專利名稱：：Egfr抑制劑治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)記物的制作方法EGFR抑制劑治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)記物本發(fā)明提供一種生物標(biāo)記物，其預(yù)測(cè)對(duì)癌癥患者中使用EGFR抑制劑的治療的反應(yīng)。許多人惡性腫瘤與表皮生長因子受體(EGFR)的異常或過表達(dá)有關(guān)。EGF，轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)，和許多其他配體結(jié)合EGFR，從而剌激該受體胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化。隨后激活多種胞內(nèi)途徑，且這些下游事件導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞體外增殖。已經(jīng)假定通過EGFR剌激腫瘤細(xì)胞可能對(duì)體內(nèi)腫瘤生長和腫瘤存活非常重要。關(guān)于Tarceva,即EGFR酪氨酸激酶的抑制劑的早期臨床數(shù)據(jù)顯示該化合物是安全的且通常在提供靶有效濃度的劑量是良好耐受(如通過臨床前數(shù)據(jù)確定地)的?；加型砥诩膊〉幕颊咧械呐R床I和II期試驗(yàn)證明TarcevaTM在一定范圍的上皮腫瘤中具有有前景的臨床活性。事實(shí)上，已經(jīng)顯示出Tarceva能夠在先前受治療的患有頭頸癌和NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)的患者中誘導(dǎo)與確定的第二線化學(xué)療法相似級(jí)別的持久部分好轉(zhuǎn)，但是具有比化學(xué)療法更好的安全特性和改進(jìn)的方便性(片劑代替靜脈內(nèi)[i.v.]施用)的額外益處。近期完成的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)(BR.21)顯示單試劑TarcevaTM顯著延長和改善NSCLC患者的存活，對(duì)于所述NSCLC患者，標(biāo)準(zhǔn)的晚期疾病療法未能成功。TarCevaTM(厄洛替尼)是小化學(xué)分子；其是EGFR酪氨酸激酶(EGFR-TKI)的口服活性有效選擇性抑制劑。肺癌是北美和歐洲中癌癥相關(guān)死亡的主要原因。在美國，由肺癌繼發(fā)的死亡數(shù)量超過由第二(結(jié)腸癌)、第三(乳腺癌)、和第四(前列腺癌)主要癌癥死亡原因組合的總死亡。全部肺癌的約75%-80%是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其約40%的患者表現(xiàn)出局部晚期和/或不可切除的疾病。該組典型地包括患有大量IIIA和IIIB期疾病的那些，不包括惡性胸膜滲漏。肺癌在歐洲聯(lián)盟中的粗略發(fā)生率是52.5，死亡率是48.7病例/100000/年。分別地，在男性中，所述比率是79.3和78.3，在女性中，是21.6和20.5。NSCLC占所有肺癌病例的80%。男性中約90%的肺癌死亡率和女性中的80%可歸因于吸煙。在美國，根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)，在2004年，存在約173，800件新肺癌病例(男性中93，100和女性中80，700)并占全部新癌癥的約13%。大多數(shù)患者在診斷兩年內(nèi)由于他們的疾病后果而死亡。對(duì)于許多NSCLC患者，成功的治療仍然難以捉摸。晚期腫瘤經(jīng)常不能通過手術(shù)處理并且還可能對(duì)可耐受劑量的放射療法和化學(xué)療法具有抗性。在隨機(jī)試驗(yàn)中，當(dāng)前最具活性的組合化學(xué)療法獲得約30%_40%的反應(yīng)率，和35%-40%的1年存活率。這確實(shí)是超過單獨(dú)使用支持性醫(yī)護(hù)所觀察到的10%的1年存活率的進(jìn)步(Sh印herd1999)。直到最近，患者復(fù)發(fā)后的治療選擇僅限于最佳支持性醫(yī)護(hù)或減輕。近期比較多西他賽(Taxotere⑧)和最佳支持性醫(yī)護(hù)的試驗(yàn)顯示患有NSCLC的患者在基于順鉑的第一線方案失敗后，可以受益于第二線化學(xué)療法。所有年齡和具有0，l，或2EC0G性能狀態(tài)的患者證明了使用多西他賽的提高的存活，先前用基于鉑的治療難治的患者也如此。不受益于療法的患者包括體重減輕>10%、高乳酸脫氫酶水平、多器官累及、或肝累及的那些。另外，多西他賽單一療法的益處不擴(kuò)展超過第二線設(shè)置。接受多西他賽作為第三線治療或以上的患者沒顯示出存活的延長。單試劑多西他賽成為NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)第二線療法。近期，第二線NSCLC療法中的另一個(gè)隨機(jī)III期試驗(yàn)比較了培美曲塞0\1^1^&@)和多西他賽。使用培美曲塞的治療導(dǎo)致臨床等價(jià)功效但與多西他賽相比具有顯著更小的副作用。長期以來公認(rèn)存在開發(fā)個(gè)性化癌癥治療的方法的需要。伴隨著靶向癌治療的發(fā)展，存在可以提供腫瘤靶標(biāo)分子特征的方法學(xué)的特別目的，(即預(yù)測(cè)臨床益處的那些)。關(guān)于癌癥中基因表達(dá)模式原則的證據(jù)已經(jīng)利用腫瘤類型分子分類建立了，所述腫瘤類型基于目前的形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)測(cè)試是不明顯的。因此，本發(fā)明的目的是提供預(yù)測(cè)癌癥患者中對(duì)EGFR抑制劑治療的反應(yīng)的表達(dá)生物標(biāo)記物。在第一個(gè)目標(biāo)中，本發(fā)明提供預(yù)測(cè)癌癥患者對(duì)EGFR抑制劑治療的反應(yīng)的體外方法，其包括以下步驟確定患者腫瘤樣品中EGFR基因的表達(dá)水平和對(duì)該EGFR基因表達(dá)水平和代表不反應(yīng)患者群的腫瘤中EGFR基因表達(dá)水平的值進(jìn)行比較，其中患者的腫瘤樣品中EGFR基因的較高表達(dá)水平指示將對(duì)該治療有反應(yīng)的患者?？s寫EGFR意指表皮生長因子受體。人EGFR的核苷酸序列在Seq.Id.No.1中給出。