專利名稱：：耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：世界上至少20%的耕地和超過40%的灌溉耕地在不同程度上受到鹽害的影響，土壤鹽漬化是當(dāng)今世界普遍關(guān)注的問題。鹽脅迫是植物生長發(fā)育的主要限制因子之一。大多數(shù)植物尤其是農(nóng)作物對(duì)鹽脅迫是敏感的，它們?cè)邴}堿地生長時(shí)，由于受鹽堿的脅迫作用，生長緩慢，往往葉片變黃、死亡、脫落，嚴(yán)重影響光合作用，有時(shí)甚至整株植物枯萎死亡，從而造成農(nóng)作物減產(chǎn)。高鹽等環(huán)境脅迫已極大的限制了全世界糧食產(chǎn)量的提高，因此，認(rèn)識(shí)植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)機(jī)制，提高植物的抗鹽性，是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。鹽脅迫對(duì)植物造成的負(fù)向效應(yīng)主要表現(xiàn)為鉀、鈣、磷、氮攝入不足造成的營養(yǎng)脅迫；鈉離子、氯離子及硫酸鹽的累積造成的離子毒害效應(yīng)；土壤中高濃度溶質(zhì)造成的滲透脅迫；活性氧積累造成生物膜、蛋白和核酸的破壞，即氧化脅迫。植物對(duì)鹽脅迫的耐受反應(yīng)是近年來植物研究的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)，植物對(duì)鹽脅迫耐受性的分子生物學(xué)研究不僅對(duì)于培育耐鹽農(nóng)作物品種具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且也是植物基因表達(dá)調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等基礎(chǔ)理論研究的重要內(nèi)容。迄今為止已分離出一批與植物耐鹽相關(guān)的基因，根據(jù)基因產(chǎn)物的作用，可將鹽脅迫誘導(dǎo)基因做如下分類(l)功能蛋白基因是指在植物抗性中起作用的蛋白質(zhì)及多種有機(jī)溶質(zhì)的合成酶基因，如LEA蛋白、水孔蛋白的基因；參與脯氨酸、甜菜堿、糖和糖醇類等合成過程的一些酶的基因。(2)與信號(hào)傳遞相關(guān)的基因一些轉(zhuǎn)錄因子，如bZIP轉(zhuǎn)錄因子、Myc轉(zhuǎn)錄因子、Myb轉(zhuǎn)錄因子、DREB轉(zhuǎn)錄因子、熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)等；一些蛋白激酶，如MAP激酶、CDP激酶；在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程種起重要作用的蛋白酶，如磷酸脂酶、磷脂酶C等。(3)與跨膜運(yùn)輸有關(guān)的基因這類基因與K+輸送、Na7H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，如SOSl、SalT等，其中，ZhuJK等進(jìn)行的一系列關(guān)于sos突變體的工作揭示出一條耐鹽脅迫反應(yīng)中全新的信號(hào)通路。小鹽芥(Thellugiellahalophila)是擬南芥的一個(gè)近緣屬，生長在華東地區(qū)海灘鹽土上，屬鹽生植物，極端耐鹽，可用于研究植物耐鹽的分子機(jī)理。擬南芥完成其生活史的NaCl濃度最高不超過75mM，而小鹽芥能在超過300mM的NaCl濃度下完成其生活史。小鹽芥有許多特征和模式植物擬南芥相似相似的形態(tài)和生活史(個(gè)體小，生活周期短，自花傳粉)、易于轉(zhuǎn)化、基因組簡單、相近的親緣關(guān)系(cDNA序列中90%的核苷酸相同)、相似的基因序列和排列。小鹽芥的基因組大小接近于擬南芥的兩倍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物耐鹽相關(guān)蛋白，名稱為ThST3(Salttolerant3)，來源于小鹽芥(Thellugiellahalophila)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由155個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)保守的C2結(jié)構(gòu)域(自序列1的氨基末端第5至106位氨基酸殘基)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指將序列1的C2結(jié)構(gòu)域外的氨基酸進(jìn)行取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的ThST3便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的ThST3可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的ThST3的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'端第1至468位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述植物耐鹽相關(guān)蛋白的編碼基因(ThST3)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植物耐逆性相關(guān)蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列2由468個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5'末端的第1至468位脫氧核糖核苷酸為ThST3的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)。含有所述編碼基因(ThST3)的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)擴(kuò)增所述基因的引物。