專利名稱：甲基化胞嘧啶的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測標本DNA中的甲基化胞嘧啶的方法及用于該方法的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
在高等真核生物的染色體DNA中，構(gòu)成DNA的堿基中C (胞嘧啶)的第5位有時會 被甲基化修飾。在此高等真核生物中，DNA甲基化發(fā)揮著抑制遺傳信息表達的功能。比如， 當(dāng)大量含有某種基因的啟動子常見的CpG序列區(qū)域(CpG島、CG島)甲基化時，其基因轉(zhuǎn)錄 受到抑制。與此相反，當(dāng)CpG島未被甲基化時，轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到啟動子，基因進入可轉(zhuǎn)錄 狀態(tài)。如此，DNA甲基化是基因表達的調(diào)控方式之一。因此，DNA甲基化對初期胚胎發(fā)生、 組織特異性基因表達、哺乳動物特有的基因印記和X染色體失活、染色體穩(wěn)定化、DNA復(fù)制 的時機等各種生理和病理現(xiàn)象發(fā)揮著重要的作用。特別是近年來，已顯而易見，這種DNA甲 基化強烈地干預(yù)癌癥和其他疾病。作為分析DNA甲基化的方法，已知有甲基化特異性PCR法(Methylationspecific Polymerase Chain Reaction)(參考非專利文獻1)。此方法是用亞硫酸氫鈉等轉(zhuǎn)化堿基的 試劑對生物試樣中的DNA進行轉(zhuǎn)化處理，將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為其他堿基，區(qū)分甲基化 胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶。然而，已知進行這種使用轉(zhuǎn)化堿基的試劑和DNA接觸進行轉(zhuǎn)化 處理時，生物試樣中的大部分DNA會因化學(xué)反應(yīng)而分解。近年來，(專利文獻1)公開了一種檢測DNA試樣中的胞嘧啶甲基化的方法，S卩，用 與DNA試樣雜交的探針，在DNA試樣和探針之間形成雜交，使DNA試樣中的預(yù)期甲基化的胞 嘧啶形成突起結(jié)構(gòu)或錯配后，用鋨酸鹽等氧化劑特異性地氧化突起結(jié)構(gòu)或錯配部分的甲基 化胞嘧啶，檢出氧化反應(yīng)物。這種方法是利用甲基化胞嘧啶的甲基化嘧啶堿基環(huán)的碳原子 易氧化的特點，通過檢出已被氧化的反應(yīng)物來檢測胞嘧啶的甲基化。當(dāng)用氧化劑處理DNA試樣時，作為檢測目標的甲基化胞嘧啶以外的甲基化胞嘧啶 和與甲基化胞嘧啶同樣有甲基的胸腺嘧啶也會被氧化。因此，在此方法中，DNA試樣和探針 雜交，在DNA試樣中的檢測目標以外的胸腺嘧啶等堿基和探針之間形成堿基對，防止檢測 目標以外的堿基被氧化。然而，在DNA試樣和探針之間形成突起結(jié)構(gòu)或錯配，有時會使雜交后的雙螺旋結(jié) 構(gòu)的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。更具體而言，在突起結(jié)構(gòu)中，會出現(xiàn)作為甲基化檢測目標的胞嘧啶 從DNA試樣和探針雜交所形成的雙鏈DNA飛出的狀態(tài)。因此，在立體結(jié)構(gòu)上，特別是與DNA 試樣中的突起結(jié)構(gòu)相鄰的堿基難以與探針所對應(yīng)的堿基形成堿基對。而形成錯配的探針也 同樣，不與作為甲基化檢測目標的胞嘧啶形成堿基對的堿基會成為立體結(jié)構(gòu)上的障礙，與 錯配相鄰的堿基難以與探針所對應(yīng)的堿基形成堿基對。特別是當(dāng)與預(yù)期甲基化的胞嘧啶相 鄰的區(qū)域存在胸腺嘧啶時，以及DNA試樣中有CpG島時，立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變形的可能性很大。 因此，DNA試樣中的檢測目標以外的堿基和探針之間不能充分形成堿基對，檢測目標以外的
