專利名稱：：一種生物傳感器及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物傳感器及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丁醇是一種重要的化工原料，有多種用途，如用于制造鄰苯二甲酸二丁酯和脂肪族二元酸丁酯類增塑劑，用于各種塑料和橡膠制品的生產(chǎn)。丁醇還可用來生產(chǎn)丁酸、丁酸、丁胺和醋酸丁酯，它們可用作樹脂、油漆、粘接劑的溶劑，也可用作油脂、藥物和香料的萃取劑及醇酸樹脂涂料的添加劑。近年來美國(guó)科學(xué)家的研究表明，丁醇還是一種極具潛力的新型生物燃料。與甲醇和乙醇相比，丁醇在性能上與汽油更為接近，這就更加引起了研究者和企業(yè)對(duì)其的研究開發(fā)興趣。丁醇可由化學(xué)合成法和發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法主要包括兩條路線，一是以丙烯為原料，經(jīng)羰基合成法生成正、異丁醛，加氫后分餾得到正丁醇；二是以乙醛為原料，經(jīng)醇醛縮合成丁醇醛，脫水生成丁烯醛，再經(jīng)加氫后得到正丁醇。丙烯和乙醛主要來自于石油等不可再生資源，不利于節(jié)約資源，因此，化學(xué)合成法的推廣受到了資源限制。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著全球石油等不可再生資源的價(jià)格迅速上漲以及綠色化學(xué)理念的提出，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇工藝由于原料來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)又重新受到重視。目前工業(yè)中用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的菌的生產(chǎn)能力和耐受性還都比較低，需要篩選出新型高產(chǎn)的產(chǎn)丁醇微生物。目前檢驗(yàn)微生物產(chǎn)丁醇的能力一般需要擴(kuò)大培養(yǎng)，再進(jìn)行氣相或液相檢測(cè)，這一系列過程都很繁瑣，耗時(shí)耗力。因此，篩選產(chǎn)丁醇微生物的關(guān)鍵是建立一套快速、有效檢測(cè)丁醇存在的技術(shù)。全細(xì)胞傳感器是一種利用完整活細(xì)胞為載體，能夠連續(xù)檢測(cè)和分析細(xì)胞在外界刺激下的生理性能，定性定量測(cè)定物質(zhì)信息(如確定該類物質(zhì)的存在與否以及濃度大小等)的檢測(cè)器。與酶?jìng)鞲衅飨啾?，全?xì)胞傳感器應(yīng)用范圍更廣，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和提供的信息更多，更能準(zhǔn)確地反應(yīng)被分析物的信息；其次，全細(xì)胞是一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定修復(fù)整合酶活性，產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)而且重復(fù)性好；另外，全細(xì)胞傳感器在環(huán)境毒性化合物檢測(cè)方面彌補(bǔ)了氣相和液相等傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足；尤為重要的是，全細(xì)胞傳感器的檢測(cè)酶為胞內(nèi)酶，不存在酶的純化、酶活性保持以及失活等問題。因此，全細(xì)胞傳感器在有機(jī)化合物檢測(cè)方面得到了更為迅速的發(fā)展。微生物全細(xì)胞傳感器的最大特點(diǎn)就是能夠檢測(cè)天然環(huán)境中可供生物利用的痕量物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。本發(fā)明所提供的DNA片段，其自上游至下游依次為調(diào)節(jié)基因、丁醇特異性啟動(dòng)子和報(bào)告蛋白的編碼基因；所述調(diào)節(jié)基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述報(bào)告蛋白為如下(1)或(2)所示的蛋白-(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。為了使上述(a)或(1)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2或序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l、標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(a)、(b)、(1)或(2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到；上述(2)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明所提供的DNA片段中，所述調(diào)節(jié)基因可為如下(c)、(d)或(e)所示的基因(c)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；(d)在嚴(yán)格條件下與(c)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(e)與(c)限定的DNA序列有9(W以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；所述報(bào)告蛋白的編碼基因可為如下(3)、(4)或(5)所示的基因(3)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與(3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(5)與(3)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；所述丁醇特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列可為如下I、II、III或IV所示I至少含有序列表中序列5中自5'末端第148-198位核苷酸的DNA分子；II其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；III在嚴(yán)格條件下與I或II限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；IV與I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。