所述引物具體可為序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述編碼基因(ThST3)的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用ThST3構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體可將所述編碼基因(ThST3)插入pCAMBIA1300-221的多克隆位點(diǎn)得到。所述重組表達(dá)載體具體來說，可為pCAMBIA1300-221-35S-ThST3;所述pCAMBIA1300-221-35S-ThST3是將pCAMBIA1300-221的Xbal和Sacl位點(diǎn)間的小片段取代為所述編碼基因(ThST3)得到的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐鹽植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐鹽植物的方法，可將所述植物耐鹽相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到耐鹽植物；具體來說，可以將所述含有所述編碼基因(ThST3)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐鹽植物。本發(fā)明所提供的培育耐鹽植物的方法，還可以將上述耐鹽植物與其它植物嫁接，得到新的耐鹽植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的水稻受體類蛋白ThST3的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得鹽耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因能顯著提高植株的耐鹽性。本發(fā)明的耐鹽相關(guān)蛋白可在擬南芥維管束中進(jìn)行長距離運(yùn)輸。本發(fā)明的耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因可應(yīng)用于培育耐鹽植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和應(yīng)用前景。以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為ThST3與其同源蛋白的分子結(jié)構(gòu)及相互比較分析。圖2為正常環(huán)境下擬南芥種子的萌發(fā)情況。圖3為鹽脅迫環(huán)境下擬南芥種子的萌發(fā)情況。圖4為鹽脅迫環(huán)境下擬南芥種子萌發(fā)后的生長情況。圖5為擬南芥植株成體的生長狀況。圖6為嫁接實(shí)驗(yàn)中ThST3的移動(dòng)示意圖。圖7為擬南芥嫁接植物的耐鹽性。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、耐鹽相關(guān)蛋白基因ThST3的篩選及其cDNA的克隆—、ThST3的篩選用200mMNaCl處理小鹽芥(Thellugiellahalophila)幼苗，提取處理后小鹽芥的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將小鹽芥的cDNA文庫構(gòu)建在雙元載體pGreen-SA上，用重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥。同時(shí)以空載體pGreen-GFP轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的擬南芥作為對(duì)照。將轉(zhuǎn)基因擬南芥用200mMNaCl處理，篩選耐鹽株系，發(fā)現(xiàn)株系NO.0003比對(duì)照耐鹽，將其命名為ThST3(Salttolerant3)。提取ThST3株系擬南芥的基因組DNA，用載體pGreen上的引物，通過PCR方法擴(kuò)增載體上的插入片段，將PCR產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，插入片段為序列2所示的核苷酸序列，編碼序列l(wèi)所示的氨基酸序列。通過SMART程序，發(fā)現(xiàn)序列1所示的氨基酸其N端含有一個(gè)保守的C2domain。ThST3與其同源蛋白的分子結(jié)構(gòu)及相互比較分析見圖1。圖中實(shí)心黑線對(duì)應(yīng)的下方區(qū)域?yàn)榕c保守的Ca"/phospholipid-bindingC2domain對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；白色方框A、B及C對(duì)應(yīng)的下方區(qū)域?yàn)镃2domain的三個(gè)亞域；'*'對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為C2domain中保守的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。二、ThST3cDNA的克隆根據(jù)序列2設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，用于擴(kuò)增ThST3基因的CDS序列同時(shí)將ThST3基因的CDS序列兩端加上EcoRI酶切位點(diǎn)，所用的引物序列如下正引物(序列表的序列3):5'-CGGAATTCGATGGCTGTGGGAATCCTC-3';反引物(序列表的序列4):5，-CGGAATTCCTAATCAAATTGGCTATGCTTCC-3，。以小鹽芥(Thellugiellahalophila)(WangZI，LiPH，F(xiàn)redricksenM，GongZH，KimCS，ZhangCQ，BohnertHJ，ZhuJK，BressanRA，HasegawaPM，ZhaoYXandZhangH(2004)ExpressedsequencetagsfromThellungiellahalophila，anewmodeltostudyplantsalt-tolerance.PlantScience166，609-616.)