3胸腺嘧啶等有可能被氧化。當(dāng)用檢測甲基化胞嘧啶來進行上述癌癥和其他疾病診斷時，從診斷結(jié)果的可靠性 方面來說，需要更高的檢測精度。因此，人們希望進一步提高甲基化胞嘧啶檢測精度。專利文獻1 國際公布第2006/132022號文本非專利文獻1 甲基化特異性PCR:—種新的用于檢測CpG島甲基化狀態(tài)的 PCR(James G. HERMAN et al. , Methylation-specific PCR :A novel PCRassay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 93,pp.9821-9826, September 1996)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題鑒于以上情況，本發(fā)明目的之一是提供一種精確檢測甲基化胞嘧啶的方法，使用 寡核苷酸與標本DNA雜交時，立體結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變形、且易與預(yù)期甲基化的胞嘧啶以外的 堿基形成堿基對。本發(fā)明的目的之二是提供用于上述甲基化胞嘧啶檢測方法的甲基化胞嘧啶檢測 用的寡核苷酸。本發(fā)明的目的之三是提供一種含有固定上述寡核苷酸的固相載體的甲基化胞嘧 啶檢測用核酸芯片。解決課題的方法有鑒于此，本項發(fā)明的發(fā)明者們銳意研究，終于發(fā)現(xiàn)使用在與標本DNA中的預(yù)期 甲基化的胞嘧啶互補的位置上有脫堿基部位的寡核苷酸，該寡核苷酸可以不發(fā)生立體結(jié)構(gòu) 變形，直接與標本DNA雜交。進而發(fā)現(xiàn)通過在該寡核苷酸與標本DNA之間形成雜交可以用 氧化劑更特異性地氧化標本DNA中的甲基化胞嘧啶，從而完成了本項發(fā)明。SP，本發(fā)明提供(1) 一種檢測甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步驟寡核苷酸與標本DNA雜交的步驟，所述寡核苷酸與DNA標本中含預(yù)期甲基化的胞 嘧啶的區(qū)域雜交且在與所述胞嘧啶的互補位置有脫堿基部位；氧化步驟，使氧化劑與所述步驟中生成的雜交標本DNA進行反應(yīng)，當(dāng)存在甲基化 胞嘧啶時，使所述甲基化胞嘧啶氧化；以及檢測步驟，即檢出被氧化的甲基化胞嘧啶；(2)上述(1)所述檢測方法，其特征在于檢測步驟包括用堿基物質(zhì)對所述與氧化 劑反應(yīng)的標本DNA進行處理的步驟和判斷用堿基物質(zhì)處理的所述標本DNA有無被切斷的判 斷步驟；(3)上述(2)所述檢測方法，其特征在于堿基物質(zhì)是哌啶或苯胺；(4)上述⑵或(3)所述檢測方法，其特征在于判斷步驟包括對標本DNA中含預(yù) 期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域進行核酸擴增的步驟，以及檢出核酸擴增步驟所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物 的步驟；(5)上述(1)_(4)中任一項所述檢測方法，其特征在于氧化劑選自高錳酸鹽、鋨 酸鹽、鎢酸鹽、高碘酸鹽、過氧化氫水、叔丁基氫過氧化物、過安息香酸、過安息香酸衍生物、碘、七氧化二錸、過氧乙酸、過氧乙酸衍生物及錳_薩倫絡(luò)合物至少其中之一；(6)上述(5)所述檢測方法，其特征在于氧化劑是鋨酸鹽；(7)上述(6)所述檢測方法，其特征在于已被氧化的甲基化胞嘧啶與鋨酸鹽形成 鋨絡(luò)合物；(8)上述(1)所述檢測方法，其特征在于氧化劑是鋨酸鹽，與氧化劑反應(yīng)的步驟 包括使與氧化劑反應(yīng)的標本DNA再與能作為鋨離子配體的化合物反應(yīng)，檢測步驟則是檢測 形成配體配位結(jié)合的鋨絡(luò)合物的甲基化胞嘧啶；(9)上述(8)所述檢測方法，其特征在于配體用標記物標記；(10)上述⑶或9所述檢測方法，其特征在于，配體是吡啶、聯(lián)吡啶或菲咯啉；(11) 一種用于甲基化胞嘧啶檢測方法的寡核苷酸，所述甲基化胞嘧啶檢測方法是 