術(shù)語"代表不反應(yīng)患者群的腫瘤中EGFR基因表達(dá)水平的值"指對(duì)使用EGFR抑制劑的治療不反應(yīng)的患者群的腫瘤中標(biāo)記物基因平均表達(dá)水平的估值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物基因EGFR典型地在反應(yīng)的患者的腫瘤樣品中表現(xiàn)出與代表不反應(yīng)患者群的腫瘤中EGFR基因表達(dá)水平的值相比，1.8-4.3或更多倍的更高表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGFR基因的表達(dá)水平通過微陣列技術(shù)或其他評(píng)估RNA表達(dá)水平的技術(shù)如定量RT-PCR或通過任何著眼于各自蛋白表達(dá)水平的方法，例如免疫組織化學(xué)法(IHC)來確定?；蛐酒臉?gòu)建和用途是本領(lǐng)域中眾所周知的。參見，美國專利號(hào)5，202，231;5，445，934;5，525，464;5，695，940;5，744，305;5，795，716和15，800，992。還參見，Johnston,M.Curr.Biol.(當(dāng)前生物學(xué))8:R171_174(1998);IyerVR等，Science(科學(xué))283:83-87(1999)。當(dāng)然，基因表達(dá)水平可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其他方法，諸如例如RNA印跡、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、引物延伸、RNA酶保護(hù)、RNA表達(dá)模式來確定。本發(fā)明的基因可以與其他預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物組合為生物標(biāo)記物組。生物標(biāo)記物組可以由預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物的任何組合構(gòu)成，從而預(yù)測(cè)EGFR抑制劑治療在癌癥患者中的作用。本文中所述的多種生物標(biāo)記物和生物標(biāo)記物組可以用于，例如，預(yù)測(cè)患有癌癥的患者將如何對(duì)使用EGFR抑制劑的治療干預(yù)進(jìn)行反應(yīng)。術(shù)語"基因"用于本文中時(shí)，包括基因的變體。術(shù)語"變體"涉及與GenBank登記號(hào)提供的核酸序列基本相似的核酸序列。術(shù)語"基本相似"被本領(lǐng)域中技術(shù)人員充分理解。具體地，基因變體可以是這樣的等位基因，所述等位基因與人群中最普遍的等位基因的核酸序列相比表現(xiàn)出核苷酸交換。優(yōu)選地，這樣的基本相似的核酸序列與最普遍的等位基因具有至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的序列相似性。術(shù)語"變體"還意指涉及剪接變體。EGFR抑制劑可以選自由吉非替尼，厄洛替尼，PKI-166,EKB_569，GW2016,CI-1033和抗erbB抗體，諸如曲妥珠單抗和西妥昔單抗組成的組。4在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑制劑是厄洛替尼。在再一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是NSCLC。用于檢測(cè)本發(fā)明所述基因的基因表達(dá)的技術(shù)包括，但不限于，RNA印跡、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、引物延伸、RNA酶保護(hù)、RNA表達(dá)模式和相關(guān)技術(shù)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的。參見例如，SambrookJ等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第三版(ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)，ColdSpringHarbor(冷泉港)，2000)。用于檢測(cè)本發(fā)明所述各種基因的蛋白表達(dá)的技術(shù)包括，但不限于，免疫組織化學(xué)法(IHC)。根據(jù)本發(fā)明，可以測(cè)定來自患者組織樣品，例如腫瘤或癌活組織檢查的細(xì)胞，以確定一種或多種生物標(biāo)記物的表達(dá)模式。癌癥治療的成功或失敗可以基于來自測(cè)試組織(測(cè)試細(xì)胞)，例如腫瘤或癌活組織檢查的細(xì)胞的生物標(biāo)記物的表達(dá)模式來確定，如與一種或多種生物標(biāo)記物的對(duì)照組的表達(dá)模式相對(duì)相似或不同。在本發(fā)明的上下文中，發(fā)現(xiàn)EGFR基因受到上調(diào)，即與不對(duì)EGFR抑制劑治療反應(yīng)的患者的腫瘤相比，在對(duì)EGFR抑制劑治療反應(yīng)的患者的腫瘤中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平。因此，如果測(cè)試細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于對(duì)癌癥治療有反應(yīng)的患者的生物標(biāo)記物表達(dá)模式，則該個(gè)體的癌癥或腫瘤應(yīng)該有利地對(duì)使用EGFR抑制劑的治療有反應(yīng)，這是高度可能的或被預(yù)測(cè)的。相反，如果測(cè)試細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于不對(duì)癌癥治療有反應(yīng)的患者的生物標(biāo)記物表達(dá)模式，則該個(gè)體的癌癥或腫瘤不應(yīng)該對(duì)使用EGFR抑制劑的治療有反應(yīng)，這是高度可能的或被預(yù)測(cè)的。本發(fā)明的生物標(biāo)記物，即表3中列出的基因，是對(duì)于患有癌癥的患者，特別是患有難治NSCLC的患者的個(gè)性化療法的第一步。該個(gè)性化療法應(yīng)該容許治療醫(yī)師從用于癌癥療法，特別是NSCLC的現(xiàn)存藥物中選擇最合適的藥劑。個(gè)性化療法對(duì)于每名將來的患者的益處是反應(yīng)率/獲益患者數(shù)量將增加且歸因于無效治療的有害副作用的風(fēng)險(xiǎn)將降低。在另一個(gè)目標(biāo)中，本發(fā)明提供治療通過本發(fā)明的體外方法鑒定的癌癥患者的治療法。