含有上述任一所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生物傳感器。本發(fā)明所提供的生物傳感器，包括含有上述任一所述DNA片段的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。一般情況下，本發(fā)明的生物傳感器與熒光顯微鏡等物理器件聯(lián)合使用。其中，所述菌可為大腸桿菌、枯草芽胞桿菌。上述生物傳感器在檢測(cè)丁醇中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體可用于環(huán)境樣品(如土壤、污水等)中丁醇的定性和定量檢測(cè)。上述生物傳感器在篩選丁醇產(chǎn)生菌中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，如可應(yīng)用于從環(huán)境樣品中篩選能產(chǎn)生丁醇的菌株、從經(jīng)誘變等處理的突變菌株庫中篩選產(chǎn)丁醇能力比出發(fā)菌株強(qiáng)的菌株等。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種報(bào)告蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。上述報(bào)告蛋白在制備生物傳感器中的應(yīng)用及上述報(bào)告蛋白的編碼基因在制備生物傳感器中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明是將本發(fā)明報(bào)告蛋白的編碼基因與丁醇特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列相連，得到融合基因，再將融合基因?qū)胨拗骶校玫缴飩鞲衅?，該傳感器能特異的檢測(cè)丁醇。在實(shí)際應(yīng)用中，還可以將本發(fā)明報(bào)告蛋白的編碼基因與其它對(duì)某物質(zhì)具有特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子相連，從而制備檢測(cè)該物質(zhì)的生物傳感器。生物傳感器通常采用綠色熒光蛋白作為報(bào)告蛋白，這種傳感器適用于單細(xì)胞檢測(cè)，而且表型更為直觀。然而綠色熒光蛋白形成生色團(tuán)過程嚴(yán)格需要輔因子分子氧參與，這種缺陷就制約了生物傳感器在厭氧條件下的應(yīng)用。本發(fā)明的來源于尸se"A/z/朋i'a尸WiA的報(bào)告蛋白，其在厭氧和好氧條件下均能依賴黃素單核苷酸產(chǎn)生熒光，因此，由其所構(gòu)建的傳感器即使在厭氧條件下也能保證熒光信號(hào)分子的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的生物傳感器，在厭氧條件下能高效、特異和靈敏地檢測(cè)丁醇，既可定性又可半定量，而且即使在有其它物質(zhì)(如丙酮、乙醇)存在的情況下，也不影響其對(duì)丁醇的檢測(cè)效果；本發(fā)明生物傳感器借助流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及酶標(biāo)儀等儀器，實(shí)現(xiàn)了從大量微生物樣品中高通量篩選產(chǎn)丁醇微生物或產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)微生物，縮短和簡(jiǎn)化了篩選過程，解決了目前丁醇檢測(cè)手段的費(fèi)時(shí)、繁瑣等缺點(diǎn)，有利于迅速擴(kuò)充現(xiàn)有的產(chǎn)丁醇微生物資源，獲得新型、高效產(chǎn)丁醇微生物，從而有效提高丁醇工業(yè)發(fā)酵的產(chǎn)量。圖1為重組載體pUC18//Ptot/FbFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為生物傳感器熒光活性檢測(cè)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從生物公司購買。惡臭假單胞菌(尸sewofe歷o/^a.A/z^VaKT2440)購自DSMZ。酵母粉購自英國(guó)0X0ID公司(目錄號(hào)1023098)，蛋白胨購啟英國(guó)0X0ID公司(目錄號(hào)594566)，牛肉膏購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；pUC18購自寶生物工程(大連)有限公司。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)67a^n'力'咖ace"Zwz^h'c咖響應(yīng)丁醇濃度的生理和分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，克隆受丁醇誘導(dǎo)特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)節(jié)基因，將其與報(bào)告蛋白FbFP[flavinmononucleotide(F麗)-basedfluorescentproteins]編石馬基因在大腸桿菌中融合表達(dá)，構(gòu)建檢測(cè)丁醇的生物傳感器。