用氧化劑對DNA標本進行處理、檢測被氧化的甲基化胞嘧啶的方法，所述寡核苷酸與標本 DNA中含有預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域雜交且在與所述胞嘧啶互補的位置有脫堿基部位；(12)上述(11)所述寡核苷酸，其特征在于所述胞嘧啶是CpG島區(qū)域中的胞嘧啶；(13)上述(11)或(12)所述寡核苷酸，其特征在于脫堿基部位由不含堿基的核 苷酸形成；(14)上述(11)-(13)中任一項所述寡核苷酸，其特征在于其與存在于標本DNA 中、和寡核苷酸雜交的區(qū)域中的所有胸腺嘧啶形成堿基對；(15) 一種用于使用氧化劑進行甲基化胞嘧啶檢測的核酸芯片，包含固定有權(quán)利要 求(11)-(14)中任一項所述寡核苷酸的固相載體。發(fā)明效果本發(fā)明可以提供一種當(dāng)與標本DNA雜交時，立體結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變形，預(yù)期甲基化 的胞嘧啶以外的堿基容易形成堿基對的檢測甲基化胞嘧啶用的寡核苷酸和用此寡核苷酸 的核酸芯片。用此寡核苷酸或核酸芯片，運用氧化劑進行甲基化胞嘧啶檢測的話，可以防止標 本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶以外的堿基、如胸腺嘧啶等被氧化劑氧化。從而可以更具特 異性地氧化甲基化胞嘧啶，提高甲基化胞嘧啶的檢測精度。本發(fā)明的寡核苷酸和核酸芯片適用于特別是將在與檢測甲基化目標的胞嘧啶相 鄰的區(qū)域存在胸腺嘧啶的DNA作為標本DNA使用時的狀況，以及使用含有CpG島的DNA時 的狀況。本發(fā)明可以提供一種用上述甲基化胞嘧啶檢測用寡核苷酸精確檢測甲基化胞嘧 啶的方法。用本發(fā)明的甲基化胞嘧啶檢測方法，會全面防止標本DNA中預(yù)期甲基化胞嘧啶以 外的堿基如胸腺嘧啶等被氧化劑氧化，因此可以僅精確檢測出氧化的甲基化胞嘧啶。


圖1顯示了鋨酸鹽氧化反應(yīng)和哌啶處理后的試樣1-4的電泳結(jié)果。
具體實施例方式<雜交步驟>
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本發(fā)明的甲基化胞嘧啶檢測方法包括使用與標本DNA中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶 的區(qū)域雜交且在與上述胞嘧啶的互補位置有脫堿基部位的寡核苷酸與標本DNA雜交的步 驟(以下也稱“雜交步驟”)。在本實施方式中，作為標本DNA只要是含DNA的物質(zhì)并無特別限定，但最好是含 生物的基因組DNA，尤以含有給予疾病診斷等臨床評價的DNA的物質(zhì)為宜。作為標本DNA， 比如有從臨床標本獲得的DNA等。具體而言，可列舉出從血液、血清、淋巴液、尿液、乳頭分 泌液、體液以及通過手術(shù)或活檢采集的組織等獲得的DNA，特別是含有從腫瘤細胞中獲得的 DNA的物質(zhì)最為理想。更具體地說，作為標本DNA，當(dāng)臨床評價以檢測腫瘤為目的時，可以舉出調(diào)節(jié)癌遏 制基因和癌基因表達的基因組DNA。當(dāng)以檢測其他疾病為目的時，可舉出調(diào)節(jié)參與該疾病 的基因表達的基因組DNA。比如，作為檢測腫瘤相關(guān)的基因組DNA，可以舉出14-3-3、MGMT、 CDH13、HICl、Twist、pl6、Rassfla、ERa 、RARb、CDHl、GSTPl、Cyclin D2、DAPK、HIN1 和 pl4 等。最好標本DNA含有這些調(diào)節(jié)基因組DNA的CpG島區(qū)。這些基因組DNA的序列從公共數(shù) 據(jù)庫可以獲得。上述標本DNA可以有一個或幾個預(yù)期甲基化的胞嘧啶。本實施方式中的寡核苷酸是一種與標本DNA中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域雜 交且在與上述胞嘧啶的互補位置有脫堿基部位的物質(zhì)。該寡核苷酸可以是DNA或RNA其中 之一，但最好是DNA。