專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項(xiàng)目。現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計(jì)等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。
氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很多種氨基酸同時(shí)存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。
大量食肉或饑餓時(shí)尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。
酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡便、成本低的特點(diǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧 氨基酸氧化酶 氧代酸+氨+過氧化氫 過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+輔酶A+氧 丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+乙酰輔酶A +還原型輔酶 這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC 1.4.3.3)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.6)、丙酮酸脫氫酶(pyruvatedehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨基酸的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑500mmol/L 輔酶3mmol/L 氨基酸氧化酶10000U/L 丙酮酸氧化酶12000U/L 丙酮酸脫氫酶12000U/L 碳酸氫鈉7mmol/L 乙酰輔酶A 9mmol/L 輔酶A 6mmol/L 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。
輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。
輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 氨基酸氧化酶 10000U/L 丙酮酸氧化酶 12000U/L 丙酮酸脫氫酶 12000U/L 碳酸氫鈉 7mmol/L 乙酰輔酶A9mmol/L 輔酶A6mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 碳酸氫鈉 7mmol/L 乙酰輔酶A9mmol/L 輔酶A6mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 氨基酸氧化酶 10000U/L 丙酮酸氧化酶 12000U/L 丙酮酸脫氫酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 碳酸氫鈉 7mmol/L 乙酰輔酶A9mmol/L 輔酶A6mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 丙酮酸氧化酶 12000U/L 丙酮酸脫氫酶 12000U/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定氨基酸濃度時(shí)，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
申請人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(ΔA/min)≤0.0007；吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R≥0.99)線形范圍可達(dá)40mmol/L；試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±4％；試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)≤2％；試劑的靈敏度可達(dá)0.004±0.002ΔA/mmol/L；試劑在2-8℃下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的氨基酸的濃度測定方法，其方法如下
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫
過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+
輔酶A+氧
丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A
+還原型輔酶
將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2.一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括
緩沖液 20——500mmol/L
穩(wěn)定劑 1——4000mmol/L
輔酶 1——6mmol/L
氨基酸氧化酶 1000——80000U/L
丙酮酸氧化酶 1000——80000U/L
丙酮酸脫氫酶 1000——80000U/L
碳酸氫鈉(二氧化碳) 1——50mmol/L
乙酰輔酶A1——50mmol/L
輔酶A1——50mmol/L
試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。
其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A組成單劑試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酚輔酶A、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1-4000mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、輔酶A、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101762502SQ20081023599
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司