所述治療法包括將EGFR抑制劑施用于患者，所述患者已經(jīng)基于表3中列出的基因的預(yù)測(cè)性表達(dá)模式被選擇進(jìn)行處理。優(yōu)選的EGFR抑制劑是厄洛替尼且優(yōu)選的待治療癌癥是NSC1X。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示研究設(shè)計(jì)；圖2顯示樣品處理方案；圖3a顯示EGFR表達(dá)水平對(duì)比Genechip戀模式的臨床結(jié)果；圖3b顯示EGFR表達(dá)水平對(duì)比qRT-PCR的臨床結(jié)果；禾口圖3c顯示關(guān)于EGFR的Genechip⑧禾PqRT-PCR測(cè)量之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)部分關(guān)于研究和研究設(shè)i十的某本原理近期，描述了NSCLC患者子集的腫瘤組織中EGFR基因內(nèi)的突變和這些突變與針對(duì)厄洛替尼和吉非替尼的靈敏性的聯(lián)系(PaoW，等2004;Lynch等2004;Paez等2004)。對(duì)于由兩項(xiàng)研究組合的患者，在14名對(duì)吉非替尼有反應(yīng)的患者中的13名中觀察到突變的EGFR和在11名吉非替尼_治療的不反應(yīng)患者中沒有觀察到突變的EGFR。這些突變的報(bào)告的普5遍性在未選擇的NSCLC患者中是8X(25名中2名)。發(fā)現(xiàn)這些突變?cè)谙侔┲?21%)，在來自雌性的腫瘤中(20%)，和在來自日本患者的腫瘤中(26%)更頻繁。這些突變導(dǎo)致增加的EGFR體外活性和增加的針對(duì)吉非替尼的靈敏性。沒有預(yù)期評(píng)估突變與延長的穩(wěn)定疾病或存活期限的關(guān)系?；趤碜訠R.21研究的探究性分析，觀察到的存活益處似乎未必僅歸因于EGFR突變，因?yàn)榧词乖趯⒕哂心繕?biāo)反應(yīng)的患者排除在分析之外時(shí)，顯著的存活益處仍保持(數(shù)據(jù)存檔)。其他的分子機(jī)制必定也對(duì)該效果作出功效。基于這樣的假設(shè)，即存在預(yù)測(cè)對(duì)Tarceva治療反應(yīng)/益處的基因表達(dá)水平變化，使用微陣列分析檢測(cè)這些變化。這需要明確定義的在第一線療法失敗后使用TarcevaTM單一療法治療的研究群體?；趤碜?1.21研究的經(jīng)驗(yàn)，將獲益群體定義為具有目標(biāo)反應(yīng)，或>12周的疾病穩(wěn)定性。按照預(yù)定義的統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)，分析臨床和微陣列數(shù)據(jù)組。該技術(shù)的應(yīng)用需要新鮮冷凍的組織(FFT)。因此，在開始治療前，必須進(jìn)行強(qiáng)制性活組織檢查。將收集的材料冷凍在液氮(N2)中。同時(shí)收集第二腫瘤樣品并保存在石蠟(福爾馬林固定的石蠟包埋的，F(xiàn)FPE)中。分析該樣品，以獲得EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的改變。通過支氣管鏡檢進(jìn)行腫瘤活組織檢查的能力是該研究的先決條件。支氣管鏡檢是驗(yàn)證肺癌診斷的標(biāo)準(zhǔn)程序。盡管通常安全，但是保留并發(fā)癥，例如出血的風(fēng)險(xiǎn)。該研究是對(duì)于患有難治NSCLC的患者的個(gè)性化療法的第一步。該個(gè)性化療法應(yīng)該容許治療醫(yī)師針對(duì)該指示從現(xiàn)存藥物中選擇最合適的藥劑?！┛衫脗€(gè)性化療法，在本研究中，對(duì)每名未來患者的益處將勝過患者不得不接受的風(fēng)險(xiǎn)反應(yīng)率/獲益患者數(shù)量將增加，歸因于無效治療的有害副作用的風(fēng)險(xiǎn)將降低。關(guān)于劑量選擇的基本原理Tarceva以150mg劑量每日口服給藥一次，直到疾病發(fā)展，無法耐受的毒性或死亡。該劑量的選擇基于藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以及在重度預(yù)處理的晚期癌癥患者的I，II和III期試驗(yàn)中觀察到的該劑量的安全性和耐受能力模式。在接受150mg/日劑量的癌癥患者血漿中觀察到的藥物水平一致地高于臨床功效作為目標(biāo)的平均血漿濃度500ng/ml。BR.21顯示使用該劑量的存活益處。研究的目標(biāo)第一個(gè)目標(biāo)是鑒定預(yù)測(cè)TarcevaTM治療益處(CR，PR或SD>12周)的差異表達(dá)基因。鑒定預(yù)測(cè)對(duì)TarcevaTM治療"反應(yīng)"(CR，PR)的差異表達(dá)基因是一個(gè)重要的額外目標(biāo)。第二個(gè)目標(biāo)是評(píng)估EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)于來自治療的益處的變化。研究設(shè)計(jì)研究設(shè)計(jì)和給藥方案綜述這是一個(gè)開放_(tái)標(biāo)記、預(yù)測(cè)性標(biāo)記物鑒定II期研究。該研究在約12個(gè)國家中的約26個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行。264名經(jīng)歷過至少一次以前化學(xué)療法方案失敗的晚期NSCLC患者在12個(gè)月的期間內(nèi)參與。連續(xù)口服TarcevaTM以150mg/日的劑量給藥。基于對(duì)藥物療法的耐受能力允許劑量的減少。評(píng)估臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)，以評(píng)價(jià)疾病控制和毒性。治療持續(xù)直到疾病發(fā)展，不能接受的毒性或死亡。研究設(shè)計(jì)描述在圖l中。獲得腫瘤組織和血液樣品進(jìn)行分子分析，從而評(píng)價(jià)Tarceva的作用和鑒定受益于療法的患者子群。預(yù)測(cè)性標(biāo)記物評(píng)估腫瘤的活組織檢查在開始治療前2周內(nèi)進(jìn)行。收集2種不同的樣品第一樣品通常立即冷凍在液^中第二樣品在福爾馬林中固定并包埋在石蠟中快速冷凍的組織在該研究中具有最高的優(yōu)先級(jí)。圖2顯示樣品處理方案。微陣列分析快速冷凍的樣品用于腫瘤細(xì)胞的激光捕獲顯微切割(LCM)，從而提取腫瘤RNA和來自腫瘤周圍組織的RNA。