S卩，上述寡核苷酸的序列具有與上述含預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域的標本DNA的 部分或全部核苷酸序列互補的序列，且在與該胞嘧啶互補的位置上有脫堿基部位。在本說明書中，所謂“預(yù)期甲基化的胞嘧啶”指所要檢測的是否已被甲基化的胞嘧 啶。標本DNA中的該胞嘧啶可能已甲基化或尚未甲基化，如已甲基化時，可能是5-甲基胞 嘧啶或6-甲基胞嘧啶。在本說明書中，所謂脫堿基部位，其意思與在該領(lǐng)域通常的認識相同。即，所謂脫 堿基部位是指，在可形成雙鏈的核酸中，由于在一個核酸中一定核苷酸所對應(yīng)位置上的另 一個核酸的互補位置的核苷酸不具堿基，而在雙鏈核酸之間不形成氫鍵結(jié)合型堿基對的部 位。更具體而言，這種脫堿基部位可以通過具有堿基部分已脫離的核苷酸結(jié)構(gòu)或有與之類 似結(jié)構(gòu)的寡核苷酸形成。對于與標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶的互補位置上形成脫堿基部位的化合物 無特別限制，只要其能在寡核苷酸與標本DNA雜交形成雙鏈核酸時在與標本DNA中目標胞 嘧啶互補的位置上形成脫堿基部位且又不會破壞雙鏈核酸的立體結(jié)構(gòu)即可。所謂不會破壞 雙鏈核酸的立體結(jié)構(gòu)指一種狀態(tài)，即，標本DNA與寡核苷酸雜交時，標本DNA中位于脫堿基 部位的胞嘧啶以外的堿基可以在不妨礙立體結(jié)構(gòu)的情況下與寡核苷酸中的堿基形成堿基 對，整體上可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。通過在制備寡核苷酸時，使與標本DNA形成雜交時能在與預(yù)期甲基化的胞嘧啶之 間產(chǎn)生空間的物質(zhì)聚合在寡核苷酸中希望的位置上，以形成上述脫堿基部位。作為該物質(zhì) 比如可列舉出不含堿基的核苷酸。用這種核苷酸合成寡核苷酸就可在寡核苷酸形成堿基部 分脫離的核苷酸結(jié)構(gòu)。這種化合物作為無堿基間隔基(dSpacer)被廣泛知曉。上述脫堿基部位可對應(yīng)于標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶的數(shù)目并包含在寡核苷酸中，可以在寡核苷酸中存在1個或2個以上。本發(fā)明的寡核苷酸可以按照公知的核酸合成方法制造。眾所周知，在上述寡核苷 酸的任意位置插入無堿基間隔基，合成有脫堿基部位的寡核苷酸。已插入無堿基間隔基的 寡核苷酸也可從市場購買。寡核苷酸的長度可根據(jù)檢測氧化的甲基化胞嘧啶的方法和標本DNA的序列適當(dāng) 選擇，無特別限制。比如，作為可與標本DNA中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶區(qū)域雜交的長度為 20-100個堿基。上述雜交條件可根據(jù)標本DNA的種類、所用寡核苷酸的長度適當(dāng)選擇。上述雜交 可在如pH7-9、0. 001-0. 05M的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl)、0. 05_0. 15M鈉離子濃 度(或其他堿)、25-55°C的條件下進行。當(dāng)標本DNA是雙鏈DNA時，在上述雜交步驟前，可先將標本DNA在90-100°C加熱 1-10分鐘使其變性。本發(fā)明的方法是，用氧化劑特異性地檢出標本DNA中的目標甲基化胞嘧啶。因此， 將標本DNA和上述寡核苷酸雜交，使目標胞嘧啶以外的堿基埋沒在雙鏈核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu) 中，難以與氧化劑反應(yīng)。更具體而言，讓標本DNA中易與氧化劑反應(yīng)的胸腺嘧啶和存在于目 標胞嘧啶以外的部位的甲基化胞嘧啶與上述寡核苷酸的腺嘌呤和鳥嘌呤等形成堿基對，使 其不易受到氧化劑的氧化反應(yīng)。特別是胸腺嘧啶和甲基化胞嘧啶同樣，易于被氧化劑氧化。 