(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為0.45kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，參照Cohen等的方法(ProcNatl6AcadSci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的基因由468個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框(ORF)為序列表中序列2的自5'末端第1至468位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白質(zhì)。將序列l(wèi)所示蛋白命名為ThST3，將序列2所示的基因命名為ThST3，將含有序列2所示基因的pGEM-TEasy載體命名為pTE-ThST3。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)ThST3基因植株的獲得和耐逆性鑒定—、轉(zhuǎn)ThST3基因植株的獲得Xbal和Sacl雙酶切pTE-ThST3載體，將酶切產(chǎn)物連入經(jīng)同樣酶切后的雙元載體pCAMBIA1300-221(CAMBIA，Canberra,Australia)的35S啟動(dòng)子后面，然后將GFP熒光蛋白的編碼基因?qū)胫亟M質(zhì)粒，構(gòu)建了正義表達(dá)載體pCAMBIA1300-221-35S-ThST3。將正義表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲透法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0)。在卡那霉素(kanamycin)濃度為50微克/毫升的MS平板上進(jìn)行篩選，得到17株陽性株系。提取轉(zhuǎn)基因植物的DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明17株轉(zhuǎn)基因株系皆為ThST3基因的過量表達(dá)株系。獲得了17個(gè)株系的T。代轉(zhuǎn)基因擬南芥。制備轉(zhuǎn)空載體的T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，方法同上。二、轉(zhuǎn)ThST3基因植株種子的萌發(fā)情況試驗(yàn)材料100粒野生型擬南芥(Col-0)(對(duì)照1);100粒轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的T2代種子(對(duì)照2);100粒20.3株系轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子；100粒16.2株系轉(zhuǎn)基因植株的L代種子。1、正常環(huán)境下不同擬南芥種子的萌發(fā)情況分別將四種種子直接播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，4t:春化3天；然后移至23t:進(jìn)行萌發(fā)，從置于萌發(fā)條件開始計(jì)時(shí)，每天觀察萌發(fā)情況。結(jié)果見圖2。圖2中，2-A為擬南芥種子萌發(fā)第4天的照片；2_B為擬南芥種子的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，四種種子的萌發(fā)速率基本相近。2、鹽脅迫環(huán)境下不同擬南芥種子的萌發(fā)情況分別將四種種子直接播種于含有150mMNaCl的MS固體培養(yǎng)基上，4。C春化3天；然后移至23t:進(jìn)行萌發(fā)，從置于萌發(fā)條件開始計(jì)時(shí)，每天觀察萌發(fā)情況。結(jié)果見圖3。圖3中，3-A為擬南芥種子萌發(fā)第4天的照片；3_B為擬南芥種子的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，20.3株系轉(zhuǎn)基因植株和16.2株系轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)速率明顯快于兩個(gè)對(duì)照，所以導(dǎo)入ThST3基因可減輕鹽脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的抑制。三、轉(zhuǎn)ThST3基因植株種子萌發(fā)后的生長情況試驗(yàn)材料100粒野生型擬南芥(Col-0)(對(duì)照1);100粒轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的T2代種子(對(duì)照2);100粒20.3株系轉(zhuǎn)基因植株的T2代種子；100粒16.2株系轉(zhuǎn)基因植株的L代種子。1、正常環(huán)境下不同擬南芥種子萌發(fā)后的生長情況分別將四種種子直接播種于MS培養(yǎng)基的平板(50粒)和豎板(50粒)上，4t:春化3天；然后移至23t:進(jìn)行萌發(fā)，從移至23t:開始計(jì)時(shí)，第12天進(jìn)行表型觀察，拍照、統(tǒng)計(jì)長出真葉的植物的百分率、統(tǒng)計(jì)植物主根根長。結(jié)果顯示在平板上，四種植株的莖的生長狀態(tài)一致；在豎板上，四種植株的根的生長狀態(tài)也一致。2、鹽脅迫環(huán)境下不同擬南芥種子萌發(fā)后的生長情況分別將四種種子直接播種于含有150mMNaCl的MS固體培養(yǎng)基的平板(50粒)和豎板(50粒)上，4t:春化3天；然后移至23t:進(jìn)行萌發(fā)，從移至23t:開始計(jì)時(shí)，第12天進(jìn)行表型觀察。結(jié)果見圖4。圖4中，4-A為平板上擬南芥種子的生長狀態(tài)；4_B為豎板上擬南芥種子生長狀態(tài)；4-C為平板上長出真葉的植物的百分率；4-D為豎板上植物主根根長。