這種核酸(mRNA和gDNA)的顯微切割和共-提取的方法使得歸檔的FFPE組織在多個(gè)平臺(tái) 上可用于基因組范圍的分析，并開始使存在于可用于基因組分析的大量病理學(xué)檔案中的有 價(jià)值患者樣品中的數(shù)據(jù)最大化，其尤其與很少有新鮮材料可用的遺傳疾病研究和臨床試驗(yàn) 相關(guān)。
實(shí)施例18 :上述的引物的序列 ERCC1-504F SEQ ID N0:1 gggaatttgg cgacgtaatt c
ERCC1-574R SEQ ID NO :2 gcggaggctg aggaacag
GST-F SEQ ID NO :3 cctgtaccag tccaatacca tcct
GST-R SEQ ID NO :4 tcctgctggt ccttcccata
DPD3A SEQ ID NO :5 aggacgcaag gagggtttg
DPD3a-13R SEQ ID NO :6 gtccgccgag tccttactga
DPD3b_651F SEQ ID NO :7 gaagcctatt ctgcaaagat tgc
DPD3b_736R SEQ ID NO :8 gagtacccca atcgagccaa a
TS-763F SEQ ID NO :9 ggcctcggtg tgccttt
52
TS-825R SEQ ID NO :10 gatgtgcgca atcatgtacg t EGFR-1753F SEQ ID NO :11 tgcgtctctt gccggaat EGFR-1823R SEQ ID NO :12 ggctcaccct ccagaagctt Her2_neu 2671F SEQ ID NO :13 ctgaactggt gtatgcagat tgc Her2-neu 2699R SEQ ID NO :14 ttccgagcggccaagtc 引用的所有參考文獻(xiàn)在此通過(guò)提述整體并入。整篇說(shuō)明書，參考的用參考序號(hào)表 示。這些參考文獻(xiàn)如下所列舉。
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權(quán)利要求
從固定組織樣品分離長(zhǎng)片段RNA的方法，該方法包括如下步驟a)將提取溶液中的固定組織樣品加熱至范圍在大約44至大約62℃的溫度持續(xù)3個(gè)小時(shí)以上的時(shí)間，其中所述提取溶液包含濃度為大約0.1mM至大約20mM的螯合劑，和蛋白酶K；和b)去除DNA污染；和c)從所述的提取溶液分離所述RNA。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述加熱選自下組范圍在大約45至大約6(TC，大約 48至大約58°C ，大約48至大約55°C ，大約48至大約52"和大約50°C的溫度。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述加熱為大約50-56°C。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述時(shí)間長(zhǎng)于4小時(shí)。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中所述時(shí)間長(zhǎng)于8小時(shí)。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述時(shí)間長(zhǎng)于12小時(shí)。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述時(shí)間長(zhǎng)于14小時(shí)。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述時(shí)間為大約16小時(shí)。
9. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述時(shí)間為大約16小時(shí)。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑選自下組EDTA、 EGTA、檸檬酸鹽類、檸 檬酸類、水楊酸、水楊酸鹽類、鄰苯二甲酸類、2，4-戊二酮類、組氨酸類、二鹽酸組氨醇類、 8-羥基喹啉類、8-羥基喹啉、擰檬酸鹽類和鄰羥基醌類。
11. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑為EDTA。
12. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑為檸檬酸鈉。
13. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑以大約0. 6mM至大約5. 0mM的濃度存在。
14. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑以大約0. 6mM至大約3. 6mM的濃度存在。
15. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述螯合劑以3. 6mM的濃度存在。
16. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述EDTA以大約3. 6mM存在。
17. 權(quán)利要求12所述的方法，其中檸檬酸鈉以大約0. 6mM至大約3. 6mM存在。
18. 權(quán)利要求1所述的方法，其中使用第一和第二苯酚提取進(jìn)行DNA污染的去除，其中 所述第二苯酚提取包含離液劑。
19. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離液劑選自下組尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉 (NaSCN)、鹽酸胍(Guanidine HC1)、鹽酸胍(guanidiniumchloride)、硫氰酸胍、四氯乙酸 鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫。
20. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離液劑為異硫氰酸胍。
21. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固定樣品為福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣PR o
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述固定的福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品為5 年或更短時(shí)間的。
23. 權(quán)利要求1所述的方法，其中沒(méi)有使用DNA酶。
24. 分離長(zhǎng)片段RNA的方法，該方法包括如下步驟a)將提取溶液中的固定組織樣品加熱至范圍在大約5(TC至大約56t:的溫度持續(xù)大約 16小時(shí)的時(shí)間；禾口b)進(jìn)行至少第一和第二苯酚提取，其中所述第二苯酚提取包含離液劑，并從所述提取 溶液分離所述RNA。
25. 分離長(zhǎng)片段RNA的方法，該方法包括如下步驟a) 將提取溶液中的福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品加熱至范圍在大約45至大約 62t:的溫度持續(xù)3小時(shí)以上的時(shí)間；其中所述提取溶液包含濃度為2. 5mM至大約5. OmM的 螯合劑和濃度為12.5iig蛋白酶K/mL的蛋白酶K;b) 進(jìn)行至少第一和第二苯酚提取，其中所述第二苯酚提取包含離液劑，并從所述提取 溶液分離所述RNA。
26. 從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織提取長(zhǎng)片段RNA的方法，該方法包括如下步驟a) 將提取溶液中固定的石蠟包埋的組織樣品加熱至大約50°C _561:的溫度持續(xù)大約 16小時(shí)的時(shí)間，所述提取溶液包含濃度為大約3. 6mM的EDTA或檸檬酸鈉和濃度為12. 5 y g 蛋白酶K/mL的蛋白酶K;禾口b) 進(jìn)行至少第一和第二苯酚提取，其中所述第二苯酚提取包含離液劑，并從所述提取 溶液分離所述RNA。
27. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述長(zhǎng)片段RNA的長(zhǎng)度長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸。
28. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述長(zhǎng)片段RNA為300個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。
29. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述提取方法共分離低于10%的DNA。
30. 通過(guò)權(quán)利要求1所述的方法分離的長(zhǎng)片段RNA。
31. 從權(quán)利要求30所述的長(zhǎng)片段RNA生成的cDNA。
32. 權(quán)利要求30所述的RNA在基因表達(dá)分析中的用途。
33. 測(cè)定固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因表達(dá)水平的方法，該方法包括(a) 通過(guò)權(quán)利要求1所述的方法從組織樣品分離長(zhǎng)片段RNA ;(b) 使用能夠擴(kuò)增靶基因區(qū)域的寡核苷酸引物對(duì)所述mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以得到擴(kuò)增的 mRNA ;禾口(c) 相對(duì)于內(nèi)部控制基因的mRNA的量確定耙基因mRNA的量。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述耙基因?yàn)镋RCC1 、 TS、DPD、Her2neu、Gst-pi 、 RRM1 或Kraso
全文摘要
本發(fā)明涉及從固定組織樣本中提取長(zhǎng)片段RNA的方法。特別是，本發(fā)明涉及從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中提取RNA的方法，該方法用于生物學(xué)上的應(yīng)用，包括基于寡核苷酸雜交的測(cè)定法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101784663SQ200880103932
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者凱瑟琳·達(dá)南伯格 申請(qǐng)人:應(yīng)答遺傳公司