因此，存在于與寡核苷酸雜交區(qū)域的標本DNA中的胸腺嘧啶最好全部通過雜交與上述寡核 苷酸形成堿基對。<氧化劑反應(yīng)步驟>通過上述雜交步驟，標本DNA與上述寡核苷酸雜交。本發(fā)明的方法包括氧化步驟 (以下也稱“氧化劑反應(yīng)步驟”)，讓氧化劑作用于已形成雜交的標本DNA，當(dāng)存在甲基化胞 嘧啶時，氧化該甲基化胞嘧啶。在本實施方式中，氧化劑只要能氧化嘧啶環(huán)的5位和6位碳原子間的雙鍵即可，并 無特別限制。作為氧化劑，比如有高錳酸鉀(KMnO4)等高錳酸鹽、四氧化鋨(OsO4)和二水 合鋨酸鉀(K2OsO4)等鋨酸鹽、鎢酸鈉(Na2WO4)等鎢酸鹽、高碘酸鈉(NaIO4)等高碘酸鹽、過 氧化氫水(H2O2)、叔丁基氫過氧化物(t-BuOOH)、過安息香酸及其衍生物(間氯過氧苯甲酸 (!1￡ 8幻、3，5-二硝基苯甲酸)、碘(I2)、七氧化二錸(Re2O7)、過氧乙酸(AcOOH)及其衍生物 以及錳-薩倫(salen)絡(luò)合物等。氧化劑可以使用其中一種或二種以上。還原上述氧化劑時，可以與上述氧化劑一起使用能使已被還原的氧化劑再氧化的 化合物。作為具有這種再氧化作用的化合物，可以舉出鐵氰化鉀等。關(guān)于用氧化劑處理標本DNA的條件，只要根據(jù)氧化劑種類能夠在與寡核苷酸雜交 的標本DNA中氧化未形成堿基對的甲基化胞嘧啶即可，無特別限定。比如將根據(jù)氧化劑種 類適當(dāng)調(diào)制濃度的氧化劑水溶液加入寡核苷酸和標本DNA雜交的產(chǎn)物中，在0-40°C左右溫 度下處理1分鐘-1小時，即可進行氧化劑的反應(yīng)。氧化劑濃度可根據(jù)氧化劑種類適當(dāng)選擇，但最好在0. I-IOOOmM之間。另外，和寡核苷酸雜交的標本DNA與氧化劑的反應(yīng)最好在PH7-9的堿基條件下進 行。以此可加快氧化速度，更明確地區(qū)分胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。特別是在PH7-9時，寡核 苷酸和標本DNA雜交的產(chǎn)物雙鏈DNA可保持穩(wěn)定。
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<檢測步驟>本發(fā)明的方法包括檢測步驟，即檢測在上述氧化劑反應(yīng)步驟生成的氧化甲基化胞 嘧啶。在本實施方式中，作為檢測氧化的甲基化胞嘧啶的方法使用國際公布第 2006/132022號文本記載的眾所周知的方法即可，無特別限制。檢測氧化的甲基化胞嘧啶的方法比如有(A)基于用上述氧化劑處理寡核苷酸和 標本DNA的雜交產(chǎn)物后用堿基物質(zhì)處理的方法，和(B)當(dāng)使用鋨酸鹽作為氧化劑時檢測在 該鋨酸鹽和甲基化胞嘧啶之間形成的鋨絡(luò)合物的方法等。(A)用堿基物質(zhì)處理的方法當(dāng)采用用堿基物質(zhì)處理氧化的甲基化胞嘧啶的方法時，上述檢測步驟最好包括用 堿基物質(zhì)處理與氧化劑反應(yīng)的標本DNA的步驟和判斷用堿基物質(zhì)處理的標本DNA有無切斷 的步驟。當(dāng)標本DNA中存在甲基化胞嘧啶時，通過用堿基物質(zhì)處理在氧化劑的氧化反應(yīng)中 所生成的標本DNA中氧化的甲基脫氧胞苷，與相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵會發(fā)生水解。 由此，如果標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶是甲基化胞嘧唳，標本DNA就會因在此步驟中用 堿基物質(zhì)處理而在甲基化胞嘧啶的位置被切斷。另一方面，如果標本DNA中預(yù)期甲基化的 胞嘧啶是胞嘧啶，即使在此步驟用堿基物質(zhì)處理標本DNA也不會被切斷。也就是說，由于通 過用堿基物質(zhì)處理，如果是甲基化胞嘧啶，標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶的部位就會發(fā) 生切斷，因此，通過判斷標本DNA有無因堿基物質(zhì)處理而發(fā)生的切斷，就可以檢測出有無甲 基化胞嘧啶。