將RNA在Affymetrix微陣列芯片(HG-U133A)上分析，以構(gòu)建患者腫瘤基因表達(dá)模式。使用Affymetrix芯片的質(zhì)量控制選擇具有足夠質(zhì)量以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較的那些樣品。關(guān)于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織的單生物標(biāo)記物分析將第二腫瘤活組織檢查，F(xiàn)FPE樣品，用于進(jìn)行DNA突變，IHC和ISH分析，如下所述。類似的分析對(duì)在最初診斷時(shí)收集的組織進(jìn)行。編碼EGFR和參與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的其他分子的基因的DNA突變狀態(tài)通過DNA測(cè)序分析。EGFR和相關(guān)基因的基因擴(kuò)增通過FISH來研究。蛋白表達(dá)分析包括EGFR或EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的其他蛋白的免疫組織化學(xué)[IHC]分析。反應(yīng)評(píng)估使用RECIST(—維腫瘤測(cè)量)標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)反應(yīng)?？梢栽谝韵骆溄又邪l(fā)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)http://www.eortc.be/recist/。注意為了對(duì)CR或PR狀態(tài)賦值，腫瘤測(cè)量的改變必須通過在治療期間內(nèi)任意時(shí)刻時(shí)彼此相隔至少4周的重復(fù)評(píng)估來驗(yàn)證。在SD的情形中，后繼測(cè)量必須在研究以6周的最小間隔進(jìn)入后，達(dá)到了SD標(biāo)準(zhǔn)至少一次。在維持的SD的情形中，后繼測(cè)量必須在研究以至少12周的維持期間進(jìn)入后，達(dá)到了SD標(biāo)準(zhǔn)至少一次。存活評(píng)估每3個(gè)月的定時(shí)狀態(tài)檢查通過患者就診(visittotheclinic)或通過電話進(jìn)行。記錄所有的死亡。在研究結(jié)束時(shí)，需要對(duì)每名患者進(jìn)行存活的明確確認(rèn)。方法RNA樣品制備和RNA樣品的質(zhì)量控制所有的活組織檢查樣品處理通過病理學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室來操作；新鮮冷凍的組織樣品由研究者地點(diǎn)運(yùn)到RocheBasel(巴塞爾羅氏)中的臨床樣品操作機(jī)構(gòu)(ClinicalSampleOperationsfacility)，并由那里運(yùn)到病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室以進(jìn)行進(jìn)一步的處理。使用激光捕獲顯微切割來從周圍組織中選擇腫瘤細(xì)胞。LCM后，由富集的腫瘤材料中純化RNA。病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室然后進(jìn)行許多步驟，以評(píng)價(jià)RNA的濃度和質(zhì)量。RNA酶是RNA降解酶且到處存在，并且因此所述所有使用RNA的程序必須嚴(yán)格受控，以最小化RNA降解。大部分mRNA種類自身具有相當(dāng)短的半衰期并且因此被認(rèn)為非常不穩(wěn)定。因此，在任何測(cè)定前進(jìn)行RNA完整性檢查和量化非常重要。RNA濃度和質(zhì)量模式可以使用來自安捷倫(AgilentTechnologies,Inc.(安捷倫技術(shù)公司)，PaloAlto，CA)的儀器，稱為2100Bioanalyzer(2100生物分析儀⑧)評(píng)估。該儀器軟件產(chǎn)生RNA完整性指數(shù)(RIN)，一種量化評(píng)價(jià)(Schroeder，A.，等，TheRIN:anRNAintegritynumberforassigningintegrityvaluestoRNAmeasurements(RIN:用于對(duì)RNA測(cè)量賦予完整性數(shù)值的RNA完整性指數(shù)).BMCMolBiol(BMC分子生物學(xué))，2006.7:第3頁)，并計(jì)算總RNA樣品的核糖體比率。RIN由RNA樣品的全部電泳痕跡確定，并且因此包括降解產(chǎn)物的存在或缺乏。RNA質(zhì)量通過2100Bioanalyzer(2100生物分析儀⑧)分析。只選擇具有至少一個(gè)高于加入的聚-I噪音的rRNA峰和充足RNA的樣品來進(jìn)一步在Affymetrix平臺(tái)上進(jìn)行分析。將純化的RNA運(yùn)送到RocheCentreforMedicalGenomics(羅氏醫(yī)學(xué)基因組中心)(RCMG;巴塞爾，瑞士)，以通過微陣列進(jìn)行分析。從病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室收到122份RNA樣品以進(jìn)一步處理。耙標(biāo)記組織RNA樣品耙標(biāo)記根據(jù)來自Affymetrix(Affymetrix,SantaClara，加利福尼亞)的兩循環(huán)靶標(biāo)記擴(kuò)增流程進(jìn)行，按照制造商的說明。該方法基于標(biāo)準(zhǔn)Eberwine線性擴(kuò)增程序，但是使用2個(gè)循環(huán)的該程序，以產(chǎn)生足夠的標(biāo)記的cRNA，從而與微陣列雜交。該標(biāo)記反應(yīng)中使用的總RNA輸入，對(duì)于可獲得多于10ngRNA的那些樣品是10ng;如果可獲得小于該量或如果不存在可用的數(shù)量數(shù)據(jù)(由于非常低的RNA濃度)，則將總樣品的一半用于該反應(yīng)。來自標(biāo)記反應(yīng)的產(chǎn)量在20-180iigcRNA的范圍內(nèi)。在雜交水平上引入標(biāo)準(zhǔn)化步驟，其中關(guān)于每份樣品使用15iigcRNA。將人參照RNA(Stratagene，卡爾斯巴德，CA，美國)用作每批樣品工作流程的對(duì)照樣品。將10ng的該RNA作為輸入用在測(cè)試樣品的旁邊，以檢驗(yàn)標(biāo)記和雜交試劑如預(yù)期地工作。