結(jié)果顯示在平板上，20.3株系轉(zhuǎn)基因植株和16.2株系轉(zhuǎn)基因植株均可長出真葉，且葉片保持嫩綠，兩個(gè)對(duì)照均只停留在兩片子葉狀態(tài)，且葉片已開始發(fā)生黃化和漂白，此結(jié)果表明ThST3可以減輕鹽脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)后地上部生長的抑制；在豎板上，兩種對(duì)照的根系生長明顯受到NaCl的抑制，20.3株系轉(zhuǎn)基因植株和16.2株系轉(zhuǎn)基因植株的根長明顯長于對(duì)照，此結(jié)果表明ThST3可以減輕鹽脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)后根系生長的抑制。四、轉(zhuǎn)ThST3基因植株成體的生長狀況試驗(yàn)材料20株種植在土壤中3周大未抽苔的野生型擬南芥(Col-0)(對(duì)照1);20株種植在土壤中3周大未抽苔的T3代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株(對(duì)照2);20株種植在土壤中3周大未抽苔的T3代20.3株系轉(zhuǎn)基因植株；20株種植在土壤中3周大未抽苔的T3代16.2株系轉(zhuǎn)基因植株。四種植株同時(shí)進(jìn)行梯度鹽水(0-50-100-150-200mMNaCl)澆灌實(shí)驗(yàn)。具體如下將植株依次用含有50、100、150及200mMNaCl的鹽溶液進(jìn)行梯度式鹽脅迫處理，從50mMNaCl開始，每隔3天增加50mMNaCl，直到200mMNaCl，處理結(jié)束后，記錄植物生長狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)存活率。同時(shí)將正常條件(即不采用鹽脅迫)生長的4種植株作為對(duì)照。結(jié)果見圖5。圖5中，5-A為梯度式鹽脅迫處理結(jié)束后四種植株的生長狀態(tài)；5-B為正常條件生長相同時(shí)間的四種植株的生長狀態(tài)；5-C為梯度式鹽脅迫處理結(jié)束后四種植株的存活率統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明20.3株系轉(zhuǎn)基因植株和16.2株系轉(zhuǎn)基因植株約70%都可以正常抽苔，開花及結(jié)莢，可以正常完成整個(gè)生活史，兩個(gè)對(duì)照只有約30%的植株可以完成整個(gè)生活史。此結(jié)果表明ThST3可以在擬南芥的營養(yǎng)生長期和生殖生長期提高植株的耐鹽性。實(shí)施例3、ThST3蛋白的長距離運(yùn)輸活性及其在培育耐鹽植株中的應(yīng)用—、ThST3蛋白的長距離運(yùn)輸活性為了鑒定ThST3是否可以進(jìn)行長距離運(yùn)輸，進(jìn)行擬南芥嫁接實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下取培養(yǎng)基上生長7d的Col-0和自實(shí)施例2的T3代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株，用鋒利刀片將幼苗從子葉胚軸中部迅速橫向切斷，之后將砧木與接穗的斷點(diǎn)迅速對(duì)齊，盡量使接穗和砧木的切面相吻合，之后滴上融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖，待瓊脂糖冷卻凝固后，將平板豎直放置與光下繼續(xù)培養(yǎng)。整個(gè)操作過程在顯微鏡下及無菌條件下進(jìn)行。結(jié)合部位的上半部分為接穗，來自T3代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株的下胚軸，下半部分為砧木，來自野生型擬南芥(Col-0)的下胚軸。結(jié)果見圖6。圖6-A為嫁接兩部分的結(jié)合部位，結(jié)合部位的上半部分為接穗，下半部分為砧木；圖6-B為與砧木的下胚軸相連的野生型擬南芥(Col-0)的主根伸長區(qū)部分。結(jié)果表明在野生型擬南芥下胚軸部分(砧木)可以清楚地檢測(cè)到GFP熒光信號(hào)，這說明融合蛋白ThST3-GFP可以從T3代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株移動(dòng)至野生型擬南芥的下胚軸(砧木)部分，可以進(jìn)行長距離運(yùn)輸；在野生型擬南芥的根系部分可以清晰的看到GFP熒光信號(hào)，這說明融合蛋白ThST3-GFP可以從Ts代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株(接穗)移動(dòng)至野生型擬南芥下胚軸部分(砧木)的更遠(yuǎn)距離的根系部分，這些進(jìn)一步表明ThST3-GFP可以進(jìn)行長距離運(yùn)輸。二、嫁接植株的耐鹽性取抽薹后的擬南芥野生型Col-0和ThST3的來自實(shí)施例2的1\代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行相互嫁接，以Col-0自嫁接作為對(duì)照。共得到三種嫁接植株各10株Co1/Col(接穗和砧木皆來自Col野生型)、Col/ThST3(接穗來自Col野生型，砧木來自實(shí)施例2的T3代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株)、ThST3/Co1(接穗來自實(shí)施例2的T3代2.20株系轉(zhuǎn)基因植株，砧木來自Col野生型)。嫁接2周后，每種嫁接植株取3株，依次用含有100、150、200、250、300及350mMNaCl的鹽溶液進(jìn)行梯度式鹽脅迫處理，從lOOmMNaCl開始，每隔3天增加50mMNaCl，直到350mMNaCl，處理結(jié)束后，記錄植物表型并照相并統(tǒng)計(jì)植物存活率。結(jié)果見圖7。