實(shí)施例l、生物傳感器的制備一、融合基因的制備特異性啟動(dòng)子的獲得根據(jù)丙酮丁醇梭菌(67oWr^7咖ace^Z^^ic鵬)ATCC824(US2007020740(A1))中丁醇誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)(Genbank中的CAC1485)，設(shè)計(jì)如下引物CGCGGATCCCAGAAACGGTTAAATTTGAA、TAGTACACCTACTTTGATAAGAGTTTTGCGTTGATCAT，以Csce"Zw^h'cMzATCC824的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序驗(yàn)證，表明得到序列正確的特異性啟動(dòng)子(命名為P，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；報(bào)告蛋白編碼基因的獲得根據(jù)惡臭假單胞菌(/^ewo^w/7^.尸w^Ws)的序歹!j(Genbabk號(hào)AE015451)，設(shè)計(jì)如下弓l物ATGATCAACGCAAAACTC、CCGGAATTCTCAGTGCTTGGCCTGG，以惡臭假單胞菌(/^ew/oMMia.A/OW3)的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，得到序列正確的報(bào)告蛋白編碼基因(命名為FbFP)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如序列表中序列1所示；調(diào)節(jié)基因序列的獲得根據(jù)丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824中丁醇誘導(dǎo)表達(dá)基因的調(diào)節(jié)基因的序列(Genbank中的CAC1493)，設(shè)計(jì)如下引物CCCAAGCTTATGCCAAATGTGAAGTCTAT、AACTGCAGCTAAAATGTGCTTACACAAT，以C.acefoZw^h'c鵬ATCC824的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，得到序列正確的調(diào)節(jié)基因序列(命名為力Wi)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，該核苷酸序列編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；調(diào)節(jié)基因、特異性啟動(dòng)子序列與報(bào)告蛋白編碼基因的融合分別通過PCR擴(kuò)增上述特異性啟動(dòng)子和報(bào)告基因，然后利用融合PCR進(jìn)行連接，得到啟動(dòng)子和報(bào)告基因的融合片段P^/fbFP;用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI酶切pUC18，回收大片段，將上述調(diào)節(jié)基因PCR產(chǎn)物與回收的大片段連接，得到含有調(diào)節(jié)基因的重組載體pUC18/to^;用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切重組載體pUC18/^/M，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切融合片段Pto,/FbFP，將酶切產(chǎn)物連接，得到含有調(diào)節(jié)基因、特異性啟動(dòng)子序列與報(bào)告蛋白編碼基因的融合基因的重組載體，將其命名為pUC18/Zw"/P紐/FbFP。將重組載體pUC18/P紐/FbFP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明陽性質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和序列正確，其中的調(diào)節(jié)基因、特異性啟動(dòng)子、報(bào)告基因的核苷酸序列正確，其連接順序也正確，即得到序列正確的融合基因，融合基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。含有融合基因的重組載體pUC18//Pto/FbFP的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。圖1中，A表示抗性基因(Ws);B表示co^5V復(fù)制起點(diǎn)(oricWi57);C表示調(diào)節(jié)基因(;D表示受丁醇誘導(dǎo)特異表達(dá)基因即被調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子(P^);E表示報(bào)告蛋白編石馬基因(reporterproteingene)。二、生物傳感器的制備將上述陽性重組載體pUC18//wM/P紐/FbFP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種至含有終濃度為100mg/L的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取單克隆接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，得到陽性克隆，即為生物傳感器。實(shí)施例2、生物傳感器的應(yīng)用一、檢測(cè)樣品中丁醇濃度將實(shí)施例1制備的生物傳感器分別接種至含有不同終濃度的丁醇、丙酮、乙醇、乙酸和丁酸的CGM培養(yǎng)基中，各物質(zhì)在培養(yǎng)基中的不同終濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.2%(v:v);在厭氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌0、1、2、4、6、8、10h;采用熒光顯微鏡檢測(cè)報(bào)告蛋白FbFP熒光活性。以接種不含任何質(zhì)粒的大腸桿菌作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果，傳感器接種6h后，在丁醇濃度為O.1-0.7%(v:v)的培養(yǎng)基中有明顯的熒光產(chǎn)生(圖2)，而不同濃度的丙酮、乙醇、乙酸和丁酸均未引發(fā)傳感器產(chǎn)生熒光，接種不含任何質(zhì)粒的大腸桿菌的培養(yǎng)基中也均未產(chǎn)生熒光。