微陣列雜交AffymetrixHG-U133A微陣列含有超過22，000個(gè)探針組，其耙向約18，400個(gè)轉(zhuǎn)錄物和變體，其代表約14，500個(gè)充分表征的基因。對(duì)于所有樣品的雜交根據(jù)Affymetrix說明書(AffymetrixInc.(Affymetrix公司)，ExpressionAnalysisTechnicalManual(表達(dá)分析技術(shù)手冊(cè))，2004)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，對(duì)于每份樣品，將15yg生物素標(biāo)記的cRNA在存在二價(jià)陽離子和加熱的條件下斷裂，并與AffymetrixHG-U133A全基因組寡核苷酸陣列雜交過夜。第二天，按照制造商的說明，用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白(MolecularProbes(分子探針)；Eugene，OR)染色陣列。然后用GeneChipScanner(基因芯片掃描儀)3000(Affymetrix)掃描陣列，并通過GeneChipOperatingSoftware(基因芯片操作軟件)(GC0S)版本1.4(Affymetrix)自動(dòng)計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Affymetrix數(shù)據(jù)分析由四個(gè)主要步驟組成。步驟1是質(zhì)量控制。目的是從分析陣列中識(shí)別和排除具有不合標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量模式的數(shù)據(jù)。步驟2是預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化。目的是形成標(biāo)準(zhǔn)化的和成比例的"分析數(shù)據(jù)組"，其可用于芯片間比較。其包括背景噪音評(píng)估和扣除，探針總計(jì)和定比例。步驟3是探究和描述。目的是識(shí)別潛在偏差和可變性來源。其由應(yīng)用多變量和單變量描述性分析技術(shù)來識(shí)別影響性相關(guān)變量(covariates)組成。步驟4是建模和測(cè)試。目的是基于"反應(yīng)者"(具有"部分反應(yīng)"或"完全反應(yīng)"作為最佳反應(yīng)的患者)和"不反應(yīng)者"("進(jìn)行性疾病"作為最佳反應(yīng)的患者)之間平均表達(dá)水平差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估來鑒定一系列候選標(biāo)記物。其由使合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型擬合每個(gè)探針組和獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性測(cè)量組成。全部分析均利用R軟件包進(jìn)行。步驟1:質(zhì)量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估基于檢查若干參數(shù)。這些包括標(biāo)準(zhǔn)AffymetrixGeneChipTM質(zhì)量參數(shù)，具體地比例因子、PresentCall百分比和平均背景。該步驟還包括視覺化檢查虛擬芯片圖像(virtualchipimage)以檢測(cè)局部化雜交問題，和比較每個(gè)芯片和虛擬中值芯片(virtualmedianchip)以檢測(cè)由中值行為的任何不尋常偏離。還進(jìn)行芯片間相關(guān)性分析，以檢測(cè)異常值樣品。另外，考慮使用AgilentBioanalyzer2100(安捷倫生物分析儀2100)獲自RNA樣品分析的RNA質(zhì)量的輔助測(cè)量?；谶@些參數(shù)，從分析中排除來自20個(gè)陣列的數(shù)據(jù)。因此該分析中包括來自代表102名患者的總共102個(gè)陣列的數(shù)據(jù)。這102名患者組的臨床說明報(bào)告在表1中。表1:該分析中包括的患者的臨床特征說明<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>步驟2:數(shù)據(jù)預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化使用rma運(yùn)算法貝U(Irizarry，R.A.，等，SummariesofAffymetrixGeneChipprobeleveldata(Affymetrix基因芯片探針?biāo)綌?shù)據(jù)總結(jié)).Nucl.AcidsRes.(核酸研究)，2003.31(4):第el5頁)進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化。使用mas5運(yùn)算法則(AFFYMETRIX,(7e"eC7w)⑧Expression:DataAnalysisF皿damentals(^"eC7^⑧表達(dá)數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)).2004，AFFYMETRIX)檢測(cè)關(guān)于各個(gè)探針組的調(diào)用(call)。在所有樣品中稱為"缺乏的"或"最低限度的"探針組由進(jìn)一步分析去除；由基于該標(biāo)準(zhǔn)的分析去除5930個(gè)探針組。分析數(shù)據(jù)組因此由具有在102名患者中測(cè)量的16353個(gè)(在22283個(gè)范圍內(nèi))探針組矩陣組成。步驟3:數(shù)據(jù)描述和探究進(jìn)行描述性探究分析，以確定潛在的偏差和主要可變性來源。篩選了一組對(duì)基因表達(dá)模式具有潛在影響的相關(guān)變量。其包括技術(shù)和臨床變量。技術(shù)相關(guān)變量包括RNA處理日期(以后稱為批次)，RIN(作為RNA質(zhì)量/完整性的測(cè)量)，操作者和樣品收集中心。臨床相關(guān)變量包括組織學(xué)類型，吸煙狀態(tài)，腫瘤等級(jí)，表現(xiàn)評(píng)分(0ken，M.M.，等，ToxicityandresponsecriteriaoftheEasternCooperativeOncologyGroup(東方合作月中瘤學(xué)小組的毒性和反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)).AmJClinOncol(美國臨床腫瘤學(xué)雜志)，1982.5(6):第649-55頁)，人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，反應(yīng)者狀態(tài)和臨床受益狀態(tài)。