圖7中，7-A為植物表型照片；7-B為嫁接示意圖；7_C為植物存活率統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明組合Col/ThST3和ThST3/Co1都有約超過60%的植株能正常結(jié)莢，正常完成生活史，而嫁接組合Col/Col只有約30%的植株能結(jié)莢，如圖6;在未經(jīng)鹽水澆灌的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，嫁接組合Col/Co1、Col/ThST3、ThST3/Co1的植物全部都能正常完成生活史。此結(jié)果表明伴隨著ThST3蛋白的移動(dòng)，可以提高擬南芥的耐鹽性。序列表〈110〉中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所〈120〉耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用〈130〉CGGNARY81982〈160>4〈210>1〈211>155〈212>PRT〈213〉鹽芥屬小鹽芥(Thellugiellahalophila)〈400>1MetAlaValGlylieLeuGluValAsnLeulieSerGlyLysGlyLeu151015LysArgSerAspPhePheGlyLyslieGluProTyrAlaGlulieGin202530TyrLysGlyGinThrArgLysSerSerValAspLysAspGlyGlyArg90107]35400108]AsnProThrTrpAsnAspLysLeu0109]50550110]SerGlyAlaAspTyrLysLeulie0111]65700112]PheSerAlaAspAspPhelieGly0113]850114]LeuLeuGluMetGlyValGluLys0115]1000116]LysTyrAsnValValAspSerAsp0117]1151200118]LeuGlyValSerTyrSerLeuMet0119]1301350120]AspPheGlyGlyTrpLysHisSer0121]1451500122]〈210>20123]〈211>4680124]〈212>DNA0125]〈213〉鹽芥屬小鹽芥(Thellugiella0126]〈400>20127]atggctgtgggaatcctcgaggtteatctg0128]ttttttggteagateg朋ccttetgctgag0129]agcgttgate朋gatggaggtega朋tccg0130]gagtttcctggctccggtgccgacteteag0131]ttctccgccgacgatttcatcggcgaagct0132]ggElgtgg卿朋gg朋cggcggagcteagg0133]ctctcttttgtcggagagattttccttgga0134]Eltgg朋ggElg3卿ttttggtggEltgg朋g0135]〈210>30136]〈211>270137]〈212>DNA0138]〈213〉人工序列0139]〈220〉0140]〈223〉0141]〈400>30142]cgg朋ttcgatggctgtgggaatcctc0143]〈210>40144]〈211>310145]〈212>DNA45LysTrpArgAlaGluPheProGly60ValLysValMetAspHisAspThr7580GluAlaThrValTyrValLysGlu9095GlyThrAlaGluLeuArgProThr105110LeuSerPheValGlyGluliePhe125GinGluArgGlyMetGluGlyGlu140GinPheAsp155halophila)ateagtggcaaaggtctcaaacgctctgat60皿gg3C皿3Cccgc皿皿gc120ate皿cte皿3tgg3g3gca180cttetcgtca皿gtcatgg3tcatgatect240acggtetetg300ccgaccaagtacaacgttgttgattccgat360gtttcttectctcttetgca3g皿3gggga420categccaatttgatteg468〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>4cggaattcctaatcaaattggctatgcttcc3權(quán)利要求一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐鹽性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1300-221-35S-ThST3;所述pCAMBIA1300-221-355-ThST3是將pCAMBIA1300-221的Xbal和Sacl位點(diǎn)間的小片段取代為權(quán)利要求2或3所述基因得到的。6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的引物；所述引物為序列表中的序列3和序列表中的序列4。7.—種培育耐鹽植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到耐鹽植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物為擬南芥。10.—種培育耐鹽植物的方法，是將用權(quán)利要求7至9中任一所述方法制備得到的耐鹽植物與待培育植物嫁接，得到耐鹽植物。全文摘要本發(fā)明公開了一種耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐鹽性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述蛋白的編碼基因。將所述蛋白的編碼基因?qū)胫参锟梢垣@得耐鹽能力提高的轉(zhuǎn)基因植物，并且得將所述轉(zhuǎn)基因植物嫁接其它植物，可以獲得新的耐鹽能力提高的植物。本發(fā)明對(duì)于耐鹽植物的培育具有巨大的意義。文檔編號(hào)C12N15/63GK101747419SQ200810238998公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月8日優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日發(fā)明者夏然,張華偉,張譯月,李剛,謝旗申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所