關(guān)于本實施方式中的堿基物質(zhì)無特別限制，只要能水解標本DNA中的氧化的甲基 脫氧胞苷及其與相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵即可。作為堿基物質(zhì)的一例，比如有含氮堿 基物質(zhì)，更具體地說，有哌啶或苯胺等，尤以哌啶為宜。上述用堿基物質(zhì)的處理可以將適當(dāng)濃度的堿基物質(zhì)水溶液與已和氧化劑反應(yīng)的 標本DNA混合，在60-100°C的溫度下反應(yīng)1分鐘_1小時。堿基物質(zhì)的濃度可依堿基物質(zhì)種 類適當(dāng)選擇，比如用吡啶時，最好濃度為1-20容量％。測定用堿基物質(zhì)處理生成的DNA片段的大小以判斷標本DNA是否被切斷。DNA片 段的大小可用公知的方法測定，比如核酸擴增法、電泳法等。當(dāng)用核酸擴增法時，上述判斷步驟最好包括對含有預(yù)期甲基化的胞嘧啶的標本 DNA區(qū)域進行核酸擴增的步驟和檢測核酸擴增步驟生成的擴增產(chǎn)物的步驟。上述核酸擴增法是擴增經(jīng)堿基物質(zhì)處理后的標本DNA中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶 的區(qū)域，測定擴增產(chǎn)物的大小。作為核酸擴增法，只要是用引物擴增核酸的眾所周知的方法 即可，無特別限制。比如，可以是PCR法、LAMP法、ICAN法、SDA法或TAS法等，尤以PCR法 為宜。上述引物只要能與要擴增的標本DNA區(qū)域的核苷酸序列互補地結(jié)合，且用上述核 酸擴增法能夠擴增核酸即可。這種引物序列的設(shè)計和制造方法為業(yè)內(nèi)人士所周知。擴增產(chǎn)物的檢測可以測定核酸擴增的效率(比如實時PCR法)或?qū)U增產(chǎn)物供后 述電泳。上述電泳法是包括眾所周知的核酸電泳和其后的核酸檢測的方法。電泳可用丙烯酰胺、瓊脂糖等凝膠進行。核酸檢測可用溴化乙錠等核酸染色劑進行。(B)檢測鋨絡(luò)合物的方法在上述反應(yīng)步驟中，如果使用鋨酸鹽作為氧化劑，標本DNA中的甲基化胞嘧啶和 鋨酸鹽就能形成鋨絡(luò)合物。通過檢測有無此鋨絡(luò)合物即可檢出甲基化胞嘧啶。用此方法只 要標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶是甲基化胞嘧啶，就可以形成鋨絡(luò)合物。因此，只要檢出 鋨絡(luò)合物，就可判斷目標胞嘧啶被甲基化。與此相反，如果標本DNA中預(yù)期甲基化的胞嘧啶 是胞嘧啶，就不形成鋨絡(luò)合物，也就檢測不出鋨絡(luò)合物。據(jù)此可判斷目標胞嘧啶未被甲基 化。作為檢測有無鋨絡(luò)合物的方法，比如有使用可作為鋨離子配體的化合物(以下也 稱“配位化合物”)的方法。比如，讓標記物標記的配位化合物作用于由甲基化胞嘧啶和鋨 酸鹽形成的鋨絡(luò)合物，形成配體后檢測此標記，即可檢出已形成鋨絡(luò)合物的甲基化胞嘧啶。 另外，讓配位化合物作用于由甲基化胞嘧啶和鋨酸鹽形成的鋨絡(luò)合物，形成配體后再標記 配體，檢測此標記，也可以檢出已形成鋨絡(luò)合物的甲基化胞嘧啶。在此，作為配位化合物，只要是能成為鋨離子配體的化合物即可，并無特別限定。 比如可以是吡啶、聯(lián)吡啶和菲咯啉，尤以聯(lián)吡啶為宜。作為標記物只要能夠標記上述配體，無特別限制。比如可以是酶標記、熒光標記、 電化標記和放射標記等。標記物尤以電化的便于檢測，故最好是蒽醌。制造上述標記物標記的配位化合物的方法和用標記物標記配體的方法為眾所周 知。比如可以使用國際公布第2006/306359號文本上記載的化合物。本發(fā)明還提供一種包含固定上述寡核苷酸的固相載體的甲基化胞嘧啶檢測用核 酸芯片。在本實施方式中，作為核酸芯片，只要具有固定上述寡核苷酸的固相載體，無特別 限制。固相載體只要是能固定寡核苷酸的固相載體即可。如，聚苯乙烯、金、玻璃、磁性氧化 鐵等磁性粒子、具有量子點性能的硫化鋅等微粒子。核酸芯片的制作方法眾所周知。