分析工具包括單變量ANOVA和主要成分分析。對(duì)于這些相關(guān)變量中的每個(gè)，將單變量AN0VA獨(dú)立應(yīng)用于每個(gè)探針組。確定批次變量的顯著作用。在實(shí)踐上，批次變量捕獲樣品處理和Affymetrix芯片組日期之間的差異。在檢查批次變量幾乎與目的變量無關(guān)后，批次影響利用Johnson,W.E.，C丄i，禾口A.Rabinovic，AdjustingbatcheffectsinmicroarrayexpressiondatausingempiricalBayesmethods(利用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法調(diào)節(jié)微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)中的批次影響)Biostat(生物統(tǒng)計(jì)學(xué))，加0L8(1):第118_127頁中所述的方法校正。批次影響校正后，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)組在隨后的分析中起分析數(shù)據(jù)組的作用。組織學(xué)和RIN是通過描述性分析突出的2種另外的重要變量。步驟4:數(shù)據(jù)建模和測(cè)試將線性模型對(duì)每個(gè)探針組進(jìn)行獨(dú)立擬合。該模型中包括的變量報(bào)告在表2中。通過最大似然技術(shù)評(píng)估模型參數(shù)。使用對(duì)應(yīng)于"反應(yīng)"變量(XI)的參數(shù)評(píng)估"反應(yīng)"和"不反應(yīng)"患者組之間的表達(dá)水平的差異。表2:線性模型中包括的變量的描述。將由這些變量定義的線性模型，包括正態(tài)分布的誤差術(shù)語，對(duì)每個(gè)探針組進(jìn)行擬合。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在該模型中，將反應(yīng)變量定義如下反應(yīng)=是具有部分反應(yīng)作為其最佳反應(yīng)患者的患者(n=6)*反應(yīng)=否具有進(jìn)行性疾病(PD)作為其最佳反應(yīng)或無腫瘤評(píng)估的患者(n=65)排除具有穩(wěn)定疾病狀態(tài)的患者(n=31)?；驹硎峭ㄟ^集中在對(duì)療法具有更顯著反應(yīng)的患者，不反應(yīng)者組將變得更均一。對(duì)于每個(gè)探針組i，統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試的目的是為了否定這樣的假說，即對(duì)治療有反應(yīng)的患者和對(duì)治療不反應(yīng)的患者中平均表達(dá)水平相等，其中考慮了表2中列出的其他調(diào)節(jié)相關(guān)變量。在形式上，等同性的虛假設(shè)針對(duì)兩面性選擇對(duì)象來測(cè)試。在該虛假設(shè)下，關(guān)于該測(cè)試的Wald-統(tǒng)計(jì)學(xué)分布遵從具有64自由度的卡方分布。相應(yīng)的p值報(bào)告在表3中。線性模型的選擇由兩個(gè)原因促成。第一，線性建模是通用的、充分表征和有效的方法，其容許在評(píng)價(jià)目的變量作用時(shí)調(diào)節(jié)混同的變量。第二，假定樣品尺寸71，和數(shù)據(jù)組的標(biāo)準(zhǔn)化和定比例，正態(tài)分布假設(shè)是合理的和正當(dāng)?shù)摹６嘀販y(cè)試的問題通過使用用于鑒定差異表達(dá)基因列表的假發(fā)現(xiàn)率(FalseDiscoveryRate(FDR))標(biāo)準(zhǔn)來處理(Benjamini等，JournaloftheRoyalStatisticalSocietySeriesB-Methodological(皇室統(tǒng)計(jì)學(xué)協(xié)會(huì)雜志系列B_方法學(xué))，1995.57(1):第289-300頁)。宣稱具有低于0.3閾值的FDR的探針組為顯著的。將0.3截取值選為對(duì)嚴(yán)格控制假陽性風(fēng)險(xiǎn)的多重測(cè)試的嚴(yán)格校正和錯(cuò)過真正區(qū)別性標(biāo)記物風(fēng)險(xiǎn)之間的合理折衷。確定的標(biāo)記物基因報(bào)告在表3中。表3:基于比較"反應(yīng)者"和"進(jìn)展者(Progressors)"的標(biāo)記物。反應(yīng)者定義為具有與"部分反應(yīng)"(PR)相等的最佳反應(yīng)的患者。"進(jìn)展者"定義為具有與"進(jìn)行性疾病"(PD)或無可獲得的評(píng)估相等的最佳反應(yīng)的患者。無腫瘤評(píng)估的患者包括在"進(jìn)展者"組中，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情形中，由于早期退出而錯(cuò)過評(píng)估，這歸因于疾病進(jìn)展或死亡。欄1是探針組的Affymetrix識(shí)別物。欄2是相應(yīng)基因序列的GenBank登記號(hào)。欄3是相應(yīng)的正式基因名稱。欄4是"反應(yīng)者"和"進(jìn)展者"之間表達(dá)水平的相應(yīng)調(diào)節(jié)的平均倍數(shù)變化，如使用線性模型評(píng)估地。欄5是如由線性模型導(dǎo)出的，"反應(yīng)者"和"進(jìn)展者"之間表達(dá)水平差別測(cè)試的P值。欄6是調(diào)節(jié)的表達(dá)水平平均倍數(shù)變化的95%可靠區(qū)間。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對(duì)于每個(gè)探針組，方差的同質(zhì)性假定利用基于模型剩余(modelresiduals)的Fligner-Killeen檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)。該分析由以下三步組成測(cè)試所有分類變量以獲得它們水平之間的剩余方差的等同性注意具有最小p值的變量V如果最小p值小于0.001，則重?cái)M合該模型，以容許不同水平的變量V具有不同的方差。