表明，實(shí)施例l中的傳感器可用來檢測(cè)含有O.1-0.7%(V:V)丁醇的樣品，即可對(duì)樣品中的丁醇進(jìn)行半定量檢測(cè)。二、利用傳感器篩選丙酮丁醇梭菌突變文庫本實(shí)驗(yàn)是用生物傳感器篩選產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)的菌株。出發(fā)菌為C.acetototyh'cu/SMB-1(CGMCCNs.2287，中國(guó)微生物菌種保藏中心)(CN101250496)。誘變處理將菌種接入RCM培養(yǎng)基中，置于363S。C厭氧培養(yǎng)3648h，等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期時(shí)，取出離心，用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液，用終濃度為0.51%硫酸二乙酯誘變1030min，用硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，離心，用生理鹽水洗滌兩次，去除剩余的誘變劑。將誘變劑處理過的C.ace"Zw^h'c咖突變文庫涂布于固體培養(yǎng)基上，在溫度37°C、相對(duì)濕度為60%的厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于裝有液體CGM培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，同時(shí)對(duì)該菌落做備份；厭氧培養(yǎng)60h后，分別接種生物傳感器于96孔板內(nèi)，混合培養(yǎng)12h，利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔板的熒光強(qiáng)度，以未經(jīng)任何誘變的出發(fā)菌株作為對(duì)照。選擇熒光強(qiáng)度高于未經(jīng)任何誘變的出發(fā)菌株的處理，即為產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)的菌株。再利用液相色譜對(duì)其備份菌株產(chǎn)丁醇性能進(jìn)行鑒定。液相色譜方法及條件樣品前處理取發(fā)酵液，12000rpm離心lmin，取上清液，用0.22um濾膜過濾；色譜條件Agilent1200液相色譜儀，示差檢測(cè)器；BioRadAminexHPX-87H有機(jī)酸柱(300*7.8畫)，柱溫15。C;上樣量10yl;流動(dòng)相為0.05mMH2S04，流速0.5ml/min。丁醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司(目錄號(hào)4C006217);在如上色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為40.9分鐘。固體培養(yǎng)基組成蛋白胨，10g/L;牛肉膏，10g/L;酵母粉，3g/L;葡萄糖,5g/L;可溶性淀粉，10g/L;NaCl，5g/L;Cys-HC1，0.5g/L;醋酸鈉，3g/L，瓊脂粉，15g/L，溶劑為水。CGM培養(yǎng)基:KH2P04，0.75g/L;K2HP04,3H200.75g/L;MgSO"H20，0.4g/L;FeSO7H20，0.01g/L;NaCl，1.0g/L;天冬酰胺，2.0g/L;酵母粉，5.0g/L;(NH4)2S04，2.0g/L;葡萄糖，50g/L，溶劑為水。RCM培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g,淀粉10.0g，乙酸鈉3.0g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，pH6.8。培養(yǎng)溫度為37°C。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，利用本發(fā)明傳感器進(jìn)行檢測(cè)，得到的熒光強(qiáng)度與菌株實(shí)際產(chǎn)生丁醇的能力成正比，表明本發(fā)明傳感器可以用于高通量篩選誘變后的產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)的菌株。表2、篩選菌株產(chǎn)丁醇性能的鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>三、實(shí)施例1中制備的生物傳感器用于篩選環(huán)境樣品中丁醇生產(chǎn)菌取北京郊區(qū)土豆地土壤，分別以io倍濃度遞減方式對(duì)土壤懸浮液進(jìn)行稀釋。然后從稀釋后的樣品中篩選生產(chǎn)丁醇的菌株。篩選方法及所用的培養(yǎng)基等均同實(shí)驗(yàn)二中所述一致。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，能夠產(chǎn)生丁醇的菌株均可以通過本發(fā)明生物傳感器檢測(cè)出，表明，本發(fā)明生物傳感器可用于環(huán)境樣品中能生產(chǎn)丁醇的菌株的篩選。