即，可以讓上述寡核苷酸與經(jīng)表面處理以使其有 所希望的能與醛基、氨基等核酸結(jié)合的官能基的上述固相載體接觸，使該寡核苷酸結(jié)合到 固相載體表面。使用這種核酸芯片，可以對與固相載體上的寡核苷酸雜交的標本DNA進行包括上 述雜交步驟、氧化劑反應(yīng)步驟和檢測步驟在內(nèi)的處理以及在處理過程中清洗固相載體。下面實施例詳細說明本項發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。實施例1(制備標本DNA)合成以下序列號1和2的堿基序列所示DNA，作為標本DNA使用。序列號1 5’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列號2 5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTMGCMGCMGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列號2所示堿基序列中，“M”表示甲基化胞嘧啶。在本實施例中，以從序列號1 和2所示標本DNA的5’端到第23位胞嘧啶作為甲基化檢測目標的胞嘧啶。
(制備寡核苷酸)合成以下序列號3和4的堿基序列所示DNA，作為用于甲基化胞嘧啶檢測的寡核苷酸。序列號3:5’ -GTACTCACTGGTGGCGAAGACTGCGGCGGCGAAACTCCAGCGAAGGCCTC-3’序列號4:5’ -GTACTCACTGGTGGCGAAGACTGCGGCNGCGAAACTCCAGCGAAGGCCTC-3’序列號3所示寡核苷酸具有與序列號1和2所示標本DNA完全互補的堿基序列。序列號4所示寡核苷酸在與上述標本DNA雜交時插入了用于形成脫堿基部位的無 堿基間隔基，取代用于與序列號1和2所示標本DNA的5’端到第23位胞嘧啶或甲基化胞 嘧啶形成堿基對的鳥嘌呤。無堿基間隔基在堿基序列上用“N”表示。為了使序列號1和2與序列號3和4雜交時的狀態(tài)更加易懂，序列號3和4顯示 為3’端到5’端的序列，一并標記序列號1-4如下。序列號1 5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列號2:5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTMGCMGCMGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列號3:3 ’ -CTCCGGAAGCGACCTCAAAGCGGCGGCGTCAGAAGCGGTGGTCACTCATG-5’序列號4:3 ’ -CTCCGGAAGCGACCTCAAAGCGNCGGCGTCAGAAGCGGTGGTCACTCATG-5’如上所示，在與序列號1和2的5’端到第23位胞嘧啶或甲基化胞嘧啶的互補位 置上，序列號3的核苷酸有鳥嘌呤，而序列號4的核苷酸有無堿基間隔基。(標本DNA和寡核苷酸的雜交)如以下表1所示，將序列號3和4所示的寡核苷酸混入上述序列號1和2所示標 本DNA，制備試樣1-4。各標本DNA (序列號1和2)及寡核苷酸(序列號3和4)用TE緩沖 液(ImM EDTA, IOmM Tris-HCl，pH7. 4)溶解到濃度為10 μ M。稀釋液也使用同樣的TE緩沖液。[表1]
權(quán)利要求
一種檢測甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步驟寡核苷酸與標本DNA雜交的步驟，所述寡核苷酸與DNA標本中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域雜交且在與所述胞嘧啶的互補位置有脫堿基部位；氧化步驟，使氧化劑與所述步驟中生成的雜交標本DNA進行反應(yīng)，當(dāng)存在甲基化胞嘧啶時，使所述甲基化胞嘧啶氧化；以及檢測步驟，即檢出被氧化的甲基化胞嘧啶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測方法，其特征在于，檢測步驟包括用堿基物質(zhì)對所述與氧 