講一歩統(tǒng)i十學(xué)分禾斤對(duì)于選擇的候選標(biāo)記物EGFR，由獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)人員，在生效環(huán)境中進(jìn)行以下另外的分析關(guān)于來自初步Affymetrix分析的PFS(無進(jìn)展存活)的單變量Cox回歸，關(guān)于來自初步Affymetrix分析的反應(yīng)的單變量邏輯回歸和將這些分析的結(jié)果顯示在下文中。它們與初步分析的結(jié)果相一致并確認(rèn)所選標(biāo)記物的選擇。結(jié)果關(guān)于來自初步Affymetrix分析的PFS(無進(jìn)展存活)的單變量Cox回歸基因患者數(shù)目風(fēng)險(xiǎn)比風(fēng)險(xiǎn)比的95p-值%CIEGFR1020.750.58;0.970.0271結(jié)果關(guān)于來自初步Affymetrix分析的反應(yīng)的單變量Cox回歸基因患者數(shù)目比值比比值比的p-值95%CIEGFR1022.491.24;4.980.0103qRT-PCR利用用于qRT-PCR的Superscript111第一鏈合成高效混合物(SuperMix)(Invitrogen，CA，美國)，按照制造商的說明書但在不包含RNA酶H消化的條件下，合成cDNA。定量PCR利用TaqMar^基因表達(dá)測(cè)定法，在ABIPRISM7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)上，按照制造商的建議(A卯liedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，CA，美國)進(jìn)行。所有測(cè)定一式三份地進(jìn)行?；虮磉_(dá)測(cè)定法使用(HS01076086_ml[EGFR]并選擇使引物和探針跨過外顯子邊界或在AffymetrixGenechip⑧目的探針序列內(nèi)。包括2個(gè)持家基因作為內(nèi)源對(duì)照|3-2-微球蛋白(B2M;測(cè)定Hs99999907_ml)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT;測(cè)定Hs99999909_ml)。所有運(yùn)行包括校正樣品(MVP,來自人成年肺的總RNA;Stratagene，CA，美國)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用通用人參照總RNA(Stratagene，CA，美國)作為EGFR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。將全部樣品一式三份地測(cè)量。利用-ACt法進(jìn)行相對(duì)量化。結(jié)果如以前報(bào)告地，對(duì)本研究中包括的102名患者確定Affymetrix061^^11@基因表達(dá)模式。在這些患者中，對(duì)75名獲得qRT-PCR結(jié)果(表4)。具有qRT-PCR結(jié)果的患者的人口統(tǒng)計(jì)和臨床特征類似于整個(gè)群體(n=264)和具有可獲得的061^0^@基因表達(dá)模式的患者的那些。表4:基線特征具有qRT-PCR分析的患者(n=75)13年齡(中值，范圍)62(39-85)性別;n(%)男性19(25)女性56(75)ECOG性能狀態(tài)；n(%)07(9)145(60)223(31)組織學(xué);n(%)腺癌27(36)鱗狀細(xì)胞癌34(45)大細(xì)胞癌2(3)其他12(16)疾病狀態(tài);n(%)IIIB22(29)IV53(71)先前化學(xué)療法方案的數(shù)量；n(%)019(25)136(48)>220(27)14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在75名具有qRT-PCR結(jié)果的患者中，4(5X)具有部分反應(yīng)(PR)，23(31%)具有SD，39(52%)具有PD，且9(12X)不可評(píng)估。這些結(jié)果非常類似于在整個(gè)研究群體(n=264)中觀察到的那些。圖3顯示個(gè)體患者中EGFR的相對(duì)mRNA水平，如通過AffymetrixGenechip⑧模式和qRT-PCR評(píng)估地。圖3a顯示表達(dá)水平對(duì)比Genechip⑧模式的臨床結(jié)果，且圖3b顯示qRT-PCR的表達(dá)水平。在關(guān)于EGFRmRNA轉(zhuǎn)錄物的Genechip⑧和qRT-PCR測(cè)量之間存在良好相關(guān)性(圖3c;pearson's(皮爾森)p=0.76，p<0.01)。如使用Genechip⑧模式觀察地，利用qRT-PCR評(píng)估的EGFRmRNA水平顯示與針對(duì)厄洛替尼的反應(yīng)相關(guān)，在反應(yīng)者中觀察到與不反應(yīng)者相比更高的水平。對(duì)厄洛替尼治療的反應(yīng)總共264名來自12個(gè)國家和26個(gè)中心的患者在該研究中參與。26X患有IIIB期且24%患有IV期NSCLC。13.6%(n=36)的患者獲得目標(biāo)反應(yīng)，而31.4%(n=83)具有臨床益處(定義為具有目標(biāo)反應(yīng)或穩(wěn)定的疾病12周或更長)。中值總存活是7.6(CI7-9)個(gè)月且中值無進(jìn)展存活是11.3(CI8-12)周。關(guān)于臨床數(shù)據(jù)的全部詳細(xì)信息顯示在表1中。將新鮮冷凍的支氣管鏡檢活組織切片由所述受試者中收集，但是不是全部樣品在顯微切割(LCM)前都具有足夠的腫瘤含量，或LCM后不具有足夠的RNA產(chǎn)量以進(jìn)行微陣列分析，因此腫瘤材料僅可用于125名患者；這些中的122名具有可評(píng)估的RNA。另一組20份樣品沒有通過我們的微陣列數(shù)據(jù)質(zhì)量控制評(píng)估。在適合于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的102個(gè)微陣列數(shù)據(jù)組中，臨床特征顯示在表1中。當(dāng)總研究中的36名患者獲得目標(biāo)反應(yīng)時(shí)，其中僅6名具有微陣列數(shù)據(jù)；與獲得臨床益處的那些相類似，當(dāng)與全數(shù)據(jù)組中的83名相比時(shí)，具有微陣列數(shù)據(jù)的受試者數(shù)目僅為21名。6名被判斷為部分反應(yīng)者(PR)，31名具有SD且49名具有PD;在具有PR的6名患者中，5名具有腺癌且1名具有鱗狀細(xì)胞癌。