表3、環(huán)境微生物產(chǎn)丁醇性能鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所〈120〉一種生物傳感器及其應(yīng)用<130〉CGGNARC82062<160>6<210〉1<211〉148<212>PRT<213〉假單胞菌屬惡臭假單胞菌(Pset/ctomoA7/ap〃f/Qfa)<400〉1MetlieAsnAlaLysLeuLeuGinLeuMetValGluHisSerAsnAsp151015GlylieValValAlaGluGinGluGlyAsnGluSerlieLeulieTyr202530ValAsnProAlaPheGluArgLeuThrGlyTyrCysAlaAspAsplie354045LeuTyrGinAspAlaArgPheLeuGinGlyGluAspHisAspGinPro505560GlylieAlalielieArgGluAlalieArgGluGlyArgProCysCys65707580GinValLeuArgAsnTyrArgLysAspGlySerLeuPheTrpAsnGlu859095LeuSerlieThrProValHisAsnGluAlaAspGinLeuThrTyrTyr100105110lieGlylieGinArgAspValThrAlaGinValPheAlaGluGluArg115120125ValArgGluLeuGluAlaGluValAlaGluLeuArgArgGinGinGly130135140GinAlaLysHis145〈210〉2<211〉142<212〉PRT<213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(67osW(/2'mzacef。紐Wc咖)〈400〉2MetProAsnValLysSerlieLeuAsnHislieGluLysLeuProLeu1015GinGinLysGluGinlieLeuSerThrLeuGluGlulieLeuValLeu202530GlySerGinValSerGinValGluGinGluValLysGluPheArgPhe354045SerLysGlyLysValCysProlieCysGlySerGluThrlieSerArg505560AsnSerLysTyrAsnGlyLysGinGlyTyrlieCysLysSerCysLys65707580LysSerPheThrAspPheThrAsnSerAlaThrTyrLysSerLysLys859095ThrLeuAspLysTrpLeuLysTyrAlaLysCysMetValAsnGlyTyr100105110SerlieArgLysSerAlaLysValValGlulieAsnlieAlaThrSer115120125PhePheTrpArgHisLyslieLeuAspCysValSerThrPhe130135140〈210>3<211〉447〈212〉DNA〈213〉假單胞菌屬惡臭假單胞菌(Pseucfomon/apuf,'da)<400〉3atgatcaacggccgagcaggaccggctactcacgaccagccaggtgctgcccggtgcacagcgc3agt3tcggcagcaggC3333CtCCtgcgccgscg3cgggcatcgcgcaactaccgscgsggcggatcgccgaggagccaggccaagcaactgatggagcatcctttsttctctstaattatccgccaaagacggcccagctgaccsagggttcgcgcactgagtcgaacattaXctacgtcacaggactgccgaggcgatcc3gcctgttcttsctscstcggagctggaggccaacgatggacccggccttgttttcttcsgcgaaggccgggaacgagttgcatccagcgctgaagtggccatcgttgtccgsgcgcctggggcgaggstcccctgctgcgtccatcacacgatgtcacsggsactgcgc6012018024030036〇420447〈210〉4<211>429〈212〉DNA<213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(Wo9tn'力'鄉(xiāng)sc"o力"0^z'c鵬)〈400〉4atgccaaatgC333t3Ct3tcaagaagttasagtccttt3tggcttaaattgaagtctatc33cttt3g3aagaatttagctgscttcacatgctaagtgattawbcatagaaattcttsttttccaaggtataatggttsattctgcacatggttaataagtttctttattgaaaagtgtcctaggttaaacaaggatggatattctatggagacatataccattacacacaagtaaggcccaatttgatatctgcaatcaggaagagccaagtagaatggttctgaagtcttgtaa_3attagstsagtgctaaagttttgtgtaagc42960120180240300360420<210〉5<211〉339<212〉DNA<213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(Gosz^rio7zMacez^力wt7乃'cMH)〈400〉5cagaaacggttaaatttgaaagtttataataaaatacggtatttcaacaagtaaagtctgcggctttttgttttaaaaacttgttatgcattgtgaattatattattgatataatcagcttgaattttgtgattatagtcatattaaataatatcgatactagtattaatgatattttatgtagacaactgtgtaaaatagacattaaatgtctaataaagttgaataaaatatatscaaactggcgtatttttttaaaatatcaaattttatcasagtaggtgtactaaagtcgtagattaggaaaggtttWtt333agataaaaaa6012018024〇300339〈210〉6〈211〉1233<212〉腿〈220〉〈223〉<400〉6aagcttatgcgtagaacsagtctgaaactatgtasaaagtgataagtggcaaagttgtaggtttstsatagaattttgtgatattttatgccattacsgccssgtsagccccwtttgtg3tctgc3agtaggasgagtgattcttgattcaaatgtgaassgttaaagatatcaagaaaccttt3Ctg己tt333tstgctttagctgcsa33t3cggtstgttstgc3tattatagtcat己gac33Ctggtgtactaataagtagaacagttctgaaaccttgtaaaaatagataagtgctaaagttgtgtgtaagcacgtctatsttatttagasgaaatttagattttagcasgtatcttcactaattasgtgcstgggtcgsctcttgtgaattatctggcgtattgccaaatgtgaa_tacta_tcaaga3gtt333gtcctttactgcttaaatatagaaattaatattttaggaawtcststtgsttcttgtcctccsaggggatctgcaacctgttaatggatttcttttggaagaggatcccagtcgtagagtaggaaaggtat3t3C3gttgaatttsgatgscttC3Ct3gctaagtgcaatagcaacaattca33agttacctaggttcscaaagtatgccc3ttct3tcsgsgaaacggtttaaagtctgcattattgatatatcgatscttttttaaaataaatttcttgttttccaagggataatggtaaattctgcasctggttaatgggtttcttttgattac3gcsgaatttgtggtctgcaagtctgaaaacattagaagsgtgcttcttgsttgtggctttttgttaatcagcttagt3ttaatgtctaataaag3tC333tttttgaaaagttacctsggttcactataaaagt3t3ttCt3tCgagacataas1233601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200權(quán)利要求1、一種DNA片段，其自上游至下游依次為調(diào)節(jié)基因、丁醇特異性啟動(dòng)子和報(bào)告蛋白的編碼基因；所述調(diào)節(jié)基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述報(bào)告蛋白為如下(1)或(2)所示的蛋白(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述調(diào)節(jié)基因?yàn)槿缦?c)、(d)或(e)所示的基因(c)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；(d)在嚴(yán)格條件下與(c)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(e)與(c)限定的DNA序列有90。/Q以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；所述報(bào)告蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?3)、(4)或(5)所示的基因(3)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與(3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的咖A分子；(5)與(3)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；所述丁醇特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列為如下I、II、III或IV所示I至少含有序列表中序列5中自5'末端第148-198位核苷酸的DNA分子；II其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；III在嚴(yán)格條件下與I或II限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；IV與I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。3、含有權(quán)利要求1或2所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。4、一種生物傳感器，包括含有權(quán)利要求1或2所述DNA片段的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5、權(quán)利要求4所述生物傳感器在檢測(cè)丁醇中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求4所述生物傳感器在篩選產(chǎn)丁醇的菌中的應(yīng)用。7、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。8、權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。9、權(quán)利要求7所述蛋白在制備生物傳感器中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求8所述編碼基因在制備生物傳感器中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種DNA片段，其自上游至下游依次為調(diào)節(jié)基因、丁醇特異性啟動(dòng)子和報(bào)告蛋白的編碼基因；所述調(diào)節(jié)基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的傳感器，在厭氧條件下能高效、特異和靈敏地檢測(cè)丁醇，既可定性又可半定量，借助流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及酶標(biāo)儀等儀器，實(shí)現(xiàn)了從大量微生物樣品中高通量篩選產(chǎn)丁醇微生物或產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)微生物，縮短和簡(jiǎn)化了篩選過程，解決了目前丁醇檢測(cè)手段的費(fèi)時(shí)、繁瑣等缺點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101418295SQ20081023947公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者張延平,寅李,賈開志申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所