化劑反應(yīng)的標本DNA進行處理的步驟和判斷用堿基物質(zhì)處理的所述標本DNA有無被切斷的 判斷步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測方法，其特征在于，堿基物質(zhì)是哌啶或苯胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述檢測方法，其特征在于，判斷步驟包括對標本DNA中含預(yù) 期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域進行核酸擴增的步驟，以及檢出核酸擴增步驟所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物 的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測方法，其特征在于，氧化劑選自高錳酸鹽、鋨酸鹽、鎢酸鹽、 高碘酸鹽、過氧化氫水、叔丁基氫過氧化物、過安息香酸、過安息香酸衍生物、碘、七氧化二 錸、過氧乙酸、過氧乙酸衍生物及錳-薩倫絡(luò)合物至少其中之一。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測方法，其特征在于，氧化劑是鋨酸鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測方法，其特征在于，已被氧化的甲基化胞嘧啶與鋨酸鹽形 成鋨絡(luò)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測方法，其特征在于，氧化劑是鋨酸鹽，與氧化劑反應(yīng)的步驟 包括使與氧化劑反應(yīng)的標本DNA再與能作為鋨離子配體的化合物反應(yīng)，檢測步驟則是檢測 形成配體配位結(jié)合的鋨絡(luò)合物的甲基化胞嘧啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測方法，其特征在于，配體用標記物標記。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述檢測方法，其特征在于，配體是吡啶、聯(lián)吡啶或菲咯啉。
11.一種用于甲基化胞嘧啶檢測方法的寡核苷酸，所述甲基化胞嘧啶檢測方法是用氧 化劑對DNA標本進行處理、檢測被氧化的甲基化胞嘧啶的方法，所述寡核苷酸與標本DNA中 含有預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域雜交且在與所述胞嘧啶互補的位置有脫堿基部位。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述寡核苷酸，其特征在于，所述胞嘧啶是CpG島區(qū)域中的胞嘧啶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述寡核苷酸，其特征在于，脫堿基部位由不含堿基的核苷 酸形成。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述寡核苷酸，其特征在于，其與存在于標本DNA中、和寡核苷酸 雜交的區(qū)域中的所有胸腺嘧啶形成堿基對。
15.一種用于使用氧化劑進行甲基化胞嘧啶檢測的核酸芯片，包含固定有權(quán)利要求11 所述寡核苷酸的固相載體。
全文摘要
本發(fā)明的甲基化胞嘧啶檢測方法包括以下步驟使寡核苷酸與標本DNA雜交的步驟，該寡核苷酸與標本DNA中含預(yù)期甲基化的胞嘧啶的區(qū)域雜交且在與上述胞嘧啶互補位置有脫堿基部位；氧化步驟，使氧化劑與上述步驟中生成的雜交標本DNA進行反應(yīng)，當(dāng)存在甲基化胞嘧啶時，氧化該甲基化胞嘧啶；以及檢出被氧化的甲基化胞嘧啶的步驟。
文檔編號C12N15/09GK101960020SQ20088010391
公開日2011年1月26日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日
發(fā)明者山本憲明, 岡智子, 梶田昌裕, 石原英干, 酒井綾子 申請人:希森美康株式會社