數(shù)據(jù)組中沒有患者獲得CR。鑒定與對(duì)厄洛替尼的反應(yīng)有關(guān)的基因?qū)⒎磻?yīng)者定義為其最佳反應(yīng)是部分反應(yīng)的患者，而"進(jìn)展者"定義為具有進(jìn)行性疾病或?qū)ζ洳贿M(jìn)行評(píng)估的患者(在大部分情形中是由于疾病進(jìn)展或死亡引起的早期退出的結(jié)果)。因此，在該模型中，6名"反應(yīng)者"與65名"進(jìn)展者"進(jìn)行比較。在除去來自HG-U133A微陣列上的總共22283個(gè)的任何樣品中不存在的那些探針組后，使線性模型對(duì)該分析中使用的16353個(gè)剩余的探針組中的每一個(gè)獨(dú)立擬合。計(jì)算關(guān)于每個(gè)探針組的反應(yīng)和不反應(yīng)之間表達(dá)差異的P值。將0.3的假發(fā)現(xiàn)率(FDR)應(yīng)用于校正多重測(cè)試。由該分析鑒定的一系列三種候選標(biāo)記物顯示在表3中。討論靶向表皮生長因子受體(EGFR)作為癌癥治療方法基于其在若干上皮癌中普遍存在的異常表達(dá)來提議(Davies&Chamberlin1996，Mendelsohn,2002)。作為激活酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的突變和/或其擴(kuò)增的結(jié)果，EGFR涉及許多腫瘤包括40-80%的NSCLC腫瘤的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展(Baselga&Albanell，2002;Normanno等，2006)。當(dāng)激活時(shí)，受體經(jīng)歷二聚化作用，由此導(dǎo)致在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡抑制和新血管發(fā)生(neoangiogenesis)中具有作用的下游靶標(biāo)的磷酸化(Mendelsohn&Baselga，2003)。已經(jīng)開發(fā)了兩種主要的EGFR抑制劑類型，即靶向受體胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，和靶向受體催化結(jié)構(gòu)域的小分子酪氨酸激酶抑制劑。后者包括與ATP競(jìng)爭(zhēng)胞內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)的厄洛替尼。近年來發(fā)現(xiàn)若干因子在對(duì)厄洛替尼的靈敏性中起作用，包括女性性別、非吸煙者狀態(tài)、亞洲血統(tǒng)和腺癌組織學(xué)；考慮到提高的反應(yīng)率在這樣的臨床患者子集中明顯，正在進(jìn)行大量努力以說明關(guān)于患者成層現(xiàn)象的預(yù)測(cè)性分子標(biāo)記物。EGFR中的突變，EGFR基因座的擴(kuò)增和EGFR在蛋白水平的過表達(dá)，都與不同程度的反應(yīng)相關(guān)，盡管這些不是反應(yīng)的唯一分子決定因素。通過使用高密度寡核苷酸微陣列技術(shù)分析組織樣品，和對(duì)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)建模，我們已經(jīng)能夠鑒定其表達(dá)水平預(yù)測(cè)針對(duì)厄洛替尼的反應(yīng)的基因(PR對(duì)比PD的比較)(表3)。該基因是EGFR本身(2.8倍上調(diào)；p=0.00005)。我們的分析發(fā)現(xiàn)EGFRmRNA轉(zhuǎn)錄物在反應(yīng)者(PR)中與不反應(yīng)者(PD)相比上調(diào)的事實(shí)非常有趣，因?yàn)槠駷橹勾蠖鄶?shù)工作集中在蛋白水平的過表達(dá)，如通過免疫組織化學(xué)法評(píng)估的。1權(quán)利要求預(yù)測(cè)癌癥患者對(duì)使用EGFR抑制劑的治療的反應(yīng)的體外方法，其包括確定患者腫瘤樣品中EGFR基因的表達(dá)水平和對(duì)所述EGFR基因表達(dá)水平和代表不反應(yīng)患者群的腫瘤中EGFR基因表達(dá)水平的值進(jìn)行比較，其中所述患者的腫瘤樣品中EGFR基因的較高表達(dá)水平指示將對(duì)所述治療有反應(yīng)的患者。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述表達(dá)水平通過微陣列技術(shù)或測(cè)量RNA或蛋白表達(dá)的任何技術(shù)確定。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述EGFR抑制劑是厄洛替尼。4.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述癌癥是NSCLC。5.權(quán)利要求1-4的方法，其中與代表不反應(yīng)患者群的腫瘤中EGFR基因表達(dá)水平的值相比，所述EGFR基因在反應(yīng)患者的腫瘤樣品中表現(xiàn)出1.8-4.3或更多倍的更高表達(dá)。6.EGFR基因用于預(yù)測(cè)癌癥患者對(duì)EGFR抑制劑治療的反應(yīng)的用途。7.權(quán)利要求6的用途，其中所述癌癥是NSCLC。8權(quán)利要求6或7的用途，其中所述EGFR抑制劑是厄洛替尼。9.治療通過權(quán)利要求1-5的方法鑒定的癌癥患者的方法，其包括將EGFR抑制劑施用于所述患者。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述EGFR抑制劑是厄洛替尼。11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述癌癥是NSCLC。全文摘要本發(fā)明提供一種生物標(biāo)記物，其預(yù)測(cè)癌癥患者中針對(duì)使用EGFR抑制劑的治療的反應(yīng)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101778953SQ200880103307公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2008年8月7日優(yōu)先權(quán)日2007年8月14日發(fā)明者保羅·德爾馬,帕特里夏·麥克洛克林,芭芭拉·克盧格哈默,韋雷娜·盧策申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司